专利名称：一种高效的脂肪酶基因定向进化方法
技术领域：
本发明利用酿酒酵母同源重组结合微生物细胞表面展示技术，建立高效的 脂肪酶基因定向进化方法，涉及酶基因定向进化、分子改造的技术，属于生物 技术领域。
背景技术：
酶基因定向进化是改善酶的酶学性质最为有效的方法之一。90年代的DNA 改组技术开创了定向分子进化的新纪元。DNA改组是指DNA分子的体外重组， 是基因在分子水平上进行的有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有的 核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。
常规DNA改组技术及随后进过改进的技术虽然可以有效地提高目的基因的 突变频率，但其所有的腦A分子实验操作步骤均是在活体生物细胞外借助PCR 技术进行，而且所得到的突变体还必须要有效转化进入活体宿主细胞中才能实 现筛选，实验操作步骤繁琐，限制了突变体的高通量筛选。
定向进化可以分为随机突变(突变体获得)和定向选择(突变体筛选)两 个阶段，定向进化技术发展到今天，突变体的获得不再是限制其发展的因素， 目前通过错误倾向PCR、 DNA shuffling等技术可以非常有效的获得突变体，然
后一般利用大肠杆菌为宿主进行突变体文库构建。相关文献报道，很多酶在大 肠杆菌中往往以包涵体的形式表达，这样以大肠杆菌为宿主构建的突变文库就 难以实现高通量筛选。值得指出的是，无论是哪种DNA改组技术，其效果必须 由改组后基因表达产物的功能来进行验证。因此，灵敏可靠的选择或筛选方法 是DNA改组技术成功与否的关键。特别是针对脂肪酶基因的定向进化，获得突 变体文库后必须要使这些突变体能有效表达得到有活性的脂肪酶，才能实现突 变体的高通量筛选，因此高效的表达突变文库构建是脂肪酶分子定向进化的关 键所在。
目前脂肪酶基因的定向进化主要分突变体获得和突变体表达两步进行。突 变体获得的方法有错误倾向PCR、 DNA shuffing等常规技术，所采用的方法均 无法回避细胞外的DNA操作，实验步骤复杂。突变体的表达方面，所采用的表 达系统主要是大肠杆菌表达系统，很多脂肪酶在此系统中均无法实现分泌表达， 或表达得到的是无生物学活性的包涵体。这样就不能进行直接有效的突变体筛 选，更不可能进行突变体的高通量筛选。需要进行细胞破碎、包涵体的变(复)
4性分离得到脂肪酶，然后进行突变体筛选，所涉及的步骤复杂繁琐，难以实现 突变体的高通量筛选。
发明内容
本发明的目的是提出一种利用酿酒酵母同源重组的特性结合微生物细胞表
面展示技术，将不同来源的脂肪酶基因在细胞内实现活体DNA重组得到突变体， 并同时将各种突变体在微生物细胞表两展示表达得到有生物活性的脂肪酶。本 发明将常规定向进化技术中突变文库的构建和突变体的表达实现同步，克服现 有技术中脂肪酶分子定向进化操作步骤复杂、突变体筛选困难等缺点。本方法 亦可应用于其他酶分子的定向进化。
以下是实现本发明目的的技术路线
1. 酿酒酵母展示表达载体构建利用酵母细胞Flop膜蛋白或a-凝聚素、 a-凝聚素、等膜蛋白构建适合脂肪酶表达的展示表达载体。
2. 脂肪酶酿酒酵母展示表达重组质粒构建利用酿酒酵母展示表达载体， 构建不同来源的脂肪酶基因(具有一定同源性)在酿酒酵母中展示表达 的重组载体。 '
3. 带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得及表达突变文库的构建根据展 示表达载体序列设计引物，PCR扩增带有酿酒酵母展示表达载体同源序 列的不同来源脂肪酶基因片段；将带有载体同源序列的脂肪酶基因片段 与线性化的展示表达载体混合，转化酿酒酵母，得到表达突变文库。
4. 展示表达突变文库及突变体分析不同来源的脂肪酶基因在酿酒酵母中
实现同源重组，得到展示表达突变文库，如图1示意。(具体操作详见实 施实例)
本发明利用同源的核酸序列在酿酒酵母中可以发生同源重组的这一特性，
将不同来源的脂肪酶基因(具有一定的序列同源性)利用酿酒酵母展示表达载
体导入酿酒酵母细胞，使这些脂肪酶基因在酿酒酵母细胞内实现同源重组得到
突变体，同时这些突变体可以有效地展示表达在酿酒酵母细胞表面，得到有活
性的脂肪酶。这样即避免了常规基因定向进化中复杂的细胞外基因操作，同时
又可以实现各种突变体基因在酿酒酵母细胞表面的展示表达，便于突变体的高
通量筛选，从而实现脂肪酶基因在细胞内的活体定向进化。这种方法首次利用 酿酒酵母同源重组的性质结合微生物细胞表面展示技术构建表达突变文库，进
行细胞内活体DNA改组(f/7-wVo DNA shuffling),省去了基因的核酸酶消化、 有性PCR产生突变体等DNA分子的体外操作，而且使突变体同步实现展示表达， 大大提高了脂肪酶分子定向进化的效率，为实现酶定向进化中突变体的高通量 筛选开辟新的技术路线。本发明获得杂合脂肪酶基因7//7必>7，其编码的脂肪酶突变体同时实现了在酿酒酵母细胞表面的展示表达，得到全细胞脂肪酶。脂 肪酶突变体酶学性质较其亲本有所改善，可以应用于脂肪酶催化的各种生物催 化反应。
图l、不同的酶基因在酵母中同源重组示意，
图2、酿酒酵母展示表达载体pLHJ042图谱，
图3、重组质粒pLHJ044图谱，
图4、重组质粒pLHJ042-B68图谱，
图5、重组质粒pLHJ052图谱，
图6、重组质粒pLHJ053图谱，
图7、重组子橄榄油底物平板活性检测，
图8、脂肪酶基因与7j'a/似的序列比较，
图9、月旨肪酶基因hX&r7与7iA7^的序列比较，
图10、脂肪酶基因7&必>7与7/p浙《的序列比较，
图11、脂肪酶基因7&必>7与h》M 的序列比较，
图12、脂肪酶基因h》H7序列来源，
具体实施例方式
下面结合具体实例对本发明作进一步阐述,但实施实例不限制本发明的保护范闺，具体实施实例如下 实施实例l: Fl叩膜蛋白介导的酿酒酵母展示载体的构建
蛋白Flolp是在51 cereKJ'w'ae中由凡W基因编码一个类似凝聚素的细 胞壁蛋白，根据已报道的凡W基因(GenBank NO. NC—001133)全序列，设计Flolp 的凝絮功能区编码序列的引物F0Lf-Hind III和FOLr"Bgl II (F0Lf-Hind III: 5， 一acat朋gc"atgacaatgcctcatcgctatatgtttttg"3， FOLr—Bgl II: 5, -gata辟t"ggtgatttgtcctgaagatgatgatgacaaa-3，)， 以酿酒酵母 S ATCC 60715的总DM为模板PCR扩增得到Flolp的凝絮功能区编 码序列片断，将此片断经历Vxi III、 1I双酶切后与经历73d III、I双 酶切的酿酒酵母表达载体pYES2/NT在T4 DNA连接酶作用下连接(餘J II与M I互为同尾酶)，得到以Flolp凝絮功能区为介导锚合蛋白的酿酒酵母展示表达 载体pLHJ042，如图2。
实施实例2:脂肪籌基因酿酒酵母展示表达重组质粒的构建 2. 1、荧光假单孢菌来源脂肪酶基因酿酒酵母展示表达载体构建 以脂肪酶基因"/7丑5^ (Genbank NO. AY623009)序列设计其全长基因引物 LipB52Pf (5， 一 aaa^朋"cccaacaLaaaagagaggcaacagcaatg—3， )、 LipB52Pr(5， -aaa^c叙ccgctccctccccacccttgtcgtcagg-3，)， 以尸./!/woresce/7s B52 基因组DNA为模板PCR扩增得到W/^5i"全长基因片段，此片断纯化后用限制性 内切酶&o Rl、 tV" I双酶切，胶回收双酶切的h'/^忍基因片段与经&o Rl、
I双酶切的酿酒酵母展示表达载体pLHJ042在T4 DNA连接酶作用下连接， 得到"/^5^基因酿酒酵母展示表达质粒pLHJ044,如图3。
按照上述类似的流程构建得到脂肪酶基因h'p5^(GenBankN0. AY694785) 的酿酒酵母展示表达重组质粒pLHJ042-B68，如图4。
2.2环境样品(不可培养微生物)来源脂肪酶基因酿酒酵母展示表达载体
构建
将含脂肪酶基因(GenBank NO. AY673674)的质粒用限制性内切 酶fco Rl、 I双酶切，胶回收h'A/必基因片段与经&o Rl、 lot I双酶切的 酿酒酵母展示表达载体pLHJ042在T4 DNA连接酶作用下连接，得到7&/0 基 因酿酒酵母展示表达质粒pLHJ052，如图5。
与上述流程类似，将含脂肪酶基因h'A/ft (GenBank NO. AY700013)的质 粒pLHJ025用限制性内切酶&o Rl、 #"1双酶切，胶回收力'/ 7^基因片段与 经￡bo Rl、 #W I双酶切的酿酒酵母展示表达载体pLHJ042在T4 DNA连接酶作 用下连接，得到h'A/O 基因酿酒酵母展示表达质粒pLHJ053,如图6。
实施实例3:带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得及表达突变文库的构建
3.1带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得
根据酿酒酵母展示表达载体pLHJ042的序列分别设计位于多克隆位点两端 的引物pLHJ042F、 pLHJ042R。引物pLHJ042F(5' -cactgaaccatggaccggaacUt-3，) 的序列位于 Flolp 凝絮功能区编码序列，引物 pLHJ042R(5' -ggggggagggcgtgaatgta-3')的序列位于终止子6TC77T序列。分别 以pLHJ044、 pLHJ052、 pLHJ053和pLHJ042-朋8为模板，以pLHJ042F、 pLHJ042R 为引物对，PCR扩增得到带有酿酒酵母展示表达载体同源序列的不同来源脂肪 酶基因的片断。
3.2不同来源脂肪酶基因表达突变文库的构建
将带酿酒酵母展示表达载体同源序列的不同来源脂肪酶基因的片断与经 双酶切线性化的酿酒酵母展示表达载体pLHJ042混合物，转化酿酒酵母INVScl, 涂布含葡萄糖的SC-U平板(URA一)， 30° C培养，待长出转化子后，转接转化 子至含葡萄糖的SC-U平板30° C培养24h后，将转化子转接至补加1%橄榄油 和0.002% Rhodamine B含2%半乳糖的SC-U平板30° C培养，利用半乳糖诱 导目标蛋白的表达。2 3天后部分菌落周围有明显的显色反应，如图7。
菌落周围有的显色反应表明脂肪酶基因在宿主菌中实现表达，由此可以判 断不同来源的脂肪酶基因在酿酒酵母中发生同源重组，得到表达突变文库。实施实例4:脂肪酶基因突变体分析
挑取表达突变文库中10个脂肪酶活性较高的转化子(显色反应出现较早、
显色范围较大的转化子)，将其在含葡萄糖的sc-u液体培养基中活化，并于
30° C培养过夜。收集酿酒酵母菌体提取质粒并转化大肠杆菌再生，随机挑取 含质粒的菌体送样分别用引物pLHJ042F、 pLHJ042R测序分析其全序列。通过序
列分析表明10个样品中有1个基因发生重排，其余均为亲本单基因与载体发生 同样重组，将包含正常读框的突变体脂肪酶基因命名为并提交 GenBank (GenBank NO. GQ383920)。
4.1脂肪酶基因突变体乃》必ii与脂肪酶基因2iA/i!^的序列比较 通过序列分析表明，脂肪酶基因的序列中有205bp 237bp、 342bp 653bp和838bp 872bp三段序列与脂肪酶基因7j'A/iM序列完全一致， 如图8。
由此推测脂肪酶基因的这三段序列可能源于脂肪酶基因h'A/i^。 4.2脂肪酶基因突变体7/p必'x2与脂肪酶基因7&/似的序列比较
通过序列分析表明，脂肪酶基因7j'pJ//^的序列中有67bp 221bp、442bp 489bp、 674bp 708bp和835bp 881bp四段序列与脂肪酶基因h'A/i^序列完 全一致，如图9。
由此推测脂肪酶基因的这四段序列可能源于脂肪酶基因乃'A/i^。 4. 3脂肪酶基因突变体h》必:"与脂肪酶基因W/^^9的序列比较
通过序列分析表明，脂肪酶基因h》H7的序列中有lbp 106bp、208bp 364bp、 366bp 395bp和640bp 1432bp四段序列与脂肪酶基因h'p"^9序列完 全一致，如图10。
由此推测脂肪酶基因的这四段序列可能源于脂肪酶基因h》5^ 。 4. 4脂肪瞎基因突变体h》必iJ与脂肪,因7//^5^等的序列比较 通过序列分析，脂肪酶基因h》H7与H/^W序列没有大段完全一致的 序列，如图ll。表明脂肪酶基因突变体h》必'x7序列可能没有源于这些脂肪酶 基因的序列或只有极少部分的碱基发生重组。 4. 5脂肪酶基因突变体7^Ifo^序列来源分析 从上述序列比对发现，脂肪酶基因突变体72》必>7的序列可能来源于 7j'/ /0 和h'/^傲，如图12。脂肪酶基因7&必>7全长序列包含1431bp， 大小与荧光假单孢菌来源脂肪酶基因h》S6《(1431bp)大小一致，具有完整的 0RF。
实验分析结果表明，不同来源的脂肪酶基因在该酿酒酵母展示表达系统中可以 有效地实现同源重组，得到杂合脂肪酶基因。
8序列表
〈110> 湖北大学
<120> —种高效的脂肪酶基因定向进化方法
<130> (巻宗参考号) <140〉(专利申请号)
<141> 2009-8-30
<160> 8
〈210> 1
<211> 1431
<212〉 薩
<213〉以不同来源的脂肪酶基因为出发亲本通过定向进化得到的杂合脂肪酶基因^pi/^7 (GenBank NO. GQ383920)。 <400>
1atgggtatctttgactataaaaacctcggcaccgagggctccaaaacgctgttcgccgat
61gccatcgcgatcacgctgtattcctaccacaacctggataacggccttgccgtgggttac
121caacacaacggcctggggctgggcttgccggcgstcgttggtcggtgcgctgctgggcagc
181acgaactccc鄉gcgtgaitccctggcattccctggaaccccgactcggaaaetetgctgcg
241ctggaagcggtgcaaaaagccggctggacgcccatcagcgccagtgacctgggctatggc
301ggcaaggtcgatgggcgcggcactttctttggcgaaasggCCggCt3C8Ccacggcccag
361gtcgaagtgctcggcaagtacgatgacgccggcaagctgctggaaattggcatcggtttt 421cgtggtacttcaggcccacgggsaagcctgatcagcgactccatcggcgatctggtcagc
481gatctgctcgcggccctggggcccaaggattacgcgaaaaactacgccggcgaagccttc
541ggcggtttgctcaagaacatcgctgactacgccagtgcccacggcctcagcggccacgag
601gtggtagtcagcggccacagcctgggtggccttgcggtgaacagcatggcggatttaagc
661aacaacaaatggtcggggttctacaaggacgccaactacgtggcctatgcctcaccgacc
721c卿gcgcgggcgataaagtgttgaacatcggctacgaaaacgacccggtgttccgcgcg
781cttgacggctcatccttcaacttgtcgtccctgggcgtgcacgacaaaccccacgagtcg
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1381 gtcggcgttg ggcatggcgg cctgtgggcg gacggggtca gcatcggctg a
〈210〉 2
〈211〉 476
<212> PRT
<213>杂合脂肪酶基因7/p必';^编码的氨基酸序列 〈400〉
1MGIFDYKNLGTEGSKTLFADAIAITLYSYHNLDNGLAVGYQHNGLGLGLP
61ATLVGALLGSTNSQGVIPGIPWNPDSEKAALEAVQKAGWTPIS,LGYG
101GKVDGRGTFFGEKAGYTTAQVEVLGKYDDAGKLLEIGIGFRGTSGPRESL
161ISDSIGDLVSDLLMLGPKDYA證AGEAFGGLLKNIADYASAHGLSGHE
201兩SGHSLGGLAVNSMADLSNNKWSGFYKDANYVAYASPTQSAGDKVLNI
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401NSGHNTFLFSGNFGNDRVIGYQTTDKLVFQ賺GSTDLRDHAKVVGADTV
461LTFGADSVTLVGVGHGGLWADGVSIG
〈210〉 3 〈211> 40 〈212〉 DNA
〈213〉 腳遂因(GenBank NO. NC—001133)
<223〉引物FOLf-Hind III
<400>
acataagcttatgacaatgcctcatcgctatatgtttttg 40
〈210> 4 〈211> 40 <212> DNA
<213〉 凡魄因(GenBank NO. NC—001133)
<223>引物FOLr-Bgl II
〈400>
gat a卵tctggtgatttgtcct gaagat gat gat gacaaa
1040
<210> 5 <211> 36 <212> DNA
<213〉 脂肪酵基因7j'/^5^ (Genbank no. ay623009)
<223>引物LipB52Pf
〈400>
aaagaattcccaacaaaaagagaggcaacagcaatg 36
〈210〉 6 〈211> 35 〈212〉 DM
<213> 脂肪酶基因"p丑5^ (Genbank NO. AY623009)
〈223〉引物LipB52Pr
<400>
aaagcggccgctccctccccacccttgtcgtcagg 35
<210〉 7 <211〉 24 <212> DNA
<213>酿酒酵母展示表达载体pLHJ042的序列
<223>引物pLHJ042F
<400>
cactgaaccatggaccggaacttt
24
<210> 8 <211〉 20 <212> ,
<213>酿酒酵母展示表达载体pLHJ042的序列
<223>引物pLHJ042 R
<400>
ggggggagggcgtgaatgt3 20
权利要求
1、一种高效的脂肪酶基因定向进化方法，其特征在于步骤为1)酿酒酵母展示表达载体构建利用酵母细胞Flop膜蛋白或a-凝聚素、α-凝聚素、等膜蛋白构建适合脂肪酶表达的展示表达载体；2)脂肪酶酿酒酵母展示表达重组质粒构建利用酿酒酵母展示表达载体，构建不同来源、具有一定同源性的脂肪酶基因在酿酒酵母中展示表达的重组载体；3)带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得及表达突变文库的构建根据展示表达载体序列设计引物，PCR扩增带有酿酒酵母展示表达载体同源序列的不同来源脂肪酶基因片段；将带有载体同源序列的脂肪酶基因片段与线性化的展示表达载体混合，转化酿酒酵母，得到表达突变文库；4)展示表达突变文库及突变体分析不同来源的脂肪酶基因在酿酒酵母中实现同源重组，得到展示表达突变文库。
2、 根据权利要求l所述的一种高效的脂肪酶基因定向进化方法，其特征在 于酿酒酵母展示表达载体构建是利用酵母细胞Flop膜蛋白，设计Flolp的凝 絮功能区编码序列的引物F0Lf-Hind III和FOLr~Bgl II (FOLf-Hind III: 5' -acat朋^cf加gacaatgcctcatcgctatatgtttttg-3， F0Lr~Bgl II: 5， -gata辟i""ggtgatttgtcctgaagatgatgatgacaaa-3，)， 以酿酒酵母 51 cere"w'ae ATCC 60715的总DNA为模板PCR扩增得到Flolp的凝絮功能区编码 序列片断，将此片断经扮'fld III、勘_/ II双酶切后与经历/ d III、 fe/zH I双酶 切的酿酒酵母表达载体pYES2/NT在T4 DNA连接酶作用下连接(《^ II与，I 互为同尾酶)，得到以Flolp凝絮功能区为介导锚合蛋白的酿酒酵母展示表达载 体pLHJ042。
3、 根据权利要求1所述的一种高效的脂肪酶基因定向进化方法，其特征在 于脂肪酶酿酒酵母展示表达重组质粒构建是以脂肪酶基因"/^a (Genbank NO. AY623009 ) 序列设计其全长基因引物 LipB52Pf ( 5，-aaa^aa"cccaacaaaaagagaggcaacagcaatg"3， ) 、 LipB52Pr(5， —aaagc级cc^rtccctccccacccttgtcgtcagg"3，), 以尸./!/waresce"s B52 基因组DNA为模板PCR扩增得到"/^M全长基因片段，此片断纯化后用限制性 内切酶Rl、 I双酶切，胶回收双酶切的h';^^基因片段与经fco Rl、 I双酶切的酿酒酵母展示表达载体pLHJ042在T4 DNA连接酶作用下连接， 得到7j》丑W基因酿酒酵母展示表达质粒pLHJ044。
4、根据权利要求1所述的一种高效的脂肪酶基因定向进化方法，其特征在 于带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得及表达突变文库的构建是根据酿酒 酵母展示表达载体pLHJ042的序列分别设计位于多克隆位点两端的引物 pLHJ042F、 pLHJ042R，引物pLHJ042F(5'-cactgaaccatggaccggaacttt-3，)的序 列位于 Flolp 凝絮功能区编码序列，引物 pLHJ042R(5' -ggggggagggcgtgaatgta-3')的序列位于终止子Cr^/'7T序列，分别 以pLHJ044、 pLHJ052、 pLHJ053和pLHJ042-B68为模板，以pLHJ042F、 pLHJ042R 为引物对，PCR扩增得到带有酿酒酵母展示表达载体同源序列的不同来源脂肪酶 基因的片断；将上述片断与经双酶切线性化的酿酒酵母展示表达载体pLHJ042混合物， 转化酿酒酵母INVScl,涂布含葡萄糖的SC-U平板(URA_), 30。 C培养，待长 出转化子后，转接转化子至含葡萄糖的SC-U平板30° C培养24h后，将转化子 转接至补加1%橄榄油和0. 002% Rhodamine B含2%半乳糖的SC-U平板30° C 培养，利用半乳糖诱导目标蛋白的表达，得到表达突变文库。
全文摘要
本发明提出了一种高效的脂肪酶基因定向进化方法，其步骤为1)酿酒酵母展示表达载体构建；2)脂肪酶酿酒酵母展示表达重组质粒构建；3)带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得及表达突变文库的构建；4)展示表达突变文库及突变体分析。本发明将常规定向进化技术中突变文库的构建和突变体的表达实现同步，克服现有技术中脂肪酶分子定向进化操作步骤复杂、突变体筛选困难等缺点。
文档编号C40B50/06GK101643941SQ20091006384
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者宋慧婷, 江正兵 申请人:湖北大学