专利名称：一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株硫杆菌及其应用，尤其涉及一株具有较高亚铁氧化能力的基因工 程菌嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其构建与应用。
背景技术：
嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)是在细菌浸矿过程中 起关键作用的菌种之一。嗜酸氧化亚铁硫杆菌在Fe2+基质中生长时，Fe2+被快速氧化成 Fe3+提供电子进入细菌呼吸链，而Fe3+作为一种强氧化剂在生物浸矿等过程中起着关键的 作用。因此，嗜酸氧化亚铁硫杆菌氧化Fe2+离子的能力是衡量其浸矿能力的一项重要指标。 经检索目前还没有任何关于以转基因的方式来提高嗜酸氧化亚铁硫杆菌Fe2+离子氧化能 力的报道。
发明内容
针对现有技术中对嗜酸氧化亚铁硫杆菌Fe2+离子氧化能力遗传改良方法的空白， 本发明要解决的问题是通过转基因的方法将氧化亚铁电子传递链蛋白CYCl基因导入嗜酸 氧化亚铁硫杆菌提供一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌以提高其氧化Fe2+离子的能力， 使嗜酸氧化亚铁硫杆菌更高效地发挥生物冶金的功能。本发明所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌为高亚铁氧化活性 A. ferrooxidanspTCYCl,该菌命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，菌株已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，保藏中心编号为CGMCC NO. 3549。本发明的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)经鉴定，具有 如下生物学特征革兰氏阴性，有鞭毛，好氧，嗜酸，为化能自养细菌，短杆状，大小为(0. 3 0. 5) μπιΧ (1 2) μπι ；能够以二价铁、元素硫或者还原态硫复合物作为能源，在含有硫酸亚铁 和硫代硫酸钠的固体培养基上能生长；菌落形态不规则，凹陷，边缘呈锯齿状，酒红色，不透 明；生长最适温度为25-30°C，生长最适pH为1.5 2. 5。本发明所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的构建及在亚铁培养基中的生长及 应用，涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC 19859 (Acidithiobacillus ferrooxidansATCC19859) ； ff 胃 DH5a (Escherica coli DH5 α )。(2)氧化亚铁电子传递链蛋白CYCl高效表达载体的构建CYC1蛋白编码基因克隆 自嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC19859染色体DNA，所用引物为上游弓丨物cyclEU(GTACGAATTCAGGAGCCGATGCCATGACGACATACTT)，下游弓丨物 eye IXD (CCTCTCTAGATTA GTGGTGGTGGTGGTGGTG CAACGATGAAAGATAAGCCGCCACA)。上游引物引入EcoR I酶切位点，下游引物引入Xba I酶切位点以及6XHis标签以方便检测cycl基因在细胞内的表达情况。将扩增产物进行EcoR I和Xba I双酶切，回 收744bp大小的片段；同时对可移动性的质粒载体PJRD215进行EcoRI和XbaI双酶切，回 收约IOkb的载体片段；用T4连接酶将这两个片段连接，以连接液转化大肠杆菌DH5 α，在 含有100yg/ml链霉素(Sm)的LB固体平板上37°C静置培养，进行转化子的筛选，挑取转化 子进行质粒提取、酶切验证，构建出中间质粒PCYCl。以质粒 pMMB24DNA 为模板，设计引物 Ptae-I (5，-GTACAAGCTTATCGACTGCACGGTGCAC C-3，)和 Pta。-2 (5，-GTACGAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3，)扩增不含调控区域的 Tac 启动 子，命名为Ptac。扩增产物经HindIII和EcoR I双酶切，连接至pCYCl质粒中cycl基因上 游HindlIl-Ec0R I位点，连接液转化大肠杆菌DH5 α。在含有Sm(100 μ g/ml)的LB固体平 板上37°C静置培养，进行转化子的筛选，挑取转化子进行质粒提取、酶切验证，同时对所插 入的外源基因Ptac以及cycl基因进行测序验证，构建了可转移质粒pTCYCl。从经测序验 证准确无误的转化子中提取质粒PTCYC1，转化至含RP4质粒的大肠杆菌DH5 α，命名为大肠 杆菌DH5 α (RP4/pTCYCl)，为下一步的接合转移实验作准备。(3)嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的制备以大肠杆菌DH5 α (RP4/pTCYCl)作 为供体菌，嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC19859作为受体菌在滤膜上进行接合转移。供体菌和 受体菌分别离心收集菌体，洗涤液洗涤至少三次，用洗涤液分别悬浮供体菌和受体菌至相 同密度，然后按一定比例混合后取适量的菌悬液(0. 1 0. 3ml)加到无菌硝酸纤维素滤膜 上，滤膜置于接合平板上30 35°C培养24 72h，使之接合。取滤膜用Iml无机盐洗涤 液洗下菌体，稀释成一系列不同浓度=IoqUo-1UO-2UO-3UO-4UO-5UO-6UO-7,分别取100 μ 1 涂布含相应抗生素的2 2选择平板及相应的不含抗生素的对照平板。同时在选择性平板 上分别涂布供体菌和受体菌作为对照。放置25 30°C温箱中培养7 10d，直至板上形成 明显菌落。(4)接合子的种子培养挑取步骤(3)中选择性平板上形成的接合子菌落，在无菌 条件下用接种环接于30mL 9K-FeS04培养基(Sm 300 μ g/ml)中，25_30°C条件下，160rpm震 荡培养3 5d，制得种子液；(5)接合转移子扩大培养以5 %体积比的接种量，将种子液接种于 200mL9K-FeS04 培养基(Sm 300 μ g/ml))中，25_30°C条件下，160rpm 振荡培养 3 5d ；(6)接合转移子的质粒提取验证将步骤(5)所得的培养液真空抽滤出去培养液 中的高铁沉淀；离心收集菌体，用9K无机盐溶液洗涤至少3次直至菌泥中没有可见的高铁 沉淀，再用PBS缓冲液洗菌体2次，然后按照常规的碱裂解法进行质粒抽提。质粒提取验证结果阳性的接合子命名为A. ferrooxidans pTCYCl ；(7) A. ferrooxidans pTCYCl中重组质粒所携带cycl基因在嗜酸氧化亚铁硫 杆菌中的表达将步骤(5)所得的培养液真空抽滤出去培养液中的高铁沉淀；离心收集 菌体，用9K无机盐溶液洗涤至少3次直至菌泥中没有可见的高铁沉淀，收集足够量的 A. ferrooxidans pTCYCl菌体，洗涤后重悬于裂解缓冲液，超声破碎细胞。经Bradford法测 定样品中的蛋白浓度后，取等量蛋白与等体积的2XLaemmli缓冲液混合，煮沸5min后进行 Western blotting检测，验证质粒pTCYCl上所携带cycl基因是否能在嗜酸氧化亚铁硫杆 菌中正常表达；(8)基因工程菌A. ferrooxidans pTCYCl亚铁离子氧化活性测定将步骤(5)所得的培养液真空抽滤出去培养液中的高铁沉淀；离心收集菌体，用TE缓冲液洗菌体三次后 将重悬于TE缓冲液中。取细菌悬浮液加入反应缓冲液中，30°C振荡培养，在培养的不同时 间取培养液以邻菲啰啉法测定培养液中剩余Fe2+的浓度；(9)重组质粒pTCYCl在A. ferrooxidans ATCC19859的稳定性检测在固体平板 上挑取A. ferrooxidans阳性接合转移子菌落一个，接种到不含有筛选标记的9K_FeS04液 体培养基中，在没有选择压力条件下30°C振荡培养5d，然后按照1 1000的比例转接，如 此连续转接5次(> 50代)，稀释后分别涂布含有抗生素的2 2选择平板以及不含抗生 素的2 2固体平板，25-35°C培养10d。通过计算抗生素抗性菌落占总菌落的比例，测出重 组质粒在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的稳定性。其中，步骤(3)中所述的菌体接合培养时间优选是48h，接合培养温度优选30°C ； 固体培养温度优选是30°C，培养时间是7d ；其中，步骤(4)、(5)中所述的菌体培养温度优选是30°C ；上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC 19859 (Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC19859)购自美国标准生物品收藏中心；大肠杆菌DH5a (Escherica coll DH5 α )购自 原平皓(天津)生物技术有限公司。上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的制备中，PJRD215质粒构建见Davison J, Heusterspreute Μ, Chevalier N, Ha-Thi V, Brunei F. Vectors with restriction site banks. V. pJRD215, a wide-host-range cosmid vector with multiple cloning sites. Gene. 1987, 51 (2-3) 275-80 ；pMMB24 M14I^lMB Miroslawa Μ. Bagdasarian, Egon Amann, Rudo1fLurz, Beate Ruckert and Michael Bagdasarian. Activity of the hybrid trp-lac(tac)promoter ofEscherichia coli in Pseudomonas putida. Construction of broad-host-range, controlled-expression vectors, 1983, Gene, 26 :273_282 ;RP4 质粒 I^jMB Datta, N. ， R. W. Hedges, Ε. J. Shaw, R. B. Sykes and M. H. Richmond. Properties of an R factor fromPseudomonas aeruginosa, 1971, J. Bacteriol,108 :1244_1249。上述质粒的构建中，培养大肠杆菌DH5 α使用的LB液体培养基，配方为每IOOOml蒸馏水中添加蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用2N NaOH溶液调pH 至7. O 7. 5，15磅/寸2高压蒸汽灭菌20min，37°C培养。上述LB固体培养基为上述LB液体培养基中加入1. 8%琼脂粉，pH 7. O 7. 5。在上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌培养使用的液体9K_FeS04无机盐培养基，配方为每IOOOml 蒸馏水中添加(NH4) 2S043g，K2HPO4O. 5g，KCl 0. lg，MgSO4 · 7H20 0. 5g， Ca(NO3)2O. 01 g，用浓 H2SO4 调 pH 2. 0，121°C条件下灭菌 20min ；配置 44. 8% 的 FeSO4. 7H20 浓 溶液，过滤除菌，使用前按按1 9的比例与9K无机盐培养液混合。上述2 2固体培养基配方为A :2g Na2S2O3 · 5H20 溶解于 IOml 蒸馏水中；B :2g FeSO4. 7H20溶解于IOmlpH值预调为2. 0的酸性水中；C 4. 5g (NH4)2SO4jO. 15g KCl，0. 75g MgSO4 · 7H20 溶解于 500ml 蒸馏水中；D :6g琼脂溶于480ml蒸馏水；其中，组分A与B过滤除菌，C与D 121°C条件下灭菌20min，待C与D组分冷却至 45°C左右时，将四种组分混合，倾倒平板备用。
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上述2 2接合培养基为上述2 2固体培养基中加入0. 的酵母粉，pH 4. 8 5. 0。其中，步骤(3)中所述的菌体洗涤液为上述2 2培养基C组分中加入等体积的 蒸馏水作为菌体洗涤液。上述步骤(6)中的PBS缓冲液配方为每IOOOml 蒸馏水中添加=NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4L 44g, KH2PO4O. 24g，用 HCl 调pH值至7. 4，加H2O定容至1L，15磅/cm2,灭菌20min。上述步骤(7)中的裂解液配方为每1000 毫升蒸溜水各成分含量为50mmol/L Tris-Cl (pH 8. 0), 150mmol/L NaCl, 100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。上述步骤(7)中2 X Laemmli缓冲液配方为4% SDS，29%甘油，10% β -巯基乙醇，0. 04%溴酚蓝；0. 125Μ Tris-HCl ；上述步骤(8)中的TE缓冲液配方为10mM Tris-HCl, ImM EDTA0本发明所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井水 的处理以及污泥中重金属的去除中的应用。实验证实本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌(A. ferrooxidans pTCYCl)与野生型嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A. ferrooxidans ATCC19859)相比较，其氧化亚铁 离子的能力提高了 13%，这对嗜酸氧化亚铁硫杆菌在生物浸出中的应用有着重要的意义。 此外，因嗜酸氧化亚铁硫杆菌在除生物浸出以外其它方面的应用，如烟气脱硫、酸性矿井水 的处理以及污泥中重金属的去除等，也是基于嗜酸氧化亚铁硫杆菌氧化二价铁离子的能 力，因此该发明具有广泛的应用前景。
具体实施例方式实施例1 重组质粒pTCYCl的构建及鉴定。(1)将含有cycl基因以及6XHis标签编码基因与穿梭性质粒PJRD215连接后，转 化大肠杆菌DH5 α，在含有Km的LB固体平板筛选得到含有Km抗性质粒的大肠杆菌DH5 α， 经提取质粒酶切验证，转化子中携带的质粒确实含有插入片段。(2)将Ptac基因片段与中间载体pCYCl连接后，转化大肠杆菌DH5 α，在含有Km 的LB固体平板筛选得到含有Km抗性质粒的大肠杆菌DH5 α，经提取质粒酶切验证，转化子 中携带的质粒确实含有插入片段。将验证过的阳性克隆进行测序，选取测序正确的克隆，提 取质粒，转化至大肠杆菌DH5 α (RP4)在含有Sm的LB固体平板上筛选得到接合转移所用的 供体菌大肠杆菌DH5 α (RP4/pTCYCl)。上述LB筛选培养基中，卡那霉素(Km)或链霉素(Sm)的筛选浓度为100 μ g/ml。实施例2 嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的构建及鉴定。(1)分别收集指数生长中期的大肠杆菌DH5 α (RP4/pTCYCl)作为供体菌，指数生 长中期的嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC19859作为受体菌，无机盐洗涤液洗涤3次，按相同菌体 浓度悬浮于洗涤液中备用。(2)按供体菌与受体菌的体积比为1 1，将悬浮液进行混合，取200 μ 1放于孔径 为0.45 μ m的硝酸纤维素滤膜(光面朝上)上，30°C于接合平板上培养48h;lml洗涤液将滤膜上的菌体洗下，稀释为10-1、10-2、10-3、10_4，分别取10(^1涂布2 2筛选平板，30°C静 置培养10d。筛选平板中抗生素Km浓度为200 μ g/ml。(3)挑取筛选平板上的抗性菌落，接种于30ml9K-FeS04培养基(Km 300 μ g/ml) 中，30°C条件下，160rpm震荡培养5d.，制得种子液；以5%体积比的接种量，将种子液接种 于200mL 9K-FeS04培养基(Km 300 μ g/ml))中，30°C条件下，160rpm震荡培养4d后收集菌 液进行质粒提取验证。(4)经质粒提取验证，从筛选平板上挑取的接合子能够提取出分子量大小正确的 质粒，而从作为对照的A. ferrooxidans ATCC19859中则未能提取出质粒。结果表明，重组质粒通过滤膜接合的方式成功地从大肠杆菌DH5 α (RP4/pTCYCl) 转移至了嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC19859中，提示已成功获得了嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因 工禾呈菌 A. ferrooxidans pTCYCl。实施例3 重组质粒pTCYCl所携带cycl基因在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的表达(1)菌种选择:A. ferrooxidans pTCYCl, A. ferrooxidans ATCC19859 ；(2)种子培养将A. ferrooxidans pTCYC 1 及A. ferrooxidans ATCCl9859在无菌 条件下用接种环接一环于30mL QK-FeSO4液体培养基中，30°C条件下，振荡培养至稳定期， 制得种子液；(3)扩大培养以5 %的体积比的接种量，将两株菌的种子液接种于 200mL9K-FeS0df体培养基中，30°C条件下，振荡培养至稳定期(约4d)；(4)嗜酸氧化亚铁硫杆菌总蛋白SDS-PAGE电泳将步骤(3)中得到的培养液抽滤 去除高铁沉淀，离心收集菌体，将菌体重悬于裂解缓冲液中，超声破碎细胞，待样品中完整 细胞的数目不超过细胞总数的10%时(镜检确定)，停止超声，13000rpm离心IOmin去除细 胞碎片。Bradford法测定 A. ferrooxidans pTCYCl 及 A. ferrooxidansATCC19859 样品中蛋 白浓度后，取相同量的蛋白以15%的变性聚丙烯酰胺凝胶分离；(5)嗜酸氧化亚铁硫杆菌总蛋白的Western-blotting检测将步骤(4)中在聚丙 烯酰胺凝胶中得到有效分离的嗜酸氧化亚铁硫杆菌总蛋白转印至PVDF膜上，分别进行一 抗(Anti-His Antibody)及二抗(Poly Rabbit Anti-mouse immunoglobulins/HRP)孵育 后，进行ECL发光检测；(6)经Western-blotting检测验证，质粒pTCYCl上所携带的cycl基因在嗜酸氧 化亚铁硫杆菌中得到了有效的表达。实施例4 嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的菌种鉴定及保藏信息。本发明构建的高亚铁氧化活性A. ferrooxidans pTCYCl菌株已于2009年12月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中 国北京)，保藏中心编号为=CGMCC N0. 3549。上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌，经鉴定，具有如下生物学特征革兰氏阴性，有鞭毛，好氧，嗜酸，为化能自养细菌，短杆状，大小为(0. 3 0. 5) μπιΧ (1 2) μπι ；能够以二价铁、元素硫或者还原态硫复合物作为能源，在含有硫酸亚铁 和硫代硫酸钠的固体培养基上能生长；菌落形态不规则，凹陷，边缘呈锯齿状，酒红色，不透 明；生长最适温度为25-30°C，生长最适pH为1.5 2. 5。实施例5 :A. ferrooxidans pTCYCl亚铁离子氧化活性的测定
(1)菌种选择:A. ferrooxidans pTCYCl, A. ferrooxidans ATCC19859 ；(2)种子培养将 A. ferrooxidans pTCYCl 及 A. ferrooxidans ATCC19859 在无菌 条件下用接种环接一环于30mL QK-FeSO4液体培养基中，30°C条件下，振荡培养至稳定期， 制得种子液；(3)扩大培养以5 %的体积比的接种量，将两株菌的种子液接种于 200mL9K-FeS0df体培养基中，30°C条件下，振荡培养至稳定期(约4d)；(4)嗜酸氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化活性的测定将步骤(3)中得到的培养液抽滤 去除高铁沉淀，离心收集菌体，用TE缓冲液悬浮至相同浓度，取一定量的细胞悬液抽提细 胞总蛋白，以bradford法进行蛋白定量。取相同体积悬浮接入3ml反应缓冲液中，在反应 不同时间从反应体系中取出0. 2ml反应液，12000g离心2min后，确定反应液中剩余的Fe2+ 浓度，根据Fe2+浓度的变化确定嗜酸氧化亚铁硫杆菌的亚铁氧化酶活性；(5)本实验所构建的基因工程菌A. ferrooxidans pTCYCl较野生型 A. ferrOOXidansATCC19859，亚铁氧化能力得到了一定的提高实验所测得的基因工程菌 A. ferrooxidansATCC19859 亚铁氧化活性为 5. 3ymol Fe2+ oxidized/mg Protein/min，而 基因工程菌亚铁氧化活性为6. 0 μ mol Fe2+oxidized/mg Protein/min,相对于野生型，本实 验所构建的基因工程菌亚铁氧化活性提高了 13%。上述A. ferrooxidans pTCYCl在进行种子培养及扩大培养时，培养基中加入浓度 为300 μ g/ml的卡那霉素(Km)。
权利要求
一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌，为高亚铁氧化活性A.ferrooxidans pTCYC1；其特征在于该菌命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，菌株已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心编号为CGMCC NO.3549。
2.权利要求1所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井 水的处理以及污泥中重金属的去除中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌，为高亚铁氧化活性A.ferrooxidans pTCYC1；其特征在于该菌命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)，菌株已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心编号为CGMCC NO.3549。本发明的基因工程菌较野生型的氧化亚铁硫杆菌在亚铁氧化活性方面有一定的提高，且性能稳定，在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井水的处理以及污泥中重金属的去除等领域具有很大的应用前景。
文档编号C22B3/18GK101935621SQ20101010537
公开日2011年1月5日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者刘玮, 刘相梅, 林建强, 林建群, 颜望明 申请人:山东大学