一种核-壳结构的金簇-碳点纳米颗粒及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供一种核?壳结构的金簇?碳点纳米颗粒及其制备方法和应用，所述金簇?碳点纳米颗粒以碳点为模板，在其内部具有纳米金簇，所述纳米金簇与碳点通过Au?N配位键相连接，所述金簇?碳点纳米颗粒的粒径大小为3?5nm。所述金簇?碳点纳米颗粒的制备方法为：以多烯多胺和柠檬酸合成的碳点为模板，加入氯金酸，在还原剂存在下反应得到所述金簇?碳点纳米颗粒。本发明得到的金簇?碳点纳米颗粒粒径均一，分散性良好，纳米金簇与碳点通过Au?N配位键相连接，维持金簇稳定，不易团聚，本发明所述金簇?碳点纳米颗粒可以应用于细胞内氧化应激放大，用于肿瘤治疗。
【专利说明】
一种核-壳结构的金簇-碳点纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于纳米材料领域，涉及一种金簇-碳点纳米颗粒及其制备方法和用用，尤其涉及一种核-壳结构的超小金簇-碳点纳米颗粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤细胞具有高活性氧(Reactive oxygen species，R0S)水平，且相比正常细胞对ROS更加敏感。但同时肿瘤细胞具有高氧化应激，并以还原型谷胱甘肽(glutath1ne，GSH)的上调为典型特征。GSH是细胞内最重要，含量最丰富的小分子抗氧化剂，GSH通过其巯基提供抗氧化损伤作用，抑制肿瘤细胞凋亡，高浓度的ROS会促进肿瘤细胞的分裂和增殖，增加肿瘤基因组不稳定性而诱导肿瘤的发生与发展。ROS与GSH之间的平衡影响着癌细胞的生存和死亡。因此，调节肿瘤细胞的氧化应激水平是肿瘤治疗的关键。
[0003]碳点作为一种新型纳米材料，由于其制备简单，高荧光量子产率，光谱可调等特性，其在荧光成像，检测等多方面具有巨大的潜在应用价值。碳点纳米颗粒大小通常在1-5nm尺寸均一，形貌规则。且其通常由有机分子高温碳化而来，其具有比较疏松的结构。碳点由于制备原料及制备方法的不同，成分各异。
[0004]贵金属纳米团簇的催化性能是一个很有前途的应用。例如，金最初被认为是具有催化惰性的，但纳米级别的金目前已经被证明在一个广泛的化学反应中具有良好的催化活性。金属纳米簇拥有与天然酶相似的内在酶活性，因其超微小的体积、低毒等优点在分子成像、生物传感、医药以及催化领域有着潜在的应用价值。
[0005]CN 103981531A公开了一种荧光碳点的制备方法，所述方法包括预处理和液相等离子体放电步骤，虽然其成功制备得到荧光碳点，该方法制备的荧光碳点的成分单一，且其制备过程中需要用到液相等离子体放电，过程相对复杂。又如CN104071769A公开了一种化学氧化法制备荧光碳点的方法，所述方法以煤炭或将煤炭加热炭化处理后得到的焦炭物质为碳源物质，具体包括氧化刻蚀、透析除盐和干燥步骤，该方法制备得到的荧光碳点也仅为煤基荧光碳点。
[0006]因此，在本领域中，期望得到一种将碳点与贵金属纳米团簇相结合的焚光碳点制备方法。
【发明内容】
[0007]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种金簇-碳点纳米颗粒及其制备方法和应用，特别是提供一种核-壳结构的超小金簇-碳点纳米颗粒及其制备方法和应用。
[0008]为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]—方面，本发明提供一种金簇-碳点纳米颗粒(金簇@碳点纳米颗粒)，所述金簇-碳点纳米颗粒以碳点为模板，在其内部具有纳米金簇，所述纳米金簇与碳点通过Au-N配位键相连接，所述金簇-碳点纳米颗粒的粒径大小为3-5nm。
[0010]在本发明中所述簇-碳点纳米颗粒的粒径大小可以为3nm、3.2nm、3.5nm、3.8nm、4nm、4.3nm、4.5nm、4.8nm或5nm。本发明的金簇-碳点纳米颗粒具有超小的纳米粒径尺寸，且粒径均一，呈单分散性。
[0011 ]本发明的金簇在碳点内部，金簇与碳点通过Au-N配位键相连接，维持着金簇的稳定不至于团聚。由于Au-S键的键能为40kcal/mol，Au_N键的键能为8kcal/mol，Au_S的键能远大于Au-N的键能，因此本发明的金簇O碳点纳米颗粒进入肿瘤细胞内部以后，细胞内的GSH会取代碳点上的氨基跟Au形成配位键，从而消耗细胞内部的GSH水平，以达到特性杀伤肿瘤细胞的目的，由于GSH-ROS平衡的存在，GSH水平的降低必然导致细胞内ROS水平的增高，从而放大细胞内的氧化应激水平，诱导肿瘤细胞发生凋亡。
[0012]另一方面，本发明提供一种如上所述金簇-碳点纳米颗粒的制备方法，所述方法为以多烯多胺和柠檬酸合成的碳点为模板，加入氯金酸，在还原剂存在下反应得到所述金簇-碳点纳米颗粒。
[0013]本发明所述金簇-碳点纳米颗粒的制备方法包括以下步骤:
[0014](I)将多烯多胺和柠檬酸混合，反应得到碳点溶液；
[0015](2)向步骤(I)得到的碳点溶液中加入氯金酸溶液，而后加入还原剂进行还原反应得到所述金簇-碳点纳米颗粒。
[0016]本发明以碳点吸附氯金酸，碳点具有比较疏松的结构，利用碳点的大量氨基官能团与氯金酸结合将氯金酸带入碳点的疏松结构内，而后采用还原剂还原，在碳点内部原位合成金簇，从而得到粒径均一的超小金簇-碳点纳米颗粒(以金簇@碳点表示)，纳米金簇与碳点通过Au-N配位键相连接，维持金簇稳定，不易团聚。
[0017]优选地，步骤(I)所述多烯多胺和柠檬酸的质量比为1:1-50:1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、15:1、18:1、20:1、23:1、25:1、28:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1。
[0018]优选地，步骤(I)所述反应的温度为130-190 °C，例如130 °C、135°C、140°C、145°C、150。(:、155。(:、160。(:、165。(:、170。(:、175。(:、180。(:、185。(:或190。(:，优选170。(:。
[0019]优选地，步骤(1)所述反应的时间为1-811，例如111、1.511、211、2.511、311、3.511、411、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5hS8h。
[0020]优选地，利用透析法对步骤(I)得到的碳点进行纯化。
[0021 ] 优选地，步骤(2)所述碳点溶液的质量浓度为1-30mg/mL，例如0.2mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、lmg/mL、I.5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、1mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、23mg/mL、25mg/mL、28mg/mL或30mg/mL。
[0022 ]优选地，步骤(2)所述氯金酸溶液为氯金酸水溶液。
[0023]优选地，步骤(2)所述氯金酸溶液的摩尔浓度为2-15mM，例如2mM、3mM、4mM、5mM、7mM、9mM、I OmM、12mM、14mM 或 15mM，优选 I OmM。
[0024]优选地，步骤(2)所述加入的氯金酸的摩尔量为1-1 Ομ??ο I，例如Ιμπιο 1、2ymo 1、3μmol、4ymol、5ymol、6ymol、7ymol、8ymol、9ymol或1ymol ο
[0025]优选地，步骤(2)所述碳点溶液与氯金酸溶液的体积比为1:1-1:8，例如1: 1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3，5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8。
[0026]优选地，步骤(2)所述向碳点溶液中加入氯金酸溶液5-20min (例如5min、6min、7min、8min、9min、lOmin、12min、14min、15min、17min、19min 或20min)后再加入还原剂进行还原反应。在本发明中碳点溶液中加入氯金酸溶液所述时间后，可以使得氯金酸根离子更好的通过配位键与碳点上的氨基结合，保证充足的孵育时间以使得碳点内外均饱和吸附氯金酸根离子。
[0027]优选地，步骤(2)所述还原剂为硼氢化钠。
[0028]优选地，步骤(2)所述还原剂的加入量为氯金酸摩尔量的3-20倍，例如3倍、5倍、7倍、9倍、1倍、12倍、15倍、18倍或20倍。
[0029]优选地，步骤(2)所述还原反应在碱性试剂存在下进行。
[0030]优选地，所述碱性试剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
[0031]优选地，所述碱性试剂与还原剂的质量比为2:1-8:1，例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1 或 8:1。
[0032]优选地，步骤(2)所述还原反应在搅拌下进行。
[0033]优选地，所述揽摔转速为I OOOrpm以上，例如 100rpm、2000rpm、2500rpm、3000rpm、3800印111、4000印111、5000印111、6000印111、7500印111、8000印111、10000印1]1等，优选1000-5000印1]1。
[0034]优选地，步骤(2)所述还原反应的温度为20-30 °C，例如20 °C、22 °C、24°C、25 °C、26°(:、28°(:或30°(:。
[0035]优选地，步骤(2)所述还原反应的时间为2-8h，例如2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h 或 8h。
[0036]优选地，将步骤(2)所述还原反应的产物进行离心，对上清液进行超滤或透析，除去杂质得到所述金簇-碳点纳米颗粒。
[0037]优选地，所述超滤利用超滤管或超滤膜进行，所述超滤管或超滤膜的截留分子量为10~30kDa，例如1kDa、12kDa、14kDa、16kDa、18kDa、2OkDa、23kDa、25kDa、28kDa或 30kDa。
[0038]优选地，所述透析使用的透析袋的截留分子量为10_30kDa，例如10kDa、12kDa、14kDa、16kDa、18kDa、2OkDa、23kDa、25kDa、28kDa或 30kDa。
[0039]另一方面，本发明提供了所述金簇-碳点纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
[0040]本发明的金簇-碳点纳米颗粒可用作治疗肿瘤的药物会用于制备治疗肿瘤的药物，其可应用于细胞内氧化应激放大，有利于肿瘤的治疗。
[0041 ]相对于现有技术，本发明具有以下有益效果:
[0042]本发明制备金簇-碳点纳米颗粒的方法具有工艺简单、产率高、环境友好等特点。本发明提供的核-壳结构的超小金簇-碳点纳米颗粒的粒径为3-5nm，粒径均一，分散性良好，所述纳米金簇与碳点通过Au-N配位键相连接，维持金簇稳定，不易团聚，本发明所述金簇-碳点纳米颗粒可以应用于细胞内氧化应激放大，细胞活力实验显示，该金簇@碳点纳米颗粒对人肝癌细胞株的IC5q值为32yg/mL，具有较好的肿瘤细胞杀伤力，可以用于肿瘤治疗。
【附图说明】
[0043]图1本发明制备的金簇@碳点纳米颗粒的制备方法示意图。
[0044]图2为本发明制备的金簇O碳点纳米颗粒的透射电镜图，其中B图为A图中方框内部区域的放大图。
[0045]图3为本发明制备的金簇O碳点纳米颗粒的动态光散射表征结果图。
[0046]图4为本发明制备的金簇O碳点纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱表征结果图。
[0047]图5为利用本发明制备得到的金簇O碳点纳米颗粒处理HepG-2细胞后，细胞中谷胱甘肽含量测试结果图。
[0048]图6为本发明所制备的金簇O碳点纳米颗粒的细胞毒性实验结果图。
【具体实施方式】
[0049]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0050]实施例1
[0051]在本实施例中，通过以下方法制备金簇O碳点核-壳纳米颗粒，具体包括以下步骤(制备方法示意图如图1所示):
[0052](I)将多烯多胺和柠檬酸以1:1的质量比混合，在170°C反应2h得到碳点溶液，透析法纯化合成的碳点，得到浓度为12mg/mL的碳点溶液；
[0053](2)取ImL步骤(I)得到的碳点溶液，加入1mM氯金酸溶液ImL，1min后，在搅拌转速100rpm搅拌下，加入逐滴加入ImL含有12mg NaOH与2mg NaBH4的冰水溶液，在25 °C下搅拌反应4h，反应结束后将反应产物用截留分子量为1kDa的超滤管在5000rpm转速下离心，以三次水洗涤多次后得到所述金簇-碳点纳米颗粒。
[0054]利用透射电镜(Tecnai G2 20S_TWIN，FEI)对制备得到的金簇-碳点纳米颗粒(金簇@碳点纳米颗粒)进行表征，结果如图2所示，由图2可以看出，碳点外壳的大小为4-5nm，金簇分布于碳点的核心位置，金簇的大小为l_2nm，该纳米颗粒分散性良好。
[0055]利用动态光散射仪(Zetasizer Nano ZS,Malvern)对制备得到的金簇-碳点纳米颗粒(金簇@碳点纳米颗粒)进行表征，结果如图3所示，由图3可以看出，该纳米颗粒分散性良好，粒径均一，大小在4.7 ± 0.38nm。
[0056]此外，对制备得到的金簇-碳点纳米颗粒(金簇@碳点纳米颗粒)进行了紫外-可见吸收光谱表征，结果如图4所示，由图4可知，单纯碳点在500nm左右无明显吸收，但金簇O碳点在500nm处具有明显的紫外吸收，证明了碳点内金簇的成功合成。
[0057]实施例2
[0058]在本实施例中，通过以下方法制备金簇@碳点核-壳纳米颗粒，具体包括以下步骤(制备方法示意图如图1所示):
[0059](I)将多烯多胺和柠檬酸以5:1的质量比混合，在190°C反应Ih得到碳点溶液，透析法纯化合成的碳点，得到浓度为30mg/mL的碳点溶液；
[0060](2)取ImL步骤(I)得到的碳点溶液，加入5mM氯金酸溶液5mL，5min后，在搅拌转速5000rpm搅拌下，加入逐滴加入ImL含有8mg NaOH与2mg NaBH4的冰水溶液，在20°C下搅拌反应4h，反应结束后将反应产物用截留分子量为1kDa的超滤管在5000rpm转速下离心，以三次水洗涤多次后得到所述金簇-碳点纳米颗粒。
[0061]利用透射电镜进行表征可以看到碳点外壳的大小为4_5nm，金簇分布于碳点的核心位置，金簇的大小为l_2nm，该纳米颗粒分散性良好。动态光散射表征结果也表明所述金簇-碳点纳米颗粒分散性良好，粒径均一，大小在4.5±0.4nm。紫外-可见吸收光谱表征结果证明了金簇@碳点纳米颗粒的成功合成。
[0062]实施例3
[0063]在本实施例中，通过以下方法制备金簇@碳点核-壳纳米颗粒，具体包括以下步骤(制备方法示意图如图1所示):
[0064](I)将多烯多胺和柠檬酸以15:1的质量比混合，在130°C反应Sh得到碳点溶液，透析法纯化合成的碳点，得到浓度为lmg/mL的碳点溶液；
[0065](2)取ImL步骤(I)得到的碳点溶液，加入15mM氯金酸溶液ImL，15min后，在搅拌转速5000rpm搅拌下，加入逐滴加入ImL含有4mg NaOH与2mg NaBH4的冰水溶液，在30 °C下搅拌反应2h，反应结束后将反应产物用截留分子量为1kDa的超滤管在5000rpm转速下离心，以三次水洗涤多次后得到所述金簇-碳点纳米颗粒。
[0066]利用透射电镜进行表征可以看到碳点外壳的大小为3_5nm，金簇分布于碳点的核心位置，金簇的大小为l_2nm，该纳米颗粒分散性良好。动态光散射表征结果也表明所述金簇-碳点纳米颗粒分散性良好，粒径均一，大小在4.3±0.8nm。紫外-可见吸收光谱表征结果证明了金簇@碳点纳米颗粒的成功合成。
[0067]实施例4
[0068]在本实施例中，通过以下方法制备金簇@碳点核-壳纳米颗粒，具体包括以下步骤(制备方法示意图如图1所示):
[0069](I)将多烯多胺和柠檬酸以50:1的质量比混合，在150°C反应5h得到碳点溶液，透析法纯化合成的碳点，得到浓度为15mg/mL的碳点溶液；
[0070](2)取ImL步骤(I)得到的碳点溶液，加入2mM氯金酸溶液8mL，20min后，在搅拌转速5000rpm搅拌下，加入逐滴加入ImL含有12mg NaOH与1.9mg NaBH4的冰水溶液，在25°C下搅拌反应8h，反应结束后将反应产物用截留分子量为1kDa的超滤管在5000rpm转速下离心，以三次水洗涤多次后得到所述金簇-碳点纳米颗粒。
[0071]利用透射电镜进行表征可以看到碳点外壳的大小为3_5nm，金簇分布于碳点的核心位置，金簇的大小为l_2nm，该纳米颗粒分散性良好。动态光散射表征结果也表明所述金簇-碳点纳米颗粒分散性良好，粒径均一，大小在4.7±0.32nm。紫外-可见吸收光谱表征结果证明了金簇@碳点纳米颗粒的成功合成。
[0072]实施例5
[0073]在本实施例中考察金簇@碳点纳米颗粒对肿瘤细胞中谷胱甘肽含量的影响，方法如下:
[0074]将HepG-2细胞以50000个每孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，将实施例1制备得到的金簇@碳点纳米颗粒以O、2、4、8、16、32、64yg/mL处理细胞2h，弃去培养液，向每个孔中加入RIPA高效裂解液各200yL，用细胞刮刀将细胞刮下，4°C裂解30min，采用谷胱甘肽检测试剂盒检测裂解液中的谷胱甘肽含量，以碳点作为对照，结果如图5所示，由图5可以得出金簇@碳点纳米颗粒可以有效的消耗细胞内的GSH水平。
[0075]实施例6
[0076]在本实施例中考察金簇@碳点纳米颗粒对肿瘤细胞细胞活力的影响，方法如下:
[0077]将HepG-2细胞以8000个每孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，将实施例1制备得到的金簇@碳点以2、4、8、16、32、64μg/mL处理细胞24h，弃去上清液，加入含有CCk-8试液的培养基，孵育2h后，在酶标仪下检测450nm吸光度，以碳点作为对照。在图6中示出了金簇@碳点和碳点细胞活力的对比，图6表明，单纯的碳点是安全无毒的，在浓度64yg/mL下还保持了 100%的细胞活力，而对应的碳点金颗粒处理组却显示出了很好的毒性效果，其半数致死量(IC5Q 在 32yg/mL)。
[0078]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的核-壳结构的金簇-碳点纳米颗粒及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种金簇-碳点纳米颗粒，其特征在于，所述金簇-碳点纳米颗粒以碳点为模板，在其内部具有纳米金簇，所述纳米金簇与碳点通过Au-N配位键相连接，所述金簇-碳点纳米颗粒的粒径大小为3-5nm。2.根据权利要求1所述的金簇-碳点纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法为:以多烯多胺和柠檬酸合成的碳点为模板，加入氯金酸，在还原剂存在下反应得到所述金簇-碳点纳米颗粒。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将多烯多胺和柠檬酸混合，反应得到碳点溶液； (2)向步骤(I)得到的碳点溶液中加入氯金酸溶液，而后加入还原剂进行还原反应得到所述金簇-碳点纳米颗粒。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述多烯多胺和柠檬酸的质量比为1:1-50:1; 优选地，步骤(I)所述反应的温度为130-190 °C，优选170 °C; 优选地，步骤(I)所述反应的时间为1-Sh; 优选地，利用透析法对步骤(I)得到的碳点进行纯化。5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述碳点溶液的质量浓度为l_30mg/mL; 优选地，步骤(2)所述氯金酸溶液为氯金酸水溶液； 优选地，步骤(2)所述氯金酸溶液的摩尔浓度为2-15mM，优选1mM ； 优选地，步骤(2)所述加入的氯金酸的摩尔量为1-ΙΟμπιοΙ。6.根据权利要求3-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述碳点溶液与氯金酸溶液的体积比为1:1-1:8。7.根据权利要求3-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述向碳点溶液中加入氯金酸溶液5-20min后再加入还原剂进行还原反应； 优选地，步骤(2)所述还原剂为硼氢化钠； 优选地，步骤(2)所述还原剂的加入量为氯金酸摩尔量的3-20倍； 优选地，步骤(2)所述还原反应在碱性试剂存在下进行； 优选地，所述碱性试剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾； 优选地，所述碱性试剂与还原剂的质量比为2:1-8:1。8.根据权利要求3-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述还原反应在搅拌下进行； 优选地，所述搅拌转速为100rpm以上，优选1000-5000rpm ； 优选地，步骤(2)所述还原反应的温度为20-30 0C ; 优选地，步骤(2)所述还原反应的时间为2-8h。9.根据权利要求3-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，将步骤(2)所述还原反应的产物进行离心，对上清液进行超滤或透析，除去杂质得到所述金簇-碳点纳米颗粒； 优选地，所述超滤利用超滤管或超滤膜进行，所述超滤管或超滤膜的截留分子量为10-30kDa; 优选地，所述透析使用的透析袋的截留分子量为10-30kDa。10.根据权利要求1所述的金簇-碳点纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
【文档编号】B22F1/00GK105880631SQ201610416821
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】梁兴杰, 宫宁强, 马晓溦
【申请人】国家纳米科学中心