高密度生化阵列芯片的制作方法

专利名称：高密度生化阵列芯片的制作方法
高密度生化阵列芯片
优先权要求；相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求于2010年8月31日提交的名称为“高密度生化阵列芯片”的美国临时专利申请第61/378，844号的优先权和权益，其全部内容以引用的方式并入本文，如同在本说明书中完全描述一样；根据35U.S.C.§ 119(e)本申请还要求了于2010年8约31日提交的名称为“具有同步跟踪的高密度生化阵列芯片”的美国专利临时申请第61/378，848号，其全部内容以引用的方式并入本文，如同在本说明书中完全描述一样。
在联邦政府资助的研究和发展下作出的发明的权利的声明不适用
参照“序列表”、表格、或以磁盘上提交的计算机程序列表附录不适用
发明背景
本说明书涉及化学阵列芯片，特别是生化阵列芯片，用于通过光学技术用于化学分析。
阵列芯片，例如在化学和生物分析中使用的那些阵列芯片，允许平行地进行大量的生化实验。例如，生化阵列芯片可以为用于平行地处理生化实验的系统的一部分。阵列芯片具有由硅或玻璃晶片，或其它材料制成的固体的平面玻璃基板。生物分子、试剂、荧光标志物和其它化合物可以以常规的方式应用于阵列芯片。
根据精确的操作方案通过用试剂洗涤阵列芯片可以在阵列芯片上进行生化实验，所述操作方案指定了使用的特定化合物和混合物、温度、孵育时间和适合于特定类型实验的其它参数。
在一些操作环境下，生化实验 可以与荧光成像一起被用于鉴定DNA碱基-A、C、G或T-通过设计生化反应使得不同颜色的染料(例如，红色、绿色、蓝色或黄色)对应各碱基。例如，荧光显微镜或其它合适的光学系统可以被用于拍摄在阵列芯片上设置的和/或进行的生化实验的图像。观察到的颜色指示在具体的实验步骤中的DNA碱基。因此用这种DNA实验从阵列芯片中提取数据依赖于记录下由可能存在于所述芯片上的数百万或者甚至数十亿的生化实验发出的荧光的颜色。
然而，由于空间分辨率、准确度和速度的收益冲突，从致密的生化阵列芯片的荧光图像中得到有用的信息是非常复杂的。对于单个的实验，必须以足够的放大率得到图像以清楚地分辨。同时，图像必须覆盖足够大的视野以便于实验被准确的确认。最后，对于大规模的研究，成像和图像处理必须足够快地进行以提供足够的处理量，并且使后续的操作商业化可行。
发明概述
在此描述的是高密度阵列芯片的原则和多个实施方式，其处理设置在所述芯片上的生化实验的成像和图像处理所涉及的收益冲突。例如，在本书明书中描述的高密度阵列芯片处理如下问题:在允许从所述芯片的图像中快速提取数据的同时怎样实现在所述芯片上的非常高密度的生化实验。此外，在本文所述的高密度阵列芯片还处理如下问题:怎样提供阵列芯片与成像仪器之间的实时对准，所述成像仪器用于在操作过程中拍摄设置在所述芯片上的生化实验的图像。如本文所述的多个实施方式和原则中所示，这些问题是通过在具有与所述芯片的其它区域不同的节距和/或不同的密度的一个或多个示踪区域(trackregion)的形式的阵列芯片上的编码信息处理的。
例如，在本文所述的高密度阵列芯片提供占据所述芯片的总面积的小的百分比的示踪区域，而所述芯片的其它面积被具有不同的和/或更致密的阵列栅格(array grid)所占据。编码为阵列芯片的一个或多个示踪区域的信息被在操作中以减少用所述芯片校准成像仪器(例如，荧光显微照相机)的必要的时间，而同时提供这种对准的实时调整。所述成像仪器的实时对准是通过基于从所述阵列芯片上的示踪区域的图像提取的信息持续地监测对准误差而实现的，然后基于对准误差随着所述成像仪器移动穿过阵列芯片并且拍摄设置在其上的生化实验的照片而校正所述对准。
根据在说明书中描述的原则和实施方式，提供了适合于生化测定的阵列芯片设计，其中，所述芯片包括根据第一节距的附着位点排列的场区域和具有根据第二节距排列的单一维度点图形的至少一个示踪区域，其中，所述第二节距稍稀疏并且为非整数的多个第一节距，从而单一维度Moir6求平均数可以应用在所述示踪区域，因此实现芯片与具有更高密度的附着位点的光学仪器的对准。
在示例性的实施方式中，用于测定的芯片包括:基板，其包括场区域和示踪区域；实验位点，其被设置在场区域的第一图形化阵列中，所述第一图形化阵列由第一节距所限定；和对准位点，其被设置在示踪区域的第二图形化阵列中，所述第二图形化阵列由沿着单一维度的第二节距所限定。所述第二节距与第一节距的区别为非整数多个，从而允许基于Moire求平均数的对准。
在该实施方式的一个方面,所述场区域具有一个目标空间像素(object spacepixel) /个实验位点的密度。在另一方面，所述场区域具有两个目标空间像素/个实验位点的密度，其中，实验位点以棋盘图形排列在所述场区域。在又一方面，所述场区域具有四个目标空间像素/个实验位点的密度。
在一个方面，在所述示踪 区域的对准位点是有效的以支持生化实验。在另一方面，根据预选的图形删除选择的一些对准位点。在又一方面，根据伪随机的图形删除选择的一些对准位点。
在一个方面，在所述场区域的实验位点和在示踪区域的对准位点都被设置成支持生化实验。在一个方面，在所述场区域的实验位点和在示踪区域的对准位点都被设置成支持DNA纳米球的附着。
在一个方面，不同于实验位点(在场区域)和对准位点(在示踪区域)的阵列芯片的基板的区域进行化学处理以抑制结合靶核酸。
在单一维度的一个方面，沿着单一维度设置的示踪区域为横向维度。在一个方面，所述单一维度为垂直维度。
在一个方面，通过无位点带将所述示踪区域与所述场区域分离。在另一方面，所述示踪区域的尺寸为如下之一:目标空间像素的尺寸的三倍，和目标空间像素的五倍。
在一个方面，所述阵列芯片的基板进一步包括:水平示踪区域，其被设置成基本垂直于所述垂直示踪区域，其中，所述水平示踪区域包括根据沿着基本垂直于单一维度的第二维度的第二图形化阵列设置的示踪位点，所述示踪区域沿着所述示踪位点设置。
在一个示例性的实施方式中，一种方法包括:成像仪器对芯片进行成像，在所述芯片上已经设置了靶核酸，其中，所述芯片包括:包括场区域和示踪区域的基板、设置在由第一节距限定的且设置在场区域中的第一图形化阵列中的实验位点，和对准位点，其被设置在由沿着单一维度的第二节距限定的且设置在示踪区域中的第二图形化阵列中，其中，所述第二节距与第一节距的区别在于非整数倍，以及所述靶核酸被附着到实验位点和对准位点上；通过使用基于图像中记录的从附着至示踪区域的附着位点上的靶核酸发出的信号的至少部分的Moir6求平均数,相关逻辑确定单一维度校正对准项(correction alignmentterm);和基于所述校正对准项使所述芯片和成像仪器沿着单一维度自动对准。
在本实施方式的一个方面，所述芯片的基板进一步包括:水平示踪区域，其被设置成基本垂直于所述垂直示踪区域，其中，所述水平示踪区域包括根据沿着基本垂直于单一维度的第二维度的第二图形化阵列设置的示踪位点。在这个方面，所述方法进一步包括:通过使用基于图像中记录的从附着至示踪区域的附着位点上的靶核酸发出的信号的至少部分的Moir6求平均数,相关逻辑确定所述第二维校正对准项(correction alignmentterm);和基于所述第二校正对准项使所述芯片和成像仪器沿着第二维自动对准。
在本实施方式的一个方面，所述相关逻辑确定所述单一维度的校正对准项的步骤进一步包括:作为校正对准项的一部分，至少部分地基于图像中记录的从附着到所述示踪区域中的附着位点上的靶核酸发出的信号和表示在至少一个示踪区域中删除位点的图形的/[目息确定不踪节距未对准偏差。
在一个方面，所述附着到芯片上的靶核酸包含DNA纳米球。在另一方面，选择性地删除在所述示踪区域中的对准位点的亚集(subset)以形成缺失的图形，并且确定校正对准项的校正逻辑的步骤进一步包括:至少部分地基于表示缺失的图形的有序数据集计算所述校正对准项。
通过结合附图参考下面的详细的描述可以更好地理解本发明。
附图简述


图1为具有显示场区域和示踪区域的示例性图形的插入物的高密度生化阵列芯片的俯视图(非比例尺寸)。
图2为具有显示一个场区域和一个示踪区域的细节的示例性的高密度生化阵列芯片的一个场的插入物的俯视图。
图3为一个示例 性的高密度生化阵列芯片的一个场区域和一个示踪区域的部分的子域的俯视图，所述高密度生化阵列芯片显示相对于显示根据本发明的相对比例和位置的像素的重叠的附着位点的布置图形的一个实施方式。
图4为一个示例性的高密度生化阵列芯片的一个场区域和一个示踪区域的部分的子域的俯视图，所述高密度生化阵列芯片显示相对于显示相对比例和位置的目标空间像素的重叠的附着位点的布置图形的另一个实施方式。
图5为图4的部分的细节，其用于显示场区域和示踪区域的周期彼此为非整数倍。
图6为显示单一维度“Moir6求平均数”技术的图。
图7为使用缺失图形显示偏移测定(offset determination)的图。
发明详述
在下面的描述中，为了解释的目的，提出了多个具体的细节以提供对本发明的透彻的理解。然而，显而易见的是，对于本领域的技术人员而言，这些具体的细节全部不存在或一些不存在的情况下也可以作出本发明。
选择的定义
“阵列芯片”(或简单地“芯片”)指的是固相载体(例如，基板)，其具有表面，优选但不限于，平坦的或基本平坦的表面，其负载位点的阵列，核酸或大分子可以附着至位点上以形成生化测定。当附着到位点上时，所述核酸或大分子可以共价地结合到，或者可以非共价地结合到所述阵列芯片的固体载体上。通常地，所述附着的核酸或大分子的身份从它们的位点位置是不可辨别的，至少开始时是不可辨别的，但是通过在阵列上的特定的操作是可以确定的，例如，通过测序、杂交、译码探针等。参见，例如，美国专利第6，396，995号；第 6，544，732 号；第 6，401，267 号；和第 7，070，927 号；WO 公开 W02006/073504 和2005/082098 ;以及美国公开第 2007/0207482 号和第 2007/0087362 号。
“荧光团”为包括在特定的吸收光谱内吸收能量并以不同的发射光谱(但是同样的明确)重新辐射能量(例如，如光)的官能团的任何分子，或者由所述官能团组成的任何分子。用作标记的优选的荧光团包括，但不限于，荧光素、瀑布蓝(cascade blue)、六氯荧光素、四氯荧光素、TAMRA, ROX、FAM、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、德克萨斯红、曙红、购自马萨诸塞州的 Waltham 的 Thermo Fisher Scientific 的 DyLight Fluor 系列和俄勒网州的 Eugene的 Molecular Probes 的 Alexa Fluor 系列。
“像空间”指的是在相机 中的像素集覆盖的面积，以及“像空间像素”指的是相机像素。
“逻辑”指的是指令集，当由一个或多个处理器执行时，其是可运行的以实施一个或多个功能和/或以一个或多个结果的形式返回数据。在多个实施方式和执行中，任何这样的逻辑可以实现为通过一个或多个处理器执行的一个或多个软件部件、一个或多个硬件部件，例如，专用集成电路(ASIC)和/或现场可编程门阵列(FPGA)，或一个或多个软件部件与一个或多个硬件部件的任何组合。任何特定的逻辑的软件部件可以实现为单独的或客户端-服务器软件应用、一个或多个软件模块、一个或多个函数库和一个或多个静态和/或动态链接库，而不受限制。
关于核酸使用的“大分子”表示具有可测量的三维结构的核酸，包括:包括二级结构的直链核酸分子(例如，扩增子)、支链核酸分子和具有相互反应的结构元件的单个序列的多个分开的拷贝，例如，互补序列、回文序列、或在所述核酸中导致三维结构元件的其他序列插入物。
在本说明书中使用的“核酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“寡聚物”或语法等同成分通常是指共价地连接在一起的至少两个核苷酸。核酸将通常包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下，可以包括具有替代的主链的核酸类似物，例如，亚磷酰胺、二硫代磷酸酯、或甲基亚磷酰胺键；或肽核酸主链和键。其它核酸类似物包括具有双环结构的那些，包括锁核酸、阳性主链、非离子主链和非核糖主链。可以进行所述核糖-磷酸酯主链的修饰以增加分子的稳定性，例如，PNAiDNA杂交在某些环境下可以显示更高的稳定性。
“目标空间”指的是目标(例如，阵列芯片)的面积，而因此“目标空间像素”指的是在目标(例如，阵列芯片)上的面积单位。所述目标空间像素的尺寸通常是由图像空间像素的尺寸(例如，相机像素)和当相机被用于对目标空间成像时应用的放大率确定的。所述放大率为图像空间像素(即，相机像素)与对应于通过相机观察到的图像空间像素的目标空间面积的实际尺寸的比率。例如，16X的放大率允许相机使用8 μ m的像素观察500nm的目标空间像素。在多个实施方式中，目标空间像素的尺寸可以为:宽度为200-1000nm之间，以及长度为200-1000nm之间；在优选的方面，目标空间像素的尺寸可以为320nmX320nm，更优选600nmX600nm,甚至更优选500nmX500nm。在一些实施方式中，选择目标空间像素的尺寸为与在阵列芯片上的位点的尺寸基本相同，或稍大，从而仅仅单个的离散位点将装入目标空间像素。这确保在操作上，从所述阵列芯片的位点发出的能量(例如，光)的强度可以被单个的相机像素记录。
“节距”(又称作“周期(period) ”)指的是限定图形(例如阵列)的均一的距离。阵列芯片或其区域的节距，指的是任何设置在芯片上的阵列格栅中的任何两个相邻的位点的中心之间的均一的距离，因此限定了芯片的阵列，或其区域。相机的节距指的是任何两个相邻的相机像素的中心之间的均一的距离，并且限定了相机的像素阵列。
关于靶核酸的“序列测定”表示涉及在靶核酸中的核苷酸序列的信息的测定。这种信息可以包括所述靶核酸的部分或全部序列信息的确定或测定。所述序列信息可以被测定而具有变化程度的统计可信度或置信度。在一方面，所述术语包括身份的测定和从靶核酸中不同的核苷酸开始的在靶核酸中的多个连续核苷酸的排序。
“位点”(又称作“点(spot) ”)表示不与芯片上的其它位点重叠的空间地限定在阵列芯片上的区域；也就是，在阵列芯片上的位点是空间离散的，并且可以以特定的图形排列。在阵列芯片上，位点通常被设定为具有适合于核酸或大分子附着的尺寸(例如，长度、宽度和可能的深度或高度)。位点的实例包括，但不限于，凹陷、凸起区域、微孔、珠等。
“靶核酸”指的是来自基因、调控元件、基因组DNA(包括，但不限于，人DNA)、cDNA、RNA (包括mRNA、rRNA、siRNA、miRNA等)及其片段的核酸(或其大分子)。靶核酸可以为来自样品的核酸，或二级核酸，例如，扩增反应的产品。
阵列芯片成像
基于图像的技术通过实验被设置在芯片上的位点的位置确认在阵列芯片上的单个的生化实验。例如，从所述位点发出的能量(例如，如光)的强度被记录为图像，然后处理图像以测定所述位点在芯片上的位置。生化实验可以通过它的位点在芯片上的在二维(例如，X-Y)，例如平面坐标系的坐标确定。阵列芯片的图像通常包括足够大的区域使得可以关于使用的坐标系测量和/或计算实验位点的位置。一些现有方法使用常规的对准标记(例如，如交叉蚀刻)以达到该目的；然而，这种标记的缺点包括用荧光显微镜难以观察它们，材料的不相容性和浪费的芯片面积。相比较而言，在本文所述高密度阵列芯片使用生化实验本身(以特定的图形排列)，和从其中发出的能量，以协助确认。
在多个操作环境下，设置在阵列芯片上的生化实验的图像可以使用成像仪器得至IJ，所述成像仪器包括附着到荧光显微镜上的相机。所述显微镜的放大率确定由所述相机像素一次可以“看到”的生化实验位点的数目；同样地，所述放大率确定相机像素的尺寸(在像空间)与观察到的且对应于相机像素的芯片区域的尺寸(在目标空间中)的比率。例如，16X的放大率允许相机使用8μπι的像素记录来自500nm芯片区域的信号(例如，目标空间像素)。因此，从阵列芯片上可以提取的数据的速率部分地取决于多少相机像素对应于芯片上的各点 (假定点的尺寸小于目标空间像素的尺寸)。例如，以二十个相机像素/点运行的一兆像素的相机可以照出50，OOO个点。如果相同的相机以两个(或甚至一个)相机像素/点运行，则每张图像上点的数目为十倍(或二十倍)。低的像素-点的比率(例如，如1: 1、2:1和4:1)是非常合意的，因为它们大大提高的成像处理量，它们还对在运行过程中的相机像素与阵列点的对准提出了非常高的要求。
根据在本文所述的原则和实施方式，仔细设计的在阵列芯片上用于生化实验的位点的空间图形有利于通过荧光成像获得数据的精度和速度。在下文中描述的特定的设计原则使得非常高密度的生化阵列能够快速成像，而因此提高大规模成像系统的处理量，例如基因组测序系统。此外，所述的新型芯片涉及有利于芯片对准和确认的精度，同时使可以用于生化实验位点的芯片的面积最大化。
如在本说明书中所述，通过使用Moir6求平均数校正亚像素X_Y对准的误差实现分数偏移(fractional offset)的精确对准校正。在Moir6求平均数中，有意地设定放大率从而使得对应于成像元件的像素(例如，相机)的目标空间像素的周期为限定芯片的示踪区域中位点的周期的非整数倍。通过提供预定的和伪随机地设置的位点集(在本文中称作删除或保留位点)实现精确的像素水平的对准，在位点集上防止生化材料附着到所述芯片基板上从而阵列的删除位点可以用于图形匹配组合(pattern matching scheme)中作为绝对位置确认的定位标记。高密度阵列芯片的比例、旋转和X-Y偏移的初始定位和后续校正在如下文献中有所描述:(1)在2011年4月22日提交的标题为“用于DNA测序的阵列的精确定位的方法和系统(METHOD AND SYSTEM FOR ACCURATE REGISTRATION OF ARRAY FORDNA SEQUENCING) ”的美国专利申请序列号第13/092，618号，其全部内容以引用的方式并入本文，如同在本说明书中完全描述一样；和(2)在2010年10月26日提交的标题为“用于具有亚像素对准的高密度生化阵列芯片成像的方法和系统(METHOD AND SYSTEM FOR IMAGINGHIGH DENSITY BIOCHEMICAL ARRAYS WITH SUB-PIXEL ALIGNMENT) ”的美国专利申请序列号第12/912，641号,其全部内容以引用的方式并入本文,如同在本说明书中完全描述一样。
具有示踪区域的高密度阵列芯片
现在转向图1，其示出了根据一实施方式的高密度生化阵列芯片。芯片100基于固体的平面基板，以 及便利地设置规格为长度和宽度为数厘米。例如，通常的芯片尺寸可以为2.5cmX7.5cmX0.lcm。更小的芯片(例如，边长小于约0.5cm)是可能的，但是在某些操作环境中可能不方便处理，并且其可能难以保持更大的芯片(例如，边长大于约10cm)所需的平整性。在一些实施方式中，根据本文所述原则设计的芯片可以支持超过10亿个生化实验。例如，在使用DNA纳米球(其在后面将作为单独的章节描述)的cPAL测序中，各实验是在直径约为300nm的圆形区域内进行的。在另一实施方式中，生化实验可以在直径为30-1000nm之间(或长度和宽度)，或者甚至在直径为200_500nm之间(或长度和宽度)的芯片位点上进行。
为了使成像问题分成可管理的大块，阵列芯片被分为微米至毫米尺寸的场；例如，场105。在一个实施方式中，通常的场可以为500μπιΧ500μπι;因此，通常芯片被分为数百或数千个场。在其它实施方式中，场的尺寸可以为320-1600 μ mX 320-1600 μ m, 600 μ mX600 μ m,或者甚至 1.6mmX 700 μ m。
图2为高密度阵列芯片的一个场205的图。所述场被分为子域(例如，210、212、214)，所述子域是被基本沿着水平X维对齐的示踪区域(例如，示踪区域220)和基本垂直于X维区域的沿着垂直Y维对齐的示踪区域(例如，示踪区域224、226)分开的。放大的视图230显示在被示踪区域226分开的两个子域中的点。除了分开所述子域的示踪区域之外，图1和2的芯片不包括用于对齐的任何标记或特征。下面将详细描述示踪区域的性能、布置它们的原则以及它们与子域的关系。
图3为根据示例性的实施方式的高密度阵列芯片的一个场的子域的一部分的图。圆形区域330表示与图2中的视图230的场的相同的放大视图。在该视图中，仅为了显示的目的，示踪区域326被加粗虚线380和381所界定；然而，实际上，所述阵列芯片本身不存在这种虚线。
在图3示出的实施方式中，垂直示踪区域326的宽度被设定为等于3个目标空间像素的长度，其对应于根据可应用的放大倍数的相机(或像空间)像素。在这个实施方式中，水平示踪区域的高度可以与示踪区域326的宽度相同。在一些实施方式中，垂直示踪区域的宽度(或类似地，水平示踪区域的高度)可以等于相邻的非示踪区域的阵列格栅的5个目标空间像素。如在图3中所示，无位点带将示踪区域326与各相邻的区域340和345分开。在运行时，这些无位点带防止从设置在更致密地植入的区域340和345上的实验发出的光信号干扰设置在示踪区域326的位点上的实验发出的信号。在其它实施方式中，所述示踪区域不需要用无位点带与场区域分离，而是，在这些实施方式中，即使所述示踪区域被嵌入在场区域中，没有无位点带分离，可以使用相关逻辑正确地处理记录在示踪区域的图像中的信号。例如，可以设置相关逻辑来区分来自场区域的“在节距上的(On-Pitch)IIf号和示踪区域的不同的“不在节距上的(ofT-pitch) ”信号，这种区分依赖于“在节距上的”信号趋于通过平均为零而容易被抵消的性质。
在图3的实施方式中，区域340和345为与示踪区域326的任一侧相邻的子域的一部分。荧光点(例如，351、352和353)出现在子域中；在示踪区域326中也观察到了荧光点(例如，360和362)。在这个实施方式中，设置在子域点上和示踪区域点上的生化实验，或者用于标记(tag)实验的荧光标志物没有任何差异。空心圆(例如，361)表示点的有意缺失，例如，删除点。通过删除在用于图形化阵列芯片上的位点的光刻掩膜上的相应的特征可以方便地形成这种删除点。根据在本文所述的原则，所述删除点优选总计多于在所述示踪区域中可用的点位置的5%，但是少于15%。在所述示踪区域中的点可以为生化或荧光分子的附着位点，与场区域中的位点相同或 类似。所述删除点可以为不存在附着位点，或者它们可以为已经被后续地化学处理以抑制或防止结合生化或荧光分子的附着位点。
仅为了说明的目的，在图3中的细虚线(例如，370、371)表示对应于相机中的物理像素(例如，图像空间像素)的边界的目标空间像素之间的边界，所述相机被用于以特定的放大率对芯片成像。因此，当图3以比相机的像素周期更精细的分辨率画出时，用具有由图中的细虚线界定的像素的相机拍摄的区域330的图像不能分辨比所述像素周期更精细的空间特征。尽管这种局限，如下所述，示踪区域中的点的布置允许点与具有亚像素分辨率的像素对准。
在示于图3中芯片上的点的布置(而因此在运行中在芯片上的生化实验的布置)提供了目标空间像素与区域340和345中的阵列点的2:1的比率，所述区域340和345为在所述阵列芯片上子域的一部分。也就是，在区域340和345中的面积被设置为两个目标空间像素/个阵列点。在示踪区域仅占据场的总面积的几个百分比的程度上，2:1的像素对点的比率大致在整个芯片上保持。然而，如在下文中进一步描述，更高密度的布置也是可能的。
例如，图3示出了阵列芯片，其中，子域区域的点以棋盘的图形设置在阵列上。具有棋盘图形的阵列具有如下的点节距:
Vi *阵列节距，
并且其为任意两个相邻点的中心之间的对角线距离。例如，对于具有500nm的目标空间节距的阵列而言，限定棋盘图形的点节距为:
*500=707nm。
以另一种方式看，在具有以棋盘图形排列的点的阵列中，在各相邻行中的点偏移±1栏。
在荧光成像中，在阵列芯片上使用棋盘图形是有利的，因为从芯片点发出的光可以垂直地或水平地扩散到(bleed)相邻的点上但是不会扩散到角落的点上。因此，以棋盘图形设置阵列芯片的点允许非常高密度的两个目标空间像素(而因此两个相机像素)/个点，同时使由在成像仪器的电子器件内的信号扩散引起的串扰最小化。
图4为根据示例性的实施方式的高密度阵列芯片的一个场的子域的一部分的图。图4类似于图3，除了在图4中子域中的目标空间像素(而因此，相机像素)与阵列点比率为1:1之外。圆形区域430表示与图2中的视图230和在图3中的视图330的场的相同的放大视图。在该视图中，仅为了显示的目的，示踪区域426被加粗虚线所界定；然而，实际上，所述阵列芯片本身不存在这种虚线。
在图4示出的实施方式中，垂直示踪区域426的宽度被设定为等于3个阵列(或目标空间)像素的长度，其对应于根据应用的放大倍数的相机(或像空间)像素。在这个实施方式中，在阵列芯片上的水平 示踪区域的高度可以与示踪区域426的宽度相同。在其它实施方式中，垂直示踪区域的宽度(或类似地，水平示踪区域的高度)可以等于相邻的非示踪区域的阵列格栅的5个目标空间像素。如在图4中所示，无位点带将示踪区域426与各相邻的区域440和445分开。在运行时，这些无位点带防止从设置在更致密地植入的区域440和445上的实验发出的光信号干扰设置在示踪区域326的位点上的实验发出的信号。在其它实施方式中，所述示踪区域不需要用无位点带与场区域分离，而是，在这些实施方式中，即使所述示踪区域被嵌入在场区域中，没有无位点带分离，可以使用相关逻辑正确地处理记录在示踪区域的图像中的信号。例如，可以设置相关逻辑来区分来自场区域的“在节距上的(on-pitch)”信号和示踪区域的不同的“不在节距上的(off-pitch) ”信号，这种区分依赖于“在节距上的”信号趋于通过平均为零而容易被抵消的性质。
区域440和445为与示踪区域426的任一侧相邻的子域的一部分。荧光点(显示为黑色点)出现在子域和示踪区域中。由子域点和示踪点、或用于观察它们的荧光标志物表示的生化实验没有任何区别。空心圆(例如,461)表示点的有意缺失(例如,删除点)。通过删除在用于图形化阵列芯片上的位点的光刻掩膜上的相应的特征可以方便地形成这种删除点。
在示于图4中的点的布置(而因此在运行中在芯片上的生化实验的布置)提供了目标空间像素与区域440和445中的阵列点的1:1的比率，所述区域340和345为在所述阵列芯片上子域的一部分。也就是，在区域440和445中的面积被设置为一个目标空间像素(而因此，一个相机像素)/个阵列点。这种布置导致在各场图像中包含大量的信息。例如，在图4中示出的实施方式中，大约5%的芯片面积被用于示踪区域，而余下的95%的芯片面积被以一个目标空间像素(而因此，一个相机像素)/个阵列点的最高密度使用。
在根据本文所述的原则的其它实施方式中，在阵列芯片的非示踪区域中的位点可以以提供4个目标空间像素(而因此4个相机像素)/个位点的密度的布置设置。即使这种4:1像素/位点的密度低于在图3和图4中示出的位点密度，当与常规的阵列芯片相比，其仍然是非常高的密度；在提交本申请时，市售可得的生化阵列芯片具有10:1至25:1像素/位点密度的密度。
在本文所述的高密度阵列芯片的设计几乎没有留下任何成像错误的空间，因为相机像素与阵列点的仅为四分之一(0.25)的像素周期的未对准可以导致不可接受的数据采集错误。针对此，下文中描述了用于设计具有示踪区域的阵列芯片的技术和用于在校正对准误差方面使用Moir6求平均数的技术，所述示踪区域提供在所需的公差内的对准。
示踪区域结构的参数的确定
根据本文所述的原则和实施方式，在示踪区域中的位点(又被称作“示踪位点”)的布置是根据对准相机像素与在阵列芯片上的位点的所需公差而确定的。为了确定实现特定的亚像素对准公差(而因此为示踪区域的节距)所必需的示踪位点的数目，可以使用下面的计算式。
作为一个实例，假定优选的预对准系统需要5nm的对准公差测量误差，并且Moir6求平均数将被用于使相机像素与在阵列芯片上的位点对准。对阵列的示踪中的任何位点的测量误差可以为大至±0.5个像素，而因此单个的目标空间像素i的平均误差大约为0.25个像素，例如，
I [误差]I i I 0.25*目标空间像素的尺寸
为了 Moir6求平均数的目的，平均的对准误差为所有对准误差的总和的平均值与校正对准值之间的差，也就是
权利要求
1.用于测定的芯片，其包括: 基板，其包括至少一个场区域和至少一个示踪区域； 实验位点，其被设置在所述至少一个场区域的第一图形化阵列中，所述第一图形化阵列由第一节距所限定；和 对准位点，其被设置在所述至少一个示踪区域的第二图形化阵列中，所述第二图形化阵列由沿着单一维度的第二节距所限定； 其中，所述第一节距与第二节距的区别为非整数倍，从而允许基于Moir6求平均数的对准。
2.如权利要求1所述的芯片，其中，所述至少一个场区域具有一个目标空间像素/个实验位点的密度。
3.如权利要求1所述的芯片，其中，所述至少一个场区域具有两个目标空间像素/个实验位点的密度，以及其中，所述实验位点以棋盘图形排列在所述至少一个场区域。
4.如权利要求1所述的芯片，其中，所述至少一个场区域具有四个目标空间像素/个实验位点的密度。
5.如权利要求1所述的芯片，其中，所述对准位点适合于支持生化实验。
6.如权利要求1所述的芯片，其中，根据预选的图形删除选择的一些对准位点。
7.如权利要求1所述的芯片，其中，根据伪随机的图形删除选择的一些对准位点。
8.如权利要求1所述的芯片，其中，所述实验位点和所述对准位点被设置为支持生化实验。
9.如权利要求1所述的芯片，其中，除了所述实验位点和所述对准位点之外的基板的区域被设置为抑制靶核酸的结合。
10.如权利要求1所述的芯片，其中，所述实验位点和所述对准位点被设置为支持DNA纳米球的附着。
11.如权利要求1所述的芯片，其中，所述单一维度为水平维度。
12.如权利要求1所述的芯片，其中，所述单一维度为垂直维度。
13.如权利要求1所 述的芯片，其中，通过无位点带将所述至少一个示踪区域与所述至少一个场区域分离。
14.如权利要求1所述的芯片，其中，所述单一维度为垂直维度，以及所述至少一个示踪区域的宽度为如下之一:目标空间像素的尺寸的三倍；和目标空间像素的尺寸的五倍。
15.如权利要求1所述的芯片，其中: 所述基板进一步包括水平示踪区域，其被设置为基本垂直于所述至少一个示踪区域；以及 所述水平示踪区域包括根据沿着基本垂直于所述单一维度的第二维度的第二图形化阵列设置的示踪位点。
16.方法，其包括: 用成像仪器捕获芯片的图像，在所述芯片上已经设置有靶核酸，所述芯片包括: 基板，其包括至少一个场区域和至少一个示踪区域； 实验位点，其被设置在所述至少一个场区域的第一图形化阵列中，所述第一图形化阵列由第一节距所限定；和对准位点，其被设置在所述至少一个示踪区域的第二图形化阵列中，所述第二图形化阵列由沿着单一维度的第二节距所限定； 其中，所述第一节距与第二节距的区别为非整数倍；以及 其中，所述靶核酸被附着到所述实验位点上和所述对准位点上； 根据相关逻辑基于在图像中记录的信号通过使用，至少部分地使用，Moir6求平均数来确定所述单一维度的第一校正对准项，所述信号是从附着到所述至少一个示踪区域的对准位点上的靶核酸发出的；以及 使芯片与成像仪器基于校正对准项沿所述单一维度自动地对准。
17.如权利要求16所述的方法，其中: 所述芯片的基板进一步包括:水平示踪区域，其被设置成基本垂直于所述至少一个示踪区域，其中，所述水平示踪区域包括根据沿着基本垂直于所述单一维度的第二维度的第二图形化阵列设置的示踪位点； 所述方法进一步包括: 根据相关逻辑基于在图像中记录的信号通过使用，至少部分地使用，Moir6求平均数来确定所述第二维的第二校正对准项，所述信号是从附着到所述第二示踪区域的示踪位点上的靶核酸发出的；以及 使芯片与成像仪器基于所述第二校正对准项沿所述第二维自动地对准。
18.如权利要求16所述的方法，其中，确定单一维度的校正对准项的相关逻辑进一步包括: 作为校正对准 项的一部分，至少部分地基于如下确定示踪节距未对准误差: 在图像中记录的信号，所述信号是从附着到所述至少一个示踪区域中的对准位点上的靶核酸发出的；和 表示在所述至少一个示踪区域中的删除位点的图形的信息。
19.如权利要求16所述的方法，其中，所述靶核酸包括DNA纳米球。
20.如权利要求16所述的方法，其中，选择性地删除所述对准位点的亚集以形成缺失的图形，并且确定校正对准项的校正逻辑进一步包括:至少部分地基于表示缺失的图形的有序数据集计算所述校正对准项。
全文摘要
本发明提供了用于生化阵列的阵列芯片，其中，所述芯片包括根据第一节距的附着位点排列的场区域和具有根据第二节距排列的单一维度点图形的至少一个示踪区域，其中，所述第二节距稍稀疏并且为非整数的多个第一节距，从而单一维度Moiré求平均数可以应用在所述示踪区域，因此实现芯片与具有更高密度的附着位点的光学仪器的对准。
文档编号C40B20/02GK103180496SQ201180050914
公开日2013年6月26日 申请日期2011年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者布赖恩·P·斯泰克 申请人:考利达基因组股份有限公司