基于光锥照明的反射式超分辨光学显微系统及方法

本发明属于可见光显微，具体涉及一种基于光锥照明的反射式超分辨光学显微系统及方法。

背景技术：

1、现有显微技术大致可分为近场显微与远场显微两大类，近场显微包括微球体辅助成像、近场扫描显微等方法。近场显微方法能实现超分辨显微成像，但其工作距离小于工作波长，极大的限制了其实际应用。远场超分辨技术，工作距离大，可以克服近场显微技术的不足。现有的远场超分辨显微技术包括受激发射损耗显微、局部激活显微、随机光重构光学显微等；然而，这些技术都需要对被检测样品进行荧光分子标记。非标记的远场超分辨显微技术，具有工作距离大、无需对样品进行标记，使用方便等优点；因此成为超分辨光学显微镜技术的重要发展趋势。近年来，基于超衍射器件的非标记远场超分辨显微已有少数实验报道。这些系统都依赖于新型的超分辨器件作为照明器件；然而，超分辨器件的聚焦效率通常较低。

2、技术背景参考文献：

3、[1]edward t.f.rogers,jari lindberg,tapashree roy,salvatore savo,johne.chad,mark r.dennisand nikolay i.zheludev.“a super-oscillatory lens opticalmicroscope forsubwavelength imaging,”nature materials,vol.11,pp.432-435(2012).

4、[2]edward t f rogers and nikolay i zheludev.“optical super-oscillations:sub-wavelength light focusing and super-resolution imaging,”journal of optics,vol.15,pp.094008(2013).

5、[3]y yan,l li,c feng,w guo,s lee,m hong.“microsphere-coupled scanninglaser confocal nanoscope for sub-diffraction-limited imaging at 25nm lateralresolution in the visible spectrum,”acs nano,vol.8,pp.1809-1816(2014).

6、[4]fei qin,kun huang,jianfeng wu,jinghua teng,cheng-wei qiu,andminghui hong.“asupercritical lens optical label-free microscopy:sub-diffraction resolution and ultra-long working distance,”advanced materials,vol.28,1602721(2017).

7、[5]yi zhou,kun zhang,jinlong wang,zhengguo shang,gaofeng liang,zhihaizhang,zhongquan wen,yufei liu,gang chen,“label-free super-resolutionmicroscopy based on non-diffraction superoscillation beam(ndsb)illumination,”optics and lasers in engineering,vol.168,pp.107690(2023)

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于光锥照明的反射式超分辨光学显微系统及方法，以实现高效的超分辨照明，提高超分辨成像对比度。

2、本发明所述的基于光锥照明的反射式超分辨光学显微系统，包括：

3、样品扫描模块，用于带动样品移动。

4、光学显微成像模块，用于对样品进行宽场成像，确定超分辨扫描成像区域。

5、环形聚焦光束产生模块，用于产生环形聚焦光束。

6、超分辨聚焦照明与收集模块，用于将环形聚焦光束转化为超分辨锥形聚焦光束，形成超分辨焦斑对样品进行照明，收集由样品反射和散射产生的超分辨信号光，并转化。

7、超分辨光学成像模块，用于获取经转化后的超分辨信号光，并将其转换为电信号。

8、计算机，用于控制样品扫描模块带动样品移动，同时接收超分辨光学成像模块输出的电信号，处理得到超分辨扫描成像区域内样品的超分辨显微图像。

9、所述环形聚焦光束产生模块沿着光线传播方向依次包括光源模块、线偏振片、锥透镜、第三正透镜、第一正透镜、第二正透镜和偏振分束器；第三正透镜与锥透镜同轴间隔放置，第一正透镜的前焦平面与第三正透镜的后焦平面重合，第一正透镜的后焦平面与第二正透镜的前焦平面重合，第二正透镜的后焦平面与超分辨聚焦照明与收集模块中的物镜的后焦平面重合，第一正透镜与第二正透镜构成第一4f系统。光源模块产生准直激光束，该准直激光束经过线偏振片、第一锥透镜、第三正透镜后形成环形聚焦光束，该环形聚焦光束在第三正透镜的后焦平面上形成环形聚焦光斑，该环形聚焦光束通过第一4f系统后尺寸被缩小，尺寸被缩小后的环形聚焦光束经偏振分束器进入超分辨聚焦照明与收集模块。

10、优选的，所述超分辨聚焦照明与收集模块除了包括物镜外，还包括四分之一波片，所述样品位于物镜的前焦平面上；经偏振分束器进入的环形聚焦光束(即尺寸被缩小后的环形聚焦光束)通过四分之一波片后，形成与物镜同轴的圆偏振环形聚焦光束，该圆偏振环形聚焦光束在物镜的后焦平面上形成与物镜同轴的环形聚焦光斑，该圆偏振环形聚焦光束通过物镜后，转化为超分辨锥形聚焦光束，在物镜前焦平面前后沿光轴形成长焦深超分辨聚焦光场，该长焦深超分辨聚焦光场的半高全宽小于0.5λ/na，该长焦深超分辨聚焦光场的超分辨焦斑的第一零点半径(即焦斑强度峰值位置到第一个零点位置的距离)小于0.61λ/na，长焦深超分辨聚焦光场的超分辨焦斑对样品进行照明，由样品反射和散射产生的超分辨信号光被物镜收集后，通过四分之一波片转化成偏振光束，该偏振光束经偏振分束器进入超分辨光学成像模块。其中，λ表示准直激光束的波长，na表示物镜的数值孔径。

11、优选的，所述超分辨锥形聚焦光束的数值孔径nac满足：0.947na≤nac<na。

12、优选的，要实现样品的三维层析扫描，样品扫描模块有两种结构。

13、第一种，样品扫描模块为二维纳米扫描台，二维纳米扫描台通过扫描信号线连接计算机，样品水平固定在二维纳米扫描台上，计算机控制二维纳米扫描台带动样品在xy平面内二维移动；所述超分辨聚焦照明与收集模块还包括轴向纳米定位器，轴向纳米定位器通过定位信号线连接计算机，物镜安装在轴向纳米定位器上，计算机控制轴向纳米定位器带动物镜在z向移动。二维纳米扫描台与轴向纳米定位器组合实现样品相对于物镜的三维移动，成本较低。

14、第二种，样品扫描模块为三维纳米扫描台，三维纳米扫描台通过扫描信号线连接计算机，样品水平固定在三维纳米扫描台上，计算机控制三维纳米扫描台带动样品在x、y、z三个方向上移动。采用三维纳米扫描台实现样品相对于物镜的三维移动，避免了物镜微小移动带来的成像影响，成像效果更好。

15、优选的，所述超分辨光学成像模块包括第四正透镜、第一立方分束器、第五正透镜、空间滤波器、第一筒镜、光纤头、光电倍增管和高速采集卡，第四正透镜的前焦平面与物镜的后焦平面重合，第四正透镜的后焦平面经过第一立方分束器反射后与第五正透镜的前焦平面重合，第五正透镜的后焦平面与空间滤波器重合(即空间滤波器位于第五正透镜的后焦平面上)，第四正透镜、第一立方分束器、第五正透镜构成第二4f系统，光纤头的前端面与第一筒镜的后焦平面重合，光纤头通过第二光纤跳线连接光电倍增管，光电倍增管通过采集信号线连接高速采集卡，高速采集卡通过数据线连接计算机。转化后的超分辨信号光被第二4f系统投射到空间滤波器上，经空间滤波器滤波后在第一筒镜的后焦平面上汇聚，并被耦合进入光纤头，然后进入光电倍增管，由光电倍增管将其转换为电信号，该电信号由高速采集卡采集并输入至计算机。第二4f系统用于将物镜后焦平面上的光场投射到第五正透镜的后焦平面上(即投射到位于第五正透镜的后焦平面上的空间滤波器上)，从而保证实现超分辨成像。

16、优选的，所述光源模块包括激光器和光纤准直器，激光器通过第一光纤跳线与光纤准直器连接；激光器发出的相干光经过第一光纤跳线传输至光纤准直器，光纤准直器将所述相干光准直后输出准直激光束。

17、优选的，所述超分辨光学成像模块还包括五维调节架，光纤头安装在五维调节架上，调节五维调节架能使进入光纤头的超分辨信号光达到最大。所述光纤头的前端面的光纤内径小于第一筒镜的后焦平面上的超分辨信号光的焦斑的第一零点半径，从而更好保证实现超分辨成像分辨率达到最优。

18、优选的，所述光学显微成像模块包括第六正透镜、非相干光源、准直透镜、第二立方分束器、第二筒镜和数字相机，数字相机通过相机信号线连接计算机，非相干光源位于准直透镜的前焦点处，第六正透镜的前焦平面与第四正透镜的后焦平面重合，第六正透镜的后焦平面位于第二筒镜前方，第六正透镜、第一立方分束器、第四正透镜构成第三4f系统；非相干光源发出的光经准直透镜准直、第二立方分束器反射后，依次经过第六正透镜、第一立方分束器、第四正透镜、偏振分束器、四分之一波片到达物镜，在物镜的前焦平面上汇聚成非相干光对样品进行照明，由样品反射或散射而产生的非相干光被物镜收集后，依次经过四分之一波片、偏振分束器、第四正透镜、第一立方分束器、第六透镜、第二立方分束器、第二筒镜后进入数字相机，使样品成像于数字相机上并通过相机信号线送入计算机，由计算机显示样品的宽场显微图像。第三4f系统用于将物镜后焦平面上的光场投射到第六正透镜的后焦平面上，而第六正透镜的后焦平面位于第二筒镜前方，从而保证宽场成像。

19、优选的，所述空间滤波器有三种结构。

20、第一种空间滤波器为环形通过型空间滤波器，其包括玻璃基底和覆盖在所述玻璃基底上且同心的圆形铝膜和第一环形铝膜，所述圆形铝膜的直径等于2rin，所述第一环形铝膜的内径等于2rout、外径等于所述玻璃基底的直径，所述玻璃基底对波长为λ的光波透射率大于90％，所述圆形铝膜、第一环形铝膜对波长为λ的光波透射率都为0。只让由样品反射产生的超分辨信号光通过，即让明场成像光信号通过，实现明场成像。其中，rin表示在物镜的后焦平面上形成的与物镜同轴的环形聚焦光斑的内半径，rout表示在物镜的后焦平面上形成的与物镜同轴的环形聚焦光斑的外半径。

21、第二种空间滤波器为环形遮挡型空间滤波器，其包括玻璃基底和覆盖在玻璃基底上的第二环形铝膜，所述第二环形铝膜的内径等于2rin、外径等于2rout，所述玻璃基底对波长为λ的光波透射率大于90％，所述第二环形铝膜对波长为λ的光波透射率为0。只让由样品散射产生的超分辨信号光通过，即让暗场成像光信号通过，实现暗场成像。

22、第三种空间滤波器为相衬板，其包括玻璃基底和覆盖在玻璃基底上的环形介质膜，所述环形介质膜为π相位环(相对于其他区域，其相位变化为π)，π相位环的内径等于2rin、外径等于2rout，所述玻璃基底对波长为λ的光波透射率大于90％，所述π相位环对波长为λ的光波透射率为10％～20％。由样品反射产生的超分辨信号光通过π相位环，由样品散射产生的超分辨信号光通过相衬板上除π相位环之外的其他位置，最后在第一筒镜的后焦平面上汇聚并产生干涉。

23、本发明所述的基于光锥照明的反射式超分辨光学显微方法，采用上述反射式超分辨光学显微系统，该方法包括：

24、步骤一、采用光学显微成像模块对样品进行宽场成像，确定超分辨扫描成像区域。

25、步骤二、在确定超分辨扫描成像区域后，使环形聚焦光束产生模块产生环形聚焦光束，超分辨聚焦照明与收集模块将环形聚焦光束转化为超分辨锥形聚焦光束，形成超分辨焦斑对样品进行照明，收集由样品反射和散射产生的超分辨信号光，并转化。

26、步骤三、计算机控制样品扫描模块带动样品移动，同时超分辨光学成像模块获取经转化后的超分辨信号光，并将其转换为电信号输入计算机。

27、步骤四、计算机对输入的电信号进行处理，并结合样品移动的坐标，形成超分辨扫描成像区域内样品的超分辨显微图像。

28、本发明利用环形聚焦光束和传统物镜聚焦效率高的优势，通过环形聚焦光束照明物镜的后焦平面，在物镜前端形成大数值孔径锥形聚焦光束，并在物镜前焦平面前后沿光轴形成长焦深超分辨聚焦光场，实现高效、长焦深的超分辨光学聚焦，进而实现了高效的超分辨照明，并利用传统物镜高效收集能力，基于共聚焦工作原理，实现了反射式超分辨光学显微，结合空间滤波器，有利于提高超分辨成像对比度。由第一正透镜与第二正透镜构成的第一4f系统可以很好地缩小经第三正透镜透射的环形聚焦光束的尺寸，并最终投射到物镜的后焦平面，该第一4f系统一方面起着缩小环形聚焦光束的尺寸作用，另一方面起着环形聚焦光束传输中继作用，用以保证将第一4f系统前焦平面的环形聚焦光束尺寸缩小后，准确地投射到第一4f系统的后焦平面，从而避免了环形聚焦光束在直接传输中由于衍射效应产生的尺寸畸变和光场强度分布波动，确保了环形聚焦光束对物镜的高质量照明，进而确保了所产生超分辨焦斑达到最小，保证反射式超分辨光学显微系统达到更佳的分辨率。本发明能实现样品的非标记、超分辨率、层析成像，可应用于生物样品、非生物样品的检测等。