利用单价抗原－结合蛋白抑制病毒感染的制作方法

专利名称：利用单价抗原－结合蛋白抑制病毒感染的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗原结合蛋白在抑制病毒或其它传染性病原体的传染性的方法中的用途、含有这种蛋白的产品和组合物以及识别和/或选择具有该活性的抗原结合蛋白的方法。特别是，本发明涉及一种利用单价抗原结合蛋白来抑制病毒感染的方法，所述单价抗原结合蛋白含有一个能够与病毒结合的、源于缺少轻链的免疫球蛋白的重链的可变区域。
背景技术：
抗体是属于一组由应答抗原的免疫系统产生的免疫球蛋白的蛋白质分子。大多数抗体分子的结构基于一个含有两条相同的重链和两条相同的轻链的四个多肽的单位，其通过二硫键共价连接在一起。每一条所述链在离散区进行折叠。重链和轻链的C-端区域是序列保守的因而被称作恒定区，其含有一个或多个所谓的C-区。重链和轻链的N-端区域，也称作V-区，是序列可变的因而决定抗体的特异性。具有抗原结合活性的轻链和重链的可变区域(分别是VL和VH)被认为是高变的或补充的决定区域(CDR)。
能够显示上述四-链免疫球蛋白的功能特性但只含有两条多肽重链而缺少多肽轻链的免疫球蛋白已有记载(WO94/04678，Casterman等，1994)。对应于分离的VH区的片段(下文称作VHH)也被公开了。专利申请WO94/25591(Unilever)中记载了大规模制备这种抗体或其片段的方法，该方法包括用编码所述抗体或片段的可表达DNA序列转化霉菌或酵母。
WO94/04678中记载的、可以从Camelids血清中分离到的免疫球蛋白不是靠重链和轻链可变区的缔合来形成抗原结合位点，而是单独由多肽重链自然形成完整的抗原结合位点。在下文中被称作“重链免疫球蛋白”的这些免疫球蛋白因此与通过普通(四-链)免疫球蛋白的降解或通过直接克隆得到的重链完全不同，所述通过普通(四-链)免疫球蛋白的降解或通过直接克隆得到的重链只能提供部分结合位点并且需要与抗原结合的轻链配偶体，才能形成一个完整的结合位点。
发现了抗体或其片段在多种用途中的应用，所述应用中可以有效地利用抗体-抗原相互作用的特性。这些应用包括作为诊断、治疗、免疫分析和纯化方法的用途。抗体或其片段在抑制病毒感染方面，例如在利用灭活的病毒制剂或利用重组细胞制备的病毒抗原进行主动免疫过程中或在通过中和性抗体的给药进行的被动免疫过程中的应用引起了人们的关注。
据文献报导单价Fab抗体片段能够中和病毒。Cheung等(1992)，病毒学杂志(Journal of Virology)，66，6714-6720记载了狂犬病毒-中和抗体MAb-57的Fab区的制备并且还阐明这个单价片段本身具有病毒-中和活性。其它出版物也报道了人Fab单价抗体片段能够中和或抑制病毒活性的性能(参见例如，Williamson等(1993)，美国国立科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90，4141-4145)。由于这种抗体片段的制备成本过高使得制备工艺在经济上不可实施因而这种方法不适于大规模的工业化应用。
一种利用该文献中记载的抗体抑制病毒复制的取代方法是选择将由病毒产生的酶作为靶的抗体。Martin等，蛋白质工程(ProteinEngineering)，10(5)，607-614(1997)记载了camelisedf VH抗体片段抑制丙肝病毒NS3蛋白酶因而阻止病毒多-蛋白前体发生裂解的用途。
另一种寻找解决病毒感染问题的经济可行性方案的工业化应用是发酵加工的领域，尤其是食品加工领域。
乳酸菌(LAB乳球菌和乳杆菌)在食品发酵生产如乳酪或酸奶的生产中起着重要的作用。这种发酵通常由于所述细菌对称作噬菌体的病毒敏感而受到抑制，其在通常是非无菌条件下进行的生产过程中增大。噬菌体感染引起LAB细胞的溶解；随着发酵时间的延长抗噬菌体的细胞数量能够增加，但是这种延迟严重地影响了生产能力，并且受到干扰的生产过程产生了低质量的产品。有时生产过程被迫中断，结果造成整批牛奶的全部损失。
直到现在，噬菌体问题主要是通过采取涉及生产设备卫生条件的特殊预防措施来解决，但是这又引起了附加的时间延迟。所建议的另一个解决方案是采用抗性LAB菌株，但是噬菌体适应形态的定期表象使得在被称作循环培养的过程中所利用的菌株不时地进行改变。这一点所造成的不利之处在于需要工作人员严密监控生产设备和培养基中噬菌体的存在状况并且需要得到几套具有相同功能属性、只是对噬菌体敏感性不同的培养物。因此抗LAB噬菌体感染的方法的进一步研究具有很大的商业意义。
由Geller等(1998)，乳品科学杂志(J.Dairy Sci.)81，895-900介绍的一种方法包括将以乳球菌噬菌体免疫的牛的初乳用作噬菌体-中和性(多克隆的)抗体的来源以便防止在噬菌体-污染的牛奶进行发酵的过程中乳酸乳球菌发生溶菌感染。然而，这一方法没能提供商业上可行的解决所述问题的方案。不仅是由于以这种方式制备抗体实在不具备经济上的诱惑力，而且向牛奶中加入初乳也没得到有关管理部门的批准。
本申请人于1998年10月26日申请的共同-悬而未决专利申请PCT/EP98/06991例示了一种取代方法，该方法通过交联或凝集作用利用多价的、多特异性的抗原结合蛋白来降低LAB噬菌体的感染力，所述抗原结合蛋白含有一种多肽，该多肽序列中含有两个或多个单域结合单位，优选地是来源于天然缺少轻链的免疫球蛋白的重链可变区。
现在仍然需要继续研究抑制或中和病毒感染的改进方法。尤其是，仍然对能经济地用于工业应用规模的方法的研究保持兴趣。
发明概述因此，一方面本发明提供了一种利用单价抗原结合蛋白抑制病毒感染的方法，该抗原结合蛋白含有一个能够结合病毒的单可变区结合单位，或其功能等价物。
另一方面本发明提供了含有一个能够结合病毒的单可变区结合单位或其功能等价物的单价抗原结合蛋白在抑制病毒感染中的用途。
本发明还提供了含有一个能够结合病毒的单可变区结合单位或其功能等价物的单价抗原结合蛋白在制备抑制病毒感染药物中的用途。
本发明还提供了含有一个能够结合病毒的单可变区结合单位的单价抗原结合蛋白、编码这种蛋白的核苷酸序列、含有这种核苷酸序列的克隆和表达载体、用含有这种核苷酸序列的载体转化的宿主细胞和含有这种蛋白的食品、化妆品以及药品。
另一方面，本发明提供了一种选择能够抑制病毒感染宿主细胞的抗原结合蛋白的方法，该方法包括步骤i)将一种抗原结合蛋白与靶病毒混合，ii)将步骤i)的抗原结合蛋白-病毒复合物暴露于过量的宿主细胞，iii)除去宿主细胞和任何有关的抗原结合蛋白-病毒复合物，iv)利用病毒特异性配体捕捉没有被步骤ii)的宿主细胞吸收的抗原结合蛋白-病毒复合物以便从非结合的蛋白中分离出病毒特异抗原结合蛋白。
本发明还提供了一种鉴定能够抑制噬菌体感染乳酸菌宿主细胞的抗原结合蛋白的方法，该方法包括步骤i)在有抗原结合蛋白和噬菌体存在的条件下培养细菌宿主细胞，ii)分析所述培养物在培养物生长培养基的PH发生变化过程中活性细胞的生长现象。
如本文所采用的，单可变区结合单位是指一种形成完整抗原结合位点的免疫球蛋白可变区或其功能等价物。这可能自然产生或合成产生。除非特别说明，术语“免疫球蛋白”和“抗体”在整个说明书中被用作同义词。
免疫球蛋白可变区的“功能等价物”是任何一种具有相似结合特异性的同源蛋白质分子。一种功能等价物的特征在于免疫球蛋白的可变区序列中插入、缺失或替换一个或多个氨基酸残基。合适地，功能等价物的氨基酸序列与免疫球蛋白可变区的氨基酸序列至少具有60％的相似性，优选地至少80％，更优选地至少90％的相似性。
抑制病毒感染包括但不限于通过阻断病毒颗粒上的必需位点如在感染的第一个步骤中病毒借以附着在宿主细胞上的病毒的受体结合蛋白来抑制感染。抑制可是全部的或者是部分的。术语“抑制”和“中和”在本文中被用作同义词。
术语“病毒”包括在其范围内的感染细菌宿主细胞的被称作噬菌体的病毒。与病毒结合包括与位于病毒颗粒表面上的一个或多个分子结合。
结合附图参照下列说明可以更充分地理解本发明

图1表示在中和乳酸乳球菌噬菌体P2过程中通过噬菌斑滴定法测定的选择的单价VHH片段VHH#1的效力。
图2表示利用少量牛奶培养物进行的酸化实验过程中通过VHH片段VHH#1避免感染噬菌体。
图3表示将基于ELISA的方法用于本研究中的抗体片段的效价测定。
发明详述本发明基于一种含有能与病毒结合的单可变区结合单位的单价抗原结合蛋白有利于用来抑制病毒对宿主细胞的感染的发现。高产率和简单的下游工艺使得这种抗原结合蛋白能够经济、有效地适用于工业化的方法和生产。
如上所述，以前文献描述的用于抑制病毒感染的基于抗体的方法依赖于通过多价构建体介导的交联或者利用了来源于“传统”抗体的较大片段如Fab片段来阻断病毒的受体结合蛋白，因而抑制了病毒感染宿主细胞的能力。
令人惊奇的是，本发明人发现含有一个单可变区的较小单价抗原结合蛋白在抑制病毒感染方面是有效的。这不能从现有技术的教导中推测出，由于这些蛋白的较小尺寸在阻止病毒与宿主细胞结合的过程中效率较低。而且，以前预计多价抗原结合蛋白由于感染性颗粒的凝集而可能更有效。至今，只报道了利用这种结合蛋白识别简单的蛋白抗原。还没有关于利用单域结合单位能够检测和抑制复杂系统如病毒的提议。
本发明适于任何免疫球蛋白可变区的用途，该可变区形成一个完整的抗原结合位点。该免疫球蛋白可以从天然资源中获得或经合成产生。优选地，本发明涉及来源于缺少轻链的免疫球蛋白的重链可变区的用途，最合适地来源于天然缺少轻链的免疫球蛋白如能够从淋巴细胞，尤其是可以从上述WO94/04678(Casterman等)中记载的Camelids的外周血淋巴细胞、骨髓细胞或脾细胞中获得的。
应当理解根据本发明也可适当地使用来源于其它免疫球蛋白的重链可变区，所述其它免疫球蛋白被修饰(‘camelised’)以便能够以与来源于Camelids的重链可变区相同的方式起着单价结合域的作用。
使用来源于Camelids的重链可变区的单域结合单位的有利方面在于能够方便易行地进行大规模的经济生产，例如通过采用WO94/25591(Unilever)中记载的低转化真核宿主。所述生产系统的主要优势在于分泌出的成分中只存在少量的杂质，因而简化了下游的纯化加工过程。尤其当考虑进行食品加工应用时，更具有优势地是这种重链可变区具有相当强的热稳定性，因而在进行巴氏消毒或其它热处理时不会导致抗原结合能力的下降。
本发明既可用于原核宿主细胞又可用于真核宿主细胞。人们所感兴趣的用于治疗人类或动物疾病的靶病毒包括病原病毒如那些属于人类免疫缺乏病毒科的病毒。本发明适用的其它病毒感染包括食物感染病毒如肝炎病毒(尤其是甲肝病毒)、轮状病毒和小圆结构病毒(SRSV)，如Norwarlk病毒(参见现代食品科学和技术(Food Scienceand Technology Today)，II(1)，49-51，1997)。在农作物生产的领域中，对植物致病的病毒如橘树根枯(Citrus tristeza)病毒(CTV)、烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯病毒Y(PVY)、莴苣坏死黄化病毒(LNYV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、三叶草伤瘤病毒(Cloverwound tumor virus)(CWTV)、花椰菜花叶病毒(CaMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、土传小麦furiovirus(SBWMV)、小麦黄化花叶bymovirus(WYNV)和小麦纺锤体条斑花叶病毒(Wheat spindlestreak mosaic virus)(WSSMV)是中和或抑制作用的主要靶目标。
单域结合单位，如识别植物病毒的重链可变区可以通过采用相当于常规的(修改的)病毒蛋白克隆和表达的方法在植物中进行克隆和表达，以便防卫这些植物病毒。通过采用本技术领域中已知的合适靶信号，能以细胞器的方式或以胞外基质的方式调控VHH’s的表达和易位。
本发明特别用于工业发酵过程，例如中和或抑制乳球菌噬菌体的感染，因而防止乳酸乳球菌的溶菌感染。通过抑制乳球菌噬菌体的感染力，本发明提供了避免采取上述多种受成本影响的方法的可能性。抗原结合蛋白可被用于清洁产品，去除存在于生产系统中的噬菌体。或者，它们被加到，如下面实施例3中所示的污染了噬菌体的牛奶中，通过发酵就能得到高质量的产品并且没有对生产造成任何延迟。在牛奶中标准加入这种抗原结合蛋白可能是一种监控噬菌体存在的方法。
除了乳制品外，乳酸菌在其它许多食品的发酵生产中也起着重要的作用。应理解为本发明不局限于在乳品发酵过程中抑制LAB噬菌体感染的应用而且还应扩展到任何利用乳酸菌发酵的任何过程中的应用。下列表1a-1b列出了合适的发酵食品和有关的乳酸菌(参见生物技术，第5卷，1-8章)。
表1a欧洲发酵食品中的主要功能性乳酸菌
表1a续
表1a续
表1b自然发酵食品中的主要功能性乳酸菌
表1b续
本发明进一步提供编码单价抗原结合蛋白的核苷酸序列，该单价抗原结合蛋白抑制普遍存在的乳球菌噬菌体P2。采用高通量筛选分析方法识别抑制性结合域，该方法能够从非-抑制性结合蛋白中识别出抑制结合蛋白。利用连接在金颗粒上的结合域片段通过电子显微镜来表征噬菌体P2上含有的结合位点。另外，更细致地分析了抗同科和其它科噬菌体的成员的交叉反应性。
本发明在抑制乳球菌噬菌体P2中使用的特定重链可变区(下文称作VHH片段)含有序列VHH#1 (SEQ.ID NO.1)QVQLQESGGG LVQAGGSLRL SCTASRRTGS NWCMGWFRQL AGKEPELVVA LNFDYDMTYYADSVKGRFTV SRDSGKNTVY LQMNSLKPED TAIYYCAARS GGFSSNRELY DGWGQGTQVT VSSVHH#2 (SEQ.ID NO.2)QVQLQESGGG LVQAGGSLRL SCTASRRTGS NWSMGWFRQL AGKEREFVVA LNLDYDIPYYADSVKGRFTV STDSGKNTVY LQMNSLKPED TAIYFCAARS GGFSSNRTYY DYWGQGTQVT VSSVHH#3 (SEQ.ID NO.3)QVQLQQSGGG LVQRGGSLRL SCTASRRTGS NWSMGWFRQF AGKEPDLLVA LNLDYDVPYYADSVKGRFTV SGDSGKNTVY LQMNNLKPED TAIYYCAARS GGFSSNRALY DGWGQGTQVT VSS本发明还提供了能够高浓度产生和分泌结合蛋白的宿主细胞和表达载体。
通过筛选编码Camelid免疫球蛋白的克隆基因片段表达库可以方便地获得来源于天然缺少轻链的免疫球蛋白的、具有确定的抗原特异性的重链可变区，所述Camelid免疫球蛋白是采用例如在WO94/04678和实施例1中记载的常规技术制备的。富集识别感染病原体的结合域由此来限制为了鉴别抑制性片段而要筛选的克隆的数目的合适方法是酵母展示(Unilever的WO94/01567)或噬菌体展示。
富集适用于本文所述单可变区结合单位的抑制结合域的优选方法是基于宿主细胞通过可与非-抑制性感染病原体结合的受体蛋白捕捉结合域和目标感染病原体的复合物来除去暴露了非-抑制性结合区的克隆。
本发明的病毒感染抑制性抗原结合蛋白可以通过插入编码上文所述多肽的基因转化宿主并在所述宿主中表达所述基因来制备。
合适的宿主可以选自原核细菌，如革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌，和革兰氏阳性细菌例如枯草芽孢杆菌以及特别是乳酸菌，低等真核生物如酵母菌，例如属于酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤氏酵母属的酵母菌，或霉菌如那些属于曲霉属或木霉属的霉菌。
本发明使用的有关优选宿主是能被直接用于牛奶发酵的低等真核霉菌和酵母菌，以及特别是乳酸菌。
合成基因、将它们插入到宿主中以及在宿主中表达基因的技术是本领域中已知的，并且技术人员采用普通知识就能够容易地实施本发明。
本发明应用的蛋白可以通过采用常规技术如亲和性色谱、离子交换色谱或凝胶过滤色谱进行回收和纯化。
通过本技术领域已知的常规技术如酶联免疫吸附分析方法(ELISA)、放射性免疫分析方法(RIA)或通过生物传感器可以方便地测定本发明的结合蛋白的结合活性。通过抑制噬菌体和病毒的噬菌斑形成，或者通过一种以细胞的连续生长作为抗感染的测量标准的方法来检测抑制能力。本申请或牛奶发酵的酸化实验中记载的高通量筛选分析方法特别适用于乳球菌噬菌体。
通过本技术领域的常规方法可以将本发明能够结合病毒的抗原结合蛋白方便地加到食品或化妆品组合物中以便制备出防止特定病毒感染的产品。或者，采用本技术领域的已知技术将本发明的抗原结合蛋白和可药用载体和/或赋形剂和任选的其它药物或化妆品活性成分配制成药物组合物。
下面的实施例只是为了说明而提供的。除非另有说明，用于操纵和分析核酸物质的技术按照Sambrook等，分子克隆(MolecularCloning)，Cold Spring Harbor Press，纽约，第二版(1989)中所记载的进行。按照Moineau等，加拿大微生物学杂志(CanadianJournal of Microbiology)38/9，875-882(1992)中记载的方法分离和繁殖噬菌体。
VHH表示重链抗体的重链可变区。
限制位点用下划线标明。
实施例实施例1 美洲驼体液免疫应答的诱导给雄性美洲驼经皮下和肌内注射免疫油乳液中的乳酸乳球菌的噬菌体P2(1∶9V/V，水中抗原Specol(Bokhout等(1981)，免疫学(Immunol.)免疫病理学(Immunopath.)，2，491-500；Bokhout等(1986)，传染病(Infect.Dis.)，161-168)。每一免疫接种位点注射0.75-1.5ml的含有200μg噬菌体蛋白的油包水乳液(大约6*1013pfu)。按照下列时间表进行免疫接种第一次注射三个星期后进行第二次免疫接种，第二次注射两个星期后进行第三次免疫接种。免疫应答随后采用ELISA对含固定在Nunc最大吸附板(maxi-sorbplates)(包被液1010pfu/ml用磷酸盐缓冲溶液稀释)上的噬菌体的血清样品进行滴定。同血清一起温育后，采用多克隆兔-抗-美洲驼的抗血清(通过利用经ProtA和ProtG柱纯化的美洲驼免疫球蛋白免疫兔子得到的；ID-DLO)和结合了辣根过氧化物酶的猪-抗-兔免疫球蛋白(DAKO)检测结合的美洲驼抗体。最后，用作为底物的N-四甲基联苯胺和过氧化脲测定过氧化物酶的活性，加入硫酸终止反应后，在450nm下测定光密度。
实施例2 克隆、选择和筛选能中和乳酸乳球菌噬菌体P2的美洲驼VHH片段2.1分离抗乳酸乳球菌噬菌体P2的VHH片段从在ELISA测定中对噬菌体P2呈阳性反应的美洲驼中取大约200ml的血样并且通过Ficoll(Pharmacia)不连续梯度离心得到富集的淋巴细胞群体。从这些细胞中通过硫氰酸鈲(guanidium)提取方法(例如通过Chomczynnski和Sacchi(1987)，分析生物化学(Analytical Biochem.)，162，156-159所记载的方法)分离总(total)RNA。采用MMLV-RT(Gibco-BRL)和随机寡聚核苷酸引物(Pharmacia)合成了第一条cDNA后，利用下列特定引物通过PCR扩增编码VHH片段和部分长或短的绞链区的DNA片段PstIvH-2B 5′-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′(SEQ.ID NO.4)s ＝c和G，M＝A和c，R＝A和G，W＝A和T，HindIIILam-07 5′-AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′(短绞链) (SEQ.ID NO.5)HindIIILam-08 5′-AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3′(长绞链) (SEQ.ID NO.6)
由PCR合成的DNA-片段被PstI(与VHH区的密码子4和5重合，编码氨基酸L-Q)和HindIII(在绞链的5’端引进特定的寡聚核苷酸引物，与氨基酸序列S-L-T重合)消化，然后作为编码VHH区的基因片段被克隆到噬菌粒载体pUR4676(与pHEN1(Hoogenboom等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，(1990)，19，4133-4137)相同，含有由Orum等在核酸研究(Nucleic Acids Res.)，(1998)，21，4491-4498中描述的lacI元件)中，因而使得抗体片段能够在丝状噬菌体的表面进行展示(McCafferty等(1990)，自然(Nature)，6，552-554)，所述VHH区包括融合到大肠杆菌噬菌体M13的geneIII蛋白上的绞链区。
2.2通过噬菌体展示方法富集结合VHH区的乳球菌噬菌体I)在噬菌粒载体pUR4676中构建具有1×107个克隆的展示库，其中75％的所述克隆含有一个完整的VHH插入片段。通过用辅助噬菌体VCS-M13(Marks等(1991)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222，581-597)感染定居在大肠杆菌中的噬菌粒来制备暴露VHH片段的噬菌体颗粒。用PEG6000将噬菌体从培养液中沉淀出来，除去游离的VHH片段，由此避免了对结合噬菌体的和游离的VHH区域之间竞争结合抗原的干扰。
II)通过淘选(biopanning)技术(McCafferty等(1990)，自然(Nature)，6，552-554)从库中选择与乳球菌噬菌体P2结合的固定在最大吸附免疫管中的噬菌体抗体。经过充分的洗涤过程后，用0.1M的三乙基胺(Baker)通过用这种碱冲击破坏抗原-抗体的结合，从管中洗脱出大肠杆菌噬菌体。用0.5体积的pH7.4的1M Tris-HCl中和后，通过转染到大肠杆菌宿主TG1中来拯救噬菌体。用前述的转染大肠杆菌群体制备的噬菌体重新进行选择。或者，暴露乳球菌噬菌体特异性抗体片段的大肠杆菌噬菌体的‘溶液内’捕捉是通过采用体外生物素酰化的噬菌体P2来进行的。利用抗生蛋白链霉素包裹的磁性珠(Dynall)将抗原-抗体复合物和相关的噬菌体颗粒从溶液中分离出来(见Hawkins等(1992)，J.Mol.Biol.，226，889-896)。洗涤后，用上述三乙基胺洗脱大肠杆菌噬菌体。
将经过两轮选择获得的单个大肠杆菌克隆接种到微量滴定板的孔中，通过加入异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，0.1mM)来诱导产生VHH片段。生长16小时后，用ELISA分析克隆的培养上清液中是否含有VHH片段，该片段与固定化噬菌体P2特异性结合。结合的VHH片段用兔抗-美洲驼VHH多克隆抗体来检测，接着与结合了辣根过氧化物酶(BIORAD)的山羊抗-兔多克隆抗体一起温育，或用小鼠单克隆抗-真菌(myc)抗体来检测，接着与结合了辣根过氧化物酶的多克隆兔抗-小鼠(DAKO)一起温育。
2.2.1另一种富集方法按照上述实施例2.2(I)的方法，可制备结合噬菌体的VHH区的库。大肠杆菌噬菌体与体外生物素酰化的乳球菌噬菌体P2一起温育2小时后，用过量的乳酸乳球菌菌种的宿主细胞来捕捉暴露非-中和性的、而噬菌体P2特异性的VHH片段的大肠杆菌噬菌体克隆。通过它们暴露的VHH片段与生物素酰化的噬菌体P2复合的、而未与乳酸乳球菌结合的(因而潜在地中和)大肠杆菌噬菌体颗粒可以利用病毒特异性配体如包裹了磁性珠的链霉抗生物素从溶液中捕捉，因而与通过它们暴露的VHH片段未与噬菌体P2结合的大肠杆菌噬菌体分离。利用pH-冲击(0.1M三乙基胺)洗脱后，富集了中和性VHH区域的噬菌体种群可以通过感染大肠杆菌宿主细胞来拯救(rescued)。
作为一种选择的方法，可以使用未标记的噬菌体P2代替与暴露的VHH-大肠杆菌噬菌体结合的抗生物素酰化的噬菌体。用乳酸乳球菌捕捉了暴露非-中和性VHH片段的克隆后，显示中和性结合域蛋白的克隆种群可以通过采用单克隆的或多克隆的抗体从溶液中捕捉，所述抗体定向抗乳酸乳球菌噬菌体P2，其固定在一种固体表面或偶合到一种基质上。
单个大肠杆菌克隆可以被接种到微量滴定板的孔中，通过加入IPTG(0.1mM)来诱导产生VHH片段。含有游离VHH区的培养上清液，可在ELISA中利用检测用myc-TAG测试与乳酸乳球菌噬菌体P2的结合和通过采用上述技术分析它们在高通量分析中的抑制能力。
2.3用于鉴定中和性VHH片段的噬菌体的高通量筛选分析方法的发展。
通过宿主细胞乳酸乳球菌的连续生长来证明VHH片段的噬菌体中和能力。当测定细胞生长时，伴随着牛奶的酸化，包含pH指示剂溴酚红从开始培养时的紫红色(pH是6.5至7.0)经过8至15小时的培养后变到黄色(pH是4.5至5.0)。50μl用大肠杆菌或啤酒糖酵母选择得到的单个克隆上清液与50μl噬菌体溶液(2×109pfu/ml，用补充了0.35％的蛋白胨，0.35％的酵母抽提物，1％的葡萄糖，0.8％的多粘菌素B的半脱脂牛奶稀释)在微量滴定板的孔中混合。接着，与100μl的乳酸乳球菌细胞(补充了2％的溴酚红的上述半脱脂牛奶培养基50倍稀释的过夜培养物)混合。在30℃培养8至15小时后，通过颜色的变化(黄色)从285个分析的VHH片段中鉴定出了10个中和性抗体。对其中的三个进行了详细表征(参见2.6部分以及其它部分)。
2.4噬菌体中和VHH片段的序列如上所述获得了抗-LAB-噬菌体VHH片段，该片段能够中和乳球菌噬菌体P2。下面列出三个这种片段的序列VHH#1(在大肠杆菌噬菌粒载体pUR3827和啤酒糖酵母附加型质粒pUR3834中克隆)QVQLQESGGG LVQAGGSLRL SCTASRRTGS NWCMGWFRQL AGKEPELVVA LNFDYDMTYYADSVKGRFTV SRDSGKNTVY LQMNSLKPED TAIYYCAARS GGFSSNRELY DGWGQGTQVT VSS(SEQ.ID NO.1)VHH#2(在大肠杆菌质粒pUR3828和啤酒糖酵母附加型质粒pUR3835中克隆)QVQLQESGGG LVQAGGSLRL SCTASRRTGS NWSMGWFRQL AGKEREFVVALNLDYDIPYYADSVKGRFTV STDSGKNTVY LQMNSLKPED TAIYFCAARS GGFSSNRTYY DYWGQGTQVT VSS(SEQ.ID NO.2)VHH#3(在大肠杆菌质粒pUR3829和啤酒糖酵母附加型质粒pUR3836中克隆)QVQLQQSGGG LVQRGGSLRL SCTASRRTGS NWSMGWFRQF AGKEPDLLVA LNLDYDVPYYADSVKGRFTV SGDSGKNTVY LQMNNLKPED TAIYYCAARS GGFSSNRALY DGWGQGTQVT VSS(SEQ.ID No.3)实施例3.VHH片段中和乳酸乳球菌噬菌体P2的效力3.1在啤酒糖酵母中产生VHH片段的附加型质粒体系中的再克隆
VHH#1、VHH#2和VHH#3克隆的VHH编码基因用分别来源于大肠杆菌噬菌粒载体pUR3827、pUR3828和pUR3829的PstI(存在于VHH基因的5’末端并且是通过引物VH-2B(SEQ.ID.NO.1)引入的)和BstEII(天然存在于大多数VHH基因的3’末端)和BstEII进行消化，并且克隆到附加型啤酒糖酵母分泌型质粒pUR4547上，因而分别获得pUR3834、pUR3835和pUR3836。含有一个用于在啤酒糖酵母中自主复制的Ori的复制质粒pUR4547(保藏号为CBS100012)通过诱导型Ga17启动子能够进行生产；通过将SUC先导序列(Harmsen等(1993)，Gene，125，115-123)融合到VHH产物的氨基末端而完成分泌。通过考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶分析每一构建体的5个克隆d在30℃培养了48小时后得到的培养基级分来测定产量。
根据布达佩斯条约，质粒pUR4547于1997年8月18日在Centraal Bureau voor Schimmelcutures，Baarn进行了保藏，保藏号为CBS100012。根据EPC条款28(4)，或一种对非EPC缔约国的类似处理方法，要求如果需要这种保藏样品，只能提供给专家。
3.2通过基因组中的多拷贝整合构建产生啤酒糖酵母克隆的稳定的VHH通过将编码抗体片段的基因同源重组到酵母基因组来完成建立稳定分泌型啤酒糖酵母细胞系的整合。通过选择多拷贝基因座，即含有100至150个rDNA单位的核糖体DNA-(rDNA)基因座，强行进行多拷贝的插入，因而产生了高产率的抗体片段。克隆#1的VHH基因用限制酶SacI(在SUC前导序列之前定位)和HindIII(在VHH基因的终止密码子的后面定位)和来源于附加型分泌型质粒pUR3834的HindIII进行消化，并在整合质粒pUR 2778中克隆(Giuseppin等(1991)，WO 91/00920；Driedonks等(1995)，Yeast，11，849-864)。该质粒含有诱导VHH基因产物(不具有用于识别和纯化的标记)表达的Ga17启动子、通过对抗生素氨苄青霉素的抗性来区别大肠杆菌中的转化体的选择标记bla(β-内酰胺酶)和用于啤酒糖酵母转化体繁殖的Leu2d(β-异丙基苹果酸脱氢酶)、一种大肠杆菌的复制起源，和最后用于重组到啤酒糖酵母的基因组中的侧翼同源序列。通过限制酶分析方法鉴定含有包括VHH基因的构建物的大肠杆菌转化体。用Nucleobond AX100试剂盒纯化的质粒被用于用醋酸锂方法转化啤酒糖酵母菌株VWK18gallUPA3(Gietz和Schiestl(1995)，Meth.Mol.Cell.Biol.，5，255-259)的过程中。选择了至少10个用于在50ml培养基中表达产物的单个克隆；在考马斯亮蓝染色的SDSPAGE凝胶上分析含有分泌的VHH片段的培养液级分。能最有效产生抗体片段VHH#1的克隆被编码在pUR3858上并且它被用于在10L发酵罐中表达产物。含有抗体片段的培养液级分通过超滤进行浓缩，然后通过离子交换色谱(Mono-S-sepharose，Pharmacia)进一步纯化。纯化的抗体的量通过OD280测量-微量BCA方法进行测定，并且通过在考马斯亮蓝染色的SDS PAGE凝胶上的分析进行验证。
3.3通过对噬菌斑形成的抑制作用测定中和作用为了检测抗-噬菌体P2 VHH的中和效应，测定噬菌体滴度的降低。因此通过含有编码中和性抗-LAB噬菌体VHH#1的质粒pUR383、或编码结合但非-中和VHH#4的LAB噬菌体的质粒pUR3831、或编码中和性双头分子VHH#4-#5的构建物pUR3850(PCT/EP98/06991)的啤酒糖酵母产生的抗体片段按照上述方法进行纯化，所述VHH#4-#5由具有以下序列的非-中和性VHH-片段VHH#4和VHH#5组成VHH#4(SEQ.ID NO.7)QVQLQESGGG LVQPGGSLRL SCVVSGEGFS NYPMGWYRQA PGKQRELVAAMSEGGDRTNY ADAVKGRFTI SRDNAKKTVY LQMSSLKPED TAVYYCNAARWDLGPAPFGS WGQGTQVTVS SVHH#5(SEQ.ID NO.8)QVQLQESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGAPFR ESTMAWYRQT PGKERETVAFITSGGSKTYG VSVQGRFTIS RDSDRRTVLL QMNNLQPEDT AVYYCHRALSNTWGQGIQVT VSS以1ml的总体积将100至5μg的单价片段和5至0.25μg的双价片段与5.0×108的噬菌体P2混合(以噬菌体缓冲液稀释20mMTris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO4)并在37℃下培养0.5小时。将100μl该培养混合物的未稀释液、10-2、10-4和10-6的稀释液加到100μl乳酸乳球菌亚种cremoris LM0230(1×109cfu/ml)的培养物中，该培养物在M17中经过夜培养。加入3ml的M17顶层琼脂后，将所述混合物倒在含有0.5％葡萄糖和10mM CaCl2的M17平板上。平板在30℃下过夜培养。
图1表示在5μg/ml的浓度下，VHH片段VHH#1使得噬菌体滴度相对于没有往噬菌体中加入抗体片段的对照组的滴度降低99％以上。从同一抗体库中选出的ELISA阳性、对乳球菌噬菌体P2特异性的VHH片段即使以100μg/ml的浓度也检测不到中和作用，在高通量筛选分析方法中将所述VHH片段划分为非中和性。至少当噬菌体P2以如此高的滴度存在时，双头分子VHH#4-#5不能抑制感染；下述实施例表明在噬菌体滴度较低的情况下，双头分子是有效的。
该结果显示本文所述的单价片段对噬菌体P2具有非常有效的抑制作用(中和作用)。
3.4通过酸化30ml的牛奶来测定噬菌体的中和效力另一方面，在30℃下接种了乳酸细菌的牛奶的酸化程度通过常规的pH测量来确定。为了达到这一目的，将300μl的乳酸乳球菌亚种cremoris LM0230的过夜培养物(109cfu/ml)接种到30ml XVM-葡萄糖培养基(脱脂牛奶溶液中含有0.35％酵母抽提物，0.35％蛋白胨和1％的葡萄糖)中。或者，使用产生蛋白酶的LM0230衍生菌株C2，因而这些细菌能在不含蛋白胨和葡萄糖的脱脂牛奶中生长。加入不同量的纯化的VHH片段后，培养物在30℃下培养17小时。在8小时的期间内，XVM被培养物酸化(图2)。当将103pfu/ml的P2噬菌体加到平行实验的LM0230或C2的培养物中时，在17小时的整个期间内没有发生酸化(图2，部分A和B)。将单价抗体片段VHH#1(pUR3834)加到含有噬菌体P2的培养物中，结果产生完全还原的酸化曲线(图2，部分A)。
双头分子VHH#4-#5也能防止噬菌体感染，但通过对单价片段VHH#4和VHH#5进行实验所推断出的源于其双键的中和特征没有抑制作用(图2，部分B)，所述VHH#4和VHH#5作为分别加入的片段。
3.5单价特征噬菌体中和性VHH片段的形态为了排除VHH片段发生凝集的可能性，采用基于ELISA的试验来分析所产生的分子，其中所述凝集可能导致形成如单链抗体中所观察到的二聚体或更高级数的多聚体(Holliger等(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.，90，6444-6448；Kortt等(1997)，ProteinEng.，10，423-433)。在这个分析中，噬菌体被固定化(以每毫升PBS1010pfu的浓度)并且体外生物素酰化的噬菌体被用作检测探针。当与生物素酰化噬菌体(按照商家提供的说明书采用NHS-生物素(Pierce)制备的)和被辣根过氧化物酶标记的抗生蛋白链菌素(DAKO)共同温育时，双价VHH片段如双头构建物或存在于免疫美洲驼的血清中的多克隆抗体(图3部分B)产生阳性应答；该分析原理如图3所示(部分A)。相反，非-中和性VHH片段VHH#4和VHH#5和中和性VHH片段VHH#1、VHH#2和VHH#3以及从预先经噬菌体免疫的美洲驼身上取到的血清没有检测到生物素酰化的噬菌体(图3，部分B)。
这些实验表明所产生的VHH片段是单节显性的。因此抑制作用不是通过噬菌体颗粒的交联获得的，而是由被这些特定抗体识别的表位决定的。
3.6其它种类的乳球菌噬菌体的中和作用乳球菌噬菌体被分为12种。其中只有三种被发现干扰工业的牛奶发酵生产，即扁长头形(prolate-headed)的C2种和等长头形的936(isometric-headed 936)(工厂里最常见的)和P335种。噬菌体P2属于936种类，其被用于美洲驼的免疫和抗体展示库的选择。因此，检测到了VHH#1中和936种类中的其它成员(噬菌体SK1)，但也中和扁长头形的C2种类中的两个成员(噬菌体Q38和C2)的能力。
采用实施例2.3中所述的微量滴定板的分析方法，借助作为测定噬菌体抗性的噬菌体感染的培养物的酸化作用来分析交叉反应性和中和能力。将不同量的抗体片段VHH#1加到宿主细胞(密度为106cfu/ml)和噬菌体(滴度为103pfu/ml)的混合物中；在30℃下培养15小时后，通过所包含的指示剂溴酚红的颜色变化来监测中和活性。对下列混合物进行试验乳酸乳球菌株C2与噬菌体P2的混合物、菌株SMQ-196和噬菌体Q38和细菌菌株LM230与噬菌体SK1或噬菌体C2的混合物。除了所述抗体片段VHH#1外，美洲驼免疫前和免疫后的多克隆血清就象未感染的细菌宿主一样也被用作阴性和阳性对照。
等长头形的936种的两种测试的噬菌体P2和SK1被单价抗体片段(达到47ng/ml的稀释度)和免疫血清(达到10-4倍的稀释度)有效地中和。相反，即使浓度为0.47mg/ml，VHH#1也不抑制扁长头形的C2种的两个成员Q38和C2，然而发现10倍稀释度的免疫血清却具有一定的中和作用。
通过采用这一有限数目的不同类型的噬菌体得出的结论是等长头形种的成员(用于免疫)能被VHH#1有效地中和，但属于相关性小的扁长头形的C2种的噬菌体不受抑制。
实施例4.在半硬质古乌达乳酪的生产和熟化过程中防止乳酪起子培养物受噬菌体的感染在开放式乳酪槽中对古乌达型-乳酪进行中试规模的生产(200L批量的乳酪奶，每批产生大约6kg的4个乳酪团)。为了达到大约50％(干物质)的乳酪脂肪含量而进行标准化处理前，对所述乳酪奶进行加热(68℃，14秒钟)和离心除菌(bactofugation)处理。接下来在72℃下对所述奶巴氏消毒10秒钟。将下列组分加到乳酪奶中t＝0分钟时不同浓度的噬菌体P2(表I)t＝5分钟时加入CaCl2(23.1g/100l)、NaNO3(15.5g/100l)和不同浓度的单价抗体片段VHH#1t＝10分钟时加入450g/100l的起子培养物乳酸乳球菌C2(在牛奶中充分生长)t＝15分钟时加入23g/100l的小牛粗制凝乳酶为了保证混合均匀，将所有的添加组分缓慢地倒入搅拌的乳酪奶中。按照由Kammerlehner(1)和De Vries和Van Ginkel(2)所描述的通常用于标准古乌达型-乳酪加工的已知加工方法，进一步进行加工(凝乳、切割、凝乳冲洗、加热、沥干和罐装填充)。当乳酪的pH达到5.5至5.4时，开始加盐水。在13℃和88％的相对湿度下对乳酪进行熟化。
熟化过程中，取样进行以下分析●2个星期时进行普通化学分析●2、6、13个星期时进行蛋白降解分析(总的、可溶的和氨基酸氮(3))●13个星期时进一步进行香味的分析分析前，样品在-40℃下冷冻保存。表1 对乳酪进行的3个分离实验的汇总

表I中所列的结果清楚表明，在加入起子培养物乳酸乳球菌C2前，将单价抗体片段VHH#1加到感染了P2噬菌体的乳酪奶中，可以防止培养物被噬菌体感染。当有1μg/ml的VHH#1存在时，即使乳酪奶感染了1.5×105pfu/ml的噬菌体，乳清中也没有检测到噬菌体。乳酪奶的酸化作用正如所料(参见3.1和3.4)。如果不加入抗体片段，乳清中则检测到噬菌体并且酸化作用明显降低(参见1.1和1.3或2.1和2.5)。如果加入抗体片段，即使在加入抗体前加入了噬菌体，乳清中仍能发现活性。这证明了抗体的过量存在并且能够完全中和噬菌体。如实验3.5可以见到，当将0.1μg/ml的VHH#1加到感染了1.8×105pfu/ml噬菌体的乳酪奶中时，可能达到了极限值。噬菌体感染的这一程度在正常运转的乳酪生产厂中被认为是非常高的。
为了确定初始乳酪发酵过程中的噬菌体的中和作用是否足以达到正常的乳酪熟化过程，2个星期后测定乳酪的化学组成以及2、6和13个星期后测定蛋白水解作用(表II和III)。
表II2个星期后的乳酪化学组成

表III 乳酪熟化过程中的蛋白水解作用(可溶性氮/总氮；氨基氮/TN；AN/SN)

从表II中的数据能够得出这样的结论除了酸化作用以外，乳酪的化学组成不太受噬菌体存在的影响(参见1.3和2.5以及其它数据)。因此，如果不在起子培养物之前加入中和抗体VHH#1，2星期的附加熟化期间就不能恢复感染了噬菌体的起子培养物的酸化作用能力。表III的数据表明作为乳酪熟化的一个主要指示参数，蛋白水解作用在感染了噬菌体的乳酪中异常，并且表明在加入起子培养物之前一旦加入VHH#1，蛋白水解作用再一次变得正常起来(参见1.3和2.5的AN/TN和AN/SN数据和其它数据)。如果噬菌体不被VHH#1所中和，过多的氨基酸就被释放出来，这表明蛋白水解作用失衡，因而使得乳酪有臭味。
参考文献1.Kammerlehrer，J.(1989)酶凝乳酪技术(Lab-KseTechnologie)Band III，p642-643.In Molkereitechnik Band84/85.Verlag Th.Mann，Gelsenkircher-Buer，ISBN3-7862-0083-12.De.Vries E.和van Ginkel，W.(1980)凝乳制备罐的测试(Test of a curd-making tank)“Damrow Double O”型容量16000L(Type“Damrow Double O”with a capacity of16000 L)，DEC制造(manufactured by DEC)NIZO RapportR1133.Noomen，A.，(1977)Noordhollandse MeshangerCheese用于干酪熟化研究的模型(a model for research oncheese ripening.2)干酪的熟化(The ripening of thecheese)Neth.Milk Diary J.31，75-102
序列表<110>UNILEVER PLCUNILEVER N.V<120>利用抗原-结合蛋白抑制病毒感染<130>T3078<140><141><160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>123<212>PRT<213>LLAMA<214>美洲驼<400>1Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Arg Arg Thr Gly Ser Asn Trp20 25 30Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Leu Ala Gly Lys Glu Pro Glu Leu Val35 40 45Val Ala Leu Asn Phe Asp Tyr Asp Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Gly Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Ala Arg Ser Gly Gly Phe Ser Ser Asn Arg Glu Leu Tyr Asp Gly100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>123<212>PRT<213>LLAMA<214>美洲驼<400>2Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Arg Arg Thr Gly Ser Asn Trp20 25 30Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Leu Ala Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45Val Ala Leu Asn Leu Asp Tyr Asp Ile Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Thr Asp Ser Gly Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys85 90 95Ala Ala Arg Ser Gly Gly Phe Ser Ser Asn Arg Thr Tyr Tyr Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>3<211>123<212>PRT<213>LLAMA<214>美洲驼<400>3Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Arg Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Arg Arg Thr Gly Ser Asn Trp20 25 30Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Phe Ala Gly Lys Glu Pro Asp Leu Leu35 40 45Val Ala Leu Asn Leu Asp Tyr Asp Val Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Gly Asp Ser Gly Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Ala Arg Ser Gly Gly Phe Ser Ser Asn Arg Ala Leu Tyr Asp Gly100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>22<212>DMA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列描述PRIMER<400>4aggtsmarct gcagsagtcw gg 22<210>5<211>53<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列描述PRIMER<400>5aacagttaag cttccgcttg cggccgcgga gctggggtct tcgctgtggt gcg53<210>6<211>53<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<223>人工序列描述PRIMER<400>6aacagttaag cttccgcttg cggccgctgg ttgtggtttt ggtgtcttgg gtt53<210>7<211>121<212>PRT<213>LLAMA<214>美洲驼<400>7Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Glu Gly Phe Ser Asn Tyr20 25 30Pro Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val35 40 45Ala Ala Met Ser Glu Gly Gly Asp Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Asn Ala Ala Arg Trp Asp Leu Gly Pro Ala Pro Phe Gly Ser Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser115 120<210>8<211>113<212>PRT<213>LLAMA<214>美洲驼<400>8Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ala Pro Phe Arg Glu Ser20 25 30Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Val35 40 45Ala Phe Ile Thr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Gly Val Ser Val Gln50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Asp Arg Arg Thr Val Leu Leu65 70 75 80Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His85 90 95Arg Ala Leu Ser Asn Thr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser100 105 110Ser
权利要求
1.利用单价抗原结合蛋白抑制病毒感染的方法，其中单价抗原结合蛋白含有能够结合病毒的单可变区结合单位，或其功能等价物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述单可变区结合单位含有来源于缺少轻链的免疫球蛋白的重链可变区，或其功能等价物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述单可变区结合单位含有来源于Camelid免疫球蛋白的重链可变区或其功能等价物。
4.如权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其中所述病毒是乳球噬菌体。
5.如权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其中所述病毒对人类或动物是致病的。
6.如权利要求1至4中的任何一项所述的方法，其中所述病毒对植物是致病的。
7.单价抗原结合蛋白在抑制病毒感染中的用途，其中单价抗原结合蛋白含有能够结合病毒的单可变区结合单位，或其功能等价物。
8.单价抗原结合蛋白在制备抑制病毒感染药物中的用途，其中单价抗原结合蛋白含有能够结合病毒的单可变区结合单位，或其功能等价物。
9.食品，其含有能够结合病毒的单可变区结合单位，或其功能等价物。
10.药物或化妆品组合物，其含有一个能够结合病毒的单可变区结合单位，或其功能等价物。
11.能够抑制病毒感染的单价抗原结合蛋白，其含有包含SEQ.IDNO.1，2或3中所示的氨基序列的重链可变区。
12.编码如权利要求11所述蛋白的核苷酸序列。
13.含有如权利要求12所述核苷酸序列的表达载体。
14.用权利要求13所述的载体转化的宿主细胞。
15.能够抑制病毒感染宿主细胞的抗原结合蛋白的选择方法，其包括步骤i)将抗原结合蛋白与靶病毒混合，ii)将步骤i)中的抗原结合蛋白-病毒复合物暴露给过量的宿主细胞，iii)除去宿主细胞和任何相关的抗原结合蛋白-病毒复合物，iv)利用病毒特异性配体捕捉未被步骤ii)中的宿主细胞吸收的抗原结合蛋白-病毒复合物，从而将病毒特异性抗原结合蛋白从未结合的蛋白中分离出来。
16.能够抑制噬菌体感染乳酸细菌宿主细胞的抗原结合蛋白的识别方法，其包括步骤i)在有抗原结合蛋白和噬菌体存在的条件下进行细菌宿主细胞的培养，ii)分析所述培养物在培养物生长培养基的pH变化过程中活细胞的生长现象。
全文摘要
记载了利用单价抗原－结合蛋白抑制病毒感染的方法,其中单价抗原结合蛋白含有能够结合病毒的单域结合单位。优选地所述蛋白是来源于天然缺少轻链的免疫球蛋白的重链可变区。还记载了含有这种蛋白的食品、药物和化妆产品以及从大量的主要含有非抑制性的、但结合片段的传染性病原体中选择抑制性蛋白的方法。
文档编号C07K16/08GK1351662SQ00806588
公开日2002年5月29日 申请日期2000年4月19日 优先权日1999年4月22日
发明者S·贝泽默, L·G·J·弗伦肯, J·J·W·德哈尔德, A·M·莱德波尔, C·T·维尔里普斯 申请人:荷兰联合利华有限公司