非聚集性人vh结构域的制作方法

专利名称：非聚集性人vh结构域的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体重链可变结构域。特别地，本发明涉及非聚集性人Vh结构域以及 制备和使用其的方法。
背景技术：
抗体在鉴定及中和病原体的诊断和临床应用中起着重要作用。从成对的重链和轻 链多肽构建抗体。当抗体正确折叠时，各链折叠成通过更加线性的多肽序列连接的许多不 同球状结构域。例如，轻链折叠成可变和恒定(CJ结构域。重链和轻链可变结构域 (Vh和VJ的相互作用导致抗原结合区(Fv)的形成。通常，Vh和八是最佳抗原结合所必需 的，虽然已显示重链二聚体和氨基末端片段在轻链不存在的情况下可保持活性。轻链和重链可变区负责结合靶抗原，并因此可显示抗体之间的显著序列多样性。 恒定区显示较少的序列多样性，其负责结合许多天然蛋白质以引发重要的生物化学事件。 抗体的可变区包含分子的抗原结合决定簇，从而确定抗体对其靶抗原的特异性。大部分序 列变异性发生在互补决定区(⑶R)。总共存在6个⑶R，每可变重链和轻链各3个，称为 VhCDRI、VhCDR2、VhCDR3、VlCDRI、VLCDR2 和 VLCDR3。CDR 外的区域称为构架区(FR)。抗体的 该特征结构提供了免疫系统可基于其发掘大量抗原结合多样性以获得对于大量抗原的特 异性的稳定支架。骆驼(骆驼，单峰骆驼和美洲驼(llama))的免疫库(r印ertoire)是独特的，因为 其具有罕见类型的称为重链抗体的抗体(Hamers等人，1993)。此类抗体缺乏轻链，从而它 们的结合部位(combining site)由一个结构域组成，称为VhH。在鲨鱼中也观察到单结构 域抗体(sdAb)，称为VNAR。sdAb提供了优于来源于常规四链抗体的单链Fv(ScFv)片段的几个有利方面。单 结构域抗体在亲和力方面与它们的scFv对应物相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、 可重折叠性(refoldabiIity)、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性 方面超越scFv。sdAb的许多上述特性在涉及抗体的应用中是令人期望的。然而，天然发生 的sdAb (骆驼VhH和鲨鱼VNAR)的非人性质由于免疫原性的原因限制了它们在人中的使用。 在这方面，人Vh结构域(“Vh")是人中免疫疗法的理想候选物。虽然可通过只基于结合 特性(作为选择标准)的淘选从文库(例如，噬菌体展示文库)分离天然发生的单结构域 抗体(Arbabi-Ghahroudi等人，1997 ；Lauwereys等人，1998)，但在人Vh的情况下，事实并非 如此，因为它们在溶液中易于形成高分子量聚集体。一直以来都在尝试分离非聚集性Vh (Davies等人，1994 ；Tanha等人，2001 ；Tanha 等人，2006 Jespers等人，2004a ；To等人，2005)。一个现有技术方法包括噬菌体展示文库 和连续步骤将文库经历加热以使噬菌体展示的Vh变性；冷却；以及在淘选的结合阶段靶 向抗原(Jespers等人，2004a)。具有可逆去折叠特征的Vh在冷却步骤中重新获得它们的 结合，随后在结合步骤中被选择，而具有不可逆变性特征的VH(其包括不溶性Vh)由于聚集 而丧失，从而被除去。使用基于噬菌体载体的噬菌体展示文库进行所述方法。然而，该方法 需要Vh在噬菌体表面上的多价展示；已证明该方法对于基于噬菌体载体的展示文库是有效的，但在用基于噬菌粒载体的系统提供的单价展示形式中是无效的(关于噬菌体展示系统 和它们的特征，参见Winter等人，1994 ；Bradbury和Marks，2004)。期望分离抗原特异性的、可溶的和结构上稳定的Vh以用于临床和诊断应用。因此， 在本领域内存在对非聚集性人Vh结构域和产生非聚集性人￥11结构域的方法的需要，所述非 聚集性人Vh结构域减少了现有技术的不利方面。发明概述在一个方面，本发明包括抗体重链可变(Vh)结构域。考虑到与已知的乂11结构域和 分离其的方法相关的问题，新型人Vh结构域已进行了工程改造，其展示有益于临床和诊断 应用的特性。 因此，在一个方面，本发明包括非聚集性人Vh结构域或其文库，其在至少一个互补 决定区中包含至少一个形成二硫键的半胱氨酸，并且具有酸性等电点。Vh结构域可以是可溶性的，能够进行可逆热去折叠，或能够结合蛋白A。Vh结构域 可在⑶Rl中具有至少1个半胱氨酸，和/或其可在⑶R3中具有至少3个半胱氨酸。Vh可 在一个⑶R内(例如⑶R内)或CDR之间(例如⑶R间)形成非典范(non-canonical) 二 硫键。此类⑶R内或⑶R间二硫键可形成伸出的环(extended loop)。Vh可以是酶抑制剂， 并且可通过由二硫键形成的伸出的环(或CDR)进行抑制。在另外的实施方案中，本发明的乂11可以以在CDRl的位点32上存在酸性残基(天 冬氨酸或谷氨酸)为特征。VH结构域还可具有低于6的酸性等电点。在本发明的另一个方面，非聚集性Vh结构域或其文库包含人构架序列和至少一个 来自不同物种的CDR;例如，Vh结构域可包含人构架序列和骆驼CDR序列。备选地，在另外 的非限定性实例中，Vh结构域可包含人构架序列、人⑶R1/HI、人⑶R2/H2和骆驼⑶R3/H3。非聚集性Vh结构域或其文库还可包括混合的随机化的序列或文库。在另一个实施方案中，非聚集性Vh结构域或其文库包含选自SEQ IDNO 24-90、SEQ ID NO :101-131、SEQ ID NO 132-162的任一个和其组合的序列。在另外的方面，本发明可包括非聚集性Vh结构域或其文库，其可基于AVh种系序 列，例如1-f Vh区段、1-24VH区段和3-43VH区段。备选地，本发明的Vh和其文库可基于骆 驼VhcDNA或骆驼种系Vh区段(具有酸性pi)。在另一个备选方案中，Vh和其文库可基于骆 驼VhH cDNA或骆驼种系VhH区段(具有酸性pi)。在另一个实施方案中，Vh结构域包括 huVHAm302 (SEQ ID NO 15)、huVHAm309 (SEQ ID NO 17)、huVHAm316(SEQ ID NO 19)、huVHAm303 (SEQID NO 164)、huVHAm304 (SEQ ID NO :16)、huVHAm305(SEQ ID NO 15165huVHAm307 (SEQ ID NO : 166)、huVHAm311 (SEQ ID NO : 167)、huVHAm315 (SEQID NO : 18)、huVHAm301 (SEQ ID NO : 163)、huVHAm312 (SEQ ID NO:
168)、huVHAm320(SEQ ID NO 171)、huVHAm317 (SEQ ID NO 170)、huVHAm313 (SEQID NO
169)、huVHAm431(SEQID NO 23)、huVHAm427(SEQ ID NO 21)、huVHAm416(SEQ ID NO 20)、 huVHAm424 (SEQ ID NO : 175)、huVHAm428 (SEQID NO :22)、huVHAm430 (SEQ ID N0:176)、 huVHAm406 (SEQ ID NO : 172)、huVHAm412 (SEQ ID NO : 173)或 huVHAm420 (SEQ ID NO: 174) 中的一个。在一个实施方案中，从基于噬菌粒的噬菌体展示文库分离Vh结构域。Vh结构域的 分离可包括增强选择非聚集性Vh结构域的能力或效率的选择步骤。
在特定的实施方案中，本发明提供了 Vh结构域或其文库，其中a)Vh结构域基于 HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b)保持CDR3的位点99和IOOd上的Cys ；c)随机化CDR3的剩余 的14个氨基酸残基；d)随机化氨基酸残基94 ；和e)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。在另一个方面，本发明包括Vh结构域文库，其中a) Vh结构域基于HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b)位点93-102 (93/94-CDR3)上的氨基酸残基来源于美洲驼VhH ；c)随机化CDR1/H1 的8个氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明包括Vh结构域或其文库，其中a) Vh结构域基于 HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b) CDR3 包括选自 SEQ ID NO 24-90 和 SEQ ID NO :33_63 的序列； c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。在另一个方面，本发明还提供了通过下列步骤增加非聚集性Vh结构域的选择的能 力或效率的方法a)提供基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库，其中通过Vh结构域在噬菌体表 面上的多价展示产生文库；和b)使用噬菌体-Vh结构域文库和结合靶进行淘选，其中该方法包括选择非聚集性噬菌体-Vh结构域的步骤。选择步骤可以是将噬菌 体-Vh结构域文库经历热变性/复性的步骤，其可在淘选步骤(步骤b))之前发生。备选 地，选择步骤可以是在淘选(步骤b))之后发生的测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pi 的Vh的步骤。在另一个备选方案中，选择步骤可包括热变性/复性和测定单个克隆的序列 以鉴定具有酸性Pl的VH。在一个实施方案中，该方法还可包括从基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库分 离特定Vh结构域的步骤。在备选实施方案中，该方法可包括步骤c)提供基于噬菌体载体的Vh结构域噬菌体展示文库，其中基于具有酸性pi的Vh 结构域支架产生文库；d)使用噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选；和e)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pi的Vh结构域。用于所述方法的Vh结构域支架可基于具有酸性pi的人种系序列、骆驼Vh cDNA、 具有酸性Pl的骆驼种系Vh区段、骆驼VhH cDNA、或具有酸性pi的骆驼种系VhH区段。可从 基于噬菌体载体的Vh结构域噬菌体展示文库分离特定Vh结构域。上述方法还可包括从基 于噬菌体载体的Vh结构域噬菌体展示文库分离特定Vh结构域的步骤。在另一个方面，本发明包括编码本发明的Vh的核酸、包含所述核酸的载体和包含 所述核酸或载体的宿主细胞。在另一个方面，Vh可在宿主包括但不限于任何酵母株系中表 达。在另一个方面，本发明包括药物组合物，所述组合物以Hvh结构域与抗原结合的 有效量包含一种或多种Vh结构域，和可药用的赋形剂。在另一个方面，本发明包括Vh结构域用于制备药剂的用途，所述药剂用于通过结 合抗原来治疗或预防医学病状。本发明还提供了治疗患者的方法，其包括对需要治疗的患者施用包含一种或多种 Vh结构域的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了包括一种或多种Vh结构域以及用于检测和确定一种 或多种Vh结构域与生物学样品中特定抗原的结合的一种或多种试剂的试剂盒。本发明的Vh还可用于高通量筛选测定，例如微阵列技术，其中Vh结构域的使用由 于其大小和稳定性而优于常规IgG。本发明的实施方案对基于噬菌粒的VJ^菌体展示文库使用热变性淘选方法。基于 噬菌粒载体的噬菌体展示系统提供了优于基于噬菌体载体的系统的许多有利方面，包括易 用性、分离高亲和力结合剂的适合性以及快速抗体表达和分析。此外，辅助噬菌体的使用导 致多价展示(Rondot等人，2001 ；Baek,等人，2002 ；Soltes等人，2003)，从而导致结合剂的 高产率、更少的淘选轮次和更有效的富集。此外，对于噬菌粒载体系统，单价与多价形式之 间的转换可通过使用合适类型的辅助噬菌体随意地实现(Rondot等人，2001 ；0' Connell 等人，2002 ；Kirsch 等人，2005)。本发明的Vh以非聚集性和可逆热去折叠特性为特征。本发明的方法将对由基于 噬菌体载体的展示文库提供的上述生物物理学特性的选择(Jespers，等人，2004)与用噬 菌粒载体构建大容量文库的方便结合在一起，从而导致通过进入更大序列空间来对非聚集 性结合剂进行更有效的选择。本方法通过以多价展示形式(使用热变性)和以单价展示形 式交替进行淘选还可用于同时选择(i)非聚集性和(ii)高亲和力。所描述的选择方法可 用于具有上述特征的噬菌粒文库以改善对非聚集性结合剂，以及对具有可逆热去折叠特性 的结合剂的富集。本发明展示了热变性方法(Jespers等人，2004)至从噬菌粒载体形式的巨大的合 成人Vh文库选择非聚集性Vh的成功扩展。当使用hyperphage (M13K07 ΔρΙΙΙ辅助噬菌体) 和使用热变性步骤通过噬菌体拯救(phage rescue)以多价展示形式进行淘选时，文库产生 显示可逆热去折叠的非聚集性VH。选择以富集具有酸性pi和/或CDR1-CDR3间二硫键的 Vh为特征。文库设计包括增加酶抑制性Vh在文库中的频率的特征。根据下列描述，本发明的另外的方面和有利方面将很显然。详细描述和实施例表 示本发明的优选实施方案，且仅以举例说明的方式给出，因为根据本发明的教导，本发明范 围内的各种变化和变动对于本领域技术人员来说将变得显然。附图概述现将参考附图通过举例描述本发明的这些和其他特征，其中

图1举例说明(i)通过未还原/烷基化的(imred/alk)和还原/烷基化的(red/ alk)HVHP430 Vh的质谱法获得的分子质量特征谱和(ii)HVHP430和4种抗α淀粉酶Vh的 烷基化反应/质谱实验的结果。基于所有CDR Cys残基参与二硫键形成的假定计算二硫键 的数目的理论值。二硫键的“总数”是⑶R内/⑶R间二硫键和Cys 22与Cys 92之间的典 范二硫键的和。图2Α显示HVHP430的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)，随机化的残基以下划线标示。 Hl (高变环 1)横跨残基 26-32 (GFTFSNY ；SEQ ID NO 177) (Chothia,等人，1992)。CDRl (互 补决定区1)与Hl交迭并且横跨残基31-35 (NYAMS ；SEQ ID N0:178)。CDR和构架区(FR) 的名称和编号根据Kabat等人(1991)。图2B显示人Vh噬菌体展示文库的构建的示意性步骤。图3显示pMEDl噬菌粒载体的图谱，多克隆位点和其紧邻的周围区域的核苷酸序
8列示于(ii)。RBS，核糖体结合部位；L，左；R，右；HA，血凝素；fd，丝状噬菌体，fd。图4显示通过以单价展示形式(A)或多价展示形式(使用热变性步骤)(B)淘选抗 α淀粉酶文库而分离的Vh的大小排阻层析谱。(A)huVHAm455(点线)高度沉淀，从而产 生低吸光度信号。(B)huVHAm304 点划线；huVHAm309 点线；huVHAm428 实线；huVHAm416 虚线。(C)显示提高的峰分辨率的图4B的放大。图5显示举例说明Vh的聚集倾向(以它们的单体含量的百分比表示)的图。图6显示确定由huVHAm302的位点32上的琥珀密码子编码的氨基酸的本体 的步骤。㈧通过质谱法确定的huVHAm302的序列。空格确定了 FR与⑶R之间的边 界(参见图2A)。通过使用nanoRPLC-MS/MS分析huVHAm302的胰蛋白酶消化物所确定 的肽序列以粗体标示(也参见图6B)。发现位点32上的琥珀密码子编码E(下划线标 示的)。huVHAm302的N末端被确定为焦谷氨酸(pyroQ)。根据m/z 939. 50 (2+)处的 占优势的双质子化离子的MS/MS光谱(数据未显示)获得N-末端胰蛋白酶酶解的肽序 列，pyroQVQLVESGGGLIKPGGSLR(SEQ ID N0:179)。此外，来自 m/z 1413. 71 (11+)处的质 子化蛋白质离子的CID的N末端片段离子也显示huVHAm302的N末端为pyroQ(数据未 显示)。确定的蛋白质分子量(15，541.2Da)也表明蛋白质的N末端为焦谷氨酸。来自 LSEEDLNHHHHHH(SEQ ID NO 180)的m/z 585.91 (3+)处的C末端胰蛋白酶酶解的肽离子在 DDA实验的全谱扫描(survey scan)中占优势。未观察到在C末端组氨酸后附有氨基酸的 肽。此外，进行m/z 1413.71(11+)处的蛋白质离子[M+11H] 11+的碰撞诱导解离(CID)，从蛋 白质的C末端片段离子获得C-末端胰蛋白酶酶解的肽序列VTVSSGSEQKLSEEDLNHHHHHH (SEQ IDNO 181) (MS/MS数据未显示)。(B)关于胰蛋白酶酶解的肽LSCamAAS⑶TVSDESMTWVR (SEQ ID NO 13 ；huVHAm302 的残基 20-38)的 m/z 1036. 47(2+)处的双质子化离子的 MS/MS 谱。 位点32上的琥珀编码的氨基酸E以下划线标示。质谱实验还显示⑶R3Cys残基形成了二 硫键。图7显示通过利用热变性法淘选抗α淀粉酶的Vh文库而分离的Vh (huVHAm431、 huVHAm416)的SDS-PAGE分析(箭头表示二硫键介导的二聚体VH。R 还原的；NR:非还原 的)。图8显示sensorgram叠加，其显示天然(粗线)和重折叠(细线)的huVHAm309 (A) 禾口 huVHAm416(B)以 0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、1 和 2 μ M(huVHAm309)以及 0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、 0. 5、1、2和4μ M(huVHAm416)与固定的蛋白A的结合。图9显示通过对Vh(通过针对α淀粉酶的热变性淘选法鉴定的)进行ELISA产 生的结合分析，(A)V1^i固定的α淀粉酶(点柱)和牛血清白蛋白BSA(方格柱)的结合和 (B)辣根过氧化物酶-蛋白A缀合物与固定的Vh和BSA对照的结合。在A和B中，与BSA 的结合为背景水平。图10显示确定抗α淀粉酶Vh的酶抑制活性的方面。(A) α淀粉酶活性，测量为 ΔΑ405ηπι，作为时间的函数。对于淀粉酶结合剂huVHAm302 (实心正方形)可看到明显的抑 制，对于对照Vh HVHP430(实心三角形)没有看到明显的抑制。(B)在不同浓度的抗α淀 粉酶Vh存在的情况下α淀粉酶的残留活性。只有huVHAm302在所有测试Vh浓度下起着酶 抑制剂的作用。实心正方形huVHAm302 ；空心正方形huVHAm428 ；实心圆huVHAm304 ；空 心圆huVHAm416。
9、VhH2和VhH3的大羊驼(L. glama) cDNA VhH、单峰 驼(C. dromedarius) cDNA VhH、种系VhH区段和种系Vh区段、人种系Vh区段和HVHP430文库 Vh的理论Pl分布的图。图12A显示来自美洲驼VhH⑶R3质粒文库的⑶R3序列的样品，来源于VhH2亚家 族的CDR3序列由星号标记；半胱氨酸残基以下划线标示。编号系统是由Kabat等人(1991) 描述的编号系统。图12B显示来自美洲驼VhH CDR3质粒文库的CDR3序列的样品的长度分 布；水平线表示平均CDR3长度以及中值(M)。图13显示来自HVHP430LGH3Vh噬菌体展示文库的Vh的样品的⑶R3长度分布，其 中分析了 31个Vh ；水平线表示平均CDR3长度以及中值(M)。图14显示酸性人种系Vh区段的序列。发明详述本发明涉及抗体重链可变结构域。特别地，本发明涉及非聚集性人Vh结构域和分 离其的方法。本发明包括在至少一个互补决定区中具有至少1个形成二硫键的半胱氨酸并且 具有酸性等电点的非聚集性人Vh结构域和其文库。所描述的Vh结构域还可以是可溶性的， 能够可逆热去折叠的和/或能够结合蛋白A的。Vh结构域可在CDRl中包含至少一个半胱 氨酸。所描述的Vh结构域可在⑶R3中包含至少3个半胱氨酸。Vh可展示高溶解度和/或可逆热去折叠。它们还可能能够结合蛋白A。在特定的 非限定性实施方案中，人\结构域具有低于6的等电点。本发明WVh结构域和其文库还可 在Hl/⑶Rl的位点32或Hl/⑶Rl中或Hl/⑶Rl、H2/⑶R2或H3/⑶R3中的其他位点上包含 Asp 或 Glu0如本文中所使用的，“VH结构域”或“VH”是指抗体重链可变结构域。该术语包括天 然发生的Vh结构域和已通过选择或工程改造进行了改变(以改变它们的特征，包括例如稳 定性或溶解度)的Vh结构域。该术语包括能够用作Vh结构域的同源物、衍生物或片段。如对于本领域技术人员来说是已知的，Vh结构域包括3个“互补决定区”或“⑶R”; 通常，各⑶R是可变重链内与其他⑶R组合以形成抗原结合部位的区域。在本领域内熟知的 是CDR促成抗原决定簇的结合和识别。然而，可能并非所有CDR是结合抗原所必需的。例 如，但不期望限于，1、2或3个CDR可促成本发明的Vh结构域对抗原的结合和识别。Vh结构 域的CDR在本文中称为CDR1、CDR2和CDR3。根据Kabat编号系统进行本发明的Vh结构域中氨基酸的编号，所述编号系统是 指 Kabat 等人’ Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991)巾卞艮白勺 编(compilation)用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。该系统对于本领域 技术人员来说是熟知的，并且对于给定的抗体可通过在抗体序列的与“标准”Kabat编号的 序列具有同源性的区域上进行比对来确定。根据Kabat编号，CDR的位置如下CDR1_残 基 31-35B ；CDR2-残基 50-65 ；和 CDR 3-残基 95-102。Vh结构域也以与⑶R交迭的高变区(标记为H1、H2和H3)为特征。Hl定义为残基 26-32，H2 定义为 52-56，以及 H3 定义为残基 95-102 (http //www. bioinf. org. uk/abs/)。 高变区直接参与抗原结合。
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本发明的Vh结构域和其文库在至少一个⑶R中包含至少一个形成二硫键的半胱 氨酸。术语“形成二硫键的半胱氨酸”意指通过它们的巯基的氧化与另一个半胱氨酸形成 “二硫桥”(也称为“二硫键合”或“二硫键”)的半胱氨酸。不期望受理论束缚，二硫桥帮助 蛋白质和酶保持它们的结构构型。特别地，％结构域包含典范(S卩，高度保守的)的Cys 22 与Cys 92之间的二硫键。除了该典范二硫键外，本发明的Vh包含至少1个非典范二硫键。 后者可以在Vh结构中的任何非典范位置上；例如，非典范二硫键可在构架区中，CDR中，高 变环中或其任何组合中。在一个实施方案中，存在偶数数目的形成二硫键的Cys。例如，但不期望以任何方 式限于，在⑶Rl中可存在至少一个形成二硫键的Cys ；在另一个非限定性实例中，在⑶R3 中可存在至少一个Cys ；在另一个非限定性实例中，在⑶R3中可存在至少3个Cys。Vh结构 域的形成二硫键的Cys可形成CDR内二硫键或CDR间二硫键。例如，但不期望限于，Vh的 ⑶R3中的Cys残基形成⑶R内二硫键；在另一个非限定性实例中，Vh的⑶Rl和⑶R3中的 Cys残基形成⑶R间二硫键。此外，不期望受理论束缚，本发明的Vh的⑶R中非典范二硫键可用于产生酶抑制 剂；特别地，二硫键可形成突出的⑶R环，特别地⑶R3环，用于接近隐蔽表位或酶活性部位。 也已显示非典范二硫键在单结构域抗体稳定性(Nguyen等人，2000 ；Harmsen等人，2000 ； Muyldermans等人，1994 ；Vu等人，1997 ；Diaz等人，2002)中以及在就新型拓扑学和增加的
库多样性塑造结合部位中是非常重要的。从制药观点来看，针对牵涉许多疾病状态的病理生物学的酶和蛋白酶的基于抗体 的抑制剂的产生是特别有益的。由于它们的预期较低的免疫原性、较小的尺寸、和稳定性， 人Vh结构域对于治疗应用是优良的。然而，AVh结构域在溶液中倾向于形成高分子量聚集体。此类聚集体包括不如单 体可溶的结构并且显示与其他分子或表面的非特异性相互作用(有时称为“粘性”)。Vh结 构域可形成二聚体或多聚体或高分子量聚集体，此类结构没有一种是期望的或有用的。术 语“非聚集性”是指减少的Vh结构域形成此类聚集体的倾向或Vh结构域不能形成此类聚集 体。本发明的Vh结构域是非聚集性的。这可通过在凝胶过滤柱例如但不限于Superdex 75柱上洗脱来验证，其中Vh结构域基本上是单体。“基本上是单体”是指95%、96%、97%、 98%、99%或100%的Vh结构域洗脱为单体。优选，本发明的非聚集性Vh结构域是稳定的 并且不随时间流逝而沉淀。本发明结构域和其文库还具有酸性pi。术语"pi"或"等电点"是指Vh结 构域不携带净电荷时的PH。一般地，当pH为pi时，溶解度最低。酸性等电点可低于7;例 如，酸性Pl可低于7、6、5、4、3、2或1，或其间的任何值，或在由这些值描述的范围之内；在 非限定性实例中，本发明的Vh结构域的pi低于6。中性pi是7，碱性pi高于7。不期望受 到限定，本发明的Vh结构域的酸性pi主要源于非随机化的区域，包括例如，构架区。本发明的Vh的“溶解度”是指其溶解于溶剂中的能力，如根据平衡时溶解在溶剂中 的溶质的最大量测量的。本发明WVh在单体形式上是可溶的，并且无粘性。所描述的乂11结 构域在水性缓冲液例如但不限于TriS缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液或 水中是可溶的。本发明的Vh还可展示“可逆热去折叠”。热去折叠是指温度诱导的分子从其天然折叠构象至二级去折叠构象的去折叠。如果分子可从二级去折叠构象恢复至其天然折叠构 象，那么热去折叠是可逆的。通过分子的热重折叠效率(TRE)测量可逆热去折叠。上述非 聚集性Vh结构域可显示比聚集性Vh结构域更高的TRE且更有效地重折叠成它们的天然状 态。本发明Vh去折叠所处的温度将随性质和其熔化温度而变化。通常，大多数Vdf 在高于60°C、高于85°C或高于90°C的温度下去折叠。在非限定性实例中，本发明WVh可能 能够在于高于80°C或甚至高于90°C的温度下进行延长的温育后重新获得抗原特异性。Vh还可结合蛋白A(其对于本领域技术人员来说是熟知的分子)。通常将蛋白A偶 联至其他分子而不影响抗体结合部位；例如，但不期望限于，可将蛋白A偶联至荧光染料、 酶、生物素、胶体金、放射性碘和磁性胶乳(latex)和琼脂糖珠粒。还可将蛋白A固定至固体 支持物上和用作可靠方法用于从混合物例如从血清、腹水或细菌提取物纯化免疫球蛋白， 或将其与上述分子之一偶联以检测抗体的存在。可将本发明的Vh结合蛋白A的能力用于 Vh纯化和在诊断测试、免疫印迹和免疫组织化学中用于检测。Vh结构域的文库也包括在本发明内。Vh结构域文库可包括许多种展示形式，包括 噬菌体展示、核糖体展示、微生物细胞展示、酵母展示、逆转录病毒展示或微珠展示形式或 任何其他合适的形式。本发明的Vh和天然发生的骆驼VhH和鲨鱼VNAR单结构域抗体的分析显示在展示 高溶解度和可逆热去折叠方面的类似性。通过Pl的分析(参见实施例8)，现发现骆驼VhH 库具有丰富的具有酸性Pl的克隆(53%酸性对43%碱性)。在种系克隆(单峰驼)中，Vh 库主要由具有碱性Pl的Vh区段组成，然而VhH库的情况恰好相反，其主要包含具有酸性pi 的VhH区段。目前还观察到人种系Vh库中绝大部分Vh区段(92%)是碱性的。因此，目前 已确定TVh溶解度与酸性pi之间的明确关系；虽然并非所有非聚集性Vh是酸性的，但酸性 Vh是非聚集性的。因此，可通过使用酸性支架进行文库构建和/或使随机化偏向酸性残基 和/或偏离碱性残基来增加文库中非聚集性Vh的比例。本发明的Vh结构域和其文库还可在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3中包括酸性氨基酸。 例如，但不期望限于，Vh结构域和其文库可在H1/CDR1的位点32或在H1/CDR1中或在Hl/ CDR1、H2/CDR2或H3/CDR3中其他位点上包括Asp或Glu。本发明的Vh结构域和其文库可基于本领域内已知的任何合适的Vh序列。术语“基 于”是指使用“支架”作为起始Vh结构域，通过本发明的方法获得Vh结构域。本领域技术 人员可容易地理解，虽然Vh结构域文库可基于单个支架或许多支架，但可随机化CDR/高变 环。这样，可获得大量Vh结构域，其中序列在随机化区域中变化；这在本领域内称为Vh结构 域的“库”或“文库”。Vh结构域库中的Vh结构域可各自识别相同或不同的表位。此外，本 发明的Vh结构域所基于的支架可具有非聚集性Vh结构域的一个或多个上述特征。在特定的非限定性实例中，本发明结构域基于具有酸性pi 序列。本发 明的Vh结构域可基于具有酸性pi的任何人种系序列，特别地来自Vh3家族的序列，以及更 特别地具有蛋白A结合活性的序列；例如，但不被认为是限定性的，Vh结构域可基于人种 系序列1-f Vh区段、1-24Vh区段和3-43Vh区段(参见图14 ；SEQ ID NO 182-184)。备选 地，Vh结构域可基于骆驼Vh cDNA或具有酸性pi的骆驼种系Vh区段。用作文库支架的酸 性骆驼种系Vh区段可以是本领域内已知的任何此类区段；在特定的非限定性实例中，Vh区 段可以是Nguyen等人，2000中描述的区段。在另外的备选实例中，所描述的Vh和其文库可基于骆驼VhH cDNA或具有酸性pi的骆驼种系VhH区段。用作文库支架的酸性骆驼Vh 或VhHcDNA或种系序列可以是本领域内已知的任何此类序列；例如，但不限于Harmsen等 人(2000)，Tanha等人(2002)中描述的此类序列，Nguyen等人(2000)中在具有NCBI登录 号AB091838-AB092333的VhH的库中的此类序列，或人序列的VBASE数据库中的此类序列 (Medical ResearchCounci1, Centre for Protein Engineering)。本发明的Vh结构域和其文库还可基于在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3中还包含酸性氨 基酸的支架。在非限定性实例中，支架可在Hl/⑶Rl的位点32上，或Hl/⑶Rl中或Hl/⑶R1、 H2/CDR2或H3/CDR3中的其他位点上包含Asp或Glu。本发明的Vh结构域和其文库还可基于嵌合支架；例如，但不期望限于，嵌合支架可 在人构架序列上包含一个或多个骆驼或鲨鱼⑶R/高变环序列。在特定的非限定性实例中， 嵌合支架在人Vh构架(人⑶R1/H1和⑶R2/H2)上包含骆驼⑶R3/H3环。嵌合抗体结构域 在本领域内是熟知的，用于获得它们的方法在本领域内也是熟知的。在特定的非限定性实例中，本发明提供了 Vh结构域或其文库，其中a)Vh结构域基 于HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b)保持CDR3的位点99和IOOd上的Cys ；c)随机化CDR3的剩 余14个氨基酸残基；d)随机化氨基酸残基94 ；和e)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。在 另外的非限定性实例中，提供了 Vh结构域文库，其中a)VH结构域基于HVHP430(SEQ ID NO 1) ；b)位点93-102 (93/94-CDR3)上的氨基酸残基来源于美洲驼VhH ;c)随机化CDR1/H1的 8个氨基酸残基。在另一个非限定性实例中，提供了 Vh结构域或其文库，其中a) Vh结构域 基于 HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b)CDR3 包含选自 SEQ ID NO 24-90 和 SEQ ID NO 33-63 的 序列；c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。本发明的文库中的非聚集性Vh的比例，如上所述，可以比常规文库中的大。在另一个方面，本发明的Vh结构域和其文库可以是混合的随机化文库。在该类型 的文库中，通过使用随机化的寡核苷酸和本领域内已知的方法体外产生CDR。在一个实例中，通过使用本发明的方法分离非聚集性、可重折叠的Vh。其中，3种具 有酸性pl，且2种具有形成⑶Rl-⑶R3间二硫键的⑶RlCys残基。此外，3种在它们的⑶R3 中具有一对Cys的Vh (以及亲本支架，HVHP430)形成⑶R3内二硫键。然而，在一个实施方 案中，包含横跨CDRl至CDR3的非典范二硫键的本发明的乂11在淘选的重折叠步骤中比具有 ⑶R3内二硫键或只具有Cys22与Cys92之间的典范二硫键的Vh更有效地重折叠成它们的 天然结构。因此，可在淘选的结合步骤中有利地选择此类VH。此外，大多数非聚集性的可重 折叠Vh具有低于6的理论pl，这可能是由于高于pI6 (和特别地更接近于pI7)的Vh变得 易于聚集(因为它们的净电荷接近于0)。在9种利用热变性方法分离的Vh中，4种具有最 低溶解度的Vh中，有3种具有大约7. 0(6. 4-7. 3)的pi。本发明的Vh可以是展示本文中描述的期望的特征的任何VH。在特定的非限定 性实例中，人 Vh 结构域可包括 huVHAm302(SEQ ID NO 15)、huVHAm309 (SEQ ID N0:17)、 huVHAm316(SEQ ID NO 19)、huVHAm303 (SEQID NO 164)、huVHAm304 (SEQ ID NO 16)、 huVHAm305 (SEQ ID NO 15165huVHAm307 (SEQ ID NO :166)、huVHAm311 (SEQ ID N0:167)、 huVHAm315 (SEQID NO : 18)、huVHAm301 (SEQ ID NO : 163)、huVHAm312 (SEQ ID NO: 168)、 huVHAm320 (SEQ ID NO :171)、huVHAm317 (SEQ ID NO : 170)、huVHAm313 (SEQID N0:169)、 huVHAm431 (SEQ ID NO 23)、huVHAm427 (SEQ ID NO 21)、huVHAm416 (SEQ ID NO 20)、
13huVHAm424 (SEQ ID NO 175)、huVHAm428 (SEQID NO 22)、huVHAm430 (SEQ ID NO 176)、 huVHAm406 (SEQ ID NO 172)、huVHAm412 (SEQ ID NO 173)或 huVHAm420 (SEQ ID NO : 174) 中的一个。在另一个非限定性实例中，AVh结构域或其文库包括选自SEQ ID N0:101至 131，或132-162中的任一个的序列，或选自图12A中显示的那些(SEQID NO 24-90)中的任 一个的序列，或其组合。本文中描述的Vh结构域可通过下文中描述的新方法获得。在非限定性实例中，可 从基于噬菌粒的噬菌体展示文库分离Vh结构域。使用完全合成设计的基于噬菌粒的噬菌 体展示文库，然后进行以富集具有本文中提及的期望的特性的人Vh为特征的选择是之前未 曾用于人Vh的方法。在一个实施方案中，本发明提供了通过下列步骤增加非聚集性Vh结构域的选择的 能力或效率的方法a)提供基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库，其中通过Vh结构域在噬菌体的 表面上的多价展示来产生文库；和b)使用噬菌体-Vh结构域文库和结合的靶进行淘选，其中该方法包括选择非聚集性噬菌体-Vh结构域的步骤。在一个实例中，选择步骤 可在淘选步骤之前发生，并且可包括将噬菌体-Vh结构域文库经历热变性/复性步骤。备 选地，选择步骤可在淘选后发生，并且可包括测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性Pl的VH。 在另一个备选实例中，进行热变性/复性步骤和测序步骤。例如，但不期望限于，增加非聚集性Vh结构域的选择的能力或效率的方法可包 括a)提供基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库，其中通过Vh结构域在噬菌体表 面上的多价展示来产生文库；b)将基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库经历热变性/复性步骤；和c)使用噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选。在另一个非限定性实例中，增加非聚集性Vh结构域的选择的能力或效率的方法可 包括a)提供基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库，其中通过Vh结构域在噬菌体表 面上的多价展示来产生文库；b)使用噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选；和c)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pi的Vh结构域。上述方法可包含随后的淘选轮次；例如，可进行2、3、4、5、6、7、8、9或10轮淘选。所 述方法还可包括通过扩增编码Vh结构域的核酸序列；将扩增的核酸序列克隆入表达载体； 在允许编码Vh结构域的核酸表达的条件下用表达载体转化宿主细胞；和回收具有期望的特 异性的Vh结构域来分离特定的Vh结构域。可通过本领域内已知的任何方法制备基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库。 例如，但不期望限于，可通过下列来制备文库将噬菌粒(各自包含编码Vh结构域的核酸) 插入细菌种类；将细菌种类与hyperphage接触，并且将细菌种类经历用于感染的条件；和， 将噬菌粒插入的和hyperphage-感染的细菌种类经历用于产生噬菌体_VH结构域文库的条 件。
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用于本发明的方法的“噬菌粒”是通过修饰质粒衍生的载体，其包含噬菌体的复制 起点以及质粒复制起点。噬菌粒包含丝状噬菌体gill或其片段；在该实例中，编码Vh结构 域的核酸以与全长或截断的gin产物(PlII)融合的形式表达并且通过PlII在噬菌体颗 粒上展示。噬菌粒还包含编码Vh结构域的核酸；各噬菌粒可包含编码Vh结构域的库的不同 成员的核酸。噬菌粒至细菌种类的插入可通过本领域内已知的任何方法来进行。噬菌粒中编码的Vh结构域可基于任何合适的Vh序列。Vh结构域支架可以是本领 域内已知的任何合适的支架。在特定的非限定性实例中，本发明WVh结构域基于具有酸性 Pl的\序列。本发明的Vh结构域可基于具有酸性Pl的任何已知的人种系序列，特别地来 自VH3家族的序列，和更特别地具有蛋白A结合活性的序列；例如，但不被认为是限定性的， Vh结构域可基于人种系序列l_fVH区段，1-24Vh区段和3-43Vh区段(参见图14)。备选地， Vh结构域可基于骆驼Vh cDNA或具有酸性pi的骆驼种系Vh区段。用作文库支架的酸性骆驼 种系Vh区段可以是本领域内已知的任何此类区段；在特定的非限定性实例中，Vh区段可以 是Nguyen等人，2000中描述区段。在另一个备选实例中，所描述的Vh和其文库可基于 骆驼VhH cDNA或具有酸性pi的骆驼种系VhH区段。用作文库支架的酸性骆驼VhH cDNA可 以是本领域内已知的任何此类cDNA ；例如，但不限于，VH区段可以是Harmsen等人(2000)， Tanha等人(2002)中描述的Vh区段，具有NCBI登录号AB091838-AB092333的VhH的库中 的Vh区段或Nguyen等人(2000)中的Vh区段。上文中描述了 Vh结构域可基于的各种其他 支架。如本领域技术人员所公认的，虽然文库中Vh结构域可基于支架，但由于选择的区域 的随机化，大量不同的Vh结构域存在于文库中。本发明的文库中非聚集性Vh的比例可比常 规文库中的大。可将噬菌粒插入任何合适的细菌种类和株系；本领域技术人员熟悉此类细菌种类 和株系。不期望受到限定，细菌种类可以是例如大肠杆菌(E.coli)；在另一个非限定性实 例中，大肠杆菌株系可以是TGl、XLl-blue、SURE、T0P10F，、XLl-Blue MRF，或 ABLE K。用 于将噬菌粒插入细菌种类的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。在如上文中刚刚描述的本发明的方法中，通过Vh结构域在噬菌体表面上的多价展 示来产生使用的文库。这可通过将已将噬菌粒插入其中的细菌种类与hyperphage接触，然 后将细菌种类经历用于感染的条件来实现。“Hyperphage”是一种类型的辅助噬菌体，其具有野生型pill表型，从而能够以高 效率感染F(+)大肠杆菌细胞；然而，它们的功能性pill基因的缺乏意味着噬菌粒编码的 PiII-抗体融合物在噬菌体组装中是PiII的唯一来源。这导致在它们的表面上携带抗体片 段的噬菌体颗粒的比例有相当大的增加和导致噬菌体颗粒多价展示抗体片段。在一个非限 定性实例中，hyperphage可以是Μ13Κ07ΔρΙΙΙ。然而，其他合适的同源物可用于本发明的 方法；例如，但不期望以任何方式限于，Ex-phage (Baek等人，2002)或Phaberge(Sc)Ites等 人，2003)。hyperphage感染细菌种类的条件在本领域内是熟知的；例如，但不期望以任何方 式限于，所述条件可以是Arbabi-Ghahroudi，等人(2008)或Rondot等人(2001)中描述的 条件，或适合于hyperphage感染细菌的任何其他条件。然后将感染的细菌种类经历用于产生噬菌体-Vh结构域文库的条件。此类条件 在本领域内是熟知的；例如，但不期望限于，合适的条件描述于(Arbabi-Ghahroudi，等人，
152008 ；Harrison，等人，1996)中。在本发明的方法中，使用噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选。如对于本领域技 术人员来说是已知的，“淘选”是指其中将丝状噬菌体展示的抗体文库(例如，本发明的噬 菌体-Vh结构域文库)的库暴露于目的靶(或“抗原”)的过程。靶可以是固定的或可获得 的，或可在固体表面上，溶液中，细胞表面上，或可以是任何其他合适的形式。可通过不同方 法包括用含有去垢剂例如Tween 20的缓冲液充分清洗来去除非结合的噬菌体-抗体；备选 地，可利用链霉抗生物素蛋白磁珠捕获出结合至生物素化的靶的噬菌体。然后可利用本领 域内熟知的方法从靶中洗脱结合的噬菌体_抗体。然后可在F+细菌宿主中扩增(繁殖) 洗脱的噬菌体抗体。可在1轮或多于1轮的淘选中进行选择和扩增的过程；例如，可进行 2，3，4，5，6，7，8，9或10轮淘选。这导致抗体-噬菌体结合剂至靶的特异性富集和导致单 特异性抗体(例如Vh结构域)的分离。用于淘选的条件对于本领域技术人员来说是熟知 的；例如，条件可以是Marks等人(1991)，Griffiths等人(1994)，或Sidhu等人(2004)， Hoogenboom(2002)，Bradbury (2004)中描述的条件或任何其他合适的条件。用于淘选步骤的“靶”可以是任何合适的选择的靶。例如，靶可以是大体上纯化的 抗原、缀合至分子例如生物素或类似分子的抗原、部分纯化的抗原、细胞、组织；靶还可以是 固定的或可获得的，或可在固体表面上，在溶液中，在细胞表面上或可以是任何其他合适形 式(参见HOOgenbOOm，2005)。抗原与例如生物素的缀合使得选择步骤容易进行和更有效， 和需要低得多的量的纯化抗原。还可基于所得的基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库或 Vh结构域的期望的特异性选择靶。靶可以是任何类型的目的分子；例如，靶可以是酶、细胞 表面抗原、TNF、白细胞介素、ICAM家族中的分子等。本领域技术人员将容易地理解，通过本 文中描述的方法获得的Vh结构域文库可被导向任何目的靶或具有治疗重要性的靶。例如， 但不期望以任何方式进行限定，酶可以是α淀粉酶、碳酸酐酶或溶菌酶。本发明的方法还可包括选择非聚集性噬菌体-Vh结构域的步骤。在一个实施方案中，选择步骤可在淘选步骤之前发生并且可包括将噬菌体-Vh结 构域文库经历热变性/复性步骤。该步骤包括Vh结构域的热去折叠，随后重折叠成它们的 天然构象，并且可通过本领域内已知的任何方法来进行；参见例如Jespers等人(2004)。 例如，但不期望限于，可将噬菌体-Vh结构域文库在大约55°C至大约90°C的范围内的温度 下经历变性；温度可以是55、60、65、70、75、80、85或90°C，或其间的任何温度。在一个实施 方案中，噬菌体-Vh结构域文库保持在该升高的温度下，进行大约1分钟至大约30分钟的 范围内的时间；例如但不期望限于，温度可保持1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 分钟，或其间的任何时间。然后，通过 将温度返回至更低的温度，例如室温或更低，4或5°C (进行与用于变性的时间相似的时间) 来将噬菌体-Vh结构域文库经历复性。本领域技术人员公认，噬菌体-Vh结构域文库中Vh 变性所处的温度将取决于Vh结构域的性质和它们的熔化温度。此外，本领域技术人员将理 解，在一些实施方案中，可将更高的变性温度与更短的暴露时间组合；类似地在其他实施方 案中，可将更低的变性温度与更长的暴露时间组合。可以在本领域内已知的任何合适的水 性缓冲液中进行变性/复性步骤；例如，但不期望以任何方式进行限定，缓冲液可以是Tris 缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液或水。在另一个实施方案中，该方法可包括测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性Pl的Vh
16的步骤。非聚集性Vh结构域的该筛选步骤基于可通过本领域内已知的任何方法确定的理论 Pl值。例如，但不期望限于，可利用可商购获得的软件包确定理论pi。如之前所描述的，本 发明已显示具有酸性Pl WVh可以是可溶性的和非聚集性的。基于只通过DNA测序获得的 Pl值从聚集性Vh中筛选非聚集性Vh结构域避免了对大量Vh的亚克隆、表达、纯化和生物物 理学表征的需要。在另外的实施方案中，进行热变性/复性步骤和测序步骤。本文中描述的方法还可包括通过下列来分离特定Vh结构域扩增编码回收的噬菌 体-Vh结构域中的Vh结构域的核酸序列；将扩增的核酸序列克隆入表达载体；在允许编码 Vh结构域的核酸表达的条件下用表达载体转化宿主细胞；和回收具有期望的特异性的Vh结 构域。用于进行此类步骤的方法和特定条件对于本领域技术人员来说是熟知的。上述方法是使用基于噬菌粒载体的噬菌体展示(通过使用hyperphage产生)和 基于热变性或理论Pl的分析的选择步骤的新型组合。该新型方法可增加选择非聚集性人 Vh的效率。在非限定性实例中，本方法可选择包含非典范二硫键的Vh结构域，如上文所描 述的；不期望限于，非典范二硫键可在⑶Rl和/或⑶R3中发生。在另一个实例中，上述方 法可选择具有酸性Pl的Vh结构域。与基于噬菌体载体的系统相比较，本方法的基于噬菌粒载体的噬菌体展示系统提 供了许多有利方面，包括使构建大文库(其在非免疫文库的情况下是期望的)变得容易； 适合于从免疫或亲和力成熟文库中分离高亲和力结合剂；使用于提高亲和力或生物物理学 性质的操作变得容易；和易于从抗体-pin融合物转换至未融合的抗体片段(以进行快速 抗体表达和分析)。此外，在本发明的方法中导致多价展示(Rondot等人，2001 ；Baek,H.等 人，2002 ;Soltes，G.等人，2003)的辅助噬菌体，例如，hyperphage (M13K07 Δ pill)的使 用，提供了由基于噬菌体载体的展示系统给予的有利方面(由于亲合力效应)，包括结合 剂的高产率和淘选的更少轮次(0' Cormell等人，2002)；抗细胞表面抗原的抗体的更有效 富集；和用于选择针对需要自交联的细胞表面受体的抗体的适合性(Becerril等人，1999 ； Huie等人，2001)。此外，对于噬菌粒载体系统，可通过使用合适类型的辅助噬菌体容易地进 行单价与多价形式之间的转换(Rondot等人，2001 ；0' Connell等人，2002 ；Kirsch等人， 2005)。为了进一步利用基于噬菌粒的文库在选择非聚集性Vh方面提供的有利方面，我们 决定使用hyperphage技术(Rondot等人，2001)以使上述热变性策略(Jespers等人，2004) 适应于基于噬菌粒的文库。在另一个实施方案中，本发明提供了通过下列步骤增加非聚集性Vh结构域的选择 的能力或效率的方法，包括a)提供基于噬菌体载体的Vh结构域噬菌体展示文库，其中基于具有酸性pi的Vh 结构域支架产生文库；b)使用噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选；和c)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pi的Vh结构域可通过本领域内已知的任何方法制备基于噬菌体载体的Vh结构域噬菌体展示文 库。例如，但不期望限于，可通过下列来制备文库将噬菌体载体(各自包含编码Vh结构域 的核酸)插入细菌种类；和，将噬菌体载体-插入的细菌种类经历用于产生噬菌体-Vh结构 域文库的条件。
“噬菌体载体"是指通过修饰噬菌体基因组衍生的载体，其包括噬菌体的复制起 点但不包括质粒的复制起点；噬菌体载体可以具有或可以不具有抗生素抗性标记。用于产生基于噬菌体载体的噬菌体展示文库的方法在本领域内已良好建立，并且 对于本领域技术人员来说是熟知的。本文中描述的方法还可包括通过下列来分离特定结构域扩增编码回收的噬 菌体-Vh结构域中的Vh结构域的核酸序列；将扩增的核酸序列克隆入表达载体；在允许编 码Vh结构域的核酸表达的条件下用表达载体转化宿主细胞；和回收具有期望的特异性的Vh 结构域。用于进行这些步骤的方法和特定条件对于本领域技术人员来说是熟知的。本发明还涉及融合至货物分子(cargo molecule)的本发明的Vh。如本文中所使用 的，“货物分子”是指为了靶向、增加亲和力、提供第二功能或否则提供有益效应的目的的任 何分子。货物分子可具有与本发明的\相同或不同的特异性。例如，但不期望限于，货物分 子可以是毒素、抗体的Fc区域、完整抗体或酶(如在抗体导向的酶前体药物疗法(ADEPT) 的背景中(Bagshawe，1987:2006))；具有相同或不同特异性的一种或多于一种的单结构域 例如VH、\、VhH、VNAR等；用于靶向的药物递送的脂质体；治疗性分子，放射性同位素；或提 供期望的作用的任何其他分子。将货物分子偶联或附着至本发明的VH结构域的方法对于 本领域技术人员来说是熟知的。本发明的方法和Vh结构域文库不必限于噬菌体展示技术，其还可扩展至其他形 式。例如，但不期望限于，本发明的方法和Vh结构域文库可以是核糖体和mRNA展示、微生 物细胞展示、逆转录病毒展示、微珠展示等(参见HOOgenbOOm，2005)。用于进行这些类型的 展示方法的条件在本领域内是熟知的。还可以以多聚体形式重组产生本发明的VH;在非限定性实例中，Vh可产生为二聚 体、三聚体、五聚体等。以多聚体形式存在的本发明WVh的提供可增加Vh的亲和力。存在 于多聚体形式中的单体单位可具有相同的或不同的特异性。本发明还包括编码本发明的Vh的核酸。如本文中所使用的，“核酸”或“多核苷酸” 包括核酸、寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸和其任何片段、变体或衍生物。核酸或多核苷酸可以 是双链的、单链的或三链的DNA或RNA(包括cDNA)或遗传或合成来源的DNA-RNA杂交体， 其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合以及碱基包括但不限于腺嘌呤、胸 腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、肌苷、黄嘌呤和次黄嘌呤的任何组合。可将核酸或多核苷 酸与碳水化合物、脂质、蛋白质或其他材料组合。可使用本领域技术人员已知的多种技术 之一(包括但不限于具有相应于目的核苷酸序列的部分序列的序列或其变异序列的寡核 苷酸的自动化合成)，利用可商购获得的寡核苷酸合成仪例如AppliedBiosys terns Model 392 DNA/RNA合成仪来化学合成目的核酸序列。本发明的核酸还可包含在载体中。可使用任何合适的载体，并且本领域技术 人员对该主题十分熟悉。本发明还提供了包含上述核酸或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何合适的宿 主细胞，例如，但不限于大肠杆菌或酵母细胞。合适的大肠杆菌株系的非限定性特定实例 是TG1、BL21(DE3)和 BL21 (DE3) pLysS。本发明的Vh结构域可具有对于临床和诊断应用来说是期望的特性。在一个实施 方案中，可使用可检测的标志物或标记来标记VH。可使用多种标记技术之一(包括本领
18域内已知的过氧化物酶、化学发光标记以及本领域内已知的放射性标记)来进行抗体的标 记。本发明的可检测的标志物或标记可以是例如非放射性或荧光标志物例如生物素、荧光 素(FITC)、吖啶、胆固醇或羧基-X-罗丹明，其可使用本领域内已知的荧光和其他成像技术 来检测。备选地，可检测的标志物或标记可以是放射性标志物包括例如，放射性同位素。放 射性同位素可以是发射可检测的辐射的任何同位素。由放射性同位素发射的放射性可通过 本领域内熟知的技术来检测。例如，来自放射性同位素的Y发射可使用Y成像技术，特别 地闪烁成像技术来检测。此外，还可通过与绿色荧光蛋白(GFP)、RFP、YFP等的融合来进行 检测。本发明还可用于高通量筛选测定例如微阵列技术，其中Vh结构域的使用是有 利的或提供了与常规IgG相比有用的另一选择。在另一个方面，本发明提供了以将其结合至抗原的有效量包含一种或多于一种的 Vh和可药用的赋形剂的药物组合物。合适的药物赋形剂对于本领域技术人员来说是熟知 的。在另外的实施方案中，本发明提供了治疗患者的方法，包括给需要治疗的患者施 用包含一种或多种Vh的药物组合物。对于本领域技术人员来说，很显然的是文库例如本文 中公开的文库可以是靶的结合剂的来源。因此，它们可用于治疗、诊断和检测。可被本发明 的Vh结构域靶向的适应症是癌症(用于肿瘤标志物的检测和/或任何癌症的治疗)、炎性 疾病(其包括通过抗体调节靶分子、杀死靶细胞、阻断分子相互作用)、自身免疫疾病(例 如，狼疮、类风湿性关节炎等)、神经退行性疾病(例如帕金森氏病、阿尔茨海默病等)、由朊 病毒、病毒、细菌和真菌因子引起的感染性疾病或，一般地由任何已知的或未知的微生物或 因子引起的感染导致的任何感染性疾病。靶可包括特异于给定的疾病状态的任何分子。例 如，但不期望以任何方式限定，靶可包括细胞表面抗原、酶、TNF、白细胞介素、ICAM家族中 的分子等。根据本发明获得的文库还可用于获得用于检测病原体的Vh结构域。病原体可 包括人、动物或植物病原体例如细菌、真细菌、古细菌、真核微生物(例如，原生动物、真菌、 酵母和霉菌)、朊病毒、病毒和生物毒素(例如，细菌或真菌毒素或植物凝集素)。本领域技 术人员易于理解，通过本文中描述的方法获得的Vh结构域文库可被导向任何目的靶。在非 限定性实例中，靶可以是酶；在另外的实例中，但不期望限于，酶可以是溶菌酶、α淀粉酶 或碳酸酐酶。在另一个方面，本发明预期提供可用于检测和确定一种或多于一种的Vh与生物学 样品中特定抗原的结合的试剂盒。试剂盒包括一种或多于一种的Vh和一种或多种试剂。可 标记一种或多于一种的Vh结构域。此外，试剂盒还可包含阳性对照试剂。还可包括试剂盒 的使用说明书。本发明的Vh结构域还可用于抗体微阵列技术。该技术是常规免疫测定的另一选 择，并且可平行进行数千个测定。抗体Vh结构域在该类型的测定中优于完整IgG，因为它们 是小的、稳定的且高特异性的试剂。用于抗体微阵列的方法在本领域内是熟知的。本发明将在下列实施例中得到进一步说明。然而，应理解，这些实施例仅用于说明 目的并且不应当用于以任何方式限定本发明的范围。实施例除非另外指出，否则使用标准克隆技术(Sambrook等人，1989)进行分子 生物学工作。通过引入第二非相容性Sfi I位点和6个His密码子来修饰噬菌粒 pHEN4 (Arbabi-Ghahroudi等人，1997)。将称为pMEDl的新型载体用于噬菌体展示文库的构 建。将PSJF2H质粒用于单结构域抗体在大肠杆菌中的可溶性表达。除了其以与His6而非 His5融合的形式表达蛋白质外，PSJF2H与pSJF2 (Tanha等人，2003)相同。实施例1 :HVHP430 Vh文库的构建构建完全合成的基于噬菌粒的人Vh噬菌体展示文库。当在HVHP430支架(图2k, SEQ ID NO 1)上构建Vh文库时，保持2个CDR3 Cys以促进 CDR内二硫键的形成，从而增加文库中酶抑制性Vh的频率。随机化剩余的14个CDR3位点、位点 94以及8个H1/CDR1位点(图2A)。让CDR2保持不变，因为已显示其参与蛋白A结合(Randen 等人，1993 ；Bond等人，2003)。除此以外，缺乏CDR2的VNAR(Stanfield等人，2004)或利用它们 的CDRl和CDR3 (Decanniere等人，1999)或只利用CDR3 (Desmyter等人，2001)进行抗原识别的 路马它VhH显示纳摩尔的亲和力。按照图2B中显示的方案用噬菌粒载体(图3)构建文库。将人Vh HVHP430 (其在CDR3中在位点99和IOOd上具有2个Cys残基)(To等人， 2005)用作构架以通过随机化⑶Rl和⑶R3中以及位点94上的残基构建文库。使用含有 HVHP430基因的质粒(作为模板)和弓丨物对HVHBR1-R/HVHFR2_F和HVHBR3-R/HVHFR5_F (关 于使用的引物的列表，参见表1)，利用标准聚合酶链式反应(PCR)构建了 2个分别具有随机 化的Hl/⑶Rl和94/⑶R3密码子的交迭片段。表1.用于Vh克隆的引物的列表。
权利要求
非聚集性VH结构域或其文库，所述VH结构域在至少一个互补决定区(CDR)中包含至少一个形成二硫键的半胱氨酸，并且包括酸性等电点(pI)。
2.权利要求1的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域是可溶性的，能够可 逆热去折叠，和/或能够结合蛋白A。
3.权利要求1或2的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述乂11结构域在CDRl中包含 至少一个形成二硫键的半胱氨酸。
4.权利要求1至3的任一项的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域在CDR3 中包含至少3个形成二硫键的半胱氨酸。
5.权利要求3或4的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域在1个CDR内 或⑶R之间包含非典范二硫键。
6.权利要求5的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域包含通过CDR内或 CDR间非典范二硫键形成的伸出的环。
7.权利要求1至6的任一项的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域包含 存在于CDRl的位点32上的酸性氨基酸残基。
8.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述￥11结构域包括低于6的等电点ο
9.权利要求1的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述￥11结构域包含选自SEQID NO 24-90，SEQ ID NO :101_131，SEQ ID NO 132-162 的任一个和其组合的序列。
10.权利要求1的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域包含人构架序列和 至少一个来自不同物种的⑶R。
11.权利要求10的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域包含人构架序列、 人 CDR1/H1、人 CDR2/H2 和骆驼 CDR3/H3。
12.权利要求1的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域包含混合的随机化 的序列。
13.权利要求1的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域是酶抑制剂。
14.权利要求1的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述￥11结构域基于人种系序列1-f Vh区段、1_24Vh区段和3-43Vh区段。
15.权利要求1的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述Vh结构域基于具有酸性pi的 人种系序列、骆驼VhcDNA、具有酸性pi的骆驼种系Vh区段、骆驼VhH cDNA或具有酸性pi的 骆驼种系VhH区段。
16.权利要求1的非聚集性Vh结构域或其文库，其中所述￥11结构域是huVHAm302、 huVHAm309、huVHAm316、huVHAm303、huVHAm304、huVHAm305、huVHAm307、huVHAm311、 huVHAm315、huVHAm301、huVHAm312、huVHAm320、huVHAm317、huVHAm313、huVHAm431、 huVHAm427、huVHAm416、huVHAm424、huVHAm428、huVHAm430、huVHAm406、huVHAm412 和 huVHAm420 中的一个。
17.权利要求1至9的任一项的非聚集性Vh结构域或其文库，其中从基于噬菌粒的噬 菌体展示文库分离所述Vh结构域。
18.权利要求1至9的任一项的非聚集性Vh结构域或其文库，其中通过选择步骤从基 于噬菌粒的噬菌体展示文库分离所述Vh结构域，所述选择步骤增强对非聚集性Vh结构域的选择的能力或效率。
19.增加对非聚集性Vh结构域的选择的能力或效率的方法，包括a)提供基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库，其中通过Vh结构域在噬菌体表面上 的多价展示来产生所述文库；和b)使用所述噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选，其中所述方法包括选择非聚集性噬菌体-Vh结构域的步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述选择步骤是在淘选步骤(步骤b))之前发生的将噬 菌体-Vh结构域文库经历热变性/复性的步骤。
21.权利要求19或20的方法，其中所述选择步骤是在淘选步骤(步骤b))后发生的测 定单个克隆的序列以鉴定具有酸性Pl的Vh的步骤。
22.权利要求19的方法，其包括a)提供基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库，其中通过Vh结构域在噬菌体表面上 的多价展示来产生所述文库；b)将所述基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库经历热变性/复性步骤；和c)使用所述噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选。
23.权利要求19的方法，其包括a)提供基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展示文库，其中通过Vh结构域在噬菌体表面上 的多价展示来产生所述文库；b)使用所述噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选；和c)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pi的Vh结构域。
24.权利要求19至23的任一项的方法，其还包括从基于噬菌粒的Vh结构域噬菌体展 示文库分离特定Vh结构域的步骤。
25.增加对非聚集性Vh结构域的选择的能力或效率的方法，包括a)提供基于噬菌体载体的Vh结构域噬菌体展示文库，其中基于具有酸性pi的Vh结构 域支架产生所述文库；b)使用所述噬菌体-Vh结构域文库和靶进行淘选；和c)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pi的Vh结构域。
26.权利要求25的方法，其中所述Vh结构域支架基于具有酸性pi的人种系序列、骆驼 Vh cDNA、具有酸性pi的骆驼种系Vh区段、骆驼VhH cDNA或具有酸性pi的骆驼种系VhH区 段。
27.权利要求25的方法，其还包括从基于噬菌体载体的Vh结构域噬菌体展示文库分离 特定Vh结构域的步骤。
28.编码权利要求1至18的任一项的Vh结构域的核酸。
29.包含权利要求28的核酸的载体。
30.包含权利要求28的核酸或权利要求29的载体的宿主细胞。
31.药物组合物，其包含有效量的用于结合抗原的一种或多于一种的权利要求1至18 的任一项的Vh结构域，和可药用的赋形剂。
32.权利要求1至18的任一项的￥11结构域或其文库在制备药剂中的用途，所述药剂用 于通过与抗原结合来治疗或预防医学病状。
33.治疗患者的方法，其包括给需要治疗的患者施用包含一种或多于一种的权利要求 1至18的任一项的Vh结构域的药物组合物。
34.试剂盒，其包括一种或多于一种的权利要求1至18的任一项的Vh结构域和一种或 多种试剂，其用于检测和确定所述一种或多于一种的Vh结构域与生物学样品中特定抗原的纟口口。
35.权利要求1至18的任一项的Vh结构域在用于分析样品的高通量筛选测定中的用途。
36.Vh结构域或其文库，其中a)所述Vh结构域基于HVHP430(SEQ IDNO 1) ；b)保持CDR3 的位点99和IOOd上的Cys ；c)随机化CDR3的剩余的14个氨基酸残基；d)随机化氨基酸 残基94 ；和e)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
37.Vh结构域文库，其中a)所述Vh结构域基于HVHP430 (SEQ IDNO 1) ；b)在位点 93-102 (93/94-⑶R3)上的氨基酸残基来源于美洲驼VhH ;c)随机化⑶R1/H1的8个氨基酸 残基。
38.Vh结构域或其文库，其中a)所述Vh结构域基于HVHP430(SEQ IDNO 1) ；b)CDR3包 含选自SEQ ID NO 24-90和SEQ ID NO :33_63的序列；c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
39.权利要求1-18或36-38的任一项的Vh结构域或其文库，其偶联至货物分子，或用 可检测的标记或标志物进行标记。
全文摘要
本发明涉及非聚集性VH结构域或其文库。VH结构域在至少一个互补决定区(CDR)中包含至少一个形成二硫键的半胱氨酸和酸性等电点(pI)。增加对非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法包括结合选择非聚集性噬菌体-VH结构域的步骤淘选基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库。还提供了包含非聚集性VH结构域的物质的组合物以及使用方法。
文档编号C40B40/10GK101939333SQ200880125344
公开日2011年1月5日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月21日
发明者J·坦纳, M·阿巴比-格赫劳迪 申请人:加拿大国家研究委员会