专利名称：：基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法及其应用的制作方法基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法及其应用本发明属于生物技术发明领域。是我们申请的中国专利”AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号200910009059.6)”和”携带基于hGluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库及用途(申请号200910223723.7)”的延续和扩展。本发明具体涉及一种基于AAV(Adeno-associatedvirus)载体的高通量miRNA活性检测方法miRNAAsensorArray(miRNAsensorbasedAAVvectorArray，基于AAV载体的、用于miRNA活性检测的生物传感器)及其在细胞miRNA活性谱检测、不同细胞特征miRNA活性谱检测和外界因素(如药物、转基因)对细胞miRNA活性谱的影响等方面的应用。miRNAAsensorArray由不携带miRNA祀序列的controlAsensor和多种携带miRNA祀序列的miRNAAsensor按照一定顺序排列组成。ControlAsensor和miRNAAsensor均包含Gluc(GaussiaIuciferase)和Fluc(fireflyluciferase)两个独立的表达单元，其中Gluc用于miRNA活性检测，Fluc用于计算miRNAAsensor的转导系数，校正不同miRNAAsensor之间的感染性差异。使用时，将待检测细胞加入到制备好的miRNAAsensorArray中，一段时间后检测Gluc表达情况并根据转导系数计算出细胞中miRNA活性谱。该方法为细胞miRNA活性谱的制作及其影响因素研究提供了新的选择。背景miRNA(microRNA)是生物体内源的长度为1825个核苷酸的非编码RNA(BartelDP.MiRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，andfunction.Cell，2004，116(2)281-297.)o目前，在人类中已发现1000多种miRNA(参见www.mirbase.org数据库)。在体内，miRNA与AGO等蛋白形成RISC(RNAInducedSilencingComplex)，识别并结合mRNA3’UTR的靶序列，降低mRNA的稳定性和抑制翻译，在转录后水平上对基因的表达进行负调控(DoenchJG,SharpPA.SpecificityofmicroRNAtargetselectionintranslationrepression.GenesDev，2004，18(5):504-511.)。研究发现，miRNA参与人类大约三分之一基因的表达调控(LewisBP,BurgeCB,BartelDP.Conservedseedpairing,oftenflankedbyadenosines，indicatesthatthousandsofhumangenesaremicroRNAtargets.Cell，2005，120(I):15-20.)，在细胞分裂(CaretonM，ClearyMA,LinsleyPS.MicroRNAsandcellcycleregulation.CellCycle，2007，6(17):2127-2132.)、分化(IovinoN，PaneA，GaulU.miR-184hasmultiplerolesinDrosophilafemalegermlinedevelopment.DevCell，2009，17(I)123-133.)、死亡(AmbrosV.MicroRNApathwaysinfliesandwormsgrowth,death，fat，stress，andtiming[ErratumCell，2003,114(2):269].Cell，2003，113(6):673-676.)、凋亡(JovanovicM,HenqartnerMO.miRNAsandapoptosisRNAstodiefor.Oncogene，2007，25(46):6176-6187.)、新陈代谢(DangCV,LeA，GaoP.MYC-inducedcancercellenergymetabolismandtherapeuticopportunities.ClinCancerRes，2009，15(21);6479_6483.)以及干细胞的分化(XuN，PapagiannakopoulosT，PanGJ，etal.MicroRNA-145regulates0CT4，S0X2，andKLF4andrepressespluripotencyinhumanembryonicstemcells.Cell，2009，137(4):647-658.)、肿瘤的发生(SchichelR，BoyerinasB，ParkSM，etal.MicroRNAskeyplayersintheimmunesystem,differentiation,tumorigenesisandcelldeath.Oncogene,2008,27(45):5959-5974.)等诸多生理病理过程中发挥重要作用。目前已建立Northernblot、QRT-PCR>microarray和Deepsequencing等多种miRNA表达水平检测方法。按照检测原理的不同，这些方法可分为基于杂交的Northernblot和microarray、基于扩增的QRT-PCR和基于测序的Deepsequencing三大类。虽然这些方法可以简单、快捷和高通量地检测细胞内的miRNA表达水平，但是由于这些方法均需要提取细胞内RNA，因此不仅操作繁琐，还不能对同一细胞进行长期持续地监测。更为重要的是，已有的研究表明，细胞内miRNA的活性，即细胞内发挥效应的miRNA，不仅与细胞内miRNA的表达水平相关，还受到miRNA在细胞内的定位、miRNA的稳定性以及miRNA形成的miRISC中其他蛋白因子的影响(KrolJ,LoedigeI,Fillipowiczff.ThewidespreadregulationofmicroRNAbiogenesis,functionanddecay.NatureReviewsGenetics,2010,11:597-610.)。因此为了了解细胞内miRNA活性，需要建立一种检测细胞内miRNA活性的方法。现有的miRNA活性检测方法基于miRNA抑制细胞内基因表达的原理，选择常用的报告基因(Flue、EGFP,RFP、Gluc和Mluc等)，在其3’UTR区插入某种miRNA的靶序列(如和成熟miRNA完全互补的序列)，同时以3’UTR区不含miRNA靶序列的报告基因作为对照，然后将携带和不携带miRNA靶序列的报告基因分别导入检测细胞中，一定时间后比较报告基因的表达情况，推测细胞内miRNA的活性。报告基因的表达情况比较结果分为两种其一，携带miRNA靶序列的报告基因表达量小于不携带miRNA靶序列的报告基因的表达量，表明细胞内该种miRNA活性较高；其二，携带miRNA靶序列的报告基因表达量不小于不携带miRNA靶序列的报告基因的表达量，表明细胞内该种miRNA活性较低。从miRNA活性检测的原理可知，报告基因的选择和报告基因高效地导入细胞是单个miRNA活性检测方法需要解决的两个主要问题。Huang等(HuangPC,ChenCY,YangFY,etal.AmultisamplingreportersystemformonitoringmicroRNAactivityinthesamepopulationofcells.JournalofBiomedicineandBiotechnology,2009.doi10.1155/2009/104716)报道了一种以分泌型突光素酶Mluc(Metridialuciferase)为报告基因的质粒型miRNA活性检测载体，利用该方法可以连续监测同一细胞的miRNA活性。Lee等(LeeJY,KimS，HwangDff,etal.DevelopmentofaDual-LuciferaserepotersystemforinvivovisualizationofmicroRNAbiogenesisandposttranscriptionalregulation.JNuclMed，2008，49:285-294.)报道了一种以Gluc(Gaussialuciferase)为报告基因的质粒型miRNA活性检测载体，相比于Mluc，Gluc灵敏度更高，检测更加方便,为miRNA活性检测提供了一种新的选择。但是，现在仍然缺乏一种高通量的miRNA活性检测方法。这是因为高通量的miRNA活性检测方法的建立不仅需要选择适当的报告基因和简便的外源基因转导技术，还需要克服多种不同miRNA活性检测载体之间的转导效率差异。虽然荧光蛋白基因在miRNA活性检测中也常作为报告基因(JuliusBrennecke,AlexanderStark,RobertB.Russell,etal.PrinciplesofMicroRNA-TargetRecognition.PLoSBiology,2005，3(3)，404-418，e85.)，但其主要应用于miRNA活性的定性检测。在miRNA活性的定量检测中，则通常选择荧光素酶基因为报告基因，如Fluc(ChristineEsau,XiaolinKang,EigenPeralta,etal.MicroRNA-143RegulatesAdipocyteDifferentiation.TheJournalofBiologicalChemistry,2004,279,52361-52365.YongZhao,EvaSamalandDeepakSrivastava.Serumresponsefactorregulatesamuscle-specificmicroRNAthattargetsHand2duringcardiogenesis.Nature，2005，436，214-220.)、Gluc(LeeJY,KimS，HwangDW,etal.DevelopmentofaDual-LuciferaserepotersystemforinvivovisualizationofmicroRNAbiogenesisandposttranscriptionalregulation.JNuclMed，2008，49:285-294.)、Rluc(MargaretSEbert，JoelRNeilsonandPhillipASharp.MicroRNAspongescompetitiveinhibitorsofsmallRNAsinmammaliancells.NatureMethods，2007，4，721-726.VincentBoissonneault，IsabellePlante，SergeRivest,etal.MicroRNA-298andMicroRNA-328RegulateExpressionofMouse&-AmyloidPrecursorProtein-convertingEnzymeI.TheJournalofBiologicalChemistry,2009，284，1971-1981.)和Mluc(HuangPC，ChenCY,YangFY,etal.AmultisamplingreportersystemformonitoringmicroRNAactivityinthesamepopulationofcells.JournalofBiomedicineandBiotechnology,2009.doi10.1155/2009/104716)等，因为荧光素酶基因可以方便地实现其表达量的定量检测。同时，荧光素基因还具有灵敏度高的特点。新一代的荧光素酶基因Gluc不仅灵敏度高，还易分泌、检测时不依赖ATP、检测方便等特点，可作为miRNA活性检测时选择报告基因。携带和不携带miRNA革E序列的报告基因常通过质粒(Miranda，K.C.，Huynh,T.，Tay,Y.etal.APattern-BasedMethodfortheIdentificationofMicroRNABindingSiteandTheirCorrespondingHeteroduplexes.2006.Cell，126，1203-1217.)和病毒载体(BrownBD,VenneriMA,ZingaleA，etal.EndogenousmicroRNAregulationsuppressestransgeneexpressioninhematopoieticlineagesandenablesstablegenetransfer.Naturemedicine，2006，12(5)，585-591.)等方式导入细胞内。质粒载体制备方便，但对某些细胞转染效率低下，不能用于这些细胞中的miRNA活性检测。BrownBD等报道了一种利用慢病毒载体检测细胞内miRNA活性的方法(BrownBD,VenneriMA,ZingaleA,etal.EndogenousmicroRNAregulationsuppressestransgeneexpressioninhematopoieticlineagesandenablesstablegenetransfer.Naturemedicine，2006，12(5)，585-591.)。慢病毒载体能高效转染多种细胞，但其需要在溶液保存，不方便于运输，且稳定性不好，尤其因自身病毒特性，慢病毒干燥后保存在固体附着物上时的稳定性很不好。相反，另一种常用的病毒载体AAV病毒载体的稳定性就非常好，这是由于AAV病毒是一种无包膜的纳米级颗粒(直径约20mn)，正二十面体对称，结构比较”刚性”，对pH值、温度、盐浓度变化及有机溶剂(如氯仿、乙醚、乙醇等)均有很强的耐受性，因此AAV病毒载体具有很高的稳定性。同时，在体外AAV2病毒(AAV病毒的一种血清亚型)对多种细胞具有较高的转导效率。利用AAV2病毒载体的这些特点，我们建立了一种AAV2病毒的反向感染阵列(DongX,TianW，WangG，etal.EstablishmentofanAAVreverseinfection-basedarray.PLoSONE，2010，5(10):el3479.)，而且我们申请了相应的专利AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号200910009059.6)。该专利和技术的特点是，区别于传统的正向感染，反向感染阵列先将病毒反向包被于各种型号的细胞培养板上，并在操作工作台中无菌晾干后2-8°C保存，使用时，将待检测细胞加入已制备好的病毒反向感染阵列中，放入细胞培养孵箱培养一定时间后检测相应的检测标志(如报告基因)即可。我们的研究发现，该方法建立的AAV2病毒反向感染阵列可以在2-8°C保存一年以上而感染活性无明显降低。因为使用阵列这种”高通量”设计模式，所以，AAV2病毒反向感染阵列能够简单、方便地实现外源基因的高通量体外转导，为需要体外外源基因的高通量转导提供了新的选择。利用AAV2病毒反向感染阵列的方法，我们进一步建立了一种高通量的miRNA活性检测方法(申请号200910223723.7)，该案所申请的发明正是在上述发明专利申请的基础上技术进一步地延伸和扩展。高通量miRNA活性检测的另外一个主要障碍是，多种不同miRNA活性生物传感器(Sensors)之间的转导效率差异和误差，将导致检测结果与真实结果出现的偏差较大。即，不同的miRNA生物传感器是预先包被在同一个96孔板的不同的孔里，这些不同的孔里所预先包被的包含有不同的miRNA生物传感器的AAV病毒在制备和生产过程中无法达到完全一致，它们的质量和病毒滴度总会有差异，而这些差异会带来后续·的结果和数据的不可信。为了克服因包含有不同的miRNA生物传感器的AAV病毒之间的差异导致的测量误差，我们的方法是，利用不同miRNA生物传感器的结构中预先设计好的、组成比例相对稳定的物质，或测量这种差异来校正不同miRNA生物传感器之间的差异。由于miRNA活性生物传感器的转导效率通常受到多种因素的影响，例如，以质粒为载体的miRNA活性生物传感器受到质粒的质量、质粒的转染剂量等因素的影响，而以病毒为载体的miRNA活性生物传感器则受到病毒载体的质量、病毒载体的感染剂量等因素的影响，因此，不容易找到一种相对稳定的标记来指示转导效率，因此需要引入一种外源标志来指示不同miRNA活性生物传感器受间的转导效率，并且用这种外源标志校正转染效率的差异。miRNA不仅在诸多生理病理过程中发挥重要作用，而且还能够作为一种有效的分子标记用于指示特定的生理病理过程。例如，miRNA可作为癌症的一种检测标记，用于癌症的检测、分类和预后判断(CalinGA,CroceCM.MicroRNAsignaturesinhumancancers.NatureReviewsCancer,2006,6,857-866.)。而且不同种类的细胞具有特异性的miRNA表达谱，可用于细胞种类的指不。HoubaviyHB等(HoubaviyHB,MurrayMF,SharpPA.Embryonicstemcell-specificmicroRNAs.DevelopmentalCell,2003,5,351-358.)研究发现，胚胎干细胞呈现出独特的miRNA表达谱，且这些独特的miRNA在胚胎干细胞的分化和多能性的维持中发挥重要作用。这提示miRNA可能作为一种分子标记用于鉴定胚胎干细胞。此外，某些miRNA特异性地在特定的组织和组织来源细胞中高表达，如miR122主要在肝脏和肝脏来源细胞中高表达(Lagos-QuintanaM,RauhutR,YalcinA,etal.Identificationoftissue-specificmicroRNAsfrommouse.CurrentBiology,2002,12:735-739.；SempereLF,FreemantleS,Pitha-RoweI,etal.ExpressionprofilingofmammalianmicroRNAsuncoversasubsetofbrain-expressedmicroRNAswithpossiblerolesinmurineandhumanneuronaldifferentiation.GenomeBiol,2004,5,R13.)，miR142_3p则主要在造血干细胞系来源细胞中高表达(ChenCZ,LiL,LodishHF,etal.MicroRNAsmodulatehematopoieticlineagedifferentiation.Science,2004,303(5654):83-86.)，miR206、miR133a和miRl主要在肌肉及其来源细胞中高表达(SempereLF,FreemantleS,Pitha-RoweI,etal.ExpressionprofilingofmammalianmicroRNAsuncoversasubsetofbrain-expressedmicroRNAswithpossiblerolesinmurineandhumanneuronaldifferentiation.GenomeBiol,2004,5，R13.)。这表明miRNA可能成为一种分子标记用于鉴定细胞的来源。为了体现本发明与我们之前申请的中国专利”AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号200910009059.6)”和”携带基于hGluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库及用途(申请号200910223723.7)”等原案申请的相关、连续性及充分公开的要求，原案申请中的实施例也都被以背景资料进行详述。以下为我们之前申请的发明专利的背景介绍，是关于”AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号=200910009059.6)”的。申请号为200910009059.6的申请专利具体涉及AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列，将制备好的携带外源基因和基因调控元件的重组腺相关病毒(AAV)有序地包被在细胞培养支持物(如96孔板)上，在无菌条件下制成可以长期存放的重组AAV病毒阵列。将活细胞悬液加入布置了重组AAV病毒阵列的细胞培养孔板中(如96孔板)，预先包被的重组AAV病毒能够有效地感染所加入的细胞，并将重组AAV病毒携带的外源基因(如报告基因)和/或基因元件带入细胞中发挥作用。申请号为200910009059.6的申请专利的背景将外源基因和/或基因元件导入细胞、使其在细胞中表达或阻断其它基因的表达，是分子生物学中常用的技术方法，称之为转导(transduction)。这个过程往往需要载体(vector)和导入系统(deliverysystem)来介导。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体两类。非病毒载体通常是借助人工制备或合成的材料如脂质体、壳聚糖、多聚阳离子化合物等将DNA质粒”包裹”成复合物导入细胞中，这个过程通常被称为”转染”(transfection)。而病毒载体则借助病毒天然的感染能力将”搭载”的外源基因和元件序列导入细胞中，这个过程和病毒感染过程相似，也被称为”感o无论是转染方式还是感染方式，通常的基因导入方法都是先将细胞铺入培养板中、再加入DNA复合物或病毒进行”转染”或”感染”；与常规方法在操作顺序上有所不同的是，本发明所述的转导方法是先将所使用的重组病毒预先包被在孔板中，之后再加入细胞来实现感染，因此这样的方法可称作”反向感染”(reverseinfection)。为了便于区别，我们把常规方法进行的转导方法称为”正向转染”或”正向感染”。实际上，”微阵列”(MiCToarray)技术已经广泛用于生物
技术领域：
。其中最为常见的是DNAArray(基因芯片)。DNA分子因具有很好的理化稳定性和独特的碱基配对结构，而成为理想阵列材料。比如将多种合成的寡核苷酸(单链DNA)作为探针有序地排列固定在表面经过处理的玻片上制成”微阵列”(芯片)，而将待检测的样品提取核酸，用地高辛标记的随机引物进行扩增和标记后与芯片上的探针杂交，最后显色获得杂交信号。根据信号所在的探针位置来判断样品中有与该探针序列互补的序列。除了DNA外，多肽和蛋白(包括抗体)也被成功地用来制成阵列，用于蛋白检测。阵列(Array)技术的优势是具备高通量的特点，即一次检测能同时获得样品与多个探针作用的信息。传统的Southern杂交、Northern杂交和Western杂交都是将样品经过电泳分离后转印到膜上,而用标记的探针来进行检测。如果把这样的操顺序称为”正向”方式，那么，阵列技术是将已知信息的物质(探针)排布成点阵，而加入被检测的对象进行检测就可称为”反向”方式。microRNA(miRNA)是长度在1825个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守，具有转录后基因调控功能。它由基因组DNA编码，在RNA聚合酶II的作用下被转录。这些小分子通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)祀向到达mRNA,进而行使阻遏翻译或引导酶切的功能。最近有研究表明，miRNA具有多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。有研究人员发现线虫体内的异时性基因lin-4编码的小RNA与lin-14反义互补。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30%的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过530种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。有研究报道，miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌症发生发展中发挥作用的miRNA被称作oncogenicmiRNA,即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关，这些变异包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等。下表罗列出部分microRNA的表达与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、预后的关系权利要求1.一种基于AAV载体的、用于高通量地检测活细胞的miRNA活性的miRNA活性检测阵列的检测技术方法。2.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中所使用的miRNAAsensor，其特征在于，其基因组中包含Fluc和Gluc两个独立的表达框，且表达框间被绝缘子序列分隔，其中Fluc表达框用于校正不同miRNAAsensor间的转导效率差异，Gluc表达框用于探测细胞内miRNA活性。3.根据权利要求2，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，病毒感染校正单元中的Fluc的表达水平与Gluc的表达水平有平行线性关系，miRNA活性检测单元中的Gluc的表达水平与miRNA活性有平行线性关系。4.根据权利要求I，为校正miRNAAsensor间的转导效率差异，我们以Fluc的表达水平来表示miRNAAsensor的转导效率的高低,提出了转导系数(Transductioncoefficient,TC)的概念，用转导系数表示miRNAAsensor间的转导效率的高低，这样，可以有效地量化miRNAAsensor转导效率的高低,校正因不同miRNAAsensor转导效率差异而导致的miRNAAsensorArray测量误差。5.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中所使用的miRNAAsensorArray,其特征在于,其组成miRNAAsensor分为携带miRNA祀序列的和不携带miRNA革巴序列的两类，在进行miRNA活性检测时,通过检测比较这两类miRNAAsensor报告基因Gluc的表达的差异得出miRNA活性。6.根据权利要求I,miRNA活性检测阵列的检测技术方法中所使用的miRNAAsensorArray，其特征在于，由于其标准化的制备过程，同一批次制备的组成相同的miRNAAsensorArray具有相同的转导系数，因此应用其检测细胞内miRNA活性时只需检测Gluc表达活性即可，不必每次检测均测定转导系数。7.根据权利要求l，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，用于携带miRNA活性检测单元的AAV病毒包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及其任意两种型别的嵌合病毒。8.根据权利要求l，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，可用于检测全部明确成熟序列的miRNA的活性，miRNA包括天然的和人工设计的且无物种限制。9.根据权利要求l，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，通过检测细胞miRNA活性谱，筛选获得细胞特定时空条件下的特征miRNA活性谱，利用特征miRNA活性谱推测细胞的一系列特征(如来源、种类、生理特征等)或评价外界因素(如药物、转基因、环境变化等)对细胞的作用效果。全文摘要本发明具体涉及一种基于AAV(Adeno-associatedvirus)载体的高通量miRNA活性检测方法miRNAAsensorArray(miRNAsensorbasedAAVvectorArray，基于AAV载体的、用于miRNA活性检测的生物传感器)及其在细胞miRNA活性谱检测、不同细胞特征miRNA活性谱检测和外界因素(如药物、转基因)对细胞miRNA活性谱的影响等方面的应用。miRNAAsensorArray由不携带miRNA靶序列的controlAsensor和多种携带miRNA靶序列的miRNAAsensor按照一定顺序排列组成。ControlAsensor和miRNAAsensor均包含Gluc(Gaussialuciferase)和Fluc(fireflyluciferase)两个独立的表达单元，其中Gluc用于miRNA活性检测，Fluc用于计算miRNAAsensor的转导系数，校正不同miRNAAsensor之间的感染性差异。使用时，将待检测细胞加入到制备好的miRNAAsensorArray中，一段时间后检测Gluc表达情况并根据转导系数计算出细胞中miRNA活性谱。该方法为细胞miRNA活性谱的制作及其影响因素研究提供了新的选择。文档编号C40B40/02GK102719556SQ20111007614公开日2012年10月10日申请日期2011年3月29日优先权日2011年3月29日发明者吴小兵,田文洪,董哲岳,董小岩申请人:北京五加和分子医学研究所有限公司