专利名称：血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白，特别是血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白。
HSA在细胞中是以一种含18个氨基酸残基的信号肽和6个前肽的原肽形式合成的，信号肽和前肽在转运和分泌过程被切除。人血清白蛋白已成功地在多种宿主中表达(EP330451和EP361991)。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种能刺激粒细胞等生长的多肽因子，人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF，序列2)(Souza LM etal.Science.1986，232；61-65)由174个氨基酸残基组成。粒细胞集落刺激因子内部通过两个二硫键交链，受体主要存在于髓样细胞表面，G-CSF或其类似物可刺激骨髓细胞在适宜的半固体培养体系中形成粒细胞集落。其在放疗和化疗引起的白细胞减少症、某些再生障碍性贫血等方面有重要应用。现在用于治疗的rhG-CSF是在大肠杆菌(Souzalm，etal.Science 1986；23261-65)或哺乳动物细胞中表达的(Tsuchiyam.etal.EMBOJ 1987；6611-616)。在人体中，G-CSF临床应用时，由于其半衰期短，需要每天注射，增加了病人的痛苦和治疗费用。
本发明的血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二区。
其中优选的是包括与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少95％序列同源的第二区。
最优选的是包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人粒细胞集落刺激因子氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
在本发明的融合蛋白中，可以是与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N-末端，与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区位于融合蛋白的C-末端；也可以是与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区位于融合蛋白的N-末端，与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C-末端，但前一种情况的基因在酵母中的表达较高。
为了使融合蛋白两部分间有较大的间隔，使粒细胞集落刺激因子部分最大可能地与粒细胞集落刺激因子受体结合，所述与人血清白蛋白同源的第一区与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区之间设有连接肽，所述连接肽的通式是[GlyGlyGlyGly Ser]n，n为1-10的整数；其中，优选的是n为1-3的整数。
本发明的另一个目的是提供编码本发明融合蛋白的DNA序列。
包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人粒细胞集落刺激因子氨基酸残基序列相同的第二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同，第二区与人粒细胞集落刺激因子氨基酸残基序列相同，中间设有GlyGly GlyGly Ser连接肽的融合蛋白，它的编码基因为序列3。
本发明的又一个目的是提供携带编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。
本发明的重组表达载体包括pHIL-D2HSAGCSF质粒、pD2HSAGCSF0质粒、pD2HSAGCSF2质粒、pPIC9GCSF-HSA质粒等。
本发明的再一个目的是提供表达本发明融合蛋白编码基因的宿主。
本发明的宿主可以是被重组表达载体或重组表达载体的一部分转化，含有本发明融合蛋白编码基因的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母GS115。
本发明将白蛋白分子，或其至少85％序列同源的类似物或片段与粒细胞集落刺激因子，或其至少85％序列同源的类似物或片段融合，所形成的融合蛋白既保留了与粒细胞集落刺激因子受体结合的活性，同时与粒细胞集落刺激因子相比，其血浆半衰期又得到了延长。本发明的融合蛋白既可以保留激活粒细胞集落刺激因子受体的活性，作为该受体的激动剂，制造成粒细胞集落刺激因子类药物，也可以仅保留与该受体结合的活性，作为该受体的抑制剂，制造成用于治疗某些与粒细胞集落刺激因子或其受体过量表达有关疾病的药物。
人血清白蛋白天然存在多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括这些多态型。
编码HSA的多聚核苷酸和编码hG-CSF的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR(Saiki等Science.239487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文库等，如从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.USA)获得。也可以用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。编码HSA和编码hG-CSF的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，编码HSA和编码hG-CSF的多聚核苷酸的粘性末端用DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。
许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)，动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。优选的方法是将编码本发明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表达载体pHIL-D2，pPIC9等，这些质粒为酵母整合型质粒，带有His4选择性标记。醇氧化酶操纵子(AOX1)5’序列和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应的宿主菌等可以从Invitrogen Corp.San Diego.California.USA构得，优选的启动子为AOX1。
表达融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等。融合蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是天然的人血清白蛋白的信号肽，或酵母MFα信号肽，或这两种信号肽的类似物。更优选的用天然的人血清白蛋白的信号肽，用该信号肽时融合蛋白表达水平较高。融合蛋白或多肽也可以不用信号肽，而在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。
转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如电穿孔，制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者，细胞培养上清中或细胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗G-CSF的抗体检测。
可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法，可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)的生长，第二阶段主要用于合成产物。
可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。
本发明中的融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。所用修饰剂可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。
本发明中的融合蛋白及其衍生物可单独使用，优选的为与一个或多个药学上可接受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合蛋白相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸，它们需无菌且无致热原。药物制剂可以单位剂量的形式存在，并可通过任何本领域已知的方法制备。这些方法包括将融合蛋白与具有一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等，使药物的渗透性与受体血液中的渗透性相等或相似。药物制剂可存在于单元剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管中。冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水。
优选的单元剂量包括有融合蛋白的日用剂量或单元日用剂量或其适当的亚分。
本发明中的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入、口服等方法给药。优选的方法为静脉输注或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。
本发明中的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物，作为G-CSF类药物可用于治疗各种可用粒细胞集落刺激因子治疗的疾病，如粒细胞减少症、骨髓增生异常综合症、再生障碍性贫血、白细胞减少症、及用于造血前体细胞动员、扩增等。上述粒细胞减少症可以是药原性的，如肿瘤病人放疗、化疗引起的粒细胞减少症，也可以是原发性的。作为G-CSF受体抑制剂可用于治疗某些与粒细胞集落刺激因子或其受体过量表达有关的疾病，如某些白血病等。
使用剂量可通过融合蛋白相对于hG-CSF的效价计算出，同时考虑融合蛋白相对于天然hG-CSF延长的半衰期。典型用量为1×104-5×106U/kg。在由全长HSA和全长hG-CSF形成的融合蛋白中，按照摩尔数相当即意味着使用较大重量的融合蛋白，但使用频率可降低，如一周三次、一周两次、一周一次或更少。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
GCSF1 5’ATGGATCC ACC CCC CTG GGC CCT GC3’GCSF2 5’ATGAATTC TTA GGG CTG GGC AAG GTG GCG3’PCR方法为100μl反应体系中加入1μl人肝胎cDNA文库，20μmol/L的GCSF1、GCSF2引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10X反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有限公司产品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，循环35次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(0.5kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用BamH I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶解的pUC 19质粒上(实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、pUC19质粒、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)，形成pUC-GCSF。BamH I-EcoR I区DNA测序结果表明此PCR产物序列和hG-CSF核苷酸序列相同，只是在其5’-端和3’-端分别加入了BamH I位点和EcoR I位点。并在3’-端EcoR I位点前加入了终止密码子。
实施例2HSA cDNA的克隆用PCR方法从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.USA)获得带有信号肽和前肽编码序列的HSA cDNA，所用的引物HSA1和HSA2用寡聚核苷酸合成仪合成，其中引物HSA2除包括HSA基因的3’末端序列外，还在其3’末端后加入了编码GlyGlyGlyGlySer接头肽的序列。HSA15’GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT3’HSA25’TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’PCR条件为100μl反应体系中，加入1μl人肝胎cDNA文库，20μmol/L的HSA1和HSA2引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10X反应缓冲液10μl，TaqplusIDNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，35个循环后，再72℃延伸10分钟。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(1.8KD)的条带，PCR产物电泳纯化，用DNA片段回收试剂盒回收纯化约1.8KD的目标带(实验中的TaqplusI DNA聚合酶、内切酶、连接酶、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)。取纯化的HSA cDNA 6μl，加入1μl pGEM-T载化，8μl 2X缓冲液，1μl T4DNA连接酶(pGEM-T载体、缓冲液和酶为PromegaCorp.USA产品)，15℃反应过夜，转化JM109感受态细胞(细胞购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)。转化菌辅于含x-gal和IPTG和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿上，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种至3ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基，37℃培养过夜，用常规方法抽提质粒，用PstI酶切，(在载体上和HSA cDNA上各有PstI酶切位点)，电泳分析鉴定阳性克隆。从pGEM-T载体的多克隆位点两端分别测序，并合成两个测序引物HSA3 5’GCCAGAAGACATCCTTAC3’HSA4 5’AGTTGGAGTAGACACTTG3’
从两端中部接着测序，完成HSA cDNA全长测序。获得了含有序列正确的HSA cDNA的克隆，JM109(pGEMT-HSA)，这里克隆的HSA cDNA含有其天然的信号肽和前肽部分的编码序列，以便于在表达时，直接利用其信号肽和前肽用于作为分泌信号，同时在HSA cDNA的c末端添加了接头肽GlyGlyGlyGlySer的编码序列。
实施例3连接肽为GlyGlyGlyGly Ser时本发明融合蛋白的表达为了将HSA与hG-CSF以融合蛋白形式从毕赤酵母分泌表达，如
图1所示，选择pHIL-D2质粒作为载体(Invitrogen Corp.USA)，在该载体AOX启动子下游NspV与EcoRI位点间插入融合蛋白的基因，因pHIL-D2载体上有两个NspV位点，为了方便操作，首先pHIL-D2载体用ClaI/Sal酶切成3段，回收4kb片段，自身连接后命名为pD3载体。pD3载体用Nsp/EcoRI切，回收线性化载体，将实施例1构建的pUC19-GCSF用BamHI/EcoRI切，回收约0.5kb的含G-CSF cDNA的片段，将实施例2构建的pGEMT-HSA用NspV/BamHI切，回收约1.8kb的含HSAcDNA的片段，将线性化pD3载体与含HSAcDNA，G-CSF cDNA的片段用T4连接酶催化连接，转化JM109，挑选阳性克隆，分别用NspV/EcoRI和NspV/BamHI酶切鉴定，获得结构正确的，带有编码HSA-G-CSF融合蛋白(其中HSA和G-CSF间含GlyGlyGlyGlySer接头肽)基因的阳性克隆JM109(pD3HSAGCSF)。pD3HSAGCSF质粒，用ClaI/ScaI切，电泳回收线性化的6.3kb片段，pHIL-D2空载体用ClaI/ScaI切回收约4.2kb的片段。T4连接酶催化连接pD3HSAGCSF的6.3kb片段与pHIL-D2的4.2kb片段，连接产物转化JM109后，辅于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，获得克隆JM109(pHIL-D2HSAGCSF)。再抽提该质粒约10μg，用NotI酶切。线性化后转化毕赤酵母GS115(酵母表达试剂盒由Invitrogen Corp.USA提供)，转化后的GS115，辅于含山梨醇的RDB琼脂平皿1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，4×10-5％生物素，1.34％无氨基酸酵母氮源(YNB，Difco Corp.)，0.005％氨基酸混合液(谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸各0.005％)，37℃培养1-2周，挑取His+克隆。接种至装有25mlBMGY培养基(100mmol/L磷酸钾，pH6.0，4×10-5％生物素，1.34％无氨基酸酵母氮源，1％甘油)300ml三角瓶，250转/分钟30℃培养48小时，加甲醇0.5％/24h，诱导培养4天，离心取上清，过滤除菌。用NFS-60测定培养上清中G-CSF的活性。活性测定的方法参见《中国生物制品规程》2000版(中国生物制品标准化委员会编，化学工业出版社2000.6)P412-413。将NFS-60细胞培养于含20ng/ml rhG-CSF、2.5％小牛血清、12.5％马血清的1640培养基(Gibco BRL USA)中。每周传代3次，用前用含2.5％小牛血清、12.5％马血清的1640培养基洗细胞4次，稀释至2×105细胞/ml。在96孔板上，样品用含2.5％小牛血清、12.5％马血清的1640培养基作适当稀释，每孔50μl，每孔再加细胞50μl，5％CO2，37℃培养40-48小时后，加MTT溶液(噻唑蓝溶液，用磷酸盐缓冲液配成5.0mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌)20μl，继续培养5小时，加20％SDS(十二烷基磺酸钠)溶液，37℃孵育24小时，用酶联仪测定各样品孔的吸光度值，挑选吸光度值高的克隆即为高表达克隆。得到的产物经SDS-PAGE分析，分子量正确，酶联免疫分析证明其具有血清白蛋白和人粒细胞集落刺激因子的特性。同时NFS-60细胞测活结果表明产物具有G-CSF的生物活性。
实施例4G-CSF/HSA融合蛋白的表达用与实施例1相似的PCR方法从肝胎cDNA文库获得hG-CSF cDNA，所用的引物改为GCSF3和GCSF4，引物用寡聚核苷酸合成仪合成。G-CSF35’-ATGTCGACCTCGAGAAA AGA ACC CCC CTG GGC CCT GC---3’G-CSF45’-TAGGATCCACC ACC GCC GGG CTG GGC AAG GTG GCG---3’PCR扩增后，在cDNA的5’-端引入一个Sal I位点和一个Xho I位点，同时在Xho I位点下游引入了KEX2酶切位点，用以切除表达的融合蛋白的信号肽，3’-端引入BamH I位点。PCR产物电泳纯化后，克隆到用Sal I/BamHI酶解的pUC19(北京博大泰克生物基因技术有限公司)质粒上，形成pUC-GCSF2。DNA测序结果表明此克隆序列和hG-CSF序列相同，只是在其5’-端加入了Sal I位点、XhoI位点、KEX2酶切位点，和3’-端去除了终止密码子，加入了编码柔性接头的寡聚核苷酸，及BamHI位点。
用PCR的方法从人肝胎cDNA文库获得HSA cDNA，所用的引物HSA5和HSA6用寡聚核苷酸合成仪合成HSA55’-TAGGATCCGAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT-3’HSA65’-ATGAATTC TTAAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3’PCR方法同实施例2，PCR产物电泳纯化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶解的pUC19(北京博大泰克生物基因技术有限公司)质粒上，形成pUCHSA2。DNA测序结果表明此克隆序列和HSA成熟肽的编码序列相同，只是在其5’-端加入了BamHI位点，和3’-端终止密码子后加入EcoRI位点。
如图4所示，选择pPIC9质粒作为表达载体(Invitrogen Corp.USA)。在该载体AOX启动子下游XhoI与EcoRI位点间插入G-CSF/HSA基因。将上面构建的pUC19-GCSF2用XhoI/BamHI切，回收约0.5kb的含G-CSF cDNA的片段；将pUCHSA2用BamHI/EcoR I切，回收约1.8kb的含HSA cDNA的片段；将pPIC9质粒用XhoI/EcoR I酶切，回收线性化片段，将这三个片段用T4DNA连接酶连接，转化JM109，挑选阳性克隆，分别用XhoI/BamHI和BamHI/EcoR I酶切鉴定，获得结构正确的，带有编码G-CSF-HSA融合蛋白(其中G-CSF和HSA间含GlyGlyGlyGlySer接头肽)基因的阳性克隆JM109(pPIC9GCSF-HSA)。pPIC9GCSF-HSA质粒用BglII酶切线性化后，转化毕赤酵母GS115(Invitrogen Corp.USA公司酵母表达试剂盒提供的方法)，转化后的GS115，辅于含山梨醇的RDB琼脂平皿(配方同实施例3)，37℃培养1-2周，挑取His+克隆。摇瓶培养和表达菌株筛选方法同实施例3，工程酵母的培养、产物纯化、G-CSF活性测定、酶联免疫测定方法同实施例6。结果表明表达的G-CSF/HSA融合蛋白，分子量正确，具有hG-CSF的活性、hG-CSF和HSA的特性。
实施例5带不同接头的融合蛋白的表达如图3所示，将实施例3中构建的质粒pD3HSAGCSF，用BamH I/Stu I双酶切，回收大片段，用绿豆芽核酸酶处理，切除突出末端，T4DNA连结酶平端连接，转化JM109菌，挑选阳性克隆，酶切鉴定，获得带有在HSAcDNA末端缺失CTT(亮氨酸)后与G-CSF cDNA直接融合基因的质粒pD3HSAGCSF0。
同样，在HSA和G-CSF可以加入多种柔性接头，如[GlyGlyGlyGlySer]n，n可以是1-10。如当n＝2时，可合成寡聚核苷酸L2a5’CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTG 3’L2b5’GATCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCAAGG将实施例3中构建的质粒pD3HSAGCSF，用BamH I/Stu I双酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L2a与L2b退火后与回收的火片段连接，转化JM109，挑取阳性克隆，酶切鉴定和序列分析正确，获得带有在HSAcDNA末端与G-CSF cDNA间插入编码[GlyGlyGlyGlySer]2(即GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)柔性接头的寡聚核苷酸的质粒pD3HSAGCSF2。
当n＝3时，可合成寡聚核苷酸L3a5’CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGCGGCG 3’L3b5’GATCCGCCGCCACCGGAGCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCAAGG3’将实施例3中构建的质粒D3HSAGCSF，用BamH I/Stu I双酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L3a与L3b退火后与回收的大片段连接，转化JM109，挑取阳性克隆，酶切鉴定，获得带有在HSAcDNA末端与G-CSF cDNA间插入编码[GlyGlyGlyGlySer]3柔性接头的寡聚核苷酸的质粒pD3HSAGCSF3。可用相似的方法改造实施例4构建的pPIC9GCSF-HSA质粒，以在G-CSF与HSA间插入不同的接头。
将以上构建的质粒，如pD3HSAGCSF0、pD3HSAGCSF2、pD3HSAGCSF3分别用与实施例3相同的方法构建对应的质粒pD2HSAGCSF0、pD2HSAGCSF2、pD2HSAGCSF3，并转化毕赤酵母GS115，获得表达HSA末端缺失亮氨酸后与G-CSF直接融合的HSA/G-CSF0融合蛋白、HSA与G-CSF间插入[GlyGlyGlyGlySer]2柔性接头的融合蛋白HSA/G-CSF2、及HSA与G-CSF插入[GlyGlyGlyGlySer]3柔性接头的融合蛋白HSA/G-CSF3等。得到的产物SDS-PAGE分析，分子量正确，酶联免疫分析证明其具有血清白蛋白和人粒细胞集落刺激因子的特性。同时NFS-60细胞测活结果表明产物具有G-CSF的生物活性。
实施例6工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化以实施例3构建的表达融合蛋白的工程酵母发酵和融合蛋白的纯化为例，其它工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化可用相同或相似的方法。
工程酵母接种100mlYPD培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)，摇床30℃，280转/分钟培养24h。接种至装有2.5L基础培养基的5L发酵罐(B.Braun Corp.Germany)，其中基础培养基的配制方法为浓磷酸3.5ml/L，CaSO4.2H2O0.15g/L，K2SO42.4g/L，MgSO4.7H2O 1.95g/L，KOH 0.65g/L，121℃高压灭菌30分钟，再加入30ml/L甘油(单独121℃高压灭菌30分钟)，1ml/L PTM(配方为CuSO4.5H2O 6.0g/L，CoCl2.6H2O，MnSO4.H2O 3.0g/L，H3BO30.02g/L，FeSO4.7H2O 65.0g/L NaMoO4.2H2O 0.2g/L，ZnSO4.7H2O 20.0g/L，KI 0.1g/L，浓H2SO45ml/L，121℃高压灭菌30分钟)，0.5ml/L0.02％生物素(过滤除菌)。接种前用氨水将培养基pH调至5.8。发酵过程控制温度为30℃，溶氧始终大于20％饱和度，pH值不高于6.0，培养至甘油耗尽后，开始流加甘油(50％甘油，加12ml/LPTM，2ml/L0.02％生物素)，继续培养，至密度OD600值约为150时，开始补加甲醇(分析纯甲醇，加12ml/LPTM，2ml/L0.02％生物素)诱导。取诱导培养0、12、24、48、60、72、96小时培养液样品，离心取上清，SDS-PAGE分析，发现诱导48-72h时，融合蛋白在培养上清中的百分含量均大于40％，诱导72h时，菌密度为200OD，湿菌为414.1g/L。
50ml培养液离心取上清，加入硫酸铵至20％饱和度，混匀后4℃放置过夜，离心取沉淀，用3ml 25mmol/LTris-HCl(pH7.0)溶解，用Supdex 200(AmershamPharmacia Biotech UK)Φ1.6×100cm柱层析分离，流动相为25mmol/LTris-HCl(pH7.0)，150mmol/LNaCl，流速为1ml/L，紫外检测，收集第一峰(保留时间为70-85分钟)为纯化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈均一条带，分子量为84KD，如图5所示，图中1为分子量标准，自上而下分别为94，67，43，30KD；2、3为表达HSA/G-CSF融合蛋白的工程酵母培养上清，用20％饱和度的硫酸铵沉淀纯化样品；4、6为硫酸铵沉淀纯化样品，经20mmol/Ltris-HCl缓冲液溶解后，凝胶排阻层析纯化所得的纯化样品。纯化样品用NFS-60细胞测定G-CSF的活性(方法参见《中国生物制品规程》2000版，中国生物制品标准化委员会编，化学工业出版社2000.6，P412-413)。将NFS-60细胞培养于含20ng/ml rhG-CSF，2.5％小牛血清、12.5％马血清的1640培养基(Gibco BRL USA)中。每周传代3次，用前用含2.5％小牛血清、12.5％马血清的1640培养基洗细胞4次，稀释至2×105细胞/ml。在96孔板上，将适当稀释后样品或标准品(中国药品和生物制品检定所提供)用含2.5％小牛血清、12.5％马血清的1640培养基作2倍稀释，每孔50μl，每孔再加细胞50μl，5％CO2，37℃培养40-48小时后，加MTT溶液(噻唑蓝溶液，用磷酸盐缓冲液配成5.0mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌)20μl，继续培养5小时，加20％SDS(十二烷基磺酸钠)溶液，37℃孵育24小时，用酶联仪测定各样品孔的吸光度值，与标准品对照，计算样品的活性。测得纯化样品活性为3×107U/mg。用样品稀释后包被酶联板，分别用兔抗人血清白蛋白抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为二抗，邻苯二胺作为显色低物，检测样品，如图6所示，横轴为2倍梯度稀释的孔数，纵轴是吸光度值。从图中可以看出，样品具有HSA的抗原性。
如图7所示，融合蛋白样品用含2.5％小牛血清、12.5％马血清的1640培养基用培养液适当稀释后，在96孔板上作2倍稀释，每孔50μl，每孔再加细胞50μl，5％CO2，37℃培养40-48小时后，加MTT溶液20μl，继续培养5小时，加20％SDS(十二烷基磺酸钠)溶液，37℃孵育24小时，用酶联仪测定各样品孔的吸光度值，横轴为2倍梯度稀释的孔数，纵轴是吸光度值，从图中可以看出，融合蛋白对NFS-60细胞具有显著的刺激作用，即具有G-CSF活性。
取相同活性剂量的融合蛋白和rhG-CSF(中国药品和生物制品检定所提供)，小鼠尾静脉给药，不同时间取血清用NFS-60细胞(方法同上)测定其中的G-CSF活性。结果如图8所示，横轴为取样时间，纵轴活性为G-CSF的活性，与rhG-CSF相比，融合蛋白在小鼠血浆中的半衰期明显延长。
序列表<210>1<211>585<212>PRT<213>Homosapiens<214>人<400>1Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly1 5 10 15Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr20 25 30Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu35 40 45Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu50 55 60Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys65 70 75Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys80 85 90Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His95 100 105Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val110 115 120Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu125 130 135Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr140 145 150Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe155 160 165Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro170 175 180Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys185 190 195Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala200 205 210Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys215 220 225Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp245 250 255Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser260 265 270Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu275 280 285Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala290 295 300Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val305 310 315Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe320 325 330Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu335 340 345Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys350 355 360Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp365 370 375Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln380 385 390Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn395 400 405Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr410 415 420Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser425 430 435Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu440 445 450Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu455 460 465Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser470 475 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu485 490 495Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Ash Ala Glu Thr Phe Thr Phe His500 505 510Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys515 520 525Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr530 535 540Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val545 550 555Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu560 565 570Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu575 580 585<210>2<211>174<212>PRT<213>Homosapiens<214>人<400>2Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu1 5 10 15Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala20 25 30Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu35 40 45Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro50 55 60Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu65 70 75Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln80 85 90Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr95 100 105Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln110 115 120Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly125 130 135Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly140 145 150Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr155 160 155Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro170 174<210>3<211>2379<212>DNA<213>artificial sequence<214>人工序列<220><223>编码人血清白蛋白和人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸序列<400>3ttcgaaaccatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttag50ctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgagg 100ttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtg 150ttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgt 200aaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgtagctgatg 250agtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaa 300ttatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactg 350ctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaag 400atgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatg 450tgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttata 500tgaaattgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttct 550ttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgat 600aaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaa 650ggcttcgtctgccaaacagagactcaaatgtgccagtctccaaaaatttg 700gagaaagagctttcaaagcatgggcagtggctcgcctgagccagagattt 750cccaaagctgagtttgcagaagtttccaagttagtgacagatcttaccaa 800agtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgaca 850gggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaggattcgatctccagt 900aaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgttggaaaaatcccactgcat 950tgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctg1000ctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaag1050gatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctga1100ttactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatgaaaccactc1150tagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtg1200ttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaaca1250aaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgc1300tattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactctt1350gtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaaca1400tcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcc1450tgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtc1500acaaaatgctgcacagagtccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagc1550tctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacat1600tcaccttccatgcagatatatgcacactttctgagaaggagagacaaatc1650aagaaacaaactgcacttgttgagcttgtgaaacacaagcccaaggcaac1700aaaagagcaactgaaagctgttatggatgatttcgcagcttttgtagaga1750agtgctgcaaggctgacgataaggagacctgctttgccgaggagggtaaa1800aaacttgttgctgcaagtcaagctgccttaggccttggtggtggtggatc1850cacccccctgggccctgccagctccctgccccagagcttcctgctcaagt1900gcttagagcaagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcgctccaggag1950aagctgtgtgccacctacaagctgtgccaccccgagctggtgctgctcgg2000acactctctgggcatcccctgggctcccctgagcagctgccccagccagg2050ccctgcagctggcaggctgcttgagccaactccatagcggccttttcctc2100taccaggggctcctgcaggccctggaagggatctcccccgagttgggtcc2150caccttggacacactgcagctggacgtcgccgactttgccaccaccatct2200ggcagcagatggaagaactgggaatggcccctgccctgcagcccacccag 2250ggtgccatgccggccttcgcctctgctttccagcgccgggcaggaggggt 2300cctggttgcctcccatctgcagagcttcctggaggtgtcgtaccgcgttc 2350tacgccaccttgcccagccctaagaattc2379
权利要求
1.血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二区。
2.根据权利要求1所述的血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少95％序列同源的第二区。
3.根据权利要求1所述的血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人粒细胞集落刺激因子氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
4.根据权利要求3所述的血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
5.根据权利要求1所述的血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N-末端，所述与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区位于融合蛋白的C-末端。
6.根据权利要求1所述的血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区位于融合蛋白的N-末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C-末端。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述与人血清白蛋白同源的第一区与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区之间设有连接肽，所述连接肽的通式是[GlyGlyGlyGly Ser]n，n为1-10的整数；其中，优选的是n为1-3的整数。
8.编码权利要求1-7中任意一项限定的融合蛋白的DNA序列。
9.携带权利要求8所述DNA序列的重组表达载体。
10.含权利要求8所述的DNA的细菌、酵母、动物细胞、植物细胞；其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母GS115。
全文摘要
本发明公开了一种血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，编码融合蛋白的DNA序列，携带该DNA序列的细菌、酵母、动物细胞、植物细胞；本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；本发明融合蛋白的第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是[GlyGly GlyGly Ser]
文档编号C07K14/435GK1405182SQ0112411
公开日2003年3月26日 申请日期2001年8月10日 优先权日2001年8月10日
发明者吴军, 唱韶红, 巩新, 马清钧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所