超强抗砷菌As-6及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种从环境样品中选育和分离的具有超强抗砷性能，可高效氧化含砷硫化矿特别是砷黄铁矿的浸矿菌及其在高砷金矿预氧化中的应用，属于微生物冶金【技术领域】。本发明的超强抗砷菌As-6经鉴定为氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillum?ferrooxidans)，系从高砷金精矿库房排水沟酸性泥样中选育分离所得，其抗砷浓度达21.5％。用该菌对含砷量43％的超高砷金精矿进行预氧化，可使氧化渣的含砷量降低92.16％，重量下降53.02％；提金试验表明，氧化渣金的浸出率达到93.04％，是未经细菌预氧化的金精矿的5倍。超强抗砷菌As-6对于提高我国难处理高砷金矿资源的利用率具有重要作用，其应用前景广阔。
【专利说明】超强抗砷菌As-6及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种从环境样品中选育和分离具有超强抗砷性能，可高效氧化含砷硫化矿特别是砷黄铁矿的浸矿菌及其在高砷金矿预氧化中的应用。
【背景技术】:
[0002]含砷硫化矿是有价金属特别是贵金属的重要载体矿物，全球超过2 / 3我国约有I / 3的金矿是含砷矿。含砷金矿的金被包裹在砷黄铁矿一类的硫化矿中，属于难利用金矿，如不进行预处理金的提取率很低。目前国内外普遍采用氧化法预处理含砷难利用金矿，包括氧化焙烧法、加压氧化法、化学氧化法和微生物氧化法等(郑存江.含砷难浸金矿的研究及应用[J].陕西地质.2003，21 (I):88-97;李俊萌.难处理金矿石预处理方法研究现状及其发展趋势[J].稀有金属，2003，27 (4):478-481 ;陈聪，姚香.难处理金矿石预处理方法简述[J].黄金科学技术，2004，12 (4):27-30 ;王力军，刘春谦.难处理金矿石预处理技术综述[J].黄金.2000,21(1):38-45)，其中微生物预氧化法对环境无污染、流程简单、投资少、成本低，是最有发展前景的预处理方法(伍赠玲.高砷微细浸染型难处理金矿细菌预氧化-氰化提金试验研究[J].矿冶工程，2010，30 (I) =54-56,61.;王康林，汪模辉，蒋金龙.难处理金矿石的细菌氧化预处理研究现状[J].黄金科学技术，2001，9 (I):19-24.)。由于含砷金矿中的三价砷有很强的生物毒性，用于含砷金矿预氧化的微生物必须具备抗砷性能和砷氧化能力，微生物的抗砷性能和砷氧化能力决定了含砷金矿的微生物预处理效果，进而决定了金的回收率和提取成本。目前用于含砷金矿预氧化的微生物对砷浓度都有一定要求，大多在2%~10%之间，最高不超过15%，这是因为过高的砷将对微生物造成毒害甚至致死，严重影响预氧化效果。而事实上很多含砷金精矿的含砷量甚至达到40%以上，目前这部分砷含量超高的金矿还不能利用微生物进行预处理。因此，寻找抗15%以上砷浓度的超强抗砷菌对于提高我国含砷金矿资源的利用率具有重要意义。
【发明内容】
:
[0003]技术问题
[0004]针对上述问题本发明从高砷金精矿库房排水沟酸性泥样中选育和分离了一株超强抗砷菌As-6，并应用于高砷金精矿的预氧化。该菌的抗砷浓度达到21.5%。本发明提供的超强抗砷菌，将对我国含砷难处理金矿的高效利用产生重要的推动作用。
[0005]技术方案
[0006](I)菌种选育
[0007]采集高砷金精矿库房排水沟酸性泥样，加入2倍体积的稀硫酸水溶液(pH2.0)，缓慢搅拌混溶，制成悬浊液。
[0008]取一只已灭菌的250mL三角瓶，加入150mL培养基1，按5%的接种量接入上述样品悬浊液，用稀硫酸调PH至2.0，在30°C下震荡培养，定期检测培养液的Fe2+，当Fe2+氧化率达到95%以上时，按配方比例重新向培养液中加入FeSO4.7H20，并用灭菌水补足培养液至原体积(150mL)，继续震荡培养10d，此为第一代富集物。
[0009]将第一代富集物按2%的接种量，转接到150mL培养基2中，在相同条件下震荡培养，定期检测菌密度，待菌密度到达拐点时终止培养，此为第二代富集物。
[0010]取第二代富集物，按10%的接种量转接到相同体积的培养基3中，在相同条件下连续震荡培养，定期检测菌密度，直到菌密度达峰值时停止培养，此为第三代富集物。
[0011]吸取第三代富集物，按15%的接种量转接到同样体积的培养基4中，改为搅拌培养，其它条件相同，待菌密度到达最高点时停止培养，得到第四代富集物。
[0012]取第四代培养物，按15%的接种量转接到同样体积的培养基5中，在上述相同条件下继续培养，检测菌密度到达最高点时停止培养，得到第五代富集物。
[0013]取第五代培养物，按20%的接种量转接到同样体积的培养基6中，在相同条件下继续搅拌培养，检测菌密度到达最高点时停止培养，得到第六代富集物。
[0014](2)菌种分离
[0015]将第六代富集物按ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ,稀释度，分别接入分离培养基中，在30°C下进行震荡稀释分离，采用直接计数法测定活细胞数，当活菌数达IXlO7 / ml时，停止培养，选择稀释倍数最高的培养物作为稀释物I ;如此再反复稀释分离三次，最后得到稀释物4即纯菌株。经16S rRNA基因序列验证，与氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans)的相似性达99%，鉴定为氧化亚铁钩端螺旋菌。该菌株的16S rRNA基因序列已在GenBank注册，注册号KF150286。由于As-6菌株的抗砷能力远高于已有抗砷菌,具有超强抗砷性能，故命名为超强抗砷菌As-6(见图)。该菌已在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2013515。保藏单位地址:武汉市武昌珞珈山，邮编:430072，电话:
(027)-68752319 ;保藏日期:2013 年 10 月 25 日。
[0016](3)菌种保存与活性维持
[0017]按第六代富集物相同的培养方法，每20天转接一次，可长期保存As-6菌并维持其抗砷活性。
[0018]⑷应用试验
[0019]用本发明选育和分离的超强抗砷菌As-6对含砷量达43%的金精矿进行的预氧化试验。试验温度30°C,接种量10% (V / V),矿衆浓度20% (w / V),预氧化系统总体积10L，搅拌速度180转/分钟，试验时间7天。原矿和氧化渣中金、砷和其它金属元素的含量均采用原子吸收光谱法测定。
[0020]试验结果:氧化渣与原金精矿相比，含砷量降低了 92.16%，重量下降了 53.02%。氧化洛提金试验表明，当氧化洛浓度25% (w / V),初始氰化钠浓度为0.15 % (w / V),pH=9.5~10时，20°C下经过48小时，氧化渣中93.04%的金被浸出，氧化渣金的浸出率是未经细菌预氧化的金精矿的5倍。试验结果表明，该超强抗砷菌对我国难处理高砷金矿资源的高效利用具有重要意义，应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】:
[0021] 图:超强抗砷菌As-6【具体实施方式】:[0022](I)菌种选育
[0023]采集高砷金精矿库房排水沟酸性泥样，加入2倍体积的稀硫酸水溶液(pH2.0)，缓慢搅拌混溶，制成悬浊液。
[0024]取一只已灭菌的250mL三角瓶，加入150mL培养基1，按5%的接种量接入上述样品悬浊液，用稀硫酸调PH至2.0，在30°C下震荡培养，定期检测培养液的Fe2+，当Fe2+氧化率达到95%以上时，按配方比例重新向培养液中加入FeSO4.7H20，并用灭菌水补足培养液至原体积(150mL)，继续震荡培养10天，此为第一代富集物。
[0025]将第一代富集物按2%的接种量，转接到150mL培养基2中，在相同条件下震荡培养，定期检测菌密度，待菌密度到达拐点时终止培养，此为第二代富集物。
[0026]取第二代富集物，按10%的接种量转接到相同体积的培养基3中，在相同条件下连续震荡培养，定期检测菌密度，直到菌密度达峰值时停止培养，此为第三代富集物。
[0027]吸取第三代富集物，按15%的接种量转接到同样体积的培养基4中，改为搅拌培养，其它条件相同，待菌密度到达最高点时停止培养，得到第四代富集物。
[0028]取第四代培养物，按15%的接种量转接到同样体积的培养基5中，在上述相同条件下继续培养，检测菌密度到达最高点时停止培养，得到第五代富集物。
[0029]取第五代培养物，按20%的接种量转接到同样体积的培养基6中，在相同条件下继续搅拌培养，检测菌密度到达最高点时停止培养，得到第六代富集物。
[0030](2)菌种分离
[0031]将第六代富集物按10_8、10_9、10_1(1稀释度，分别接入分离培养基中，在30°C下进行震荡稀释分离，采用直接计数法测定活细胞数，当活菌数达IXlO7 / ml时，停止培养，选择稀释倍数最高的培养物作为稀释物I ;如此再反复稀释分离三次，最后得到稀释物4即As-6纯菌。经16S rRNA基因序列验证,与氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans)的相似性达99%，鉴定为氧化亚铁钩端螺旋菌。该菌株的16S rRNA基因序列已在GenBank注册，注册号KF150286。由于As-6菌株的抗砷能力远高于已有抗砷菌，具有超强抗砷性能，故命名为超强抗砷菌As-6 (见图)。As-6菌返接到培养基6中，72小时即可达到菌密度峰值，表明该菌对含砷量达43%的金矿具有很好的适应性，抗砷浓度已达到21.5%。该菌已在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2013515o保藏单位地址:武汉市武昌珞珈山，邮编:430072，电话:(027)-68752319 ;保藏日期:2013年10月25曰。
[0032](3)菌种保存与活性维持
[0033]按第六代富集物相同的培养方法，每20天转接一次，可长期保存As-6菌并维持其抗砷活性。
[0034](4)应用试验
[0035]用本发明选育和分离的超强抗砷菌As-6对含砷量达43%的金精矿进行的预氧化试验表明，在30°C下，当接种量10% (V / V),矿衆浓度20% (w / V),预氧化系统总体积10L，搅拌速度180转/分钟，经过7天，氧化渣与原矿相比，含砷量降低了 92.16%，重量下降了 53.02%,试验结果见表1。氧化洛提金试验表明，当氧化洛浓度25% (w / V),初始氰化钠浓度为0.15% (w / V)，pH=9.5~10时，20°C下经过48小时，氧化渣中93.04%的金被浸出，氧化渣金的浸出率是未经细菌预氧化的金精矿的5倍，试验结果见表2。原金精矿和氧化渣中金、砷和其它金属元素的含量均采用原子吸收光谱法测定。
[0036]本发明所用培养基配方如下:
[0037]培养基I: (NH4)2S043.0g / L, MgSO4.7Η200.5g/L, KH2PO40.5g/L, Ca(NO3)20.01g/L，FeSO4.7H205g / L，高砷金精矿(Asl9.2% )50g/L。
[0038]培养基2: (NH4)2SO41.5g / L，MgSO4.7Η200.25g / L, K2SO4L Og/L,
0.5g(NH4)2HP04g/L，高砷金精矿(Asl9.2% ) 100g / L。
[0039]培养基3: (NH4)2SO4L Og / L，MgSO4.7Η200.2g/L，K2S042.0g / L，1.0g(NH4)2HPO4g/L，高砷金精矿(Asl9.2% )200g/L。
[0040]培养基4: (NH4)2SO4L Og/L, MgSO4.7Η200.2g / L，K2S044.0g/L, 2.0g(NH4)2HPO4g /L，高砷金精矿(Asl9.2% )300g/L。
[0041]培养基5:高砷金精矿(Asl9.2% )400g / L，其它成分配比与培养基4相同。
[0042]培养基6:高砷金精矿(Asl9.2% ) 500g/L，其它成分配比与培养基5相同。
[0043]分离培养基=(NH4)2SO4LOg/ L, MgSO4.7H200.2g/L, K2S044.0g / L，
2.0g(NH4) 2HP04g/L, As203150g/L。
[0044]培养基I至6所用的金精矿砷含量为43%,各兀素的质量百分比见表1。
[0045]表1细菌氧化前后金精矿主要元素含量比较)
【权利要求】
1.超强抗砷菌As-6，其特征在于该菌是从高砷金精矿库房排水沟酸性泥样中选育分离所得，其抗砷浓度高达21.5%,该菌经鉴定为氧化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferrooxidans)，保藏号为CCTCC NO:M2013515。其选育分离步骤为: (1)菌种选育 采集高砷金精矿库房排水沟酸性泥样，加入2倍体积的稀硫酸水溶液(pH2.0)，缓慢搅拌混溶，制成悬浊液。在PH2.0和30°C条件下，依次经6种配方培养基振荡或搅拌培养，最后得到第六代富集物。
培养基 1: (NH4)2S043.0g / L, MgSO4.7H200.5g/L, KH2PO40.5g/L, Ca(NO3)20.01g/L,FeSO4.7H205g/L，高砷金精矿(Asl9.2% ) 50g / L。
培养基 2: (NH4) 2S041.5g/L，MgSO4.7H200.25g / L，K2SO4L Og/L, 0.5g (NH4) 2HP04g/L，高砷金精矿(Asl9.2% )100g / L。
培养基 3: (NH4)2SO4L Og / L，MgSO4.7H200.2g/L，K2S042.0g / L，1.0g (NH4) 2HP04g/L,闻神金精矿(Asl9.2% ) 200g / L0
培养基 4: (NH4)2SO4L Og / L，MgSO4.7H200.2g/L，K2S044.0g/L, 2.0g (NH4) 2HP04g/L，高砷金精矿(Asl9.2% )300g / L。 培养基5:高砷金精矿(Asl9.2% )400g/L，其它成分配比与培养基4相同。 培养基6:高砷金精矿(Asl9.2% )500g/L，其它成分配比与培养基5相同。 培养基I至6所用高砷金精矿的砷质量百分比为43%。 (2)菌种分离 将第六代富集物按10_8、10_9、10,稀释度，分别接入分离培养基中，在30°C下进行震荡稀释分离，经连续四次稀释分离，最终获得稀释物4即As-6纯菌。
分离培养基:(NH4)2SO4L Og / L，MgSO4.7Η200.2g/L，K2S044.0g / L,2.0g(NH4)2HPO4g/L, As203150g/L。 分离培养基所用高砷金精矿与培养基I至6相同。
2.利用权利要求1所述菌株对高砷金精矿进行预氧化处理，其特征在于:所用金精矿的砷质量百分比为43%，属超高砷金矿，预氧化温度为30°C，接种量10% (v / V)，矿浆浓度20% (w / V)，搅拌速度180转/分钟，总体积10L，时间为7天。
3.经权利要求1所述菌株预氧化处理后的超高砷金精矿，其特征在于:氧化渣与原矿相比，含砷量降低了 92.16 %，重量下降了 53.02 %。氧化渣提金试验表明，当氧化渣浓度25% (w / V)，初始氰化钠浓度为0.15% (w / v)，pH=9.5~10时，20°C下经过48小时，氧化渣中93.04%的金被浸出，氧化渣金的浸出率是未经细菌预氧化的金精矿的5倍。
【文档编号】C22B11/00GK103911316SQ201410030351
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】丁建南, 张国华, 于一尊, 计少石, 胡淼, 何力 申请人:南昌资环生态科技有限公司