背景技术：
SIM技术是当前所有超分辨荧光显微技术中成像速度最快，最适 合开展活细胞实时成像的方法。对于激光干涉式SIM系统而言，干涉 光偏振态和物镜数值孔径是影响干涉条纹对比度的主要因素。特别 地，当前几乎所有的SIM系统大都采用大数值孔径物镜进行成像，为 确保激发光在物镜焦面上产生高对比度的结构光条纹，需实时调控激 发光偏振态保证其在物镜焦平面处为s偏振光。现阶段，SIM系统中 采用的偏振调控方法主要有以下几种：
(1)第一种：两个铁电液晶位相延迟器和一个四分之一波片组 成的偏振调控装置，其特点是该液晶位相延迟器为特殊定制的快轴可 变的波片，通电后其快轴可旋转45°，位相延迟量为π/3；但控制系 统复杂，有效能量利用率低，成本较高，且因四分之一波片存在的色 散问题会导致多通道成像时调制后的出射光不再是线偏振，使得干涉 光条纹对比度下降；
(2)第二种：一个四分之一波片和一块特殊定制的pizza偏振片 组成的调控系统，该pizza偏振片是利用12块扇形分布的线偏振块组 合成一个大的圆形偏振片，且确保对称分布的6对子偏振片的快轴沿 周向平行。入射线偏振光经过四分之一波片后被调制为圆偏光，再经 过pizza偏振片后出射光为线偏振光，但能量损失50％以上，且该pizza 偏振片加工工艺复杂，价格昂贵；
(3)第三种：采用一块零级涡旋半波片的调控方案，利用零级 涡旋半波片快轴分布可编程控制的特点，入射的线偏振光经过该波片 调制后出射光偏振方向在空间对称位置是同方向的，可确保照明的± 1级干涉光偏振方向平行，获得最佳条纹对比度；然而，零级涡旋半 波片大都只能针对单一中心波长进行偏振态准确调制，不能满足多通 道SIM成像要求；
第四种：采用一个液晶位相延迟器和一块消色差四分之一波片构 成偏振调控系统，该方案的特点是结构简单，且能量利用率高，是当 前SIM系统中普遍采用的偏振调控手段。
然而，由于消色差四分之一波片在可见光波段(400-700nm)不 是绝对的消色差，使得不同波长入射光经过消色差四分之一波片后的 实测位相延迟量不再精确等于λ/4，而是相对于λ/4上下波动，最终导 致偏振光经过LCVR和消色差四分之一波片后的出射光不是线偏振 光而是椭圆偏振光，且随着激发波长的不同椭圆率也不同。上述椭圆 偏振光在物镜焦面干涉产生的干涉条纹对比度通常比两束同为s偏振 的线偏振光干涉要差；利用SIM图像重构算法对这类低调制度图像进 行处理，重构图像中容易产生伪影干扰。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种偏振调控装置、方法 及激光干涉式结构光照明显微镜系统。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
偏振调控装置，包括：两个普克尔盒或两个液晶位相延迟器，入 射光依次经过第一普克尔盒、第二普克尔盒或第一液晶位相延迟器、 第二液晶位相延迟器，且两个普克尔盒或两个液晶位相延迟器用于对 该入射光的偏振态进行调控，使其产生的出射光为任意目标偏振态。
本发明一种偏振调控装置结构简单，操作便捷，可实现对激光干 涉式SIM系统中激发光偏振态的精确调控，确保在显微物镜焦平面处 获得最佳的干涉条纹对比度，产生了意想不到的有益效果。
激光干涉式结构光照明显微系统中，各方向角的入射线偏振光 (包括0级和±1级衍射光)经过本发明的偏振调控装置后出射光仍 为偏振方向平行的线偏振，可确保入射至大数值孔径物镜后在其焦平 面处干涉的两束光或三束光皆为s偏振，以获得最佳的结构光调制度。
在上述技术方案的基础上，还可做如下改进：
作为优选的方案，第一普克尔盒的快轴与入射光偏振方向成45 度放置。
采用上述优选的方案，调控效果更佳。
作为优选的方案，第二普克尔盒的快轴与入射光偏振方向平行放 置。
采用上述优选的方案，调控效果更佳。
作为优选的方案，第一液晶位相延迟器的快轴与入射光偏振方向 成45度放置。
采用上述优选的方案，调控效果更佳。
作为优选的方案，第二液晶位相延迟器的快轴与入射光偏振方向 平行放置。
采用上述优选的方案，调控效果更佳。
偏振调控方法，利用偏振调控装置进行调控，具体包括以下步骤：
1)入射光为线偏振光；
2)第一普克尔盒的快轴与入射光偏振方向成45°放置；
3)第二普克尔盒的快轴与入射光偏振方向平行放置；
4)通过分别改变施加于第一普克尔盒和第二普克尔盒的电压的 大小来调整入射光的偏振态，使其产生的出射光为任意目标偏振态。
利用本发明公开的偏振调控方法进行调控，其调控效果更佳。
偏振调控方法，利用偏振调控装置进行调控，具体包括以下步骤：
1)入射光为线偏振光；
2)第一液晶位相延迟器的快轴与入射光偏振方向成45°放置；
3)第二液晶位相延迟器的快轴与入射光偏振方向平行放置；
4)通过分别改变施加于第一液晶位相延迟器和第二液晶位相延 迟器的电压的大小来调整入射光的偏振态，使其产生的出射光为任意 目标偏振态。
利用本发明公开的偏振调控方法进行调控，其调控效果更佳。
激光干涉式结构光照明显微镜系统，包括：激光源、反射镜、二 向色镜、声光调制器AOTF、双胶合透镜、半波片HWP、空间光调制 器LCOS、显微物镜以及相机，还包括偏振调控装置。
本发明一种激光干涉式结构光照明显微镜系统可准确实现各方 向角的入射线偏振光(包括0级和±1级衍射光)经过偏振调控装置 后出射光仍为偏振方向平行的线偏振，可确保入射至大数值孔径物镜 后在其焦平面处干涉的两束光或三束光皆为s偏振，以获得最佳的结 构光调制度。
值得注意的是，本发明所公开的激光干涉式结构光照明显微镜系 统可以为3D-SIM系统，也可以为2D-SIM系统。
作为优选的方案，还包括：空间滤波器MASK，空间滤波器MASK 设置于偏振调控装置的入射端，且空间滤波器MASK用于过滤不同 级次的光；
激光源发出激光，激光通过反射镜、二向色镜、声光调制器AOTF 选通后耦合进单模保偏光纤，准直扩束后经过半波片HWP和PSB垂 直入射到空间光调制器LCOS上，产生的各级次衍射光，利用空间滤 波器MASK进行滤波，经过偏振调控装置、双胶合透镜、二向色镜 后进入显微物镜并聚焦于焦面。
采用上述优选的方案，调控效果更佳。
作为优选的方案，空间滤波器MASK仅让在2D-SIM系统下的± 1级衍射光或3D-SIM系统下的0级、±1级衍射光通过。
采用上述优选的方案，调控效果更佳。
附图说明
图1为SIM技术原理图；
图1(a)为莫尔效应产生莫尔条纹图；
图1(b)传统宽场成像技术探测图像频谱范围图；
图1(c)单方向照明的SIM图像频谱范围图；
图1(d)三方向角照明的SIM频谱范围图。
图2为投影的三个方向角(分别为0度、60度和120度)和三个 相位(0度、120度和240度)的9张正弦分布的照明结构光条纹图 像。
图3为大NA物镜对偏振态影响图。
图4为现有技术中液晶位相延迟器LCVR与四分之一QWP波片 组合调控装置。
图5为典型的消色差λ/4波片位相延迟量实测图。
图6为现有方案调控后出射光偏振态；
图6(a)方向角0°；
图6(b)方向角60°；
图6(c)方向角120°。
图7为本发明实施例提供的偏振调控装置的结构示意图之一。
图8为经过本发明偏振调控装置调控后出射光偏振态；
图8(a)方向角0°；
图8(b)方向角60°；
图8(c)方向角120°。
图9为本发明实施例提供的激光干涉式结构光照明显微镜系统的 结构示意图。
图10为本发明实施例提供的偏振调控装置的结构示意图之二。
其中，1为快轴。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
为了更好的说明本发明的效果，在具体实施例中，先对现有的 SIM系统进行简单的描述。
荧光显微成像技术作为光学显微镜的一种，在现代生物医学研究 中扮演重要角色。荧光显微镜分辨率由光波长和物镜数值孔径 (Numerical Aperture，NA)决定。根据阿贝衍射定律，普通荧光显 微镜极限横向分辨率约为200nm，这造成显微镜在小于波长特征尺度 生物结构观测上的困难。近年来，受生物学研究在纳米尺度成像需求 的推动，伴随着光源、探测器、新型荧光探针及新成像理论的发展， 多种可突破“衍射极限”的超分辨荧光成像技术被提出，并将荧光显 微镜分辨率提高至一百纳米甚至小于10纳米。
根据成像方法不同超分辨荧光显微技术可分为三类：单分子定位 显微术(single-molecule localization microscopy，SMLM)，包括随机光 学重建显微术(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)和 光激活定位显微术(photoactivated localization microscopy，PALM)、 受激辐射损耗显微术(stimulated emission depletion microscopy，STED) 显微术以及结构光照明显微术(structured-illumination microscopy， SIM)。SMLM可实现20nm甚至更高分辨率，但时间分辨率低，同时 通常采用全内反射荧光(Total Internal Reflection Fluorescence，TIRF) 照明方式导致成像深度很浅(约波长量级)，高达几kW/cm2的激发光 功率密度也使得样品极易发生光漂白。STED可获得40-70nm的超分 辨图像，但高达GW/cm2量级的STED光功率密度也同样存在样品漂 白的问题，不适合活细胞成像。SIM则有效克服了上述两类超分辨显 微镜的不足，其非特定荧光标记和宽场采图特性，使得它在时间分辨 率和抑制光漂白方面有相当优势，被视为用于活细胞观测最有效的手 段。
SIM技术利用强度正弦调制的结构光照明被观测物体产生“莫尔 效应”，将原本不在远场空间传播的高频信息编码到低频图像中，通 过图像重构算法解码出高频成分实现分辨率提高。从光学系统成像过 程看，采集到的原始图像D(r)可表述为：
式中，S(r)为被观测物体，I(r)为照明光场，PSF(r)为成像光学系统 点扩散函数，N(r)为探测器噪声，代表卷积运算。对于线性SIM技 术而言，发射光场强度与照明光场强度成正比，通常采用正弦分布的 结构光场照明被观测物体：
I(r)＝I0[1+m cos(2πk0·r+φ)] (2)
式中，k0和φ分别为结构光空间频率和初始相位。将式(2)带入式 (1)并进行傅里叶变换可得：
式中，为荧光频谱图像，为被观测物体频谱，OTF(k)为成像 光学系统传递函数，N(k)为噪声谱。其中右边第一项代表普通宽场显 微频谱，另两项相对于第一项分别平移了k0，相当于系统将大于截止 频率kc的高频成分编码到光学传递函数低频区域。为分析简单令： 则有：
其中，为原始图像频谱，φi为不同位相值。通常采集三个方 向、三个不同相位共9张原始图像带入上述方程组进行联立求解将三 个谐波项(和)分离开；对两频谱项和平移解码出高频信息并拼接到的高频区域，最后基于为纳 滤波即可重构出高分辨图像。
图1所示为SIM技术基本原理示意。图1a)所示为莫尔效应产生 莫尔条纹图，显示出了莫尔效应调制产生高频信息。图1b)所示为普 通宽场成像技术可探测图像频谱范围。图1c)-d)为线性SIM频谱拓展 示意，具体为，图1c)所示为单方向照明的SIM图像频谱范围，图2d) 所示为三方向角照明的SIM频谱范围。
图2所示为投影的三个方向角(分别为0度、60度和120度)和 三个相位(0度、120度和240度)的9张正弦分布的照明结构光条 纹图像。
目前绝大多数激光干涉式SIM系统大多采用高NA物镜成像，例 如Olympus放大倍率100x、NA1.49的TIRF油镜(UAPON 100XOTIRF)。采用高NA物镜开展SIM成像时，激发光偏振态调制 是需要重点解决的关键技术难题之一。若两束p偏振光经高NA物镜 出射后以接近垂直角度聚焦于焦面时几乎不干涉，没有结构光条纹产 生。为确保激发光场在物镜焦平面上产生的结构光条纹具有较高的对 比度，通常实时调控激发光偏振态使其与物镜光瞳面垂直(s偏振光)， 如图3所示。
当前，在激光干涉式SIM系统中采用的几种偏振调控方法中，最 常用的调控方案是采用一块液晶位相延迟器和一块消色差四分之一 波片组合的方案进行，如图4所示。该调制方案原理为：入射光为偏 振方向竖直的线偏振光，液晶位相延迟器LCVR的快轴1与入射光偏 振方向夹角为45°，消色差四分之一波片QWP的快轴1与入射光偏 振方向平行。因此，该线偏振光入射经过液晶位相延迟器后出射光为 圆偏光，再入射至四分之一波片后出射光变为线偏光；改变施加在液 晶位相延迟器LCVR上的电压，控制其快轴相应的旋转60度和120°， 确保各激发光在0°、60°和120°方向角上都严格为线偏振光，以 确保物镜焦平面处获得最佳的干涉条纹对比度。
然而，几乎所有的消色差四分之一波片在可见光波段 (400-700nm)的位相延迟量都不是精确等于λ/4，而是随波长的变化 在λ/4附近波动，如图5所示。该波动最终导致从液晶位相延迟器 LCVR出射的圆偏振光入射至消色差四分之一波片后的出射光不是线 偏振光而是椭圆偏振光，且随着激发波长的不同椭圆率也不同。两束 椭圆偏振光在物镜焦面位置干涉后产生的结构光调制度比两束s偏振 的线偏光干涉产生条纹调制度低，严重影响SIM算法重构图像效果。
故至此，我们可以发现现有技术缺点：消色差四分之一波片在可 见光波段(400-700nm)不能做到绝对“消色差”，导致上述调控方 案从四分之一波片出射的光不是线偏光而是椭圆偏振光，且不同的激 发波长对应的出射光的椭圆率不同，如图6所示。图6a)-图6c)分别 代表0°、60°和120°方向角的照明结构光被调制后的出射光偏振 态分布，图中两个对称分布的黑点代表正弦条纹频谱所对应的±1级 频谱中心，三个颜色分别代表488/561/647nm激发光波长。
下面对本发明进行描述，为了达到本发明的目的，偏振调控装置、 方法及激光干涉式结构光照明显微镜系统的其中一些实施例中，如图 7所示，偏振调控装置包括：两个普克尔盒，入射光依次经过第一普 克尔盒V1、第二普克尔盒V2，且两个普克尔盒用于对该入射光的偏 振态进行调控，使其产生的出射光为任意目标偏振态。
其中，第一普克尔盒V1的快轴1(图中由实线箭头表示)与入 射光偏振方向(图中由虚线箭头表示)成45度放置。第二普克尔盒 V2的快轴1(图中由实线箭头表示)与入射光偏振方向(图中由虚线 箭头表示)平行放置。
本发明一种偏振调控装置结构简单，操作便捷，可实现对激光干 涉式SIM系统中激发光偏振态的精确调控，确保在显微物镜焦平面处 获得最佳的干涉条纹对比度，产生了意想不到的有益效果。
激光干涉式结构光照明显微系统中，各方向角的入射线偏振光 (包括0级和±1级衍射光)经过本发明的偏振调控装置后出射光仍 为偏振方向平行的线偏振，可确保入射至大数值孔径物镜后在其焦平 面处干涉的两束光或三束光皆为s偏振，以获得最佳的结构光调制度。
偏振调控方法，利用偏振调控装置进行调控，具体包括以下步骤：
1)入射光为线偏振光，假定偏振方向为垂直方向；
2)第一普克尔盒V1的快轴与入射光偏振方向成45°放置；
3)第二普克尔盒V2的快轴与入射光偏振方向平行放置；
4)通过分别改变施加于第一普克尔盒V1和第二普克尔盒V2的 电压的大小来调整入射光的偏振态，使其产生的出射光为任意目标偏 振态。
如图8所示，因此，基于上述偏振调控方法可以使得0°、60° 和120°方向角上的两束±1级干涉光被调制为偏振方向平行的出射 光，确保SIM条纹对比度最佳。图8为基于图6进行对比实验图。图 8a)-图8c)分别代表0°、60°和120°方向角的照明结构光被调制后 的出射光偏振态分布，图中两个对称分布的黑点代表正弦条纹频谱所 对应的±1级频谱中心，三个颜色分别代表488/561/647nm激发光波 长。
任意方向角两束线偏振照明光经过本申请偏振调控装置后，出射 光在该方向角上仍为线偏振，且两束光偏振方向平行，可确保在物镜 焦平面处获得最佳的结构光调制度。
如图9所示，本发明还公开一种激光干涉式结构光照明显微镜系 统，包括：激光源、反射镜、二向色镜、声光调制器AOTF、双胶合 透镜、半波片HWP、空间光调制器LCOS、显微物镜、相机、偏振调 控装置以及空间滤波器MASK。
本发明一种激光干涉式结构光照明显微镜系统可准确实现各方 向角的入射线偏振光(包括0级和±1级衍射光)经过偏振调控装置 后出射光仍为偏振方向平行的线偏振，可确保入射至大数值孔径物镜 后在其焦平面处干涉的两束光或三束光皆为s偏振，以获得最佳的结 构光调制度。
激光源发出波长405/488/561/647nm四路激光，激光经过反射镜 (M1-M5)、二向色镜(D1-D3)、声光调制器AOTF选通后耦合进单模保 偏光纤，准直扩束后经过半波片HWP和PSB垂直入射到空间光调制 器LCOS上，产生的各级次衍射光(0级，±1级以及其他高阶级次) 经过傅里叶透镜L2在其焦面处聚焦，利用空间滤波器MASK进行滤 波仅让±1级(或0级和±1级)衍射光通过，经过偏振调控装置、 双胶合透镜组L3和L4进入显微物镜OBJ，再经过正交放置的二向色 镜D4、D5反射后进入显微物镜OBJ并聚焦于焦面。此时，因干涉产 生的结构光条纹激发被观测荧光样品产生荧光，荧光经过二向色镜 D5、发射片、Tube Lens后被相机camera采集，获得SIM原始图像。
其中，偏振调控装置为两个普克尔盒，用于对±1级(或0级和 ±1级)衍射光的偏振态进行调控，使得0°、60°和120°空间方向角 两干涉光束在物镜焦面处皆为s偏振，以确保获得最佳的条纹对比度。
其中，405为：405nm激光源；488为：488nm激光源；561为：561nm 激光源；647为：647nm激光源；
M1-M5为：反射镜；D1-D5为：二向色镜；AOTF为：声光调制 器；L1-L4为：双胶合透镜；HWP为：半波片；OBJ为：显微物镜。
上述图9所公开的一种激光干涉式结构光照明显微镜系统为 2D-SIM系统，但是值得注意的是，其仅为某一个实施例。3D-SIM系 统也属于本发明的保护范围内。
为了进一步地优化本发明的实施效果，在另外一些实施方式中， 其余特征技术相同，不同之处在于，如图10所示，偏振调控装置还 可以包括：两个液晶位相延迟器，入射光依次经过第一液晶位相延迟 器LCVR1、第二液晶位相延迟器LCVR2，且两个液晶位相延迟器用 于对该入射光的偏振态进行调控，使其产生的出射光为任意目标偏振 态。
其中，第一液晶位相延迟器LCVR1的快轴1与入射光偏振方向 成45度放置。第二液晶位相延迟器LCVR2的快轴1与入射光偏振方 向平行放置。
偏振调控方法，利用偏振调控装置进行调控，具体包括以下步骤：
1)入射光为线偏振光，假定偏振方向为垂直方向；
2)第一液晶位相延迟器LCVR1的快轴1与入射光偏振方向成 45°放置；
3)第二液晶位相延迟器LCVR2的快轴1与入射光偏振方向平行 放置；
4)通过分别改变施加于第一液晶位相延迟器LCVR1和第二液晶 位相延迟器LCVR2的电压的大小来调整入射光的偏振态，使其产生 的出射光为任意目标偏振态。
发明针对当前激光干涉式SIM系统中采用一个液晶位相延迟器 和一个消色差四分之一波片构成的调控方案的存在的“色散”问题， 提出了一种采用两个普克尔盒或者两个液晶位相延迟器组合的调控 装置，通过分别改变施加在各普克尔盒或液晶位相延迟器上的电压， 可确保入射的线偏振光经过该调控系统后出射光仍为任意指定偏振 方向的线偏光。该方法光机结构简单，调制精度高，可有效弥补当前 调制技术的不足。
对于本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形 和改进，这些都属于本发明的保护范围。