专利名称：用于区分转移与非转移肺鳞癌的microRNA标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及ー类可用于区分转移与非转移肺鳞癌组织的microRNA标志物以及用途。本发明还涉及检测所述microRNA标志物的芯片和试剂盒。
背景技术：
原发性肺鳞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，发展迅速，治疗困难，病死率高。因此，肺鳞癌的尽早诊断就愈发显得迫切。任何事物的发生发展都处于内外因共同作用之下，内因为主，外因为辅。基因作为生命的遗传介质，在生物体的生、老、病、死中处于基础内因的地位。绝大部分基因通过转录生成核糖核酸，再翻译生成蛋白质而发挥生物学功能。 microRNA (miR或miRNA，微小RNA)是ー类在较高等的真核生物体内广泛存在的，长度约18-26个碱基的单链RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与ー些mRNA上的靶位点相结合，引起靶mRNA降解或翻译抑制，进而在转录后水平对靶基因进行调控。microRNA来源于长度约为IOOObp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60 80nt的具有茎环结构的miRNA前体(PreniRNA)。PreniRNA转运至胞质后,被Dicer酶进一步切割成长约22nt的双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex, RISC),与互补mRNA完全或不完全配对，降解祀mRNA或阻遏其表达。尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地对所有具有靶位点的mRNA产生调控作用，microRNA在生物体的发育乃至肿瘤的发生、发展过程所起的作用仍不可小视。然而，迄今为止，本领域对于与肿瘤(如肺鳞癌)相关的microRNA 了解甚少，因此本领域迫切需要进ー步地分离各种microRNA，尤其是与肿瘤的发生、转移、复发或检测有关的 microRNA。
发明内容
本发明的目的就是提供ー类新的、可用于区分转移与非转移肺鳞癌组织的microRNA标志物。本发明的另ー目的就是提供所述microRNA标志物的用途。在本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自⑴序列如SEQ ID NO :n所示的miRNA，其中η为选自1-21的正整数；或(ii)与 SEQ ID NO n 所示序列互补的 miRNA。在另ー优选例中，所述的miRNA分离自人。在本发明的第二方面,提供了ー种miRNA集(set)或组合(combination),所述的集或组合由序列如SEQ ID NO 1-21所示的21种miRNA所构成。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第一方面中所述的miRNA。在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第一方面中所述的miRNA。在另ー优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构Seq正向-X-Seq反向式 I,式I 中，能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，与Seq1^1基本上互补或完全互补的核苷酸序列； X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的ニ级结构
权利要求
1.一种分离的miRNA,其特征在于,所述的miRNA选自 ⑴序列如SEQ ID NO :n所示的miRNA，其中η为选自1_21的正整数；或 (ii)与SEQ ID NO n所示序列互补的miRNA。
2.—种miRNA集，其特征在于，所述集由序列如SEQ ID NO : 1_21所示的21种miRNA所构成。
3.一种分离的或人工构建的前体miRNA，其特征在于，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成权利要求I所述的miRNA。
4.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA,所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成权利要求I所述的miRNA。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有式I所示的结构 Seq正向_x_Seq反向 式I中， Seq1^1为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列， Seq&@为与Seq1^1基本上互补或完全互补的核苷酸序列； X为位于Seqtt和Seq&^^间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seqg不互补， 并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求I所述的miRNA，或权利要求4所述的多核苷酸。
7.权利要求I所述的miRNA的用途，其特征在于，用于制备区分转移与非转移肺鳞癌组织的芯片或试剂盒。
8.一种miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括 固相载体；以及 有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO :1-21所示的部分或全部序列。
9.如权利要求8所述的miRNA芯片的用途，其特征在于，用于制备区分转移与非转移肺鳞癌组织的试剂盒。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求8所述的miRNA芯片。
全文摘要
本发明涉及21个用于区分转移与非转移肺鳞癌的microRNA标志物。具体地，本发明涉及一类可用于区分转移与非转移肺鳞癌的microRNA标志物。经检验证明，这些特异性的microRNA标志物可非常有效地区分转移与非转移肺鳞癌组织。本发明还涉及检测所述microRNA标志物的芯片和试剂盒。
文档编号C40B40/06GK102851283SQ20111018316
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者何祥火, 梁琳慧, 陆舜, 陈智伟, 虞永峰 申请人:上海市肿瘤研究所