专利名称：生产抗冻蛋白的方法和生物体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产抗冻蛋白的方法。此外涉及用于此方法中的新生物体，由此获得的新蛋白，以及这种新蛋白的组合物和用途。一方面，它涉及新生物体Marinomonas protea的培养；由此获得的新抗冻蛋白；这种蛋白在控制冷冻方法中的用途，特别是在冷冻食品的生产中的用途；以及由此获得的食品。
背景技术：
所谓的‘抗冻蛋白’(AFPs)有修饰冰晶生长的特性。它们在作用上不同于更简单的离子抗冻剂如常见的盐。例如，水性的AFP溶液一般有一个低于其融点的冰点(滞后现象)。它们使冰晶在一定的温度范围稳定，以及抑制重结晶。它们似乎帮助生物体在水的冰点附近的温度中生存，因此发现于几种不同的生物体。它们的特性给予它们一个潜在的使用范围特别是在冷冻时食用的食品中，抑制重结晶和保持光滑的质地。在只是为了保存才冷冻的食品，AFPs可以抑制在冷冻，储存，转运，和解冻过程中重结晶，因此通过减少细胞破坏保存食品质地，也通过减少水滴来减低营养的丢失。(见Griffith，M.和Vanya Esart，K.Biotechnology Advances，13，pp375-402)。
已知多种的AFPs来源最常见的是鱼和植物。一些细菌展现出抗冻特性(见Griffith等，supra，p382)。在一些情况下，已报道了细菌中抗冻蛋白的分离(例如XuH，Griffith M，Patten CL，et al.，Can J Microbiol44(1)64-73 Jan 1998)。
考虑到抵抗冷冻的生物体的优势，抗冻蛋白没有更广泛地分布在自然界和更易被发现是令人吃惊地。这也许是因为生物体有其他的方式克服这种问题。
反之，能帮助产生强壮，坚固的结构的鱼AFP有利于一些特殊的用途，RI活性但不产生坚固结构的AFP有其自己的，不同的优势。例如，可活跃地抑制储存时冰重结晶的分子可以用来保持在储存中冷冻产品光滑的质地。对一些冷冻食品，如乳品冰淇淋，这种分子的应用优选不使产品过度地变硬。
因此对抗冻肽有一个要求，即在解冻和冷冻循环中有活性地抑制重结晶，以及能用来在储存过程中保持食品产品的光滑质地。合乎需要地，这些抗冻肽是热稳定的，由此它们能与经巴氏消毒或灭菌的食品产品相掺合，同时它们保持其功能。
本发明(部分)建立的假设基础是，如果细菌定居在一种通常低于水的正常冰点的液体水性环境在这种环境中(假定)AFPs可以是一种有效方式给细菌一个竞争优势，它们是更可能使AFP蛋白进化。
发明概述因此，在第一方面，本发明包括生产AFPs的方法，包括从水性低温环境收集一种或更多的细菌样品，培养细菌和从样品中提取蛋白，检测蛋白的抗冻特性，选择有较高的抗冻特性的蛋白，以及生产足量的作为AFP食品添加剂的筛选蛋白。
发明进一步包括由此方法获得的新抗冻蛋白，它们在食品加工的用途，以及包含它们的食品组合物。发明详述将参照附图和序列标识来进一步描述本发明，其中序列编号1是一种来自Marinomonas protea的16S rRNA基因的DNA序列；序列编号2是一种来自假单胞菌属物种(作为“分离菌20”被分离)的16S rRNA基因的DNA序列。
序列编号3是从Marinomonas protea分离的抗冻肽的N末端氨基酸序列。
图1表示Marinomonas protea的16S rRNA序列(图3)与普通海单胞菌的对应序列的序列比对；图2是把Marinomonas protea与其最近的种系发生亲属进行比较的进化系统树。
图3显示分离菌20的16S rRNA序列(序列编号2，大写)与Marinomonas protea 16S rRNA(序列编号1；小写)的比对，有89.4％相似性。
图4显示分离菌20的16S rRNA序列(序列编号2)与它的最近的种系发生亲属类黄假单胞菌的比对，有99.4％相似性。
图5是建立在比较分离菌20(序列编号2)和其最近亲属的16SrRNA序列基础上的进化系统树。通过使用空位罚分为10的Clustal方法建立了多种序列比对。
图6显示在时间＝0(6A)和时间＝60分钟(6B)时RI实验的结果。
图7，8，9涉及实施例中所描述的Vickers硬度试验。
名词抗冻肽和抗冻蛋白在本发明的内容中可互换使用。这些名词缩写为AFP。
对于一种水性的低温环境，我们表示一种环境，它主要包括一年中至少部分时间温度低于0℃的水。我们优选含盐环境，例如含有足够的盐成分(盐度)来显著降低冰的冰点(例如降低0.2℃或更多)。盐度可以多于或少于海水的盐度(35ppt)。能够收集细菌的优选的环境是盐湖(包括超盐湖)，或者在这种湖里的位点。特别地，我们优选从南极环境收集合适的细菌用于本发明。
南极洲的盐湖通常是半对流湖或单对流湖。半对流湖有持久的化学和温度分层的水柱。在表面有更冷的少盐的水，深部有更温暖多盐的水。在南极洲这种湖在一年的大多时间被冰覆盖，只有在夏天短暂地破冰而出。在南极洲单对流湖是高盐湖，盐分太多以至于不能在冬天完全被冰覆盖。冰层像是热毯子。没有它，与空气接触的湖水冷到非常低的温度。在冬天它们的水柱以温度分层，冷水在表面，暖水在下面。在夏天分层打破，水柱有同一温度。就半对流和单对流两种南极湖来说，在冬天有时水温远远低于0℃。
本发明进一步涉及从上述南极洲湖，优选从半对流湖或单对流湖分离的新细菌的培养物。
我们进一步提供产生抗冻蛋白的海单胞菌属物种的纯细菌培养物，所述细菌培养物的16S rRNA基因序列与生物体Marinomonasprotea中的对应序列(序列编号1)表现出至少90％和优选95％的同源性。
本发明进一步涉及产生抗冻蛋白的假单胞菌属物种的纯细菌培养物，所述细菌培养物的16S rRNA序列与序列编号2的基因序列表现出至少90％和优选至少95％的序列同源性。上述的培养在执行发明的方法过程中可获得。
本发明的方法包括4个阶段一种或更多细菌样品的收集；培养细菌和蛋白提取；蛋白的检测和选择；以及蛋白的生产。1.样品收集在本发明的方法中使用的细菌样品从水性低温环境中收集。如前面所指出的，“低温”环境表示一年中至少部分时间中形成冰的环境。这种环境在高纬度和高经度或两者兼有时存在。我们优选收集来自盐环境，尤其是盐水湖的细菌。特别优选的环境在南极洲发现，可以包括半对流湖或单对流湖。这种湖包括有多种特性，例如温度和盐浓度的位点，细菌样品可以从许多这种位点收集，用于随后的实验室研究。2.蛋白提取每种细菌样品在适当条件下培养，由此生产抗冻蛋白，蛋白从液体培养基中通过标准方法提取，例如通过细胞离心，沉淀和在缓冲液中用玻璃球涡旋。3.蛋白检测步骤2中提取的蛋白通过检测其抗冻特性分类。有多种适当的检测方法。我们优选使用重结晶抑制试验如下面更详细的描述。它测量了蛋白存在时当储存在冷冻条件下时冰晶大小增加的倾向。通过使用此试验，可以筛选在其存在下重结晶和晶体生长停止或减少的有效AFP蛋白。
有抗冻特性的蛋白定义为，在实施例所定义的重结晶分析中优选表现出在最大为1mg/ml的浓度下冰晶生长为6um或更少的蛋白。4.蛋白生产根据本发明的方法选择的蛋白大量被生产，用于AFP食品添加剂。这可以多种方式进行。例如，最初用来获得蛋白的方法(细菌培养后提取蛋白)可以按比例增加。通过对培养条件(温度，培养基，等)和细菌选择进行试验，产量可增加。可以从细菌分离编码选择的AFP的DNA序列，将其引入表达盒，在不同宿主细胞中产生重组蛋白。
在一种优选方法中，使含有蛋白的分离菌接受热处理如巴氏消毒或灭菌，以便灭活有活性的细菌和可能影响已形成的抗冻肽的蛋白如蛋白酶。
因此本发明的一个非常重要的特点是分离的AFPs优选耐热。如果不能通过热处理来灭活蛋白酶，在许多情况下需要使用化学的蛋白酶抑制剂，它们大多数是有毒的，因此不适合在食品中使用。
令人吃惊地，前面指出的由南极洲来源分离的蛋白是热稳定的，尽管它们天然的，原始的环境非常冷。
本
发明内容
中热稳定蛋白定义为在巴氏消毒处理后，保持热处理前蛋白抗冻活性的至少50％，优选至少80％的蛋白。
最优选地，在灭菌处理后保持活性。
另一方面，本发明涉及一种表现抗冻特性的蛋白，通过本发明的方法获得或从上面指出的培养物分离。
更具体地，本发明包括有抗冻特性的新蛋白marinomonin。进一步包括具有抗冻特性的marinomonin的异构体和衍生物，如糖基化的形式。
这些显示抗冻特性的蛋白最优选是热稳定的。
如实施例中所示，由Marinomonas protea分离的抗冻肽显示Ala-Glu-Gly-Ser-Thr-Gly/Val-Asp-Val-Tyr-Gln-Asn-Ile-Gln-Tyr-Ala-Gly-(序列编号3)的N末端氨基酸序列。优选地，衍生物N末端氨基酸序列与上面给出的16肽序列表现出至少75％，更优选85％以及特别优选至少95％的同源性。
有抗冻特性的序列编号3的氨基酸序列的异构体和衍生物也包括在本发明的范围内。
本发明进一步包括核酸序列，特别是编码本发明新蛋白的DNA。这些容易根据前面所示的蛋白序列得到。
在另一优选方面，本发明涉及编码序列编号3的氨基酸序列的核酸序列。
本发明的方法包括在一定条件下培养含编码本发明的marinomonin或另一种抗冻蛋白的DNA序列的生物体，生产marinomonin或抗冻蛋白，以及回收这种蛋白。
一种适用于本发明的此种生物体是新近发现的细菌Marinomonasprotea。培养这种生物体的适当的条件和培养基在实施例中指出。
可能发现其他生物体含编码marinomonin的DNA，可能证实其可以用于本发明的方法。另一选择是使用一种遗传学上转化的含编码marinomonin或其类似物的抗冻蛋白的DNA序列的生物体，该序列处于适于使其在被转化生物体内产生抗冻蛋白的基因启动子的控制下。编码抗冻蛋白的DNA序列可以插入适当表达的载体中，载体包含在恰当条件下，转录和翻译成要求蛋白所必要的元件，包括合适的序列方向、正确的读框、适当的靶向和表达序列。制造适当的载体，和使用它们来转化许多不同种类的生物体的方法，在本领域中是众所周知的。适合执行本发明方法的遗传学上转化的生物体也形成了发明的另一方面。
原则上，任何生物体可以用这种方式进行修饰，产生需要的蛋白，例如，细菌，酵母菌，植物，或植物细胞，昆虫细胞或动物细胞。细菌，酵母菌和植物或植物细胞体系一般是优选的。
也可以提供适当的适于产生本发明的AFPs遗传学转化的生物体，它们本身是有用的，因为它们的抗霜冻能力强。这特别适合植物可以是谷类如小麦或玉米或双子叶植物如黄豆，西红柿或莴苣。这些植物也形成本发明的一部分。
本发明的抗冻肽能方便地用于一些产品，优选用于已被冷冻或打算冷冻的食品中。这些食品的例子是冷冻食品如蔬菜，调味汁，汤，点心，奶制品和冷冻的甜品，甜品包括果汁冰糕，冰糕，格兰尼它冰糕，冷冻果冻和含奶的冷冻甜点如冰淇淋，冷冻的酸奶或乳蛋糕，果汁牛奶冻和冰奶。优选的食品是冷冻蔬菜和冷冻甜品，如冰淇淋，冰糕。如果使用干混合物或浓缩物，浓度可以更高，以保证最终冷冻产品中的水平在要求的范围内。优选的AFP水平是终产品重量的0.00005到0.3％，特别是0.0001到0.2％。
没有必要加入高纯化形式的AFP可以加入含AFP的组合物，例如一种产生AFP的生物体的提取物。
本发明的冷冻甜品能通过本领域已知的任何适当的方法产生。优选地，配方的所有成分冷冻前在或环境温度或更高温度完全地被混合在一起。在冷冻甜点中固体(如糖，脂肪，调味品)水平适当地被调整到终产品重量的至少3％，通常10到70％，特别是40到70％。
现在通过下面的非限制性实施例阐明本发明。实施例实施例1从南极洲湖的多个位点收集19种分离菌。发现两种产生抗冻蛋白(见下面表1)，即分离菌196和分离菌20。这些细菌分别从Ace湖和Club湖分离。Ace湖是半对流湖Club湖是单对流湖。两种细菌均从接近湖的表面分离。分离菌196从冰/水交界分离。分离菌20从远离湖边的水柱的顶端50cm分离。下面是两个湖的更多细节Ace湖表面为半成性-18ppt盐度随深度增加到34ppt。
冰覆盖每年的10-11个月半对流湖-化学和温度分层Club湖高盐(250ppt)没有冰覆盖单对流湖-冬天温度上分层夏天水柱混合分离菌培养分离菌接种入200ml的胰胨豆胨培养液(Oxoid)中。
分离菌196(Marinomonas protea)也在200ml海盐培养液和200ml 1/2海盐培养液中培养。
胰胨豆胨培养液[“TSB”]酪蛋白的胰液消化物(Oxoid) 11.3g/L大豆的木瓜蛋白酶消化物 2g/L磷酸氢二钾 1.7g/L葡萄糖 1.7g/LNaCl3.3g/LpH 7.3+/-0.2海盐培养液[“SSB”]海盐(Sigma)40g/L蛋白胨(BDH)5g/L酵母提取物(Merck) 2g/L海水培养液[“SWB”]‘Instant Ocean’ 38g/L(Aquarium Systems，法国)酵母提取物(Merck) 1g/L蛋白胨(BDH)1g/L
1/2海水培养液[“1/2SWB”]‘Instant Ocean’ 19g/L(Aquarium Systems，法国)酵母提取物(Merck)1g/L蛋白胨(BDH) 1g/L所有的培养物在15℃孵育直到明显的混浊(这需要2-6天，取决于每种培养物的生长速率)。然后所有培养物在5℃冷休克4天。也产生200ml大肠杆菌培养物作为阴性对照。这是菌株W3110。其在摇瓶中的Lauria-Bertani[“LB”]培养基中37℃培养过夜。
LB培养基 Bacto-胰蛋白胨 10g/LBacto-酵母提取物 5g/LNaCl 10g/L调整到PH7.0蛋白提取下面的步骤给出提取细胞总蛋白的方法。
1.通过离心从培养物中收集细胞。使用带有固定角JA-14转子的Beckman低温离心机。样品在4℃的恒温下，10,000rpm(15,300g)速度离心10分钟。仔细去除上清液，留下沉淀物。
2.沉淀物在1ml 10mM Tris/HCL缓冲液(PH7.0)中重悬。使用步骤1的同样的离心条件再沉淀。仔细去除上清液，留下沉淀物。
3.沉淀物然后在1ml蛋白提取缓冲液(见下文)中重悬，然后在冰里保存5分钟以便允许细胞裂解。重悬的沉淀物然后在一个厚壁瓶子内使用Sanyo Soniprep150在15A超声处理30秒。
4.然后将超声处理了的混合物转移回离心管，按步骤1中描述的进行离心。上清液被移去并在-20℃冷冻直到需要使用时。
蛋白提取缓冲液25mM Tris/HCL(PH7.0)1mM EDTA1mM PMSF(Sigma)2μg/mL胃蛋白酶抑制素A(Sigma)Splat测定下面的步骤是用来观察通过每种蛋白提取物达到的冰重结晶抑制水平的方法。它是Byass等描述的测定的改进。[Unilever WO-A-98/04148]。
1.配制60％的蔗糖溶液。20μl每种蛋白提取物的样品与20μl蔗糖溶液混合。然后将这些混合物装在1.5mlEppendorf管内。30％蔗糖/蛋白提取物溶液在MSE Micro Centaur DesK top微离心机中离心10秒钟，确保所有液体在管底部混合。
2.将5μl上面得到的溶液放在2个圆形的直径为16mm的盖玻片之间，盖玻片上以防水笔写下提取物数量。然后吸干。
3.然后在盖玻片内滴入已预冷到-70℃(使用干冰)的2，2，4--三甲基戊烷。将它们在其中过冷2分钟。
4.在一个预冷的浴器充入3/4容积的2，2，4-三甲基戊烷，2，2，4--三甲基戊烷使用一个Haake C水浴循环器和两个Haake温度控制单位(PG40和F4)预冷到-6℃。
5.盖玻片从过冷过程移走，直接放入-6℃浴器30分钟允许重结晶。
6.然后当盖玻片在-6℃浴器内时，在一个Leitz Dialux20 EB载物台上使用EF L20/0.30 160/0-2物镜进行观察。
7.观测到的晶体的形状，大小和密度与使用下面描述的Splat评分系统测定的AFP活性水平有关。
Splat评分观测到的晶体形态+++++非常小，非常稠密的晶体。
++++ 小的，不稠密；或小的，很稠密，有一些中等大小的晶体。
+++ 小的，不稠密的，有中-大的晶体；或小-中等大小，不稠密的晶体。
++ 中或大的晶体，有一些小晶体+大的，圆的稀疏的晶体(即30％蔗糖对照)[分离菌要有实际用途需要+++或以上的评分]splat测定结果在表1中显示表1
表1中的结果显示，在被调查的南极洲细菌的19种分离菌里，只有分离菌196和分离菌20产生具有有意义量AFP的蛋白。分离菌196是Marinomonas protea，如下面所进一步描述的。实施例2分离菌196的收集细菌在96年6月31日从南极洲(68°28’S，78°11’E)Ace湖的冰/水交界分离。样品由在湖的最深点通过冰(1600mm厚)钻洞收集。来自冰/水交界的核心下部的片段融化在琼脂上。该物质被命名为分离菌196。分离菌196的生长特性在10℃的半强度海水琼脂中孵育3到5天后形成的分离菌196的菌落是没有色素沉着的(奶油色)，光滑，凸面，圆形带有完整的边缘，大小从直径小于0.5mm到1.5mm不等。在胰胨豆胨琼脂上的菌落是浅褐色的，黏液样和播散的，直径2-5mm。分离菌是嗜冷的，在温度＜0到约25℃之间生长(最佳生长在15-22℃)，在30℃不生长。细菌在需氧和微需氧的条件下生长，但在无氧时不生长。它不需要海水来生长，但能耐受高达70％的NaCl。在60-70％NaCl中生长的细胞包括直杆和球形细胞，这些细胞比在低盐培养基中的细胞看上去更皱和具有更多锯齿。不同种类培养基中的典型生长曲线在图1和2中显示。生物体分类分析分离菌196的16S rRNA的种系发生分离菌的鉴定建立在16S rRNA分析的基础上。获得了16S rRNA基因的接近完整的(1,485bp)序列，从核苷酸位置18伸展到1530(大肠杆菌相当的数目)，见图3。对公众可获得的数据库中的物种进行的16S rRNA分析显示它代表一种海单胞菌属的新物种(在proteobacteria门的gamma--3亚纲)，与普遍海单胞菌(该属的物种)有74.7％一致性。两个序列间的匹配在图4中显示。提议(Prof.HansG.Truper，pers.comm.)使用名称Marinomonas protea sp.nov.(pro’t e.a.Gr.n.Proteos，希腊神话的海洋之神的名称，它能够表现为许多种外形，M.L.fem.adj.protea，多形态的)。该细菌在1999年2月9日已被保藏在英国国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，Aberdeen，编号为41006。
此研究中产生的16S rRNA序列被保藏在GenBank中。序列相似性百分比在表1中给出。使用PHYLIP(3.57c版)确定的进化系统树在图5中显示。它使用几乎完整的16S rRNA序列，比较Marinomonasprotea与其最近的种系发生亲属以及三种其他的海冰分离菌被鉴定为海单胞菌物种(M.Brown，pers.comm)的。使用最大可能性方法(Felsenstein，1981)构建进化系统树。分离菌20的16S rRNA种系发生分析分离菌20的分析发现它是假单胞菌的一种物种。更明确地，发现分离菌20与类黄假单胞菌有99.4％的相似值。此株保藏在布达佩斯条约下的国际保藏单位NCIMB，Aberdeen，苏格兰，编号为NCIMB41076。实施例3总细胞蛋白提取分离菌196的细菌培养物(2L)在15℃液态培养基(胰胨豆胨培养液)中生长直到混浊。培养物无菌吸入无菌NalgeneTM通用瓶中。在5℃以4,200xg离心12分钟收集(Sorvall Dupont Econospin)。沉淀物在1ml冰冷的10mM Tris缓冲液(Tris[羟甲基]氨基-甲烷)/HCl(PH7.0)中重悬。细胞被沉淀10分钟。然后沉淀或者被储存在-20℃过夜，或者立即提取蛋白。沉淀在1ml冰冷的天然提取缓冲液(NEB，由25mM Tris/HCl(PH7.0)，1mM EDTA，1mM PMSF和0.1mM胃蛋白酶抑制素A组成)中重悬。Tris缓冲液作为生化缓冲液起作用，EDTA是螯合剂，对金属蛋白酶有活性，PMSF是丝氨酸蛋白酶抑制剂，胃蛋白酶抑制素A抑制蛋白酶。对每种重悬的沉淀，加入两种体积的酸(70％HCl)洗过的玻璃珠(1.5ml 425-600μm直径的珠子和0.5ml 3mm直径的珠子，均购自Sigma)，或足以在珠子表面产生粘的附着的细胞悬浮物外壳。珠子是酸洗过的，以便阻止涡旋时从玻璃中释放碱，因为这将可能破坏细胞的碱敏感成分。然后将混合物在冰中涡旋数个1分钟时间，每次间隔1分钟。每个样品重复8次，其后将另外的1ml的冰冷NEB加入珠子，再涡旋使细胞悬浮物能进入溶液。细胞留在冰上5分钟来允许玻璃珠沉降，将裂解物转移到1ml无菌、冰冷的Eppendorf管并离心(Beckman MSE，12,000xg，5℃，5分钟)，从而分离细胞壁和没有破裂的细胞，以及偶然被转移了的一些玻璃珠。上清液转移到无菌的、冰冷的Eppendorf管中并再次离心，除去一些可能干扰RI测定的其它的细胞碎片。将上清液吸入2个冰冷的，标记的Eppendorfs中，在-20℃储存直到进行测定。实施例4细菌抗冻蛋白对冰晶形态的影响通过在-6℃下显微镜检查总细胞蛋白提取物来评估来自分离菌196的抗冻蛋白(实施例3中获得)对冰晶形态的影响。可清楚的见到六边形冰晶，一些是延长的。实施例5蛋白纯化和序列信息有活性的蛋白的纯化使用AKTATM蛋白纯化系统上的反相层析(RPC)，跟着使用SMARTM系统上的凝胶排阻层析(SephadexR 75，或S75)(均为PharmaciaBiotech)从实施例3中产生的粗提取物分离命名为marinomonin的细菌抗冻蛋白。来自每种分离方法的有活性的片段在10％双丙烯酰胺SDS凝胶中电泳获得的条带在分子量约38KDa附近。序列信息将38KDa蛋白条带电印迹到PVDF膜上，进行N端测序。获得下面的16氨基酸序列，第6个氨基酸产生甘氨酸或缬氨酸的不确定结果(黑体区表示用于设计寡核苷酸探针的序列区域)Ala-Glu-Gly-Ser-Thr-Gly/Val-Asp-Val-Tyr-Gln-Asn-Ile-Gln-Tyr-Ala-Gly(序列编号3)数据库同源性检索序列同源性检索使用新AFP蛋白的N末端序列，采用FASTA检索对SWISS-PROT数据库来执行，后者包括所有已公开的AFP序列。序列匹配是随机的，其中相似性适于广泛的生物体，既有细菌也有真核生物，且相似性不是特别高。而且，在蛋白序列之间的同源性不是定位在数据库中蛋白的N末端，而是中间序列这减少了在蛋白序列和此新蛋白的N末端序列之间任意真正同源性的可能性。实施例6使产生AFP的微生物具有实际用途的两个重要要求是它的培养能容易地按比例增加和AFP活性是稳定。例如，对热变性的易感性使得在制造过程经巴氏消毒的食品原料如冰淇淋中使用AFP更困难。在“摇瓶”(9升刻度)中培养Marinomonas protea分离菌196(Marinomonas protea)在18个含500ml无菌的海盐培养液(海盐(Sigma)40g/L；蛋白胨(Fisher)5g/L；酵母提取物(Difco)2g/L)的1L的Erlenmeyer瓶中培养。将100μl已有的M.protea培养物无菌地接种到瓶中。使培养物在Sanyo孵育器中在15℃静止地生长7天。培养物在15℃下2天后显示出混浊的征象。在第7天孵育器温度被调整到4℃，并在此温度再保持7天来诱导抗冻蛋白(AFP)的产生。
在4℃冷诱导7天后，来自9L培养物的细胞通过重复离心收集到6个无菌的300ml容器中。在Sorvall Instruments RC5C离心机中使用Sorvall F16/250固定角转子在7000rpm 4℃离心20分钟。随着每次离心步骤上清液被弃去，加入另外的培养物并重复离心。以此方式，沉淀物被聚集在6个容器中直到收获9L培养物。将6个容器和相应的沉淀物储存在-80℃直到需要进行蛋白提取和SPLAT检测。从9L培养物进行蛋白提取和对AFP活性进行splat检测沉淀物在10ml冰冷的10mM Tris/HCl(PH7.0)中通过柔和的重悬进行洗涤。取1ml重悬细胞装入Epphendorf管中在微离心机(MSEMecroCentaur)中以13,000rpm进行离心5分钟。“洗涤上清液”被保留，用于通过SPLAT测定检验AFP活性。沉淀的细胞(约0.2g)重悬在800ul的冰冷的提取缓冲液(50mM Tris/HCl，PH7.0)和200μlSigma提供的细菌蛋白酶抑制剂混合物中。[此混合物包括对丝氨酸，半胱氨酸，天门冬氨酸，金属蛋白酶和氨基肽酶的抑制有广泛特异性的蛋白酶抑制剂混合物。它包含4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟化物(AEBSF)，胃蛋白酶抑制素-A，反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰-酰胺(4-胍基)丁烷(E-64)，苯丁抑制素，和EDTA钠]。将样品涡旋转然后放在冰中，此过程被重复共8次。然后离心样品，“提取物上清液”被保留，用于通过SPLAT测定检验AFP。
SPLAT活性
实施例7通过在8℃冷休克培养物进行AFP诱导为使AFP生产容易按比例增加，冷休克在不同温度范围有效是重要的。例如，在8℃以下的温度操作发酵罐是困难的。因此，为了能够在发酵罐中按比例的增加生产，通过在8℃或以上的温度冷休克诱导AFP的表达必须是可能的。这个实施例显示Marinomonas protea培养物能够被诱导在8℃表达AFP。
分离菌196(Marinomonas protea)在含500ml无菌的海盐培养液(海盐(Sigma)40g/L；蛋白胨(Fisher)5g/L；酵母提取物(Difco)2g/L)的1L Erlenmeyer瓶中培养。烧瓶以100μl已有的M.protea培养物无菌地进行接种。培养物在Sanyo孵育器中在15℃静止地生长7天。培养物在15℃培养2天后显示出混浊的征象。在第7天，培养物被转移到一个设定为8℃的Conviron孵育器中，此温度保持另外7天来诱导抗冻蛋白(AFP)产生。
随后的7天在8℃冷诱导，收获M.protea培养物并通过SPLAT测定检验AFP活性。通过反复离心500ml培养物被收集到一个50ml的容器中。在Sorvall Instrument RC5C离心机中使用Sorvall SS34转子在4℃下以9000rpm离心5分钟。在每次离心步骤后，弃去上清液，另外的培养物被加入并重复离心。以此方式将沉淀物聚集到容器中直到收获500ml培养物。得到的细胞沉淀物重0.9g。
0.9g的沉淀细胞轻柔地在1ml冰冷提取缓冲液(25mM Tris/HCl，PH7.0)和0.5mL由Sigma提供的细菌蛋白酶抑制剂混合物(见实施例6)中重悬。样品被涡旋，然后放在冰上，此过程重复共8次。样品然后在Sorvall Instrument RC5C离心机中使用Sorvall SS34转子在18000rpm离心10分钟，“提取上清液”使用0.2μm滤器过滤并保留进行SPLAT活性鉴定(见表)。
实施例8由Marinomonas protea提取的AFP的热稳定性从Marinomonas protea的培养物中制备含AFP的提取物，基本上如实施例6中描述的。将25μl的等分物(总共5个)放入500μl的Eppendorf管中并检测热稳定性。将4个管子放入沸水浴中。每个管子进行不同时间的热处理分别为1，2，5，或15分钟。第5个管子作为对照，不进行热处理。在热处理后，将所有管子立即放入冰中，然后使用splat测定检验AFP活性。
沸水浴后SPLAT活性
由于从Marinomonas protea提取的AFP能不被煮沸破坏，因此适用于制造过程需巴氏消毒的食品原料。例如，冰淇淋“混合物”在冷却和冰冻前一般应保持在82℃25秒进行巴氏消毒。这个实施例显示由Marinomonas protea提取的AFP能经受此种巴氏消毒的方法而不失去AFP活性。实施例9为从Marinomonas protea分离AFP，优选的方法描述如下。a)培养细胞按前面的实施例6所描述的方法(15℃生长和4℃诱导)产生10升培养物。细胞通过离心收获并保存在-80℃直到需要。b)蛋白提取细胞在提取缓冲液(20mM Tris，10mM EDTA，PH7.1)中重悬，然后使用Sanyo Soniprep15探针在振幅12μ以超声处理10次，每次15秒，间隔45秒。在超声操作过程提取物放在冰/乙醇浴中避免提取物过热。c)热处理灭活蛋白酶将提取物置于沸水浴中4.5分钟。测量样品的温度，发现达到73℃。我们已发现这是灭活样品中蛋白酶的非常有效的方法，同时杀死样品中大部分或全部细菌(Marinomonas protea)。d)从细胞碎片分离AFP提取物在Sorval离心机(SS-34转子)中以16,000rpm在4℃离心1小时除去细胞碎片。发现AFP存在于上清液中。e)除去剩下的能存活的细菌对许多冷冻的食品，如冰淇淋，保证除去所有能存活的细菌是重要的。这保证了产品和设备能够保持高卫生标准。对本发明中AFP的制剂，我们已发现这可以通过微量过滤获得。在这个实施例中，上面(d)中描述的上清液用Nalgene0.2μm灭菌单位过滤。滤液以无菌试管收集并在-80℃储存直到需要。f)质量保证-整个过程中AFP活性和可存活细胞的测量在过程中的每一步，提取物以splat测定法进行测定。也检测提取物细菌细胞的存在。使用包含来自Sigma的胰胨豆胨琼脂的培养皿(40g稀释在1L中)。样品在培养皿上画成环状或用涂布器(50ul)铺成平板并且在15℃孵育7天。样品是N1重悬于提取物缓冲液中的细胞(Splat评分++++)。
N2在提取物缓冲液中，经超声处理后的细胞(Splat评分+++++)。
N3在提取物缓冲液中，经超声处理并煮沸4分钟30秒后的细胞(Splat评分+++++)。
N4离心1小时并在0.2μ灭菌单位中过滤的N3(Splat评分+++++)。
√在培养皿中存在菌落×没有菌落结论此方法产生的AFP是A)有活性，B)没有能存活的细胞，C)没有有毒性的化学物质。实施例10这个实施例中证实了通过使用“重结晶抑制(RI)测定”如何测定向食品原料加入的含AFP的溶液量。RI测定是定量的，但它也是费时的，要求特殊的设备。测量冰重结晶抑制的测定先前已经由Jarman等描述。(WO 99/37782)。在此实施例中，使用下面给出的步骤。RI测定步骤包含来自Marinomonas protea的含AFP的溶液用蔗糖晶体调整到30wt％的蔗糖水平。将3μl的一滴样品放置到22mm的盖玻片上。
然后将一个16mm直径的盖玻片放在上面，然后将200g的重物放在样品上以保证一致的玻片厚度。盖玻片的边缘以clearnail清漆封闭。玻片放在由Linkam THM600控温显微镜载物台上。载物台很快冷却到(每分钟50℃)-40℃来产生大量小晶体。载物台温度然后很快升到(每分钟50℃)-6.0℃并保持在此温度。使用Leitz Ortholux II显微镜在-6.0℃观察到冰相。采用偏振光条件连同Lambda板来增强冰晶的对比度。在T＝0和T＝60分钟记录图像并使用图像分析软件(AnalySIS，Soft-Imaging Software GmbH，D48153，Munster，Hammerstrasse，89德国)进行分析。晶体生长的计算如下。
在特定时间通过捕获群体的图像(使用上面提到的设备)测定一群冰晶的平均大小，然后选择包含至少200个冰晶的图像的一个区域。每个晶体的最长的直径通过在其周围画图并使用图像分析软件计算最长直径来测定。
每种RI试验进行3次(因此至少600个冰晶的图像)。表中的数据记录了平均冰晶生长(即在零时和60分钟后平均冰晶直径不同)。可信限按平均95％的置信区间计算。
为了找出样品稀释多少仍可有效抑制冰的重结晶，进行了对Marinomonas AFP制剂的几种稀释。在实践条件中如果一个上述的稀释液或制剂的样品导致在RI测定中冰晶生长为3μm或更少，我们认为AFP制剂或AFP制剂的稀释液有效抑制冰的重结晶。RI测定结果平均晶体生长通过分析1200个晶体的图像来测定。
图6A和6B说明典型的冰晶图像，只是显示了被捕获和分析的图像的种类。
结果显示AFP制剂稀释10倍仍可有效抑制冰重结晶。因此，此制剂的1∶10的稀释液(＝10％)可用于实施例11所示的冷冻食品原型。实施例11冰糕样品的制备为制备冰糕，制作三种液体预混合物A)20％蔗糖水溶液(阴性对照；没有根据本发明)B)包含来自海单胞菌的AFP的20％蔗糖水溶液。AFP在预混合物中已被稀释到一个浓度，该浓度将产生大约1.9μm的RI值。此处为1∶10或10％稀释液-RI数据见实施例10。
因此，预混合物B有下面的组成成分 重量％蔗糖 20.00AFP制剂(在水性的缓冲液中) 10.00水70.00C)含WO-A-97/02343中描述的鱼III型AFP HPLC 12的20％蔗糖水溶液。AFP在预混合物中稀释到一个浓度，该浓度将产生约2.9μm的RI值。硬度的测定按如下方法用每种组合物(A，B，C)制备冰糕的长方形条(10mm×55mm×95mm)。每种组合物在Gelato Chef 2000(Magimix UKLtd)冰淇淋制造器中冷冻到-3.5℃。混合物转移到先前已冷却到-30℃，内部大小10mm×55mm×95mm的硅酮橡胶造型机。然后制备物在脱模前在-30℃被冷却1小时并在硬度检测前在-25℃储存，使用Vickers硬度试验。维氏硬度维氏硬度试验是一项压痕试验，其涉及将一锥形压头推入物质表面并且记录作为尖端位移函数的外力。测量在压痕负荷循环及去负荷循环过程中的力和位移。试验描述于“Handbook of Plastics TestMaterials”Ed.R.P.Brown，Pub.George Godwin Limited，TheBuilder Group，1-3Pemberton Row，Fleet Street，London，1981。维式锥形是工程工业标准(Bsi 427，1990).它有136°的顶角。硬度测量为Hv＝Fmax/A其中Hv是维氏硬度，Fmax是最大外力(见图7)，A是留在物质表面压痕的投影面积。面积A通过假设压痕有与形成它的压头一样的几何形状，即维氏锥形来测量，因此投影面积能从图8中di所给的压痕深度判断。
A＝24.5di2强度和模数的测定按如下方法用每个组合物(A，B，c)制备冰糕的几个(10或更多)细条(50mm×10mm×2mm)随后被制备为。精确地刻制一个硅酮橡胶模，产生50mm×10mm×2mm的内部大小。将模放在一片醋酸纤维上紧压以产生水密封。每种组合物使用高准确度的微吸量管吸入一个此种模中，赶走所有气泡。将第二片醋酸纤维素在充满的模的顶端铺开，再次赶走所有气泡。通过在-30℃将整个组件在两个氮气冷却的模块之间放置2分钟冷冻组合物。此后移走模，在-20℃平衡。通过移去上面的醋酸纤维素片，随后移去硅酮橡胶模来脱膜，然后倒转下层并揭开，露出冰糕条。在使用三点弯曲试验来检测强度和模数前将这些细条储存在-25℃。三点弯曲试验能够采用弯曲试验测定冻冷甜品的大量机械特性，如杨氏模数(表观的)和抗弯强度。在弯曲试验中，当测量外力和试样偏时时使试样变形。为冷冻甜品设定的概要数据在图8中显示。弹性模数通过这个曲线的最初线性部分的斜率测定。适合所有种类固体的普遍试验在“Biomechanics materials.A practical”Ed.J.F.V.Vincent，Pub.IRL Press，Oxford University Press，WaltonStreet，Oxford，1992和“Handbook of Plastics Test materials”Ed.R.P.Brown，Pub.George Godwin Limited，The BuilderGroup，1-3Pemberton Row，Fleet Street，London，1981中描述。在这个特别的应用中，在设定在-20℃的控温箱中，三点弯曲试验适于评估冰糕条(50mm×10mm×2mm；象上述制备)。检测涉及将每个条放在2个分开30mm的支持物上，从上支持物中心施加压力到条的表面(图9)。在整个试验过程中记录在弯曲中施加的力和动触点的位移。移动支持物的下降速度是每分钟10mm。
物质的表观弹性模数由以下公式给出E＝斜率·S3/4BD3其中斜率在图8中显示，S是在试验条下支持触点之间的跨距(距离)，B是条的宽度，D是条的厚度。这些试验中跨距(S)是30mm。参考图8，在三点弯曲条件下物质的强度如下；бu＝3·FmaxS/2BD2其中бu是弯曲强度，Fmax是记录的最大力。机械特性试验的结果三种不同冰糕组合物的结果如下。数据记录为10次测量的平均值。就硬度试验而言，对一个冰糕棒(10m×55mm×95mm)进行10次测量。就强度和模数而言，对10个独立的冰糕细条(50mm×10mm×2mm)的每一个进行一次测量。
令人吃惊地，结果显示含海单胞菌AFP的样品不是硬的或易碎的，尽管鱼AFP和海单胞菌AFP从它们的RI活性方面来说加入的水平类似。
序列表序列表序列编号15’GTTAGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGGGAGCTTGCTCCTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAGGAATCTGCCTAGTAGAGGGGGACAACATGTGGAAACGCATGCTAATACCGCATACGCCCTGAGGGGGAAAGGAGGGGACTCTTCGGAGCCTTCCGCTATTAGATGAGCCTGCGTGAGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTCTAACTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGGGGTGAGGAAGGGTGATAGGTTAATACGTTATCATCTTGACGTTAGCCCCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACYGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTCGGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAATGGCACCCGATACTGGCTAGCTAGAGTATGGTAGAGGGGTGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGACACCCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGTTGTAATGACTTAGTGGCGCAGCTAACGCAATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACAGAACATTTGAGAGATCAGATGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTATTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTTTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAGAGGGCTGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCACAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGATTGCTCCAGAAGTAGCTAGCTTTAACCCTTCGGGATGGCGGTTACCACGGAGTGGTCAATGACTGGGGTTGAAGTCTACGCG-’3
序列编号21 5′GCCCTTCTC AGATTGAACG CTGGCGGCAG GCCTAACACA TGCAAGTCGA51 GCGGTAGAGA GAAGCTTGCT TCTCTTGAGA GCGGCGGACG GGTGAGTAAT101 GCCTAGGAAT CTGCCTGGTA GTGGGGGATA ACGTTCGGAA ACGGACGCTA151 ATACCGCATA CGTCCTACGG GAGAAAGCAG GGGACCTTCG GGCCTTGCGC201 TATCAGATGA GCCTAGGTCG GATTAGCTAG TTGGTGAGGT AATGGCTCAC251 CAAGGCGACG ATCCGTAACT GGTCTGAGAC GATGATCAGT CACACTGGAA301 CTGAGACACG GTCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGGA351 CAATGGGCGA AAGCCTGATC CAGCCATGCC GCGTGTGTGA AGAAGGTCTT401 CGGATTGTAA AGCACTTTAA GTTGGGAGGA AGGGTTGTAG ATTAATACTC451 TGCAATTTTG ACGTTACCGA CAGAATAAGC ACCGGCTAAC TCTGTGCCAG501 CAGCCGCGGT AATACAGAGG GTGCAAGCGT TAATCGGAAT TACTGGGCGT551 AAAGCGCGCG TAGGTGGTTT GTTAAGTTGG ATGTGAAATC CCCGGGCTCA601 ACCTGGGAAC TGCATTCAAA ACTGACTGAC TAGAGTATGG TAGAGGGTGG651 TGGAATTTCC TGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGATATAGGA AGGAACACCA701 GTGGCGAAGG CGACCACCTG GACTAATACT GACACTGAGG TGCGAAAGCG751 TGGGGAGCAA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGATG801 TCAACTAGCC GTTGGAAGCC TTGAGCTTTT AGTGGCGCAG CTAACGCATT851 AAGTTGACCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGTTAAAACT CAAATGAATT901 GACGGGGGCC CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT CGAAGCAACG951 CGAAGAACCT TACCAGGCCT TGACATCCAA TGAACTTTCT AGAGATAGAT1001 TGGTGCCTTC GGGAACATTG AGACAGGTGC TGCATGGCTG TCGTCAGCTC1051 GTGTTGTGAA ATGTAAGGGC-3′
权利要求
1.一种生产抗冻肽的方法，包括从水性低温环境收集一种或更多的细菌样品，培养细菌并从样品中提取蛋白，检测蛋白的抗冻特性，选择有抗冻特性的蛋白，以及生产所选蛋白，其含量足够用作AFP食品添加剂。
2.产生抗冻蛋白的海单胞菌属物种的纯细菌培养物，所述细菌培养物的16S rRNA基因序列与生物体Marinomonas protea中相应的序列(序列编号1)表现出至少90％，优选95％的同源性。
3.产生抗冻蛋白的假单胞菌属物种的纯细菌培养物，所述细菌培养物的16S rRNA序列与序列编号2的基因序列表现出至少90％，优选至少95％的序列同源性。
4.表现抗冻特性的蛋白，由权利要求1的方法获得或从权利要求2或3的培养物中分离。
5.权利要求4的蛋白，该蛋白是热稳定的。
6.表现抗冻活性并且N端氨基酸序列与序列编号3的氨基酸序列有至少75％的序列同源性的蛋白。
7.序列编号3的氨基酸序列的异构体和衍生物，具有抗冻特性。
8.编码序列编号3的氨基酸序列的核酸序列。
9.包含权利要求4-7的任意一项的表现抗冻特性的蛋白的食品。
10.权利要求9的食品，其中该食品选自冷冻蔬菜和冷冻甜品如冰淇淋。
全文摘要
本发明涉及制备一种新的抗冻肽的方法和由水性低温环境中的细菌，如Marinomonas protea以及一种新的假单胞菌属物种获得的肽。这些抗冻肽可以适当地掺入冷冻食品产品如冷冻蔬菜和冷冻甜品如冰淇淋。
文档编号C07K14/195GK1434859SQ00819030
公开日2003年8月6日 申请日期2000年12月5日 优先权日1999年12月15日
发明者M·J·贝里, A·格里菲斯斯, P·J·希尔, J·莱布尔尼－帕里, S·V·米尔斯 申请人:荷兰联合利华有限公司