提升化肥利用效率的富含多糖微生物液体菌肥

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种提升化肥利用效率的富含多糖微生物液体菌肥及其制备方法。


背景技术：

2.氮、磷、钾是植物生长必须的大量元素，为了追求农作物高产而过量投入化肥，化肥大量使用造成土壤退化、板结、腐殖质缺乏、生物多样性降低及农产品质量和产量下降。土壤中残留的养分氮、磷会进入地表和地下水，从而导致其成为水体富营养化的主要驱动因子。2020年，有报道表明农业污染源的总氮和总磷占地表水体氮、磷污染总负荷的46.52％和67.22％。2019年，在营养状态监测的107个重要湖泊(水库)中，贫营养状态湖泊(水库)占9.3％，中营养状态占62.6％，轻度富营养状态占22.4％，中度富营养状态5.6％。除地表水受到污染之外，长期的“肥大水勤”管理模式造成严重地下水污染，硝态氮污染尤为严重。
3.为了抑制化肥大量使用引起的面源污染，实施化肥零增长行动，化肥减量使用会导致农作物减产，而一些研究表明，我国肥料的利用率约为30％左右，仍然处于较低水平，提高化肥利用率势在必行。由于历史上肥料大量使用，还造成了氮、磷和钾在土壤中累积，激活土壤中累积养分，促进植物吸收，也是增加化肥利用率和减少养分淋失的重要途径之一。
4.胶质芽孢杆菌是硅酸盐细菌(silicate bacteria)中的一种，是土壤中一种重要功能菌，它能分解长石、云母、铝硅酸盐类和磷灰石等原生态矿物，释放磷、钾和硅等元素，供植物生长利用，同时还具有固氮的作用，因此硅酸盐细菌肥料开发受到大家广泛关注。
5.中国专利cn107227265b(申请号：201610975842.8)公布了一种胶质芽孢杆菌菌株及微生物菌剂。菌株的活菌量至少为5.0
×
109cfu/g，微生物菌剂应用于田间土壤解磷、解钾、提高作物产量和农作物抗旱性。
6.中国专利cn103525728b(申请号：201310469236.5)公布了一种应用于微生物肥料的胶质芽孢杆菌深层发酵培养基。。本发明的培养基ph值约为6.0-7.5，而胶质芽孢杆菌在ph值为6.0-8.0范围内生长良好，因此培养基在灭菌前无需用酸碱调节ph即可促进菌体生长和芽孢的形成，简化了操作，提高了产品质量，降低了生产成本，更适于工业大规模生产。
7.中国专利cn110106126(申请号201910504185.2)公开了一株胶质芽孢杆菌及其在制备盐碱土壤改良剂中的应用。该发明首次公开了通过紫外线诱变筛选培育出的抗高温耐盐碱的胶质芽孢杆菌，该胶质芽孢杆菌具有耐高温耐盐碱的抗逆性，可有效适应盐碱板结土壤。同时具有解硅解磷的作用，促进土壤中可溶性硅磷等元素的释放，增强作物的抗逆性，提高土壤修复剂的利用率，修复改良盐碱土壤，降低盐渍化。
8.已有胶质芽孢杆菌微生物菌剂生产方法需要高压高温灭菌、采用两步接种法制备、不能进行分批连续发酵，工艺较为复杂，增加生产成本。制备的微生物菌剂只关注了胶质芽孢杆菌的数量，对于菌液的保存时间、生物调节剂的含量、解磷和解钾能力以及提高化
肥利用率却鲜有报道。


技术实现要素：

9.本发明针对已知技术存在的问题，提供了一种提升化肥利用效率的富含多糖微生物液体菌肥，其特征在于，采用如下方法制备：使用含铁锰化合物和粘土矿物的无氮固体培养基反复培养驯化胶质芽孢杆菌；把驯化后的胶质芽孢杆菌接种到氮源含量低的液体培养基中，采用非高压高温灭菌和等体积重复补料分批发酵方法生产富含多糖微生物液体菌肥。富含多糖微生物液体菌肥组成包括多糖、蛋白质、铁锰钙镁微量元素、含钾的粘土矿物和胶质芽孢杆菌活菌。
10.一种提升化肥利用效率的富含多糖微生物液体菌肥中的铁锰化合物选自氯化锰、硫酸锰、三氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁、三氧化二铁、氧化铁、铁锰氧化物中的至少一种；粘土矿物选自伊利石、蒙脱石、钾长石、斜长石和云母中的至少一种，粒径介于18-75μm之间；氮源选自酵母粉、黑水虻虫粉、黄粉虫粉、蝇蛆虫粉、蛋白胨粉、牛肉膏、鱼骨粉中的至少一种，粒径介于18-75μm之间。
11.一种提升化肥利用效率的富含多糖微生物液体菌肥中的无氮固体培养基的组成如下：按质量约为1000份的培养基制备，其中各组分为：蔗糖2.5-20份，na2hpo4·
12h2o为2-10份，mgso4·
7h2o为0.3-2份，铁锰化合物为0.001-0.01份，粘土矿物为0.3-1.5份，琼脂为16-20份，水为1000份。
12.一种提升化肥利用效率的富含多糖微生物液体菌肥中的氮源含量低的液体培养基组成如下：按质量约为1000份的培养基制备，其中各组分为：蔗糖2.5-10份，na2hpo4·
12h2o为0.5-3份，mgso4·
7h2o为0.3-1份，铁锰化合物为0.001-0.01份，粘土矿物为0.3-1.5份，氮源为0.01-0.1份，水为1000份。
13.一种提升化肥利用效率的富含多糖微生物液体菌肥制备方法，其特征在于，包含如下两个步骤：步骤1：配制无氮固体培养基，121℃高压灭菌20min，倒平板，在超净工作台中紫外灭菌30min，然后接种胶质芽孢杆菌，在30℃恒温培养箱中培养10天，挑选长势较好的菌落接种到新的平板中，继续培养驯化，连续驯化培养4轮以上，既得产多糖、解磷、解钾和吸氮能力强的胶质芽孢杆菌菌株。步骤2：配制氮源含量低的液体培养基，在密闭容器中加热到80-95℃之间，冷却至30℃左右，使用封闭管道输送到臭氧杀菌的发酵罐中，接种步骤1中的胶质芽孢杆菌菌株，在30℃条件下好氧发酵3天，排出一定体积发酵液，既得富含多糖的微生物液体菌肥，补加相同体积加热冷却后的氮源含量低的液体培养基，在30℃条件下好氧发酵3天，既得第二个批次富含多糖的微生物液体菌肥，如此循环，可制得多个批次富含多糖的微生物液体菌肥。
14.本发明与现有技术相比，其核心竞争力如下：
①
功效强大：多糖是一种生物调节剂，促进作物生长，降低化肥用量；驯化后的胶质芽孢杆菌具有较强的固氮、解磷和解钾作用，阻控氮磷淋溶，防止面源污染。
②
培养基组成简单廉价：蔗糖2.5-10份，na2hpo4·
12h2o为0.5-3份，mgso4·
7h2o为0.3-1份，铁锰化合物为0.001-0.01份，粘土矿物为0.3-1.5份，氮源为0.01-0.1份，水为1000份。
③
生产工艺简单：发酵罐能够满足恒温、搅拌、含有通排气口和进出料口即可，不需要高压高温灭菌，不容易染菌，可以进行连续生产。
④
富含多糖微生物液体菌肥保存时间长：富含多糖微生物液体菌肥能够在4℃环境中进行长期保存(＞2年)，多糖含量和细菌活性不出现明显降低。
附图说明
15.图1为平板中菌落形态。
16.图2为摇瓶培养法制备富含多糖微生物液体菌肥。
17.图3发酵罐法制备富含多糖微生物液体菌肥。
18.图4富含多糖微生物液体菌肥和化肥混合对油菜生物量的影响。
19.图5富含多糖微生物液体菌肥、化肥和生物炭对油菜生物量的影响。
20.图6含多糖微生物液体菌肥、化肥和生物炭对土壤有效磷的影响。
具体实施方式
21.实施案例1：胶质芽孢杆菌驯化。
22.在无氮源培养基中，通过正交实验研究铁锰化合物和粘土矿物对胶质芽孢杆菌生长的影响。培养基的基本组成为1l水中加入蔗糖10g，na2hpo4·
12h2o 5g，mgso4·
7h2o为0.5g，琼脂为18g，采用2因素3水平正交实验研究不同类型铁锰化合物(三氯化铁、氯化锰、三氯化铁和氯化锰混合物)和粘土矿物(钾长石、蒙脱石和伊利石)对胶质芽孢杆菌生长影响，以平板中菌落的直径大小为评价指标(按菌落直径从大到小顺序，统计平板中5个菌落，然后进行计算)，其正交表和正交实验结果如表1所示。由正交实验结果可知，培养基中加入伊利石1g、三氯化铁5mg和氯化锰5mg，菌落直径最大，多糖分泌量也较多，为最佳实验条件。由极差分析可知，粘土矿物对胶质芽孢杆菌影响较大，铁锰化物影响较小；对于粘土矿物，含伊利石的培养基中菌落直径最大；对于铁锰化合物，含三氯化铁和氯化锰的培养基中菌落直径最大。由以上分析可知，在培养基中添加伊利石、三氯化铁和氯化锰，可以促进胶质芽孢杆菌生长和多糖的分泌，故驯化胶质芽孢杆菌的最佳培养基为：1l水中加入蔗糖10g、na2hpo4·
12h2o 5g、mgso4·
7h2o为0.5g、琼脂为18g、伊利石1g、三氯化铁5mg、氯化锰5mg。
23.表1正交实验和实验结果
[0024][0025]
实施案例2：胶质芽孢杆菌培养。
[0026]
按照[0022]筛选出最佳配方培养胶质芽孢杆菌，平板中菌落形态如图1所示，菌落直径较大，分泌多糖较多。
[0027]
实施案例3：摇瓶培养法制备富含多糖微生物液体菌肥
[0028]
培养基配方如下：1l自来水中加入蔗糖5g，na2hpo4·
12h2o为2g，mgso4·
7h2o为0.5g，伊利石1g，三氯化铁5mg，二氯化锰5mg，酵母粉15mg。取500ml液体培养基放倒1l三角瓶中，使用棉塞封口，在电陶炉上加热到85℃，冷却至30℃，在超净工作台中接种驯化后胶质芽孢杆菌，在30℃的恒温摇床中发酵3天，既得富含多糖微生物液体菌肥。然后向加热冷却后的400ml培养基中接种制备好富含多糖的微生物液体菌肥100ml，在30℃的恒温摇床中发酵3天，制得第二个批次富含多糖微生物液体菌肥，如此循环，制备了10个批次的富含多糖微生物液体菌肥(图2)。通过测定菌剂的粘度和细菌数量，10个批次的菌肥并没有显著性差异。
[0028]
实施案例4：发酵罐法制备富含多糖微生物液体菌肥
[0029]
培养基配方如下：1l自来水中加入蔗糖5g，na2hpo4·
12h2o为2g，mgso4·
7h2o为0.5g，伊利石1g，三氯化铁5mg，二氯化锰5mg，酵母粉15mg。取45l液体培养基加热到85℃，然后加入到50l的发酵罐中，冷却至30℃，接种摇瓶法培养的富含多糖微生物液体菌肥5l，发酵温度为30℃，发酵期间通入空气过滤器净化后的空气，流量为0.6m3/min，搅拌速度为400rad/min，发酵3天既得富含多糖微生物液体菌肥。排出80％体积发酵液，补加相同体积加热冷却后的培养基，在30℃条件下好氧发酵3天，既得第二个批次富含多糖微生物液体菌肥，如此循环制备了5个批次的富含多糖微生物液体菌肥(图3)。通过测定菌剂的粘度和细菌数量，5个批次的菌肥并没有显著性差异。
[0030]
摇瓶培养和发酵罐制得富含多糖微生物液体菌肥性质的比较如表2所示，结果表明发酵罐制得菌肥比摇瓶法的粘度和粗多糖产量高，主要是发酵罐中通入净化后空气所致。
[0031]
表2摇瓶法和发酵罐制得富含多糖微生物菌剂性质比较
[0032]
项目ph粘度(pa
·
s)细菌数量(
×
105)粗多糖(g/l)摇瓶法5.67181.52.64.4发酵罐5.83280.62.45.2
[0033]
实施案例5：富含多糖微生物液体菌肥和化肥混合使用提升化肥利用效率协同效应
[0034]
本研究采用盆栽油菜试验方法，花盆直径为28.0cm，高度为23.5cm，每盆装4.50kg土，播种，油菜长至2片真叶时，定苗，每盆保留10株油菜。在此期间，每3天浇一次水，每次1l水左右。长至第五真叶期，把化肥和富含多糖微生物液体菌肥混合于1l水后进灌溉施肥，分别进行8个处理(见表3)，尿素的最高用量按每亩10kg氮素施加，按照氮磷比为4：1比例加入磷肥，每个处理3个重复。施肥后根据不同处理土壤干湿状况进行浇水灌溉，灌溉水不能下渗到底托内。施肥后21天收获，收获后的油菜首先在105℃的烘箱中杀青30min，然后在75℃烘箱中烘干，研磨，测定植物样品氮、磷和钾含量。土壤分上下两层采样(上层10cm，下层10cm)，自然风干，研磨，用于理化性质分析。
[0035]
表3不同施肥处理
[0036]036][0037]
不同处理油菜生物量变化如图4所示，随着化肥用量增加，油菜生物量呈先降低后升高，然后达到平衡的趋势，主要因为胶质芽孢杆菌和油菜对养分利用存在竞争作用，土壤养分供应不足时，以胶质芽孢杆菌吸收养分为主。在保证产量的条件下，化肥使用量比最高使用量可降低30％以上。
[0038]
不同处理土壤氮磷钾的变化如表4、5和6所示，施加富含多糖微生物液体菌肥对土壤总氮、总磷和总钾影响不显著。随着化肥用量增加，土壤上层有效磷呈增加趋势，下层土壤有效磷和对照相比，无显著性差异；土壤上层氨态氮含量呈显著增加趋势，土壤下层铵态氮除了t6和t7显著高于对照外，其它无显著性差异；土壤上层硝态氮呈增加趋势，土壤下层硝态氮和对照无显著性差异；土壤上下层速效钾有降低趋势，但是和对照没有显著性差异。上述结果表明富含多糖微生物液体菌肥和适量化肥混合使用，可以降低养分淋失，有利于面源污染的防治。
[0039]
表4不同处理土壤有效磷和全磷的差异
[0040]
[0041]
表5不同处理土壤铵态氮、硝态氮和全氮的差异
[0042][0043]
表6不同处理土壤速效钾和全钾的差异
[0044][0045]
实施案例6：富含多糖微生物液体菌肥、化肥和生物炭阻控养分的协同效应
[0046]
本研究采用种植箱种植油菜，种植箱尺寸为：长
×
宽
×
高＝45cm
×
40cm
×
40cm。每个种植箱装50kg土，对于生物炭处理，上层25kg土中加入0.4kg生物炭，并混合均匀。其具体处理方法如下表，每个处理重复3次。播种，油菜长至2片真叶时，定苗，每盆保留30株油菜。在此期间，每5天浇一次水，每次2l水左右。长至第五真叶期，把化肥和富含多糖微生物液体菌肥混合于2l水后进灌溉施肥，分别进行8个处理(见表7，psb表示富含多糖微生物液体菌肥；c表示生物炭；f表示化肥)，尿素的最高用量按每亩10kg氮素施加，按照氮磷比为4∶1比例加入磷肥，每个处理3个重复。施肥后每3天浇一次水，每次2ml。施肥后14天收获，收获后的油菜首先在105℃的烘箱中杀青30min，然后在75℃烘箱中烘干，研磨，测定植物样品氮、磷和钾含量。土壤分上下两层采样(上层20cm，下层20cm)，自然风干，研磨，用于理化性质分析。
[0047]
表7不同施肥处理
[0048][0049]
不同处理对油菜产量影响如图5所示，不施加生物炭条件下，施加微生物菌剂可以提高油菜产量20％左右。富含多糖微生物液体菌肥、化肥和生物炭混合使用对油菜产量没有显著影响。
[0050]
不同处理对土壤有效磷影响如图6所示。施加富含多糖微生物液体菌肥，土壤上层有效磷含量和对照无显著性差异，但是下层有效磷含量显著低于对照，有效阻控了磷在垂直方向上的淋失。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。因此，凡
所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。