专利名称：定量转化生长因子－β1的方法以及通过使用该方法检测癌症的方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及一种定量一种体液中转化生长因子-β1(TGF-β1)的浓度的方法，一种通过使用相同的方法检测癌症的方法，一种检测癌症的组合物，以及一种TGF-β1特异的单克隆抗体。
在哺乳动物中存在三种形式的TGF-β因子，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，并且，在这些当中，据信TGF-β1在生理机制和疾病进展中发挥关键的作用。已经报道它在一种发病过程中作用反常，例如，癌症发生。这暗示TGF-β1作为癌症诊断中的一种肿瘤标志是有用的，并且一种定量一种体液中的TGF-β1的高精度的方法在癌症诊断中可能是决定性的。
欧洲专利公开第0 722 773 A1号(EP Publication No.0 722 773 A1)公开一种通过用一种吸附剂，OH-碳酸化的羟基磷灰石，接触一种含有TGF-β1的血液样品，从而吸附其中的TGF-β1，用一种缓冲液洗脱被吸附的TGF-β1，并用紫外分光光度法确定被洗脱的TGF-β1的量的检测癌症的方法。然而，这个方法忍受着有限的敏感性和为测量值的大波动所证明的不精确的问题。
因此，已经存在一个开发一种改进的定量血浆中TGF-β1的量的方法的需要。
本发明的概述因此，本发明的一个目的是提供一种定量一种样品中TGF-β1的量的具有高精度和敏感性的方法。
本发明的另一个目的是提供一种通过使用所说的方法检测癌症的方法。
本发明的进一步的目的是提供一种检测癌症的组合物。
本发明的又一个目的是提供一种TGF-β1特异的单克隆抗体和一种生产此单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
根据本发明的一个方面，提供了一种定量一种样品中TGF-β1的量的方法，包括用一种TGF-β1特异的受体处理此样品从而在TGF-β1与此受体之间形成一种复合物，并测量此复合物的量。
本发明的详细描述在本发明中可以被使用的TGF-β1特异的受体包括TGF-β I型，II型，III型受体(R I，RII和RIII)，并优选TGF-β1 III型受体，RIII。这些TGF-β1受体可以根据一种常规的方法(Burand，J.P.等.病毒学(Virology)101，286-290(1980))通过在一种哺乳动物或昆虫细胞系中表达一种TGF-β1受体基因而获得。例如，此TGF-β1受体可以如下获得用一种含有一种TGF-β1受体基因的重组杆状病毒感染一种昆虫细胞系，例如，Sf21(Invitrogen，Netherlands)；提取在此昆虫细胞中表达的不溶于水的受体蛋白；用盐酸胍或尿素溶解此不溶于水的受体蛋白；通过去除胍或尿素重新折叠被溶解的受体蛋白，从而恢复对TGF-β1的亲和力。
在本发明中可以使用的TGF-β1特异的抗体可以通过用TGF-β1或其中的一个部分免疫一种哺乳动物制备。此TGF-β1特异的抗体可以是仅对TGF-β1具有特异性的一种单克隆抗体或一种多克隆抗体。
一种定量一种体液，例如，血浆或尿中的TGF-β1的量的优选方法，根据本发明包括(a)将一种TGF-β1特异的受体结合到一种固体支持物上；(b)将一种体液样品加入此被支持的受体中从而形成一种TGF-β1-受体复合物；(c)将一种与一种标记物结合的TGF-β1特异的抗体结合到此复合物上；和(d)使用此种作为一种检测标记的标记物测量TGF-β1的量。
在本发明中可以被使用的代表性标记物包括辣根过氧化物酶，生物素和荧光。
本发明的第一个优选实施方案包括将TGF-β1受体结合到一种固体支持物上，例如，一块微量滴定板的孔；将一种适当稀释的含有TGF-β1的样品加入到此TGF-β1受体中，从而使得TGF-β1与此TGF-β1受体之间能够形成一种复合物；用一种磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤此支持物；向其中加入一种生色的酶联抗-TGF-β1抗体并形成生色的酶；以及测量所产生的溶液的光密度从而定量此样品中TGF-β1的含量。
在本发明的第二个优选实施方案中，一种含有一种TGF-β1特异的受体的液体可以被用于替换被支持的TGF-β1受体。在这个方法中，一种样品中的TGF-β1的量可以如下定量将此样品加入此含有TGF-β1特异的受体的液体中；加入一种TGF-β1特异的与其中一种标记物结合的抗体；沉淀一种抗体-TGF-β1受体复合物；并且测量其光密度。
本发明的方法能够检测在30 pg/ml或更低的一个非常低浓度范围的TGF-β1。
以上方法在癌症诊断中特别有用，因为癌症患者体液中的TGF-β1浓度显然不同于健康人的那个。因此，癌症可以通过重复以上方法从而定量患者体液样品，例如血浆或尿中TGF-β1水平，并将此TGF-β1浓度与健康人的那个比较而被检测。
本发明的检测一种癌症的方法的一个优选实施方案包括(a)将一种TGF-β1特异的受体结合到一种固体支持物上；(b)将一种体液样品加入此被支持的受体中从而形成此TGF-β1-受体复合物；(c)将一种TGF-β1特异的与一种标记物结合的抗体结合到此复合物上；(d)使用此种作为一种诊断标记物的标记物测量TGF-β1的量；和(e)将此TGF-β1量与健康人的那个比较。
以上方法在检测胃癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，直肠结肠癌，前列腺癌和子宫颈癌中特别有效。
在此检测一种癌症的方法中可以被使用的一种组合物包括一种TGF-β1受体，优选RIII，和一种TGF-β1特异的抗体。
为了改进敏感性，此单克隆抗体可以如下获得根据一种常规的细胞融合方法，使用TGF-β1或其中的一种抗原决定簇部分作为一种免疫原，制备一种生产TGF-β1特异的单克隆抗体的杂交瘤细胞系；并从此杂交瘤细胞系分离此单克隆抗体。例如，这样一种杂交瘤细胞系可以如下制备用人TGF-β1免疫一种小鼠；根据Kohler和Milstein(欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，6，511-519(1976))所描述的细胞融合方法，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合；通过使用ELISA选择一种仅对人TGF-β1具有特异性的杂交瘤细胞系；使用一种免疫扩散的方法，确定此杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体的亚类；并且，选择一种分泌IgG1亚类的具有最高抗体滴度的杂交瘤细胞系。这样获得的此杂交瘤细胞系被定名为hTGF-46，并根据关于因专利程序之微生物保藏物的国际识别的布达佩斯条约的条款(The Budapest Treaty on the International Recognition ofthe Deposit of Microorganism for the Purpose of Patent Procedure)在1998年4月20日保藏在韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for TypeCulture)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-600，Republic ofKorea)，其保藏号为KCTC 0460BP。
杂交瘤细胞系hTGF-46起源于β-淋巴瘤，并且在产生TGF-β1特异的IgG1亚类的抗体的同时连续地分裂。此杂交瘤细胞系可以在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco-BRL，USA)中在37℃在5％CO2的空气中和100％湿度下培养。细胞数在12到14小时内倍增。此杂交瘤细胞系悬浮在此培养基中，自身不结合到培养瓶的底部，呈圆形，直径为15到20μm。
为了用此杂交瘤细胞系生产大量的TGF-β1特异的单克隆抗体，将此杂交瘤细胞系注射到一种小鼠中，并当其腹腔膨胀时获取含有高浓度的杂交瘤细胞的腹水从而分离来自其中的此单克隆抗体。
当TGF-β1，-β2，和-β3进行电泳随后进行Western印迹时，本发明的此单克隆抗体仅识别TGF-β1，但是不识别TGF-β2或-β3。这暗示此单克隆抗体对TGF-β1有独特的特异性。本发明的此单克隆抗体还对人TGF-β1显示高亲和力，并且结合到对应于TGF-β1的第5到80氨基酸残基的表位区域。
计划用以下的实施例进一步说明本发明，而不限制其范围。
进一步地，以下给出的固体在液体中的混合物，液体在液体中混合物和固体在液体中的混合物的百分数分别基于wt/wt，vol/vol和wt/vol，除非另外明确说明。实施例1TGF-β1对受体的敏感性(步骤1)TGF-β1 III型受体的制备使用引物RIII和RIII2(SEQ ID Nos1和2)，用含有一个人TGF-β1 III型受体的全长cDNA的质粒pCEP4(Invitrogen，Netherlands)进行聚合酶链式反应(PCR)，从而获得编码包括400氨基酸残基(1到400)的此受体的一个细胞外结构域的一个DNA片段。这样获得的DNA片段被插入杆状病毒载体pCRBac(Invitrogen，Netherlands)，从而获得重组质粒pCRBac-TGFR。用此重组质粒pCRBac-TGFR转化了E.coli细胞，并在一种选择培养基，含有氨苄青霉素的LB培养基上选择了被转化的E.coli细胞。
使用脂质体转染法(Burand，J.P.，病毒学(Virology)，101，286-290(1980))，将载体pCRBac-TGFR和Bac-N-Blue DNA(Invitrogen，Netherlands)共同导入昆虫细胞系Sf21(Invitrogen，Netherlands)中，并培养3天，从而获得一种病毒产物。3天之后，用lacZ基因作为一种选择性标记，对这样获得的病毒进行了噬斑分析，从而选择此重组病毒。使用正向引物(SEQ ID NO3)和反向引物(SEQ ID NO4)，对这样获得的重组病毒进行了PCR，从而确认此TGF-β1受体基因的存在。野生杆状病毒显示了839 bp PCR产物，而此重组病毒给出了一个1.5 kbp PCR产物。
用此重组病毒感染昆虫细胞系SF21，并在此后培养5天。离心此培养物，从而去除细胞碎片并收集含有病毒的上清。
用此上清接种昆虫细胞系Sf21，并在此后在27℃在含有10％胎牛血清(FBS)，7.3％ TC yeastolate和73％乳清蛋白水解产物的Grace昆虫培养基(Invitrogen，Netherlands)中培养72天。离心此培养物，从而收集细胞，并用PBS洗涤此细胞。向其中加入蛋白裂解溶液(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)，50 mM NaCl，10 mMβ-巯基乙醇，1％Triton X-100和2 mMBMSF)，并在此后在100℃加热所产生的溶液10分钟，从而制备一种样品。
用此样品在12.5％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行了SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝对所产生的凝胶染色。如下对此凝胶进行了Western印迹将在凝胶上被分离的蛋白电转移到一张膜上，从R&D Systems Inc.，USA(美国研究与发展系统股份有限公司)获得的TGF-β1受体的抗体结合此膜上的蛋白，并在此后使用结合了辣根过氧化物酶(HRP)的抗IgG第二抗体分析TGF-β1(Chemicon，USA)，从而确认TGF-β1 III型受体的表达。
因为此TGF-β1受体不溶解于水，所以向此样品中加入8M盐酸胍，并搅拌所产生的溶液1小时。所产生的溶液在7,000rpm离心40分钟，并在此后将上清调整到2mg/ml蛋白浓度。为了恢复此TGF-β1受体结合TGF-β1的活性，将所产生的溶液加入一种折叠缓冲液中(100mMTris，0.5M精氨酸，0.2M EDTA，pH8.0)，至蛋白浓度为150μg/ml，并在10℃保存40小时，所产生的溶液用20mM Tris溶液(pH8.0)，接连地按照每4小时两次，过夜之后一次，并在此后每2小时两次透析，从而有效地重新折叠此TGF-β1受体。(步骤2)TGF-β1III型受体对TGF-β1的敏感性将在步骤1中获得的每一份2μg的TGF-β1III型受体放置于一块微量滴定板的孔中，并将所产生板子在环境温度保存24小时，从而将此受体结合在此板上。将2ng的纯化的TGF-β1(R&D systems Inc.，USA)溶解在PBS中，并连续稀释。将每一个稀释溶液按100μl的量加入孔中，并在此后在环境温度保存3小时，从而使此TGF-β1能够结合此受体。用含有0.05％Tween 20(PBST)的PBS洗涤各孔，并在此后向其中加入结合HRP的抗-TGF-β1抗体(R&D systems Inc.，USA)。将产生的板子在室温保存1.5小时。用PBST洗涤每一个孔。向其中加入100μl的TMB-ELISA(Gibco-BRL，USA)，一种HRP底物，并将所产生的板子在室温放置20分钟从而显色。通过加入25μl 2N硫酸终止了此显色反应。在450nm的测量波长和570nm的校正波长测定了此反应混合物的光密度，并将结果绘制成图，从而获得一条标准的光密度-浓度相关曲线。
图1说明这样获得的相关曲线是一条相关系数为0.999，斜率为0.28的直线。此斜率代表在这些测量中所使用的受体的敏感性，并且此TGF-β1III型受体被认为对TGF-β1结合具有良好的敏感性。在图1中的相关曲线还说明本方法可以检测极低浓度的TGF-β1，低至10pg/ml。
使用TGF-β1II型受体(R&D systems Inc.，USA)重复了以上过程，从而确定TGF-β1II型受体的敏感性。这些结果也被绘制在图1中，说明使用TGF-β1II型受体获得的相关曲线也是一条相关系数为0.999，斜率为0.57的直线。因此，II型受体也可以被用于定量TGF-β1的浓度，但是其敏感性显著地比III型受体的那个低。实施例2TGF-β1III型受体对TGF-β1的特异性除了使用含有2,000pg/ml TGF-β1，2,000pg/ml TGF-β2和2,000pg/ml TGF-β3(R&D Systems Inc.，USA)的混合物替换了TGF-β1之外，重复了实施例1的步骤2的过程。使用2,000pg/ml TGF-β1作为一个对照，重复了实施例1的步骤2的过程。结果被显示在表I中。
表I
正如从表I可以见到的一样，TGF-β1III型受体仅与TGF-β1结合，不与TGF-β2或TGF-β3发生交叉反应。实施例3使用单克隆抗体测量癌症患者的血浆TGF-β1浓度从101个健康人，111胃癌患者，100个肝癌患者和151个乳腺癌患者获得血液样品。用含有0.081ml作为一种抗凝剂的15％乙二胺四乙酸(EDTA)的真空容器收集血液样品，并在此后将所获得的混合物在3,000rpm离心20分钟，从而获得一种血浆样品。将0.1ml的此血浆样品加到0.1ml的2.5N乙酸/10M尿素溶液中。将所产生的混合物在室温保存10分钟，并用0.1ml的含有1M乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的2.7N NaOH中和。用PBST4倍稀释这样获得的被活化的血浆，从而获得一种进行以下测量其TGF-β1浓度之过程的血浆样品。
0.1ml的这样获得的血浆样品溶液，以及0.1ml一份的TGF-β1标准溶液(0，100，1,000和2,000pg/ml)被分别地加入到一块含有TGF-β1III型受体的96-孔板的孔中，在室温保存3小时，并在此后，用PBST洗涤了3次。将纯化的TGF-β1单克隆抗体-HRP复合物(Sigma)加入每一个孔，并在此后将此板在室温保存1.5小时，此后用PBST洗涤这些孔3次。将100μl的TMB-ELISA(Gibco-BRL，USA)，一种HRP底物，加入每一个孔，并将此板在室温保存20分钟从而显色。通过加入25μl的2N硫酸终止了此显色反应。在450nm的测量波长和570nm的校正波长测定了此反应混合物的光密度。基于使用标准溶液获得的校正曲线，确定了此血浆样品的TGF-β1浓度，并将结果显示于表II和图2.
表II
正如在描述各患者组的血浆TGF-β1浓度分布模式的图2中可以看见的一样，癌症患者的血浆样品呈现与健康人组的那个显然不同的TGF-β1浓度模式。这暗示上述癌症可以根据以上过程通过测量血浆TGF-β1浓度被检测。实施例4使用单克隆测量癌症患者的血浆TGF-β1浓度使用从288个健康人，29个肺癌患者，48个直肠-结肠癌患者，50个前列腺癌患者和88个子宫颈癌患者所获得的血液样品，重复了实施例3的过程，从而测量各血浆TGF-β1浓度，并将结果显示在表III和图3中。
表III
P＜0.01正如在说明各患者组的血浆TGF-β1浓度分布模式的图3中可以看见的一样，癌症患者的血浆样品呈现与健康人组的那个显然不同的TGF-β1浓度模式。这暗示上述癌症可以根据以上过程通过测量血浆TGF-β1浓度而被检测。实施例5使用多克隆抗体测量癌症患者的血浆TGF-β1浓度除了使用了一种多克隆抗体代替此单克隆抗体以外，使用从50个健康人，50个肝癌患者，和50个乳腺癌患者所获得的血液样品，重复了实施例3的过程，从而测量各血浆TGF-β1浓度，并将结果显示于表IV。
表IV
P＜0.05
正如在表IV中可以看见的一样，癌症患者的血浆样品呈现与健康人组的那个显然不同的TGF-β1浓度模式。这暗示上述癌症可以根据以上过程通过测量血浆TGF-β1浓度而被检测。实施例6生产一种TGF-β1单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备(步骤1)免疫小鼠将TGF-β1与等体积的弗氏完全佐剂混合，直至此混合物变成液体，并且所产生的混合物按100μl/小鼠的量，注射到一只7周龄的Balb/c小鼠的尾静脉。2周之后，将与弗氏不完全佐剂混合的与第一次注射中相同量的TGF-β1，注射到此小鼠的尾静脉。在4到5天之后，从尾获得小量血液，并通过ELISA确认了TGF-β1抗体的存在。此后，在下面的细胞融合过程之前3到4天，用溶解在0.85％PBS中的30μg的人TGF-β1静脉注射。(步骤2)细胞融合在此细胞融合过程中使用骨髓瘤细胞SP2/0·Ag14(ATCC CRL 1581)作为一种母细胞。此母细胞在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养，同时维持5×105/ml的最大细胞密度。
使用乙醚麻醉在步骤1中所获得的被免疫的小鼠，并摘除其脾脏，从而用组织匀浆器匀浆。将所产生的匀浆悬浮在HBSS(Gibco-BRL，USA)中，并将所产生的悬浮液放置于一支15ml离心管中离心。重复此过程两次，从而彻底地洗涤脾细胞。将此母细胞，SP2/0·Ag14细胞，悬浮在HBSS中并离心之。重复此过程两次。脾细胞和SP2/0·Ag14分别被悬浮在10ml的HBSS中从而计数每一种悬浮液中的细胞数量。将从各悬浮液获得的108个脾细胞和107个SP2/0·Ag14细胞在一支离心管中混合，此后离心，从而使细胞沉淀。用手指轻轻敲打此离心管从而分散被沉淀的细胞，并在此后，在37℃保存1分钟。历时1分钟向其中加入1ml的含有45％PEG(w/v)和5％DMSO的HBSS，此后摇动此管1分钟。历时3分钟向其中加入9ml的RPMI培养基，并在此后向其中加入RPMI培养基直至细胞悬浮液的总体积变成50ml，同时摇动此管。将所产生的悬浮液离心，并将这样获得的细胞沉淀按1-2×105/ml的浓度重新悬浮在HAT培养基(Gibco-BRL，USA)中。将0.2ml一份的所产生的悬浮液置于一块96-孔微量滴定板的孔中，并在此后在培养箱中培养了数天，条件维持在37℃，5％CO2和100％湿度。(步骤3)生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系的选择如同下面所描述的一样，使用人TGF-β1抗原对在步骤2中获得的杂交瘤细胞系进行了ELISA，从而获得特异性地与TGF-β1反应的细胞。
将人TGF-β1抗原按50μl(2μg/ml)/孔的量加入一块微量滴定板的孔中，并在室温保存12小时，从而将抗原结合到孔的表面上。用PBST洗涤了这些孔，从而去除没有结合的抗原。
将在步骤2中获得的此杂交瘤细胞培养物按50μl/细胞的量加入每一个孔中，并在37℃保存1小时。用PBST洗涤这些孔，从而去除此培养物。向其中加入羊抗鼠IgG-HRP(Sigma，USA)，在室温保存1小时，并用PBST洗涤。向其中加入100μl的底物溶液(OPD，Sigma)，在室温保存20分钟，并在492nm测量了所产生的反应混合液的光密度。
最先选择了分泌针对人TGF-β1抗原的具有高特异性的抗体的杂交瘤细胞系，并使用人TGF-β1，-β2和-β3对这些杂交瘤细胞系中的每一种都进行了ELISA，从而筛选仅对人TGF-β1抗原具有特异性的杂交瘤细胞。对这样获得的杂交瘤细胞中的每一种进行了有限稀释，从而获得7个产生一种单克隆抗体的杂交瘤细胞系克隆，hTGF-7，-8，-31，-46，-70，-119和-207。每一个克隆都被冷冻干燥。
离心杂交瘤细胞培养物，并将上清进行ELISA，从而确定此抗体滴度，并在此后用免疫分型试剂盒(immunotype kit)(Sigma，USA)分析，从而确定此抗体的亚类。将结果显示于表V。
表V
正如表V中可以看见的一样，全部7个克隆都是IgG1。
在这7个克隆当中，选择了具有最高滴度的克隆，hTGF-46，并腹膜内注射给一只小鼠。此后，收集其腹水，并进行了Western印迹。结果说明此杂交瘤细胞系克隆hTGF-46分泌一种对人TGF-β1具有高特异性的单克隆抗体。根据关于因专利程序之微生物保藏物的国际识别的布达佩斯条约的条款，在1998年4月20日将此杂交瘤细胞系hTGF-46保藏在韩国典型培养物保藏中心(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon305-600，Republic of Korea)，其保藏号为KCTC 0460BP。实施例7TGF-β1的单克隆抗体的生产为了使用在实施例6中获得的杂交瘤细胞系生产TGF-β1的单克隆抗体，给Balb/c小鼠腹膜内注射了0.5ml的降植烷，并在1周之后，给每一只小鼠注射了5×106个杂交瘤细胞。从具有膨胀的腹腔的小鼠获取含有高浓度的杂交瘤细胞的腹水，并在10,000rpm离心，从而去除此杂交瘤细胞。上清被保存在-20℃。
柱子用蛋白G珠子填充，并在此后用1×PBS洗涤了4次。将2ml的上清按5滴/分钟的速率一滴一滴地上样到此柱子上，并将0.1M甘氨酸-盐酸溶液按1滴/10分钟的速率引进此柱子从而洗脱IgG。
HRP在含有1.25％戊二醛0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.5)中被活化，并将被活化的HRP对碳酸盐缓冲液(pH9.2)透析。将被透析的HRP与此IgG反应，从而获得一种结合了HRP的IgG。在此反应完成之后，通过在280nm和403nm测量此反应混合液的光密度确定了RZ值(A403/A280)。为了确定酶联抗体的活性，用1μg的TGF-β1包被了一块微量滴定板的每一个孔，并在此后与此结合了HRP的IgG反应，从而确定活性。进一步地，对此结合了HRP的抗体进行了Western印迹，从而确定其活性。
在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上对人TGF-β1，-β2和-β3蛋白进行了SDS-PAGE，并在此后将其电转移到一张硝酸纤维素滤膜上。将此膜与此单克隆抗体反应数小时。所产生的膜在室温用牛血清白蛋白处理12到14小时，从而封闭这些蛋白的非特异反应。用含有0.5％Tween 20的PBS洗涤此膜3次，并在此后与结合了HRP的抗小鼠IgG(Sigma，USA)在室温反应。用含有0.5％Tween 20的PBS洗涤此膜3次，此后，向此膜加入一种底物缓冲液(TMB，Gibco-BRL，USA)从而显色。
结果说明了本发明的此单克隆抗体仅与人TGF-β1反应，并且不与人TGF-β2和-β3反应。因此，本单克隆仅对人的TGF-β1具有特异性。
尽管关于以上特定实施例，本发明已经被描述了，应该承认本领域中的熟练人员可以对本发明进行各种修饰和改变并仍然在被附加的权利要求书所规定的范围中。
微生物国际保藏证明(译文)
序列表<110>韩美药品工业株式会社<120>定量转化生长因子-β1的方法以及通过使用该方法检测癌症的方法<130>PCA00418/HMY<150>KR 1999-12568<151>1999-04-09<150>KR 1999-43935<151>1999-10-12<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer RIII1<400>1atggcagtga catcccac18<210>2<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer RIII2<400>2atttgggctt cc 12<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>3tttactgttt tcgtaacagt tttg24<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400>4caacaacgca cagaatctag c 2权利要求
1.一种定量样品中TGF-β1的量的方法，包括用一种TGF-β1特异的受体处理样品从而在TGF-β1与此受体之间形成一种复合物，并测定此复合物的量。
2.权利要求1的方法，包括(a)将TGF-β1特异的受体结合到一种固体支持物上；(b)将此样品加入此被支持的受体从而形成TGF-β1-受体复合物；(c)将一种结合了一种标记物的TGF-β1特异的抗体结合到此复合物上；和(d)使用该标记物作为检测标记测定TGF-β1的量。
3.权利要求1或2的方法，其中TGF-β1特异的受体是TGF-β1 III型受体。
4.权利要求2的方法，其中TGF-β1特异的抗体是一种通过用TGF-β1或其中的一个部分免疫一种哺乳动物所制备的抗体。
5.权利要求4的方法，其中此抗体是一种单克隆抗体或多克隆抗体抗体。
6.权利要求5的方法，其中此单克隆抗体是用一种杂交瘤细胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)生产的。
7.权利要求1或2的方法，其中在此样品中TGF-β1的浓度是30pg/ml或更低。
8.权利要求2的方法，其中此标记物是辣根过氧化物酶，生物素或荧光。
9.一种在患者中检测癌症的方法，包括用TGF-β1特异的受体处理取自患者的体液样品从而在此受体与存在于此样品中的TGF-β1之间形成复合物；测量此复合物的量从而定量此样品中的TGF-β1的浓度；并且将此TGF-β1浓度与健康人的进行比较。
10.权利要求9的方法，包括(a)将TGF-β1特异的受体结合到一种固体支持物上；(b)将此样品加入此被支持的受体从而形成TGF-β1-受体复合物；(c)将一种结合了一种标记物的TGF-β1特异的抗体结合到此复合物上；(d)使用该标记物作为检测标记测定TGF-β1的量，从而确定此样品中TGF-β1的浓度；和(e)将此TGF-β1浓度与健康人的比较。
11.权利要求9或10的方法，其中此TGF-β1特异的受体是TGF-β1 III型受体。
12.权利要求10的方法，其中此TGF-β1特异的抗体是一种通过用TGF-β1或其中的一个部分免疫一种哺乳动物所制备的抗体。
13.权利要求13的方法，其中此抗体是一种单克隆抗体或一种多克隆抗体。
14.权利要求13的方法，其中此单克隆抗体是用一种杂交瘤细胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)生产的。
15.权利要求9或10的方法，其中此样品中的TGF-β1的浓度是30pg/ml或更低。
16.权利要求10的方法，其中此标记物是辣根过氧化物酶，生物素或荧光。
17.权利要求9或10的方法，其中此癌选自胃癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，直肠结肠癌，前列腺癌和子宫颈癌。
18.权利要求9或10的方法，其中此体液是血浆或尿。
19.一种检测癌的组合物，包括一种TGF-β1特异的受体和一种TGF-β1特异的抗体的。
20.权利要求19的组合物，其中此TGF-β1特异的受体是TGF-β1III型受体。
21.一种杂交瘤细胞系，它是产生人TGF-β1特异的单克隆抗体的hTGF-46(KCTC 0460)。
22.一种由杂交瘤细胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)产生的TGF-β1特异的单克隆抗体。
全文摘要
通过用一种TGF－β1特异的受体处理样品从而在TGF－β1与此受体之间形成复合物并测量此复合物的量而定量一种样品中的TGF－β1的量。
文档编号C07K16/22GK1355882SQ00806081
公开日2002年6月26日 申请日期2000年4月10日 优先权日1999年4月9日
发明者陈承嫄, 申勋, 林昌基 申请人:韩美药品工业株式会社