棒状细菌的精氨酸阻遏物缺陷型菌株和制备l－精氨酸的方法

专利名称：棒状细菌的精氨酸阻遏物缺陷型菌株和制备l－精氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种能制备L-精氨酸的棒状细菌以及利用该细菌制备L-精氨酸的方法。L-精氨酸是一种工业上有用的氨基酸，其作为肝功能促进剂、氨基酸输注剂、广泛的氨基酸药物等的成分。
常规的经发酵制备的L-精氨酸是利用下列棒状细菌得到的棒状细菌的野生型菌株；对某些试剂(包括磺胺类药、2-噻唑丙氨酸、a-氨基-a-羟基戊酸等)有抗性的棒状细菌；除了对2-噻唑丙氨酸有抗性，而且对L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸表现为营养缺陷型的棒状细菌(日本专利待审公开54-44096)；对酮丙二酸、氟代丙二酸或一氟乙酸具有抗性的棒状细菌(日本专利待审公开57-18989)；对精氨醇(argininol)具有抗性的棒状细菌(日本专利待审公开62-24075)；对X-胍具有抗性的棒状细菌(X表示脂肪酸的衍生物或脂族链，日本专利待审公开2-186995)等等。
另一方面，现有技术还公开了利用重组DNA技术制备L-精氨酸的方法。即公开了利用棒杆菌或短杆菌属的微生物制备L-精氨酸的方法，其中使得所述细菌携带有包括载体DNA和含有以下基因的DNA片段的重组DNA，所述基因为来自属于埃希氏菌属微生物的乙酰鸟氨酸去乙酰基酶、N-乙酰谷氨酸-a-半醛脱氢酶、N-乙酰谷氨激酶(glutamokinase)和精氨琥珀酸酶(日本专利公开5-23750)。
另外，至于棒状细菌，已经知道L-精氨酸生物合成体系的某些酶的合成受到L-精氨酸的抑制。而且，据报道，在L-精氨酸生物合成体系的某些酶受到L-精氨酸抑制的同时，在棒状细菌的突变株中取消了L-精氨酸对这些酶的抑制，而显示出L-精氨酸积累量的增加(Agric.Biol.Chem.，43(1)，105，1979)。
同时，对于大肠杆菌，L-精氨酸生物合成体系的阻遏物和编码该阻遏物的基因被鉴定(美国科学院学报(1987)，84(19)，6697-701)，还研究了该阻遏物蛋白质的结合相互作用和L-精氨酸生物合成体系的各种基因(美国科学院学报(1987)，84(19)，6697-701，分子生物学杂志(1992)，226，367-386)。
但是，在棒状细菌中还没有确定L-精氨酸生物合成体系的任何阻遏物蛋白质。尽管在该阻遏物蛋白质基因(argR)的核苷酸序列和推测由其编码的氨基酸序列登记在基因数据库GnBank(AF049897)中，但该基因被命名为argR是因为在上述氨基酸序列和已知的精氨酸阻遏物之间有同源性。
如上所述，尽管研究了棒状细菌的L-精氨酸生物合成体系的阻遏物蛋白质及其基因，但是该阻遏物蛋白质本身还未被确定，而且其功能等也根本没有阐述。因此，本发明的一个目的是确定棒状细菌中的L-精氨酸生物合成的阻遏物，提高棒状细菌的L-精氨酸的生产率。
本发明的发明人从棒状细菌中分离出在基因数据库中以argR登记的基因(Genbank登记号为AF049897)的同系物，并且发现如果该基因在棒状细菌中被扩增，L-精氨酸的生产能力将下降，另一方面，如果破裂了该基因，L-精氨酸的生产能力将增加，由此证实了L-精氨酸生物合成受到棒状细菌(如大肠杆菌)中的阻遏物和上述编码该阻遏物以argR登记的基因的抑制。因此，本发明得以完成。
本发明提供了以下的内容(1)一种棒状细菌，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式发挥作用，并且其具有L-精氨酸生产能力。
(2)如(1)所述的棒状细菌，其中由于该细菌染色体上编码精氨酸阻遏物的基因的破裂，精氨酸阻遏物不以通常的方式发挥作用。
(3)如(2)所述的棒状细菌，其中精氨酸阻遏物具有在SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列或者表现出与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。
(4)一种制备L-精氨酸的方法，包括在培养基中培养如(1)至(3)中任一项所述的棒状细菌，以在该培养基中产生和积累L-精氨酸，并且从该培养基中收集L-精氨酸。
在本发明中，“精氨酸阻遏物”指的是一种具有抑制L-精氨酸生物合成作用的蛋白质，如果编码该蛋白质的基因的表达量在棒状细菌中增加，L-精氨酸的生产能力将下降，如果该表达量下降或该蛋白质消失，那么L-精氨酸生产能力将增加。此后，编码该精氨酸阻遏物的基因也被称为argR基因。另外，用于本发明的“L-精氨酸生产能力”指的是，当本发明的微生物在培养基中培养时，其在该培养基中积累L-精氨酸的能力。
根据本发明，具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌的L-精氨酸的生产能力得到提高。


图1表示质粒pK1的构建过程。
图2表示质料pSFLK6的构建过程。
图3表示质粒pSFKT2的构建过程。
下面将对本发明作详细的阐述。
本发明的微生物是具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式发挥作用。本发明的棒状细菌可以是具有L-精氨酸生产能力的微生物(因为精氨酸阻遏物在其中不以通常的方式发挥作用)或是一种经培育使得在其中精氨酸阻遏物不会以通常的方式发挥作用的微生物。另外，其还可以是经培育的微生物，其中使精氨酸阻遏物不会在其中以通常的方式发挥作用，然后赋予其L-精氨酸生产能力。
棒状细菌包括迄今已被划分到短杆菌属但目前并入棒杆菌的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且包括与棒杆菌密切相关的属于短杆菌属的细菌。这些棒状细菌的例子包括下面的细菌。
嗜乙酰乙酸棒杆菌醋谷棒杆菌corynebacterium alkanolyticum美棒杆菌谷氨酸棒杆菌百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)corynebacterium melassecola热产氨棒杆菌力士棒杆菌乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)Brevibacterium immariophilum乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)玫瑰色短杆菌解糖短杆菌生硫短杆菌Brevibacterium album蜡状短杆菌嗜氨短杆菌具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌不特别限定，只要它们具有L-精氨酸生产能力，它们包括，例如，棒状细菌的野生型菌株；对某些试剂(包括磺胺类药、2-噻唑丙氨酸、a-氨基-羟基戊酸等)具有抗性的棒状细菌；除了对2-噻唑丙氨酸有抗性，而且对L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸表现出营养缺陷的棒状细菌(日本专利待审公开54-44096)；对酮丙二酸、氟代丙二酸或一氟乙酸具有抗性的棒状细菌(日本专利待审公开57-18989)；对精氨醇(argninol)具有抗性的棒状细菌(日本专利待审公开62-24075)；对X-胍具有抗性的棒状细菌(X表示脂肪酸的衍生物或脂族链，日本专利待审公开2-186995)等等。
特别是以下的菌株作为举例。
黄色短杆菌AJ11169(BP-6892)谷氨酸棒杆菌AJ12092(FERM BP-6906)黄色短杆菌AJ11336(BP-6893)黄色短杆菌AJ11345(BP-6894)谷氨酸棒杆菌AJ12430(FERM BP-2228)AJ11169菌株和AJ12092菌株是如日本专利待审公开54-44096所述的2-噻唑丙氨酸抗性菌株；AJ11336菌株是如日本专利公开62-24075所述的具有精氨醇(argininol)抗性和磺胺嘧啶抗性的菌株；AJ11345菌株是如日本专利公开62-24075所述的具有精氨醇抗性、2-噻唑丙氨酸抗性、磺胺胍抗性以及表现出组氨酸营养缺陷的菌株；AJ12430菌株是如日本专利待审公开2-186995所述的具有辛基胍抗性和2-噻唑丙氨酸抗性的菌株。
AJ11169菌株于1977年8月3日保藏在国际贸易和工业部的工业科学和技术署的国家生物科学和人类技术研究所(现在是经济、贸易和工业部的国家高级工业科学和技术研究院的国家生物科学和人类技术研究所)(邮政编码305-8566，1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，保藏号为HERMP-4161，并且基于布达佩斯条约在1999年9月27日从原先的保藏转换至国际保藏，并已经以FERM BP-6892的保藏号进行保藏。
AJ12092菌株于1983年9月29日保藏在国际贸易和工业部的工业科学和技术署的国家生物科学和人类技术研究所，保藏号为FERM P-7273，并且基于布达佩斯条约于1999年10月1日从原先的保藏转换至国际保藏，并已经以FERM BP-6906的保藏号进行保藏。
AJ11336菌株于1979年4月25日保藏在国际贸易和工业部的工业科学和技术署的国家生物科学和人类技术研究所，保藏号为FERM P-4939，并且基于布达佩斯条约于1999年9月27日从原先的保藏转换至国际保藏，并已经以FERM BP-6893的保藏号进行保藏。
AJ11345菌株于1979年4月25日保藏在国际贸易和工业部的工业科学和技术署的国家生物科学和人类技术研究所，保藏号为FERM P-4948，并且基于布达佩斯条约于1999年9月27日从原先的保藏转换至国际保藏，并已经以FERM BP-6894的保藏号进行保藏。
AJ12430菌株于1988年12月26日基于布达佩斯条约保藏在国际贸易和工业部的工业科学和技术署的国家生物科学和人类技术研究所，保藏号为FERM BP-2228。
其精氨酸阻遏物不以通常方式发挥作用的棒状细菌可以通过修饰其argR基因获得，使得该精氨酸阻遏物的活性降低或消除，或者argR基因的转录得到减少或取消。例如，得到这样一种棒状细菌的方法可以是，通过例如基于基因重组技术的同源重组，用不以通常方式发挥作用的argR基因取代染色体argR基因(后文有时被称为“破裂的argR基因”)(分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社(1972)；Matauyama，S.And Mizushima，S.，细菌学杂志，162，1196(1985))。
在同源重组中，当携带与染色体序列或其他类似物具有同源性的序列的质粒被引入相应的细菌细胞时，在同源序列的一个位点以一定的频率发生重组，因此引入的质粒全部被整合进染色体中。然后，通过在染色体中的同源序列的位点再次进行重组，从该染色体中可以除去该质粒。但是，取决于发生重组的位置，该破裂基因可以保留在染色体上，同时原先正常的基因与质粒一起从染色体中除去。通过选择这么一种细菌菌株，能够得到其中正常的argR基因被破裂的argR基因取代的细菌菌株。
现在已经确定了这种基于同源重组的基因破裂技术，因此可以使用利用线性DNA的方法、利用温度敏感质粒等的方法。ArgR基因还可以通过使用含有插入标记基因(如抗药基因)的argR基因的质粒被破裂，并且在棒状细菌的靶细胞中不会发生复制。也就是说，在已经被所述的质粒转化而获得抗药性的转化体中，所述的标记基因在染色体DNA中被整合。显然，通过位于标记物两侧的argR基因和染色体上的argR基因的同源重组已经整合出该标记基因，因此能够有效地选择基因破裂的菌株。
特别地，用作基因破裂的破裂的argR基因可以通过以下方法获得借助用限制酶的消化和重连接以缺失argR基因的某一区域；通过向argR基因中插入另一个DNA片段(标记基因等)，通过位点专一诱变(Kramer，W.与Frits，H.J.，Methods in enzymology，154，350(1987))或者用化学试剂如次硫酸钠和羟胺处理(Shortle，D.，与Nathans，D.，美国科学院学报75，270(1978))等方法通过引入取代，缺失，插入，添加或转化argR基因编码区、启动子区等的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸，使得编码的阻遏物的活性得以降低或消除，或者argR基因的转录得以减少或消除。在这些实施方案中，鉴于可靠性和稳定性，优选使用借助限制酶的消化和重连接来缺失argR基因的某一区域的方法，或者在argR基因中插入另一个DNA片段的方法。
通过使用含argR基因及其侧翼区的质粒作为模板以及对应于argR基因末端部分或侧翼区的引物进行PCR(聚合酶链式反应)以扩增出除argR基因内部或其全部之外的部分，并且使所得的扩增产物环化，可以制备出用于argR基因破裂的质粒。在以后所述的实施例中，用该方法破裂argR基因。
通过使用基于已知的argR基因的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物进行PCR反应从棒状细菌的染色体DNA获得所述的argR基因。所述的argR基因也可以通过杂交技术从微生物的染色体DNA文库中获得，其具有嘌呤操纵子，其中使用了基于已知的argR基因的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为探针。出于本发明的目的，因为该argR基因用作制备所述破裂的argR基因，它就不需要含有全长片段，它具有能引起基因破裂的长度即可。
该argR基因的来源不特别限定，只要它具有能够与棒状细菌的argR基因发生同源重组的同源性程度就可以。特别地，黄色短杆菌的argR基因(其具有在SEQ ID NO17中所示的核苷酸序列)和谷氨酸棒杆菌的argR基因(GenBank登记号为AF049897)用作棒状细菌的argR基因。这些argR基因高度同源，但是认为，与argR基因被破裂的棒状细菌不同属或种的棒状细菌的argR基因也可以用作基因破裂。
在本发明中，SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列指的是由具有下列同源性程度的argR基因编码的氨基酸序列，其应当与编码SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列的argR基因发生同源重组(例如，具有SEQ ID NO17中所示的核苷酸序列的argR基因)。
对于用作PCR的引物，可以使用使argR基因扩增的任何引物。特定的实施例包括具有SEQ ID NO19和20中所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
另外，标记基因的实施例包括抗药基因，如卡那霉素抗性基因。卡那霉素抗性基因通过PCR扩增方法从已知的含有粪链球菌卡那霉素抗性基因的质粒获得，例如pDG783(Anne-Marie Guerout-Fleury等人，基因，167，335-337(1995))。
当抗药基因用作标记基因时，获得argR基因破裂的菌株的方法是将抗药基因插入到由质粒携带的argR基因的合适位点，用该质粒转化微生物，选择抗药的转化体。染色体上argR基因的破裂能够借助DNA印迹法、PCR或其它类似方法通过分析染色体上的argR基因或标记基因进行确定。将卡那霉素抗性基因整合进入染色体DNA中可以通过采用使卡那霉素抗性基因扩增的引物通过PCR进行确定(例如，具有SEQ ID NO1和2中所示的核苷酸序列的寡核苷酸)。
L-精氨酸能够有效地在培养基中通过培养如上所述的具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌进行制备，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式发挥作用，以便在培养基中产生和积累L-精氨酸，然后从该培养基中收集该L-精氨酸。
所使用的培养基可以选自常规的利用微生物进行发酵生产氨基酸的公知的培养基。也就是说，该培养基可以是含有碳源、氮源、无机离子和所需的其它有机成分的通常的培养基。
对于碳源，可以使用糖类如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解物，醇如甘油或山梨糖醇，或有机酸如富马酸、柠檬酸或琥珀酸。
对于氮源，可以使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵，有机氮如大豆蛋白水解产物，氨气、氨水等。
作为有机痕量营养物，希望在该培养基中添加适量的其它所需物质如维生素B1和L-高丝氨酸、酵母提取物等。除了上述营养物，磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等也可以按需要少量地添加。
该培养基优选在需氧条件下培养1-7天，培养的温度优选控制在24℃至37℃，在培养过程中，PH优选控制在5-9。无机或有机酸、碱或氨气等可以作为PH调节剂。通过结合公知技术如离子交换树脂技术和其它的技术，从发酵培养液中收集L-精氨酸。
完成本发明的最好的方式下面，本发明将参照实施例进行更详细地阐述。
实施例1构建大肠杆菌和棒状细菌的穿梭载体和温度敏感载体首先，构建将argR基因引入棒状细菌的载体和用于生产棒状细菌的argR缺陷菌株的温度敏感载体。
(1)构建含有粪链球菌抗药基因的载体粪链球菌的卡那霉素抗性基因从已知的含有该基因的质粒通过PCR进行扩增。粪链球菌的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列已经得到阐述(Trieu-Cuot，P.与Courvalin，P.基因，23(3)，331-341(1983))。基于该序列，合成SEQ ID NOS1和2中所示的引物，通过使用pDG783作为模板(Anne-Marie Guerout-Fleury等人，基因，167，335-337(1995))进行PCR，扩增含有卡那霉素抗性基因及其启动子的DNA片段。
使用由Takara Shuzo有限公司制备的SUPREC02纯化上述DNA片段，然后用限制酶HindIII和HincII进行充分消化使成为平端。使用由Takara Shuzo有限公司制备的平端化试剂盒进行平端化。将该DNA片段与另一DNA片段混合，其中所述另一DNA片段是通过采用SEQ ID NOS3和4中所示的引物并以pHSG399(参见S.Takeshita等人基因，61，63-74(1987))作为模板进行PCR的扩增产物经纯化和平端化而获得的，并且将这两个片段连接。使用由TakaraShuzo有限公司制备的2型DNA连接试剂盒进行上述连接。大肠杆菌JM109的感受态细胞(由Takara Shuzo有限公司制备)用上述连接的DNA进行转化，在含有10μg/ml的IPTG(异丙基-a-D-硫代半乳吡喃糖苷)、40μg/ml的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-半乳糖苷)和25μg/ml的卡那霉素的L培养基(10g/L的Bacto胰蛋白胨，5g/L的Bacto酵母提取物，5g/l的NaCl，15g/L的琼脂，PH7.2)上涂平板，并培养过夜。挑选所出现的蓝色菌落，分离成单一的菌落，获得转化菌株。
通过碱性方法(Seibutsu Kogaku Jikkensyo(生物工程实验教材)，由日本生物科学与生物工程协会编辑，P.105，Baifukan，1992)从转化菌株制备质粒，并绘制限制酶图谱。具有相当于图1的限制酶图谱的质粒被称作pK1。该质粒稳定地携带在大肠杆菌中，赋予宿主以卡那霉素抗性。而且，由于它含有lacZ’基因，它适合用作克隆载体。
(2)构建穿梭载体pSFK6作为获得温度敏感复制控制区的原料，制备能够在大肠杆菌细胞和棒状细菌细胞中自主复制的质粒载体。从乳发酵短杆菌ATCC13869提取出的质粒pAM330(参见日本专利公开Kokai No.58-67699)被限制酶HindIII充分消化，并使其变成平端。将该片段与用限制酶BsaAI通过充分消化上述pK1获得的片段相连接。乳发酵短杆菌ATCC13869用连接的DNA进行转化。利用电脉冲方法进行转化(参见日本专利公开No.2-207791)。在含有25μg/ml的卡那霉素的M-CM2B平板上(10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10μg/L的生物素，15g/L琼脂，PH7.2)选择转化体。培养2天后，挑选菌落，分离成单一的菌落，得到转化体。从该转化体制备质粒DNA，绘制限制酶图谱。具有与图2限制酶图谱相同的质粒被称作pSFK6。该质粒能够在大肠杆菌和棒状细菌中自主复制，并赋予宿主以卡那霉素抗性。
(3)构建具有温度敏感复制控制区的质粒在体外用羟胺处理pSFK6。根据已知的方法进行该羟胺处理(例如参见，G.O.Humpherys等人，Molec.Gen.Genet.，145，101-108(1976))。收集经受该处理后的DNA，用来进行乳发酵短杆菌ATCC13869菌株的转化。在含有25μg/ml卡那霉素的CM2B平板上于低温(25℃)下选择转化体。将出现的转化体复制在类似的选择平板上，在升高的温度下(34℃)进行培养。获得一种菌株，它不能在升高的温度下在含有卡那霉素的选择平板上生长。从该菌株，回收质粒并命名为p48K。
(4)测定温度敏感复制控制区的核苷酸序列测定在具有野生型复制控制区的质粒psFK6和具有温度敏感复制控制区的质粒p48K中的复制控制区片段的核苷酸序列。在全自动测序仪ABI310(ABI)上使用DNA测序试剂盒(ABI)测定核苷酸序列。结果发现，在野生型复制控制区和温度敏感复制控制区之间存在6个核苷酸的取代。在棒状细菌中发挥作用的包含在pSFK6中的温度敏感复制控制区片段的核苷酸序列(来源于pAM330的全长序列)在SEQ ID NO5中所示；在棒状细菌中发挥作用的包含在p48K中的温度敏感复制控制区片段的核苷酸序列在SEQ ID NO7中所示。此外，由在这些核苷酸序列中包含的ORF所编码的氨基酸序列在SEQ ID NOS6和8所示。在温度敏感复制控制区中，第1255位的C突变为T，第1534位的C突变为T，第1866位的G突变为A，第2058位的G突变为A，第2187位的C突变为T，第3193位的G突变为A。其中，仅仅在第1534位置的突变伴随有氨基酸突变，导致丝氨酸替代脯氨酸。
(5)构建具有温度敏感突变的穿梭载体将p48K的6个突变中的每一个引入到穿梭载体pSFK6(参见图3)。通过已知的方法进行该突变的引入(Mikaelian，I.，Sergeant，A.，核酸研究，20，376(1992))。具体的步骤将在下面涉及。为了引入第1534位的C至T的突变，使用SEQ IDNOS9和10中所示的混合引物(引物9和10)和SEQ ID NOS11和12中所示的混合引物(引物11和12)并且以pAM330作为模板进行PCR。将每种获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从凝胶中收集该产物。使用2型EASYTRAP(Takara Shuzo有限公司)从凝胶中收集DNA片段。纯化的DNA以1∶1的摩尔比混合，并且用作通过采用SEQ ID NOS13和14中所示的引物(引物13和14)进行的PCR的模板。该扩增的产物用限制酶MluI充分消化，进行琼脂糖凝胶电泳以回收约3.2kb的DNA片段。类似地，pSFK6也用限制酶MluI充分消化，进行琼脂糖凝胶电泳以回收约3.8kb的DNA片段。将所得到的DNA片段进行混合和连接，用来转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Shuzo有限公司)。将这些细胞放在含有25μg/ml卡那霉素的L培养基中，进行过夜培养。挑选出现的菌落，分离单一的菌落，得到转化菌株。通过碱性方法由该转化菌株制备质粒，测定该质粒的核苷酸序列以证实在SEQ ID NO5所示序列中的第1534位的C被突变为T。该质粒称为pSFKT2(图3)。
实施例2棒状细菌中arg-R基因的克隆及其扩增效果通过利用黄色短杆菌野生菌株2247(AJ14067)的染色体DNA作为模板，并以具有在SEQ ID NO15中所示的(在SEQ ID NO17中的第1717-1741位核苷酸的序列)和SEQ ID NO16(与在SEQ ID NO17中的第2386-2362位核苷酸序列互补的序列)所示的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物(引物15和16)，进行PCR。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)，进行PCR 30次循环，每个循环包括在98℃下反应10秒钟，在58℃下反应1分钟，在72℃下反应3分钟。将所得到的扩增的片段插入到由实施例1获得的穿梭载体pSFK6的SmaI位点，得到能够在棒状细菌中自主复制的质粒pWR。
为了研究argR基因在生产L-精氨酸的棒状细菌中的扩增结果，将pWR引入到AJ113455菌株(FERM BP-6894)，该菌株是黄色短杆菌的L-精氨酸生产菌株。该质粒是通过电脉冲法引入的(日本专利公开No.2-207791)。在含有25μg/ml卡那霉素的CM2G琼脂培养基上(在1L纯水中含有5g葡萄糖，5g NaCl和15g琼脂，PH7.2)选择卡那霉素抗性菌株的转化体，得到AJ11345/pWR。作为对照，类似地将pSFK6引入到AJ113455菌株中，得到转化体AJ113455/pSFK6。
将上述的每种菌株涂平板，其中的琼脂培养基含有0.5g/dl葡萄糖、1g/dl聚胨、1g/dl酵母提取物和0.5g/dl NaCl，在31.5℃下培养20小时。将一铂环所述的细胞接种至含有4g/dl葡萄糖、6.5g/dl硫酸铵、0.1g/dl KH2PO4、0.04g/dlMgSO4、0.001g/dl FesO4、0.001g/dl MnSO4、5μg/dl维生素B1、5μg/dl的生物素和大豆蛋白水解产物(以N量计算为45mg/dl)的培养基中，在振荡下在烧瓶中于31.5℃下培养50小时。测量每种培养肉汤中的L-精氨酸的积累量(浓度，g/dl)。结果列在表1中。结果显示argR扩增的菌株很难积累L-精氨酸。这说明argR基因产物起到了精氨酸阻遏物的作用。
表1
在pWR中克隆的插入片段的核苷酸测序结果在SEQ ID NO17中所示。可以由该核苷酸序列编码的氨基酸序列在SEQ ID NO18中所示。
实施例3构建棒状细菌的argR破裂菌株和精氨酸阻遏物缺失的结果(1)用于argR破裂的质粒的构建通过使用黄色短杆菌的野生菌株2247菌株(AJ14067)的染色体DNA作为模板，并以具有SEQ ID NO19所示的核苷酸序列(在SEQ ID NO17的第4-28位核苷酸的序列)和SEQ ID NO20所示的核苷酸序列(与在SEQ ID NO17的第4230-4211位核苷酸的序列互补的序列)的寡核苷酸作为引物(引物19和20)，进行PCR。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)，PCR进行30次循环，每次循环包括在98℃下反应10秒钟，在58℃下反应1分钟，在72℃下反应3分钟。将所得到的扩增的片段插入到克隆载体pHSG399的多克隆位点的SmaI位点。
为了从插入的DNA片段中缺失掉被认为是编码精氨酸阻遏物的完整的ORF，使用具有SEQ ID NO21所示的核苷酸序列(在SEQ ID NO17的第2372-2395位核苷酸的序列)和SEQ ID NO22所示的核苷酸序列(与在SEQ IDNO17的第1851-1827位核苷酸序列互补的序列)的寡核苷酸作为引物(引物21和22)并以插入了扩增片段的pHSG399作为模板，进行PCR。通过该PCR产物的自身连接作用构建pssER。
然后，将用限制酶SmaI和SalI消化pssER获得的片段以及在实施例1中所得的并用SmaI和SalI消化获得的温度敏感质粒pSFKT2进行连接，得到用于argR破裂的质粒pssERT，其在棒状细菌中的自主复制能力变成温度敏感。
(2)通过同源重组构建棒状细菌的精氨酸阻遏物缺陷菌株将上述得到的质粒pssERT引入到乳发酵短杆菌AJ13029菌株中(FERMBP-5189)。利用电脉冲方法引入该质粒(日本专利公开2-207791)。因为该质粒的自主复制能力在乳发酵短杆菌中是温度敏感的，所以仅有通过同源重组将该质粒掺入所述染色体的菌株能够在34℃下作为卡那霉素抗性菌株被选择，该温度为不使所述质粒进行复制的温度。在含有25μg/ml卡那霉素的CM2G平板(在1L水中含有10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，5g/L葡萄糖，5g/LNaCl和15g/L琼脂，pH7.2)上用于argR破裂的质粒整合入染色体的菌株作为卡那霉素抗性菌株被选出。在该步骤中，来自该染色体的普通的argR基因和来自其中OFR被缺失的质粒的argR基因顺序出现在该染色体的质粒部分的两边。
然后，使该重组菌株再次进行同源重组，选择在34℃下变得对卡那霉素敏感的菌株作为其中一个argR基因缺失的菌株，所述的温度是不让质粒进行复制的温度。这些菌株包括在所述染色体上保留了普通argR基因的菌株和在该染色体上保留了所述破裂的argR基因的菌株。从这些菌株中，选择仅具有破裂的argR基因的菌株。通过制备在34℃下变得对卡那霉素敏感的菌株的染色体、利用该染色体作为模板并以具有在SEQ ID NOS19和20所示的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物(引物19和20)进行PCR，并且证实了所述的PCR产物要比通过类似方法利用来源于亲代菌株的染色体作为模板进行PCR得到的产物短了约600bp，确定了在该染色体上的argR基因是破裂型的。
上述选择的argR基因破裂的菌株的PCR产物进行直接测序，以证实该argR基因被合乎要求的破裂，由此得到AJ13029ΔR菌株。
(3)用argR破裂的菌株制备L-精氨酸将AJ13029ΔR菌株在琼脂培养基上涂平板，该培养基含有0.5g/dl葡萄糖，1g/dl聚胨，1g/dl酵母提取物，0.5g/dl NaCl，在31.5℃下培养20小时。将一铂环所述的细胞接种至含有3g/dl葡萄糖、6.5g/dl硫酸铵、0.1g/dl KH2PO4、0.04g/dlMgSO4、0.001g/dl FesO4、0.001g/dl MnSO4、300μg/dl维生素B1、200μg/dl的生物素和大豆蛋白水解产物(以N量计算为165mg/dl)的培养基中，用NaOH调整培养基至PH7.0，在31.5℃下作为种子培养物培养24小时。
将1ml的上述种子培养肉汤接种至含有4g/dl葡萄糖、6.5g/dl硫酸铵、0.5g/dlKH2PO4、0.04g/dl MgSO4、0.001g/dl FesO4、0.01g/dl MnSO4、5μg/dl维生素B1、5μg/dl的生物素和大豆蛋白水解产物(以N量计算为45mg/dl)的培养基中，用NaOH调整培养基至pH7.0，在31.5℃下于摇动中在烧瓶中培养50小时。测量在每个菌株的培养肉汤中的L-精氨酸的积累量(浓度，mg/dl)。结果列在表2中。结果表明，与亲代菌株相比，该argR破裂的菌株积累的L-精氨酸的量显著增加。
表2
(序列表的说明)SEQ ID NO1用于粪链球菌的卡那霉素抗性基因的扩增引物SEQ ID NO2用于粪链球菌的卡那霉素抗性基因的扩增引物SEQ ID NO3用于pHSG399的载体部分的扩增引物SEQ ID NO4用于pHSG399的载体部分的扩增引物SEQ ID NO5pSFK6的复制控制区的核苷酸序列
SEQ ID NO6可能由pSFK6中ORF编码的氨基酸序列SEQ ID NO7p48K的复制控制区的核苷酸序列SEQ ID NO8可能由p48K中ORF编码的氨基酸序列SEQ ID NO9用于将第1534位的C突变至T引入pSFK6的第一次PCR的引物SEQ ID NO10用于将第1534位的C突变至T引入pSFK6的第一次PCR的引物SEQ ID NO11用于将第1534位的C突变至T引入pSFK6的第一次PCR的引物SEQ ID NO12用于将第1534位的C突变至T引入pSFK6的第一次PCR的引物SEQ ID NO13用于将第1534位的C突变至T引入pSFK6的第二次PCR的引物SEQ ID NO14用于将第1534位的C突变至T引入pSFK6的第二次PCR的引物SEQ ID NO15用于argR基因扩增的引物SEQ ID NO16用于argR基因扩增的引物SEQ ID NO17含有argR基因的DNA片段的核苷酸序列SEQ ID NO18可以由上述DNA片段编码的氨基酸序列SEQ ID NO19用于argR基因扩增的引物SEQ ID NO20用于argR基因扩增的引物SEQ ID NO21用于扩增含有argR基因的质粒中除argR基因ORF之外的部分的引物SEQ ID NO22用于扩增含有argR基因的质粒中除argR基因ORF之外的部分的引物序列表<110>Ajinomoto有限公司<120>棒状细菌的精氨酸阻遇物缺陷型菌株和制备L-精氨酸的方法<130>OP1018<140><141>2001-04-<150>JP2000-129167<151>2000-04-28<160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述作为扩增粪链球菌的卡那霉素抗性基因的引物<400>1cccgttaact gcttgaaacc caggacaata ac 32<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述作为扩增粪链球菌的卡那霉素抗性基因的引物<400>2cccgttaaca tgtacttcag aaaagattag 30<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述作为扩增大肠杆菌克隆载体PHSG399的引物<400>3gatatctacg tgccgatcaa cgtctc 26<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述作为扩增大肠杆菌克隆载体PHSG399的引物<400>4aggccttttt ttaaggcagt tattg 25<210>5<211>4447<212>DNA<213>乳发酵短杆菌<220><221>CDS<222>(1318)..(2598)<400>5aagcttgtct acgtctgatg ctttgaatcg gacggacttg ccgatcttgt atgcggtgat 60ttttccctcg tttgcccact ttttaatggt ggccggggtg agagctacgc gggcggcgac 120ctgctgcgct gtgatccaat attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc 180atagaagaac ccccgtgaac tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc 240gcgcaattcc ctagcttagg tgaaaacacc atgsaacact agggaaacac ccatgaaaca 300cccattaggg cagtagggcg gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt 360ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat 420ttaccgggtc acggtgggca aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg 480gtggtggtga gcttttctag ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt 540tcaccgttct gcatgcctgc gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg 600gtgaccacga cgggcttagc 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1.一种棒状细菌，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式发挥作用，并且其具有L-精氨酸生产能力。
2.根据权利要求1的棒状细菌，其中由于在该细菌的染色体上编码精氨酸阻遏物的基因的破裂，所述的精氨酸阻遏物不以通常的方式发挥作用。
3.根据权利要求2的棒状细菌，其中所述的精氨酸阻遏物具有SEQ IDNO18所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。
4.一种制备L-精氨酸的方法，其包括在培养基中培养根据权利要求1-3中任一项的棒状细菌，以便在该培养基中生产和积累L-精氨酸，并且从该培养基中收集该L-精氨酸。
全文摘要
通过在培养基中培养一种棒状细菌以便在该培养基中产生和积累L－精氨酸并且从该培养基中收集所述的L－精氨酸来制备L－精氨酸,在该细菌中参与L－精氨酸生物合成的精氨酸阻遏物通过破裂编码该阻遏物的基因而缺失,且该细菌具有L－精氨酸生产能力。
文档编号C07K14/34GK1347982SQ0111965
公开日2002年5月8日 申请日期2001年4月28日 优先权日2000年4月28日
发明者菅美喜子, 朝仓阳子, 森由起子, 伊藤久生, 仓桥修 申请人:味之素株式会社