抗ccr5的抗体的制作方法

专利名称：抗ccr5的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)家族成员多肽的新人类基因。更具体地，本发明涉及编码称作人G蛋白趋化因子受体(CCR5)HDGNR10(本文称作“G蛋白趋化因子受体”或“HDGNR10”)的新人类多肽的多核苷酸。本发明还涉及G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽、以及载体、宿主细胞、指向G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的抗体，和制备它们的重组方法。本发明还提供检测涉及免疫系统和HIV感染的疾病、紊乱和/或病症的诊断方法，和治疗、预防和/或诊断这些疾病、紊乱和/或病症的治疗方法。本发明还涉及用于鉴定G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的拮抗剂和激动剂的筛选方法。G蛋白趋化因子受体(CCR5)又称作CCR5。
背景技术：
十分明确的是，许多医学上有意义的生物学方法是由参与涉及G蛋白和/或第二信使如cAMP的细胞转导途径的蛋白质介导的(Lefkowitz，Nature，351353-354(1991))。此处这些蛋白质称作参与涉及G蛋白或PPG蛋白的途径的蛋白。这些蛋白质的一些例子包括GPC受体，例如针对肾上腺素药剂和多巴胺的那些GPC受体(Kobilka，B.K.等，PNAS，8446-50(1987)；Kobilka，B.K.等，Science，238650-656(1987)；Bunzow，J.R.等，Nature，336783-787(1988))，G蛋白本身，效应蛋白如磷脂酶C、腺苷酸环化酶、和磷酸二酯酶，和激励者蛋白(actuatorprotein)如蛋白激酶A和蛋白激酶C(Simon，M.I.等，Science，252802-8(1991))。
例如，在一种形式的信号转导中，激素结合的效果是激活细胞内的酶，腺苷酸环化酶。激素对酶的激活依赖于核苷酸GTP的存在，而且GTP还影响激素的结合。G蛋白使激素受体与腺苷酸环化酶连接起来。已证明G蛋白质在被激素受体激活时将结合的GDP交换为GTP。然后携带GTP的形式与激活的腺苷酸环化酶结合。G蛋白本身催化GTP水解为GDP，这使G蛋白回到其基础的无活性形式。因此，G蛋白扮演了双重角色，一个是作为将信号从受体接替到效应器的中间体、一个是作为控制信号持续时间的时钟。
G蛋白偶联受体的膜蛋白基因超家族的特征在于具有7个可能的跨膜域。这些域被认为是通过胞外或胞质环连接的跨膜α螺旋。G蛋白偶联受体包括广泛的生物学活性受体，如激素、病毒、生长因子和神经受体。
G蛋白偶联受体的特征在于包括这样7个约20-30个氨基酸的保守疏水链，连接至少8个趋异的亲水环。G蛋白家族的偶联受体包括多巴胺受体，其与用于治疗精神和神经疾病的精神抑制药物结合。该家族成员的其它例子包括降钙素、肾上腺素、内皮素、cAMP、腺苷、毒蕈碱、乙酰胆碱、5-羟色胺、组胺、凝血酶、激肽、促卵泡激素、视蛋白、内皮分化基因-1受体及视紫红质、增味剂、巨细胞病毒受体等。
G蛋白偶联受体可以细胞内通过异三聚体G蛋白偶联与多种细胞内酶、离子通道和转运蛋白偶联(见，Johnson等，Endoc.Rev.10317-331(1989))。不同G蛋白α亚基优选刺激特定的效应器以调节细胞中的多种生物学功能。已经确定G蛋白偶联受体的细胞质残基的磷酸化是调节某些G蛋白偶联受体与G蛋白偶联的重要基质。在哺乳动物宿主中发现G蛋白偶联受体存在于许多位点中。
趋化因子(又称间分泌细胞因子(intercrine cytokine))是一个结构和功能相关的细胞因子亚家族。这些分子大小为8-10kd。一般地，趋化因子在氨基酸水平上表现出20％至75％的同源性，而且特征在于形成两个二硫键的4个保守的半胱氨酸残基。基于头两个半胱氨酸残基的排列，趋化因子被划分为两个亚家族即α和β。在α亚家族中，头两个半胱氨酸被一个氨基酸分隔开并由此称作“C-X-C”亚家族。在β亚家族中，这两个半胱氨酸处于相邻位置并因此被称作“C-C”亚家族。迄今，在人类中已鉴定到至少9个不同的该家族成员。
这些间分泌细胞因子表现出广泛的功能。标志性的特征是它们能够引起不同细胞类型(包括单核细胞、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和成纤维细胞)的趋化迁移。许多趋化因子具有促炎活性并参与炎症反应过程中的多个步骤。这些活性包括刺激组胺释放、溶酶体酶和白三烯的释放、增加靶免疫细胞与内皮细胞的粘附、增强补体蛋白的结合、诱导粒细胞粘着分子和补体受体的表达、和呼吸爆发。除了参与炎症反应外，证实某些趋化因子还表现出其它活性。例如，巨噬细胞炎症蛋白1(MIP-1)能够抑制造血干细胞增殖，血小板因子4(PF-4)是内皮细胞生长的有效抑制剂，白介素8(IL-8)促进角质细胞增殖，而GRO是黑素瘤细胞的自体分泌生长因子。
根据这些多样的生物学活性，许多生理和疾病情况涉及趋化因子是毫不惊奇的，包括淋巴细胞运输、伤口愈合、造血调节和免疫紊乱例如过敏、哮喘和关节炎。
由此，需要可以调整免疫系统调节的多肽，因为这些调节的失常可能涉及与免疫系统有关的疾病、紊乱和/或病症。因此，需要鉴定和表征能够在检测、预防、改善或矫正这些疾病、紊乱和/或病症中起作用的人类多肽。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)是7次跨膜的G蛋白偶联受体，表达在免疫系统的细胞中，例如巨噬细胞，包括树突细胞如郎氏细胞，和T细胞包括Th0和Th1效应细胞。G蛋白趋化因子受体(CCR5)还被检测到存在于小胶质细胞、星型胶质细胞、神经元、和中枢神经系统(CNS)的血管内皮细胞中。G蛋白趋化因子受体(CCR5)还表达在类风湿性关节炎患者滑液中的单核细胞和T细胞中，并且还参与其它形式的关节炎。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体包括MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、RANTES和Eotaxin。CCR5还是HIV的主要共同受体，并且还可以被其它感染剂例如其它病毒所识别以允许进入细胞。近来发现包含突变的CCR5基因的某些个体尽管多次暴露于HIV病毒，但对HIV感染具有抗性。该突变造成细胞表面不表达CCR5(Liu等，Cell861(1996))。
目前HIV是世界上最主要的致死性感染疾病，在1999年造成2.6百万人死亡。由HIV感染导致的死亡数目将持续增加；在1999年，世界上有5.6百万新的HIV感染病例并且活着患者有33.6百万。尽管目前有14种药物被批准用于治疗HIV，但半数患者在一年药物治疗后仍不能得到成功的治疗(成功定义为血清中不能检测到HIV RNA(实际上这等于每ml少于50个拷贝的HIV-1RNA))。这些药物疗法不能有效治疗HIV的原因在于几方面的失败某些药物的使用导致产生抗药性HIV株；一些个体不能耐受某些药物或药物有不良副作用；患者难于遵守复杂的给药疗法；以及药物不能接近身体内HIV的储存地。因此，本领域仍需要开发改良的HIV疫苗和疗法。
发明概述本发明涉及G蛋白趋化因子受体(CCR5)的新多核苷酸和编码的多肽。而且，本发明涉及载体、宿主细胞、抗体、和制备这些多肽和多核苷酸的重组和合成方法。还提供检测涉及这些多肽和多核苷酸的疾病、紊乱和/或病症的诊断方法、以及治疗、预防和/或诊断这些疾病、紊乱和/或病症的治疗方法。本发明还涉及鉴定G蛋白趋化因子受体(CCR5)的结合伙伴(partner)的方法。
根据本发明的一个方面，提供新的成熟受体多肽以及其生物学上有效的和诊断或治疗上有用的片段、类似物和衍生物。本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽是人类来源的。
根据本发明的另一方面，提供编码本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的分离核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及其反义类似物和其生物学上有效的及诊断或治疗上有用的片段。
根据本发明的再一方面，提供通过重组技术制备G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的方法，包括在促进所述多肽表达的条件下培养含有编码本发明受体多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，以及随后回收所述多肽。
根据本发明的再一方面，提供与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合的抗体。本发明包括免疫特异性地与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或多肽片段或G蛋白趋化因子受体(CCR5)的变体结合的抗体(包括包含其抗体片段或变体，或者是由其抗体片段或变体组成的分子)。具体地，本发明包括免疫特异性地与人G蛋白趋化因子受体(CCR5)例如SEQ IDNO2的多肽或多肽片段或变体或由保藏克隆编码多肽的多肽或多肽片段或变体结合的抗体(包括包含其抗体片段或变体，或者是由其抗体片段或变体组成的分子)。
本发明涉及预防、治疗或改善疾病或紊乱的方法和组合物，包括给动物，优选人类使用有效量的一种或多种免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体或其片段或变体、或相关分子。在特定实施方案中，本发明涉及预防、治疗或改善与G蛋白趋化因子受体(CCR5)的功能或G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体的功能或异常的G蛋白趋化因子受体(CCR5)或G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体的表达有关的疾病或紊乱的方法和组合物，包括给动物，优选人类使用有效量的一种或多种免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体或其片段或变体、或相关分子。在极为优选的实施方案中，本发明涉及预防、治疗或改善HIV感染和/或与HIV感染相关的疾病的基于抗体的方法和组合物。可以使用本发明抗体治疗、预防或改善的其它疾病或紊乱包括，但不限于，免疫紊乱(例如自身免疫病如多发性硬化、葛雷夫斯氏病、和类风湿性关节炎)、神经变性病(例如阿尔茨海默氏病)、炎性疾病(例如哮喘、过敏性疾病、或炎性肾疾病如肾小球性肾炎)、感染性病(例如肝炎感染、疱疹病毒感染、和其它病毒感染)和增生性疾病。
本发明还涉及检测、诊断或预后疾病或紊乱的方法和组合物，包括给动物，优选人类使用有效量的一种或多种免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体或其片段或变体、或相关分子。在特定实施方案中，本发明涉及检测、诊断或预后与G蛋白趋化因子受体(CCR5)的功能或G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体的功能或异常的G蛋白趋化因子受体(CCR5)或G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体的表达有关的疾病或紊乱的方法和组合物，包括给动物，优选人类使用有效量的一种或多种免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体或其片段或变体、或相关分子。在极为优选的实施方案中，本发明涉及检测、诊断或预后HIV感染和/或与HIV感染相关的疾病的基于抗体的方法和组合物。可以使用本发明抗体检测、诊断或预后的其它疾病或紊乱包括，但不限于，免疫紊乱(例如自身免疫病如多发性硬化、葛雷夫斯氏病、和类风湿性关节炎)、神经变性病(例如阿尔茨海默氏病)、炎性疾病(例如哮喘、过敏性疾病、或炎性肾疾病如肾小球性肾炎)、感染性病(例如肝炎感染、疱疹病毒感染、和其它病毒感染)和增生性疾病。
本发明的另一实施方案包括本发明抗体作为诊断工具以监测细胞上G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达的用途。
本发明还包括表达免疫特异性地结合一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽(例如SEQ ID NO2，或由保藏克隆编码的多肽)的抗体的细胞系。
本发明还包括编码这些细胞系表达的抗体的多核苷酸、以及编码这些细胞系表达的抗体的氨基酸序列。本发明还包括包含这些抗体的片段或变体(例如，重链、VH域、VH CDR、轻链、VL域、或VL CDR，它们具有本发明表达抗体的细胞系所表达的任一种抗体的氨基酸序列，并免疫特异性地与一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体结合)或由它们组成的分子，同样编码这些抗体和/或分子的核酸分子也包括在本发明中。在极为优选的实施方案中，本发明包括与一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的细胞外区/域结合的抗体、或其片段或变体。
本发明人制备了表达免疫特异性地结合一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽(例如SEQ ID NO2或由保藏克隆编码的多肽)的抗体的杂交瘤细胞系。因此，本发明包括这些细胞系，它们被列在下表2中，保藏在美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，保藏日期和保藏编号列在表2中。ATCC位于10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。ATCC保藏是遵循国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约进行的。
而且，本发明包括编码这些细胞系表达的这些抗体的多核苷酸、以及编码这些细胞系表达的这些抗体的氨基酸序列。本发明还包括包含免疫特异性地与一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体结合的这些抗体的片段或变体(例如，重链、VH域、VH CDR、轻链、VL域、或VL CDR，它们具有由表2所述一种或多种细胞系表达的任一种这样抗体的氨基酸序序列)，并或由它们组成的分子，同样编码这些抗体和/或分子的核酸分子也包括在本发明中。在极为优选的实施方案中，本发明包括与一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的细胞外区/域结合的抗体、或其片段或变体。
本发明还提供与一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合的抗体，其与可检测标记，例如酶、荧光标记、萤光标记、或生物发光标记偶联。本发明还提供与一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合的抗体，其与治疗剂或细胞毒性剂偶联。本发明还提供与一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合的抗体，其与放射性物质偶联。
本发明还提供抑制或废除HIV结合、进入G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞/与该细胞融合(感染)、和/或在该细胞中复制的能力的抗体。在本发明极为优选的实施方案中，本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体被用于治疗、预防或改善HIV感染和/或与HIV感染有关的疾病。在其它极为优选的实施方案中，本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体单独地或与其它治疗性化合物(尤其是抗逆转录病毒药剂)一起施用给个体，以治疗、预防或改善HIV感染和/或与HIV感染有关的疾病。
本发明还提供与一种或多种G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合的抗体，其起到G蛋白趋化因子受体(CCR5)激动剂或G蛋白趋化因子受体(CCR5)拮抗剂的作用。在特定的实施方案中，本发明抗体刺激G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的趋化性。在其它特定实施方案中，本发明抗体抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合。在其它特定实施方案中，本发明抗体上调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的表达。
本发明还提供下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达的抗体。在再其它特定实施方案中，本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体通过促进G蛋白趋化因子受体(CCR5)内化下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的表达。
本发明还提供抑制或消除G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体(例如MIP1-β、MIP1-α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、RANTES和Eotaxin)与G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的结合。
本发明还提供核酸分子，其一般是分离的，并编码本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体、或由它们组成的分子，例如scFv、VH域、或VL域)。本发明还提供使用编码本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体、或由它们组成的分子，例如scFv、VH域、或VL域)的核酸分子转化的宿主细胞、和其后代。本发明还提供制备本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体、或由它们组成的分子)的方法。本发明还提供从核酸分子表达本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体、或由它们组成的分子)的方法。本发明的这些和其它方法更为详细地描述在下面。
在另一实施方案中，本发明提供包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸、多肽或其片段、变体或衍生物、或由它们组成的疫苗。
根据本发明另一方面，提供用于筛选结合并激活或抑制本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的化合物的方法。
根据本发明再一实施方案，提供给宿主施用结合并激活本发明受体多肽的化合物的方法，其可用于刺激造血、伤口愈合、凝血、血管发生，以治疗实体瘤、慢性感染、白血病、T细胞介导的自身免疫病、寄生虫感染、银屑癣，以及刺激生长因子活性。
根据本发明另一方面，提供通过基因治疗施用本发明受体多肽以治疗与该多肽的不足表达或G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的配体的低表达有关的疾病的方法。
根据本发明再一实施方案，提供给宿主施用结合并抑制本发明受体多肽激活的化合物的方法，该方法可用于预防和/或治疗过敏、动脉粥样化形成、过敏性反应、癌、慢性和急性炎症、组胺和IgE介导的过敏反应、与前列腺素无关的发烧、骨髓衰竭、硅肺病、肉样瘤病、类风湿性关节炎、休克和嗜酸性粒细胞过多症。
根据本发明再一方面，提供包含足够长度的核酸分子以特异地与本发明多核苷酸序列杂交的核酸探针。
根据本发明再一方面，提供诊断分析方法，其用于检测与编码该多肽的核酸序列发生突变有关的疾病和用于检测该受体多肽可溶形式的水平改变。
根据本发明再一方面，提供将该受体多肽、或编码该多肽的多核苷酸用于与科学研究有关的体外目的、DNA合成和DNA载体制备的方法。
从本文的教导，本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员应是明了的。
附图简述以下附图是本发明实施方案的举例说明，不旨在限制由权利要求包括的本发明范围。


图1显示本发明G蛋白偶联受体的DNA序列和相应的推导氨基酸序列。对于氨基酸，使用标准的单字母缩写。测序使用373自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.)进行。
图2描述了本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)和人MCP-1受体(SEQID NO9)的氨基酸比对。该图显示了通过BLAST分析确定的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白和人MCP-1受体A(MCP-1RA)(SEQ ID NO9)的翻译产物之间的一致区域。两个多肽之间的一致氨基酸以划线指出，而高度保守的氨基酸以冒号指示，保守氨基酸以句号指示。通过检验具有一致的、高度保守和保守氨基酸的区域，本领域技术人员可以容易地鉴别出两个多肽之间的保守域。这些保守域是本发明的优选实施方案。
图3显示对G蛋白趋化因子受体(CCR5)氨基酸序列的分析。图中显示了α、β、转角和卷曲(coil)区域；亲水性和疏水性；两亲性区域；柔性区域；抗原指数(antigenic index)和表面概率(surfaceprobability)，所有这些均是使用默认设定值产生的。在“Jameson-Wolf的抗原指数”图中，正峰指示G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的高抗原性区域的位置，即可以从其中获得本发明带有表位的多肽的区域。这些图所定义的域是本发明所考虑的。
图3给出的数据还以表格的形式列在表1中。列以标题“Res”、“位置”和罗马数字I-XIV标记。列的标题是指图3和表1所示氨基酸序列的下列特征“Res”SEQ ID NO2和图1A及图1B的氨基酸残基；“位置”SEQ ID NO2和图1A及图1B中相应残基的位置；Iα，区-Garnier-Robson；IIα，区-Chou-Fasman；IIIβ，区-Garnier-Robson；IVβ，区-Chou-Fasman；V转角，区-Garnier-Robson；VI转角，区-Chou-Fasman；VII卷曲，区-Garnier-Robson；VIII亲水性图-Kyte-Doolittle；IX疏水性图-Hopp-Woods；Xα，两亲性区-Eisenberg；XIβ，两亲性区-Eisenberg；XII柔性区-Karplus-Schulz；XIII抗原指数-Jameson-Wolf；和XIV表面概率图-Emini。
发明详述根据本发明一个方面，提供分离的核酸(多核苷酸)，其编码具有图1的推导氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽、或编码1995年6月1日保藏为ATCC保藏号97183的克隆所编码的成熟多肽。保藏克隆的样品从ATCC获得并经过了重新测序，其含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)的开放式阅读框。从重新测序的克隆得到的序列数据显示在SEQ ID NO21和22，SEQ ID NO21与SEQ ID NO1在5个位置(SEQ ID NO1核苷酸第320、433、442、646和1289位)不同，SEQ ID NO22与SEQ ID NO2在5个位置(氨基酸残基第21、59、62、130、和344位)不同。
本发明多核苷酸是在来源于人类单核细胞的基因组文库中发现的。其结构上与G蛋白偶联受体家族相关。其含有一个编码352个氨基酸残基的开放式阅读框。该蛋白质表现出与人MCP-1受体(SEQ ID NO9)有最大程度的同源性，即在整个347氨基酸链上有70.1％一致性和82.9％相似性。
本发明多核苷酸包括，但不限于，SEQ ID NO1的核苷酸序列、HDGNR10保藏克隆(ATCC保藏号97183)的核苷酸序列、SEQ ID NO21的核苷酸序列、和/或它们的片段、变体或衍生物。
本发明多核苷酸可以是RNA或DNA形式的，该DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。DNA可以是双链的或单链的，并且如果是单链的，其可以是编码链或非编码(反义)链。编码该成熟多肽的编码序列可以和图1所示编码序列或保藏克隆的编码序列一致，或可以是不同的编码序列，即该编码序列由于遗传密码的冗余性或简并性仍与图1的DNA(SEQ IDNO1)或保藏克隆编码同样的成熟多肽。
编码图1的成熟多肽或编码保藏克隆所编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括仅成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和其它编码序列如跨膜(TM)或胞内域；成熟多肽的编码序列(和任选地其它编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅包括该多肽的编码序列的多核苷酸，以及还包括其它编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及编码具有图1推导的氨基酸序列的多肽或保藏克隆所编码的多肽的片段、类似物和衍生物的上文所述多核苷酸的变体。该多核苷酸的变体可以是该多核苷酸的天然存在等位基因变体或该多核苷酸的非天然变体。
因此，本发明包括编码与图1(SEQ ID NO2)所述相同的成熟多肽或与保藏克隆所编码的相同的成熟多肽的多核苷酸以及这些多核苷酸的变体，该变体编码图1(SEQ ID NO2)多肽或保藏克隆所编码的多肽的片段、衍生物或类似物。这些核苷酸变体包括缺失变体、替代变体和添加或插入变体。
正如上文指出的，该多核苷酸可以具有是图1所示编码序列(SEQ IDNO1)或保藏克隆的编码序列的天然等位基因变体的编码序列。正如本领域已知的，等位基因变体是可以具有一或多个核苷酸的替代、缺失或添加，且实质上不改变编码多肽的功能的多核苷酸序列的改变形式。
该多核苷酸还可以编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的可溶性形式，其是从本发明全长多肽的TM和细胞内域上切割下来的该多肽的细胞外部分。
本发明多肽还可以具有按符合阅读框方式与允许纯化本发明多肽的标记序列融合的编码序列。在细菌宿主情况下该标记序列可以是pQE-9载体提供的六组氨酸标签以便纯化与标记融合的成熟多肽，或例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时该标记序列可以是血凝素(HA)标签。HA标签相应于来源于流感血凝素蛋白(Wilson，I.等，Cell，37767(1984))的表位。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA区段；它包括位于编码区之间和之后的区域(前导序列和尾随序列)以及各编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
本发明全长基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针以分离全长cDNA和分离与该基因具有高度序列相似性或相似生物学活性的其它cDNA。此类探针优选具有至少30个碱基并可以含有例如50个或更多个碱基。该探针还可以用于鉴定相应于全长转录本的cDNA克隆和含有完整基因(包括调节区和启动子区、外显子和内含子)的基因组克隆。筛选的一个例子包括通过使用已知DNA序列合成寡核苷酸探针分离该基因的编码区。具有与本发明基因序列互补的序列的标记寡核苷酸可以用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA文库以确定出与探针杂交的文库成员。
本发明还涉及与上文描述的序列杂交的多核苷酸，条件是两个序列之间有至少70％、优选至少90％、更优选至少95％的一致性。本发明尤其涉及在严紧条件下与上述所述多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严紧条件”是指杂交仅在两个序列之间有至少95％、优选至少97％一致性的条件下发生。在一个优选实施方案中，与上文所述多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽实质上保留了与图1 DNA(SEQ ID NO1)或保藏克隆编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。
或者，该多核苷酸可以具有至少20个碱基、优选30个碱基、更优选至少50个碱基，所述碱基与本发明多核苷酸杂交并与之有上述一致性，且可以或可以不保留活性。例如，这些多核苷酸可以用作SEQ ID NO1或保藏克隆的多核苷酸的探针，例如以回收该多核苷酸或作为诊断探针或作为PCR引物。
因此，本发明指向与编码SEQ ID NO2多肽或保藏克隆所编码多肽的多核苷酸有至少70％一致性、优选至少90％一致性、更优选至少95％一致性的多核苷酸以及其片段，该片段具有至少30个碱基且优选至少50个碱基，本发明还指向这些多核苷酸编码的多肽。
本文所指保藏物将依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约进行维持。这些保藏物仅仅为了方便本领域技术人员而提供，并不是在35 U.S.C.§112下要求保藏物的许可。保藏材料中包含的多核苷酸的序列、以及由其编码的多肽的氨基酸序列特此并入本文作为参考，并在万一出现任何与本文的序列描述发生冲突的时候优先考虑。可以要求制造、或销售这些保藏材料的许可，而这里没有授予这种许可。
本发明还涉及G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽，其具有图1的推导氨基酸序列(SEQ ID NO2)或其具有保藏克隆所编码的氨基酸序列(SEQID NO22)，还涉及该多肽的片段、类似物和衍生物。
当涉及图1多肽或保藏克隆编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指实质上保留了与该多肽相同的生物学功能或活性，即作为G蛋白趋化因子受体(CCR5)的功能，或即使不作为G蛋白趋化因子受体(CCR5)起作用但保留了结合配体或受体的能力的多肽(例如，受体的可溶性形式)。类似物包括原蛋白，其可以通过切割原蛋白部分产生活性成熟多肽而被激活。
本发明多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
图1多肽(SEQ ID NO2)或保藏克隆编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是这样的(i)其中一个或多个氨基酸残基替代为保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)，且该替代氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码编码的，或(ii)其中一或多个氨基酸残基包括取代基，或(iii)其中成熟多肽与另一化合物，如增加该多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或(iv)其中添加的氨基酸与成熟多肽融合以便纯化该多肽，或(v)其中该多肽的片段是可溶性的，即非膜结合的，但仍与膜结合受体的配体结合。从本文的教导，这些片段、衍生物和类似物被认为属于本领域技术人员的范围。
本发明多肽和多核苷酸优选以分离的形式，并优选被纯化至均一。
本发明多肽包括SEQ ID NO2的多肽(尤其是成熟多肽)或保藏克隆编码的多肽、以及与SEQ ID NO2的多肽或保藏克隆编码的多肽有至少70％相似性(优选70％一致性)、更优选地与SEQ ID NO2的多肽或保藏克隆编码的多肽有至少90％相似性(更优选90％一致性)、更优选与SEQID NO2的多肽或该多肽的部分(该多肽的此部分一般含有至少30个氨基酸且更优选地至少50个氨基酸)有至少95％相似性(更优选90％一致性)的多肽。
正如本领域已知的，两个多肽之间的“相似性”是通过将该多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸替代物与第二多肽的序列进行比较确定的。
本发明多肽的片段或部分可以用于通过肽合成制备相应的全长多肽，由此这些片段可以用作制备全长多肽的中间体。本发明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长多核苷酸。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA区段；其包括位于编码区之间和之后的区域，即“前导序列和尾随序列”、以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语“分离的”是指将物质从其最初环境(例如如果其是天然存在的则从自然环境)中分离出来。例如，存在于活动物体内的天然存在多核苷酸或多肽不是分离的，但从天然系统中的部分或全部共存物质中分离出来的同样多核苷酸或多肽是分离的。这些多核苷酸可以是载体的部分和/或这些多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，并且仍是分离的，因为该载体或组合物不是其天然环境的部分。
本发明多肽包括SQE ID NO2的多肽或保藏克隆编码的多肽(尤其是成熟多肽)、以及与SEQ ID NO2的多肽或保藏克隆编码的多肽有至少70％相似性(优选70％一致性)、更优选至少90％相似性(更优选90％一致性)、更优选至少95％相似性(更优选95％一致性)的多肽，并还包括这些多肽的部分，其中所述的该多肽部分一般含有至少30个氨基酸且更优选至少50个氨基酸。
正如本领域已知的，两个多肽之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸替代物与第二多肽的序列进行比较确定的。
本发明多肽的片段或部分可以用于通过肽合成制备相应的全长多肽；因此，这些片段可以用作制备全长多肽的中间体。本发明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长多核苷酸。
本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体、用本发明载体遗传改造的宿主细胞、和通过重组技术对本发明多肽的生产。
用本发明载体遗传改造(转导或转化或转染)宿主细胞，其中该载体可以是例如克隆或表达载体。该载体的形式可以是例如是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。经改造的宿主细胞可以在经修饰的常规营养培养基中培养，所述修饰适于激活启动子、选择转化体或扩增本发明基因。培养条件例如温度、pH等是以前选用来表达的宿主细胞所用的那些培养条件，并且它们对本领域普通技术人员是明显的。
本发明多核苷酸可以用于通过重组技术生产多肽。因此，例如可以将该多核苷酸包括在用于表达多肽的各种表达载体之任一种中。该载体包括染色体、微染色体和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；来源于质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(例如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、和假狂犬病病毒)的组合的载体。然而，可以使用任何其它载体，只要其可以在宿主中复制和存活即可。
可以通过各种方法将适当的DNA技术插入载体中。一般地，通过本领域已知的程序将DNA序列插入适当的限制性内切酶位点。这些程序和其它程序被认为属于本领域技术人员的范围。
将表达载体中的DNA序列操作地与适当的表达控制序列连接以指到mRNA表达。作为这些启动子的代表性例子，可以提及的有LTR或SV40的启动子、大肠杆菌(E.coli)的lac或trp、λ噬菌体PL启动子和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。表达载体还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。该载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。
此外，表达载体还优选含有一个或多个选择标记基因以提供用于筛选转化宿主细胞的表型性状，对于真核细胞培养物例如二氢叶酸还原酶或新霉素抗性、或大肠杆菌中例如四环素或氨苄青霉素抗性。
作为适当宿主的代表性例子，可以提及的是细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。从本文的教导，适当宿主的选择被认为属于本领域技术人员的范围。
更具体地，本发明还包括包含一种或多种以上广泛描述的序列的重组结构。该结构包括载体、例如质粒或病毒载体，而本发明序列以正向或反向被插入其中。在该实施方案的一个优选方面，该结构还包含与该序列可操作地连接的调节序列(包括例如启动子)。大量适当的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并是商业可获得的。举例提供以下载体。细菌pQE70、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH146A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它质粒或载体，只要它们可以在宿主中复制和存活即可。
可以使用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有选择标记的其它载体从任何期望的基因中选择启动子区。特定命名的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40早期和晚期启动子、来自逆转录病毒的LTR、和鼠金属硫蛋白-I启动子。对适当载体和启动子的选择正属于本领域普通技术人员的水平。
在再一实施方案中，本发明涉及含有上述结构的宿主细胞。该宿主细胞可以是高等真核细胞例如哺乳动物细胞，或低等真核细胞如酵母细胞，或该宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。可以通过磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导的转染、或电穿孔将该结构引入宿主细胞中(Davis，L.等，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。
可以以常规方式使用宿主细胞中的该结构通过重组序列产生基因产生。或者，可以通过常规肽合成仪合成产生本发明多肽。
成熟多肽可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在适当的启动子控制下表达。还可以使用无细胞翻译系统和来源于本发明DNA结构的RNA制备该多肽。与原核和真核宿主一起使用的适当克隆和表达载体描述在Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor，(1989)，其公开文本特此并入作为参考。
通过将增强子序列插入载体中可以使编码本发明多肽的DNA在高等真核生物中的转录增加。增强子是DNA的顺式作用元件，通常为约10至300bp，作用于启动子以增强其转录。实例包括SV40的位于复制起点的晚期侧100至270bp的增强子、巨细胞病毒早期启动子的增强子、多瘤病毒的位于复制起点的晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。
一般地，重组表达载体将包括复制起点和选择标记以允许转化宿主细胞，例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母TRP1基因，以及来源于高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。尤其是，这些启动子可以来源于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白的操纵子。异源结构序列与翻译起始和终止序列，并优选地与能够指导翻译蛋白分泌至周质间隙或细胞外介质的前导序列适当地同相组装。任选地，异源序列可以编码包括赋予期望特征(如稳定化或简化表达重组产物的纯化)的N端标志肽的融合蛋白。
细菌用途的有用表达载体可以通过以可操作的阅读相插入编码期望蛋白的结构DNA序列和适宜的翻译起始和终止信号以及功能启动子来构建。载体将包含一个或多个表型选择标记和复制起点以确保载体的维持和如果期望的话提供在宿主中的扩增。用于转化的适当原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏(Salmonellatyphimurium)、和假单孢菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyes)、和葡萄球菌属(Staphylococcus)的多个种，但也可以使用其它的作为选择的材料。
作为代表性但非限制性例子，细菌用途的有用表达载体可以包含选择标记、细菌复制起点，它们可来源于包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件的商业质粒。这些商业载体包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。将这些pBR322“主链”部分与适当的启动子和待表达的结构序列组合起来。
在转化适当宿主菌株和培养该宿主菌株达到适当细胞密度之后，通过适当的方式(例如温度变迁或化学诱导)诱导所选启动子并对细胞作再一段时间的培养。
典型地通过离心收获细胞、通过物理或化学手段将其破碎、并将所获粗提取物保留用于进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞可以通过任何常规方法，包括冻融循环、超声、机械破碎、或使用细胞裂解剂进行破碎，这些方法是本领域技术人员熟知的。
还可以使用多种哺乳动物细胞培养物系统表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞COS-7系(描述于Gluzman，Cell23175(1981))和能够表达相容载体的其它细胞系如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、适当的启动子和增强子、以及任何必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列、和5’侧翼非翻译序列。来源于SV40拼接位点和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非转录遗传元件。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以通过如下方法从重组细胞培养物中回收和纯化，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。在必要时，可以使用蛋白质重新折叠步骤来完成成熟蛋白的构象。最后，可以使用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。
本发明多肽可以是天然纯化的产物、或化学合成程序的产物、或通过重组技术从原核或真核宿主(例如由培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。依据用于重组制备方法的宿主，可以糖基化或可以不糖基化本发明多肽。本发明多肽还可以包括起始甲硫氨酸残基。
本发明多核苷酸和多肽可以用作研究试剂和材料来发现治疗和诊断人类疾病的方法。
可以将本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)用于筛选激活(激动剂)或抑制(拮抗剂)本发明受体多肽活化的化合物的方法。
一般地，这些筛选方法包括提供在其表面上表达本发明受体多肽的适当细胞。这些细胞包括来自哺乳动物、酵母、果蝇或大肠杆菌的细胞。具体地，编码本发明受体的多核苷酸可以用于转染细胞以籍此表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)。然后将表达的受体和测试化合物接触以观察结合、功能性反应的刺激或抑制。
一个这样的筛选方法包括使用经转染表达本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)的黑素细胞。该筛选技术描述在1992年2月6日公开的PCT WO92/01810中。
因此，例如该分析方法可以通过将编码受体的黑素细胞与受体配体和待筛选的化合物接触，用于筛选抑制本发明受体多肽激活的化合物。配体产生信号的抑制说明化合物是潜在的受体拮抗剂，即抑制受体的活化。
该筛选可以通过将此细胞与待筛选的化合物接触和确定是否该化合物产生了信号，即激活了受体，用于确定激活受体的化合物。
其它筛选技术包括在测量由受体激活引起的细胞外pH改变的系统中(例如描述在Science 246181-296(1989年10月))，使用表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞(例如，转染的CHO细胞)。例如，可以将化合物与表达本发明受体多肽的细胞接触，然后可以测定第二信使应答例如信号转导或pH改变，以确定该潜在的化合物是激活还是抑制该受体。
另一此类筛选方法涉及将编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的RNA引入非洲爪蟾属(Xenopus)卵母细胞中以瞬时表达该受体。然后，可以将该受体卵母细胞与受体配体和待筛选的化合物接触，之后检测钙信号的抑制或激活以筛选被认为抑制受体激活的化合物。
另一筛选技术涉及表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)，其中该受体与磷脂酶C或D连接。作为此类细胞的代表性例子，可以提及的是内皮细胞、平滑肌细胞、胚胎肾细胞等。该筛选可以如上述通过从磷脂酶第二信号检测受体的激活或对受体激活的抑制来实现。
另一方法涉及筛选抑制本发明受体多肽激活的化合物，即拮抗剂，方式是测定标记配体和表面上具有该受体的细胞进行结合所受到的抑制。该方法涉及用编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的DNA转染真核细胞以致该细胞在其表面表达此受体，和将细胞和化合物在存在标记形式的已知配体时进行接触。该配体可以通过例如放射性进行标记。通过例如测量受体的放射性，确定与受体结合的标记配体的量。如果按与受体结合的标记配体的减少所确定的该化合物与受体结合，则标记配体与受体的结合受到抑制。
抗体、或在某些情况下寡肽，可以激活本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)，方式是通过与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合并引起第二信使应答。抗体包括识别一般与抗体的抗原结合部位有关的独特决定簇的抗独特型抗体。潜在的激动剂化合物还包括与此G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体密切相关的蛋白质，例如配体的片段。
抗体，或某些情况下寡肽，可以通过与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合但不能引起第二信使应答从而抑制该G蛋白趋化因子受体(CCR5)的活性来拮抗本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)。抗体包括抗独特型抗体，其识别一般与抗体的抗原结合部位有关的独特决定簇。潜在的拮抗剂化合物还包括与G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体密切相关的蛋白质，例如丧失了生物学功能且在与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合后不引起应答的配体片段。
通过使用反义技术制备的反义结构可以用于通过三股螺旋的形成或反义DNA或RNA控制基因的表达，两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用于设计长度在约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。可以设计与参与转录的基因区域互补的DNA寡核苷酸(三股螺旋；见Lee等，Nucl.Acids Res.63073(1979)；Cooney等，Science 241456(1988)；和Dervan等，Science 2511360(1991))，由此防止G蛋白趋化因子受体(CCR5)的转录和产生。反义RNA寡核苷酸体内与mRNA杂交并阻断mRNA翻译成G蛋白偶联受体(反义-Okano，J.Neurochem.56560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。还可以将上述寡核苷酸递送至细胞以致反义RNA或DNA可以体内表达以抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)的产生。
使得此G蛋白趋化因子受体(CCR5)难于接近配体以致抑制了受体正常的生物学活性的与该受体(CCR5)结合的小分子，例如小肽或肽样分子，也可以用于抑制本发明受体多肽的激活。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)的可溶性形式，例如受体的片段，可以通过结合与本发明多肽结合的配体来防止该配体与膜结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)相互作用而用于抑制受体的激活。
结合并激活本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)的化合物可以用于刺激造血、伤口愈合、凝血、血管发生，治疗实体瘤、慢性感染、白血病、T细胞介导的自身免疫病、寄生虫感染、银屑癣，以及刺激生长因子活性。
结合并抑制本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)的化合物可以用于治疗过敏、动脉粥样化形成、过敏性反应、癌、慢性和急性炎症、组胺和IgE介导的过敏反应、与前列腺素无关的发烧、骨髓衰竭、硅肺病、肉样瘤病、类风湿性关节炎、休克和嗜酸性粒细胞过多症。
这些化合物可以和适当的药物载体组合使用。该组合物包含治疗有效量的化合物和可药用载体或赋形剂。该载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡聚糖、水、甘油、乙醇、和它们的组合。制剂应适合给药的模式。
本发明还提供药包或试剂盒，其包含装有本发明药物组合物的一或多个成分的一个或多个容器。与这些容器一起可以附调节药物或生物产品制造、使用或销售的政府机构签发形式的通知，该通知表明该机构已批准进行制造、使用或销售用于人类给药。此外，本发明化合物还可以与其它治疗性化合物一起使用。
药物组合物可以以常规方式给药，例如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或真皮内途径给药。该药物组合物以对于治疗和/或预防特定适应症有效的量给药。一般地，药物组合物的施用量是至少约10μg/kg体重，在大多数情况下给药量为不超过每天约8mg/kg体重。在大多数情况下，考虑给药途径、症状等，每日剂量从约10μg/kg至约1mg/kg体重。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽和属于多肽的拮抗剂或激动剂还可以根据本发明通过体内表达进行使用，这常常被称作“基因治疗”。
因此，例如可以用编码多肽的多核苷酸离体改造来自患者的细胞，然后向待用该多肽治疗的患者提供这些经改造的细胞。该方法是本领域所熟知的。例如，可以通过本领域已知方法通过利用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒改造细胞。
类似地，可以通过例如本领域已知方法体内改造细胞以便体内表达多肽。正如本领域已知的，可以将用于产生含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞施用给患者，以便体内改造细胞并体内表达该多肽。从本发明的教导，通过此类方法施用本发明多肽的这些和其它方法对于本领域技术人员应是明显的。例如，用于改造细胞的表达载体(Vehicle)可以不是逆转录病毒，而是例如可以在和适当的递送载体组合后用于体内改造细胞的腺病毒。
可以从中衍生出上述逆转录质粒载体的逆转录病毒包括，但不限于莫洛尼鼠类白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒、和哺乳动物肿瘤病毒。在一个实施方案中，逆转录病毒质粒载体来源于莫洛尼鼠类白血病病毒。
载体包括一个或多个启动子。可以使用的适当启动子包括，但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子(描述在Miller等，Biotechniques 7980-990(1989))、或任何其它启动子(例如细胞启动子如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、聚合酶III和β-肌动蛋白启动子)。可以使用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。从本文包含的教导，适当启动子的选择对于本领域技术人员是明显的。
将编码本发明多肽的核酸序列置于适当的启动子控制下。可以使用的适当启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR(包括上述修饰的逆转录病毒LTR)；β肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。该启动子还可以是控制编码该多肽的基因的天然启动子。
使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产细胞系。可以转染的包装细胞系的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψ CRIP、GP+E-86、GP+envAM12、和DAN细胞系，描述在Miller，Human Gene Therapy 15-14(1990)，该文献完整地并入本文作为参考。可以通过任何本领域已知手段用载体转导包装细胞系。这些手段包括，但不限于电穿孔、使用脂质体、和CaPO4沉淀。在一个可选择方案中，可以将逆转录病毒质粒载体包在脂质体中、或与脂偶联，然后给宿主施用。
生产细胞系产生包括编码该多肽的核酸序列的感染性逆转录病毒颗粒。然后可以使用这些逆转录病毒颗粒体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码该多肽的核酸序列。可以接受转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞、和支气管上皮细胞。
本发明还提供确定未知能够与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的配体是否能够与该受体结合的方法，包括将表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)的哺乳动物细胞与该配体在允许配体与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的条件下接触，检测是否存在与该受体结合的配体并由此确定该配体是否与此G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合。上述用于确定激动剂和/或拮抗剂的系统也可以用于确定与受体结合的配体。
本发明还提供通过检测编码受体的mRNA的存在检测细胞表面是否表达本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的方法，其包括从细胞中获得总mRNA、和将由此获得的mRNA与包含如下具有至少10个核苷酸的核酸分子的核酸探针接触，其中所述核酸分子能够特异地与包括在编码该受体的核酸分子序列中的序列在杂交条件下杂交，以及由此鉴定细胞是否表达该受体。
本发明还提供鉴定与本发明受体多肽相关的受体的方法。这些相关受体可以通过如下方式鉴定与本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的同源性、低严紧性交叉杂交、或鉴定在遗传或药物阻断本发明趋化因子受体多肽后与相关的天然或合成配体相互作用和/或引起相似行为的受体。
可以使用基因的片段作为cDNA文库的杂交探针以分离与本发明基因有高度序列相似性的其它基因、或具有相似生物学活性的其它基因。此类探针有至少20个碱基、优选至少30个碱基和最优选至少50个碱基或更多。该探针还可以用于鉴定相应于全长转录本的cDNA克隆以及含有本发明完整基因(包括调节区和启动子区、外显子和内含子)的基因组克隆或克隆。此类筛选的例子包括通过使用已知DNA序列合成寡核苷酸探针来分离该基因的编码区。具有与本发明基因的序列互补的序列的标记寡核苷酸可以用于筛选人类cDNA、基因组DNA或mRNA文库以确定探针所杂交的文库成员。
本发明还考虑本发明基因作为例如某些由遗传性缺陷基因导致的疾病的诊断剂的用途。可以通过比较缺陷性基因的序列与正常基因的序列比较来检测这些基因。随后，可以验证“突变”基因与异常受体活性有关。此外，还可以将突变的受体基因插入适当的载体中以便在功能性分析系统(例如比色法、在麦氏琼脂平板上表达、互补实验、在HEK293受体缺陷细胞株中)中表达，从而作为另一手段验证或鉴定突变。一旦鉴定到“突变”基因后，然后可以对群体进行筛选寻找“突变”受体基因的载体。
在本发明基因中带有突变的个体可以通过各种技术在DNA水平上进行检测。用于诊断的核酸可以从患者细胞中获得，包括但不限于血液、尿、唾液、活检组织、和尸检材料。基因组DNA可以直接地用于检测或可以在分析前通过使用PCR以酶促方式扩增(Saiki等，Nature，324163-166(1986))。还可以将RNA或cDNA用于相同目的。例如，与本发明核酸互补的PCR引物可以用于鉴定和分析本发明基因中的突变。例如，可以通过扩增产物与正常基因型相比大小的改变，检测缺失和插入。可以通过使扩增DNA与本发明放射标记的RNA或者是与本发明放射标记的反义DNA序列杂交来鉴定点突变。可以通过RNase A消化或通过熔解温度的差异从错配双链中区分出完全匹配的序列。此诊断对于产前或甚至新生儿测试尤其有用。
参考序列和“突变体”之间的序列差异可以通过直接的DNA测序方法揭示。此外，克隆的DNA区段还可以用作探针以检测特定的DNA区段。当与PCR组合时，该方法的灵敏性得到极大地增强。例如，与通过修饰的PCR产生的双链PCR产物或单链模板分子一起使用测序引物。通过常规方法使用放射标记的核苷酸或通过自动测序程序使用荧光标签进行序列确定。
基于DNA序列差异的遗传测试可以通过在有或没有变性剂的凝胶中检测DNA片段的电泳迁移率改变来实现。还可以通过核酸保护测定，如RNase和S1保护或化学切割方法(例如Cotton等，PNAS，USA854397-4401(1985))揭示在特定位置处序列的改变。
此外，由于基因表达改变导致的或以之为特征的一些疾病可以通过mRNA的改变来检测。或者，本发明基因可以用作参考以鉴定表现出此类受体的相关功能降低的个体。
本发明还涉及鉴定本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可溶性形式在多种组织中的改变水平的诊断方法。用于检测来源于宿主的样品中该可溶性受体多肽的水平的方法是本领域技术人员熟知的，并包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析和优选地ELISA测定。
ELISA测定包括首先制备特异针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽抗原的抗体，优选地单克隆抗体。此外，还制备抗该单克隆抗体的报道抗体。将报道抗体与可检测试剂结合，例如与放射活性、荧光试剂或在本实施例中与辣根过氧化物酶结合。此时从宿主中取出样品，并在可结合样品中蛋白质的固体载体上例如聚苯乙烯盘上孵育。然后通过与非特异性蛋白如牛血清白蛋白孵育覆盖该盘上所有未与蛋白质结合的部位。接着，在使单克隆能与附着在该聚苯乙烯盘上的任何G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白质结合的时间段内，在该盘中孵育单克隆抗体。用缓冲液洗掉所有的未结合单克隆抗体。现将与辣根过氧化物酶连接的报道抗体放入盘中，导致报道抗体和任何与G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白结合的单克隆抗体结合。然后向盘中加入过氧化物酶底物，在指定时间内产生的颜色量在与标准曲线比较后产生存在于指定体积的患者样品中的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白量的测量值。
本发明序列对于染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向人类个体染色体上的特定位置并能够与之杂交。而且，目前需要鉴定染色体上的特定位点。现今几乎没有基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标志试剂可以用于标记染色体位置。根据本发明进行DNA的染色体作图是将这些序列与疾病有关基因联系起来的重要的第一步。
简而言之，可以通过从克隆制备PCR引物(优选15至25bp)进行序列的染色体作图。可以使用计算机分析保藏克隆的DNA以快速地筛选在基因组DNA中不跨越一个以上外显子的引物，由此使扩增过程简化。然后将这些引物用于PCR筛选含有人类个体染色体的体细胞杂种。仅有那些含有相应于引物的人类基因的杂种可以产生扩增片段。
体细胞杂种的PCR作图是一种将特定DNA定位在特定染色体上的快速方法。使用本发明以及相同的寡核苷酸引物，按类似方式可以用来自特定染色体或大基因组克隆库的片段组实现亚定位。类似可以用于染色体作图的其它作图策略包括原位杂交、用标记的流式分选染色体预筛选和通过与构建的染色体特异性DNA文库杂交进行预筛选。
DNA克隆与中期相染色体分散物的荧光原位杂交(FISH)可以用于一步提供精确的染色体位置。该技术可以与短至50或60个碱基的DNA一起使用。对于该技术的综述，见Verma等，人类染色体基础技术手册(Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques)，Pergamon Press，纽约(1988)。一旦将序列作了精确染色体定位后，可以使序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据联系起来。该数据见例如V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可以通过Johns Hopkins UniversityWelch Medical Library在线获得)。然后，通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)鉴定基因和已经作图定位在相同染色体区域的疾病之间的关系。
接着，必需确定患者或非患者之间在cDNA或基因组序列中的差异。如果在一些或所有的患病个体中均观察到突变，但在任何正常的个体中均未观察到突变，则该突变可能是疾病的起因。
就物理作图和遗传作图技术的目前分辨率，精确定位在与疾病相关的染色体区的cDNA可能是50至500个潜在的致病性基因中的一个。(假设条件是1百万个碱基的图谱分辨率和每20kb一个基因)。
多肽、其片段或其它衍生物、或它们的类似物、或表达它们的细胞可以用作免疫原产生针对它们的抗体。这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合、单链和人源化抗体，以及Fab片段、或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法可以用于制备该抗体和片段。
制备的抗相应于本发明序列的多肽的抗体可以通过将该多肽直接注射至动物体内、或通过将该多肽施用给动物，优选非人类来获得。然后由此获得的抗体将与该多肽本身结合。以此方式，甚至仅编码该多肽片段的序列也可以用于制备与整个天然多肽结合的抗体。然后可以使用这些抗体从表达该多肽的组织中分离该多肽。
为了制备单克隆抗体，可以使用能通过连续的细胞系培养物产生抗体的任何技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，Nature256495-497(1975))、trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunology Today 472(1983))、和制备人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.(1985)，第77-96页)。
可以采用描述用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778)制备针对本发明免疫原多肽产物的单链抗体。而且，可以使用转基因小鼠表达针对本发明免疫原多肽产物的人源化抗体。
本发明进一步参考以下实施例进行描述；然而，应当理解这些实施例并不限制本发明。除非特别指出，否则所有的部分或量均按重量计算。
为了利于下列实施例的理解，我们对某些频繁出现的方法和/或术语进行描述。
“质粒”以前面的小写p和/或之后的大写字母和/或数字命名。本文中起始质粒是商业购买的、在非限制基础上公开获得的、或可以从已有质粒根据公开的方法构建。此外，与所描述的那些质粒等价的质粒是本领域已知的并是普通技术人员明了的。
“DNA”的消化是指用仅作用于DNA的某些序列的限制性酶催化切割DNA。本文所用各种限制性酶是商购的，它们的反应条件、辅因子和其它必要条件的使用是本领域普通技术人员已知的。对于分析目的，典型地，在约20μl缓冲溶液中使用1μg质粒或DNA片段和约2单位酶。对于分离DNA片段构建质粒的目的，典型地在较大体积中使用20至250单位的酶消化5至50μg DNA。特定限制性酶的适当缓冲液和底物量由厂家规定。普通使用37℃孵育约1小时，但可以根据供应商的说明书进行改变。在消化后，直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳反应物以分离期望的片段。
使用8％聚丙烯酰胺凝胶按Goeddel，D.等，Nucleic Acids Res.84057(1980)的所述方法进行切割片段的大小分离。
“寡核苷酸”是指单链多脱氧核苷酸或两条互补的多脱氧核苷酸链，其可以化学合成。这些合成的寡核苷酸没有5’磷酸，因此在不使用ATP和激酶添加磷酸的情况下其不与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸可以和未脱磷酸化的片段连接。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.等，同上，第146页)。除非特别指出，否则连接可以使用已知缓冲液和条件，以及每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)来完成。
除非特别指出，否则按Graham，F.和Van der Eb，A.，Virology52456-457(1973)中所述进行转化。
在本发明中，“分离的”是指从最初环境(例如如果物质是天然存在的则天然环境)中分离出来的物质，因此是被“人为”改变了其天然状态的物质。例如，分离的多核苷酸可以是载体或组合物的部分，或可以包含在细胞内，但仍是“分离的”，因为载体或组合物、或特定细胞并非该多核苷酸的最初环境。术语“分离的”并不指基因组或cDNA文库、整个细胞的全部或mRNA制品、基因组DNA制品(包括通过电泳分离并转移至印迹上的那些)、经剪切的全部细胞基因组DNA制品或现有技术证实没有本发明多核苷酸/序列的区别性特征的其它组合物。
本发明中，“分泌的”或“可溶性的”G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白是指由于信号序列能够被引导至ER、分泌性小泡、或细胞外空间的蛋白质，以及不一定含有信号序列但被释放至细胞外空间的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白。如果该G蛋白趋化因子受体(CCR5)分泌蛋白被释放至细胞外空间，则该G蛋白趋化因子受体(CCR5)分泌蛋白可以经历细胞外加工产生“成熟”G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白。释放至细胞外空间可以通过许多机制，包括胞吐和蛋白水解来实现。分泌或可溶性G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的例子包括包含本文所述G蛋白趋化因子受体(CCR5)的部分，或者由其组成的片段。优选的分泌或可溶性片段包含胞外环、胞内环、N端胞外域、或C端胞内域、或它们的片段。其它优选的分泌或可溶性片段包含诸如本文所述的G蛋白趋化因子受体(CCR5)的表位。
正如本文所用，G蛋白趋化因子受体(CCR5)“多核苷酸”是指具有包含在SEQ ID NO1中的核酸序列、或包含在ATCC保藏克隆中的G蛋白趋化因子受体DNA的分子。例如，该G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可以含有全长基因组序列的核苷酸序列，包括5’和3’非翻译序列、编码区、有或没有信号序列、分泌蛋白编码区、以及该核酸序列的片段、表位、域和变体。而且，正如本文所用，G蛋白趋化因子受体(CCR5)“多肽”是指具有由广泛定义的多核苷酸产生的翻译的氨基酸序列的分子。
在特定实施方案中，本发明多核苷酸有至少15个、至少30个、至少50个、至少100个、至少125个、至少150个、或至少1000个连续的核苷酸，但长度少于或等于300Kb、200kb、100kb、50kb、15kb、10kb、7.5kb、5kb、2.5kb、2.0kb或1kb。在再一实施方案中，本发明多核苷酸包含本文所公开的编码序列的部分，但不包含任何内含子的全部或部分。在另一实施方案中，包含编码序列的多核苷酸不含有基因组侧翼基因(即基因组中位于目的G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的5’或3’)的编码序列。在其它实施方案中，本发明多核苷酸不含有超过1000、500、250、100、50、25、20、15、10、5、4、3、2、或1个基因组侧翼基因的编码序列。
含有SEQ ID NO1序列的开放式阅读框的代表性克隆于1995年6月1日保藏在美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，并被给予ATCC保藏号97183。ATCC位于10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，USA。ATCC保藏是遵循国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约进行的。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)“多肽”还包括能够在严紧杂交条件下与SEQ ID NO1中所含序列、其互补序列、或保藏克隆中的DNA杂交的那些多核苷酸。“严紧杂交条件”是指在包含50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml变性的剪切鲑精DNA的溶液中42℃孵育过夜，之后在0.1×SSC中约65℃洗涤滤膜。
本发明还考虑在低严紧杂交条件下与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸杂交的核酸分子。杂交和信号检测的严紧性的改变主要通过操作甲酰胺浓度(较低百分数的甲酰胺导致较低的严紧性)；盐浓度、或温度来实现。例如，较低严紧条件包括在包含6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑精封闭DNA的溶液中37℃孵育过夜，随后用1×SSPE、0.1％SDS在50℃洗涤。此外，为了获得甚至更低的严紧性，可以在较高的盐浓度(例如，5×SSC)下在严紧杂交后进行洗涤。
注意上述条件中的变化可以通过包括和/或替代用于抑制杂交实验背景的代替封闭剂来实现。典型的封闭剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性的鲑精DNA、和商业成药制剂。由于兼容性问题，包括特异的封闭试剂可能要求修饰上述杂交条件。
当然，仅与polyA+序列(例如序列表中显示的任何DNA的3’末端polyA+序列)杂交的多核苷酸、或与T(或U)残基的互补链杂交的多核苷酸并不包括在“多核苷酸”的定义中，因为这样的多核苷酸将与含有poly(A)链或其互补链(例如实际地使用oligo dT作为引物产生的任何双链cDNA克隆)的任何核酸分子杂交。
该G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以由单链和双链DNA、属于单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、和属于单链和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂种分子(可以是单链或更典型地双链、或单链和双链区的混合物)组成。此外，该G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以由包含RNA或DNA或RNA及DNA的三股螺旋链区组成。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽还可以为了稳定或其它原因含有一或多个修饰碱基或修饰的DNA或RNA主链。“修饰”碱基包括例如三苯甲基化碱基和非寻常碱基如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶学或代谢方式修饰的形式。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以由通过肽键或修饰的肽键(即肽电子等排物)彼此连接在一起的氨基酸组成，并且可以含有20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以通过天然程序如翻译后加工、或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。这些修饰在基本的教科书和较为详细的专题文章中、以及在大量的研究文献中均有充分的描述。修饰可以发生在G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的任何位置上，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基端。应当理解同样类型的修饰可以以相同或不同程度存在于指定G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽中的几个位点处。而且，指定的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以含有许多类型的修饰。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以是分支的，例如由于遍在蛋白化造成的分支，而且它们可以是环状的，有或没有分支。环状的、分支的和分支环状的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以是翻译后的天然加工的结果，或可以是合成方法造成的。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂或脂衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚的形成、羟化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、pegylation、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、消旋作用、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的向蛋白质添加氨基酸例如精氨酸化、和遍在蛋白化。(见例如蛋白质-结构和分子特征(Proteins-Structure and Molecular Properties)，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，纽约(1993)；蛋白质的翻译后共价修饰(Posttranslational Covalent Modification ofProteins，B.C.Johnson编，Academic Press，纽约，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth Enzymol 182626-646(1990)；Rattan等，Ann NY Acad Sci 66348-62(1992)。)“SEQ ID NO1”指的是G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸序列，而“SEQ ID NO2”指的是G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽序列。
“具有生物学活性的”G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽是指表现出的活性与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽(包括成熟形式)的活性类似但并不必相同的多肽，所述活性按特定生物学测定方法测定，具有或不具有剂量依赖性。当剂量依赖性存在时，其不必与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的相同，但与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽比较应当实质上类似于指定活性中的剂量依赖性(即，相对该G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽，候选多肽将表现出更大的活性或活性降低不超过约25倍、优选不超过约10倍、最优选不超过约3倍。)G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸和多肽从人单核细胞基因组DNA文库中分离克隆HDGNR10。该克隆含有SEQID NO2所定义的完整编码区。该保藏克隆含有具有总共1414个核苷酸的DNA插入片段，其编码具有352氨基酸残基的预测开放式阅读框。(见图1)。该开放式阅读框以位于核苷酸第259位的N端甲硫氨酸起始，并终止于核苷酸第1314位编码氨基酸的最后一个三联密码子。该终止密码子位于第1315-1317位。
随后的表达分析也证明G蛋白趋化因子受体(CCR5)在巨噬细胞(包括未成熟的树突细胞如郎氏细胞)和T细胞(包括Th0和Th1效应细胞)中表达，表达模式符合免疫系统特异性表达。在小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元和中枢神经系统(CNS)的血管内皮细胞中也检测到G蛋白趋化因子受体(CCR5)。G蛋白趋化因子受体(CCR5)还在类风湿关节炎患者滑液的单核细胞和T细胞中表达，并且在其它形式的关节炎中也有所涉及。
G蛋白偶联的趋化因子受体。使用BLAST分析，发现SEQ ID NO2与G蛋白偶联趋化因子受体家族的多个成员同源。具体地，SEQ ID NO2含有与人MCP-1受体(MCP-1R)A MonoMac 6 mRNA翻译产物(GenBank索取号U03882；SEQ ID NO9)同源的域(图2)，包括含有G蛋白偶联受体家族特征性7个跨膜区段的保守跨膜域，其起始于SEQ ID NO2或保藏克隆所编码多肽的第37位氨基酸。G蛋白趋化因子受体(CCR5)还包括DRY基序，已知该基序是信号转导所必需的，并存在于许多G蛋白偶联受体中紧接第三个跨膜区段的位置。由于MCP-1R被认为在免疫系统是重要的，所以MCP-1R和G蛋白趋化因子受体(CCR5)之间的同源性提示G蛋白趋化因子受体(CCR5)也可能参与了该免疫系统。
已分离了另一个MCP-1R序列，其与MCP-1RA序列从5’非翻译区至推测的第7个跨膜域的部分是一致的，但其含有不同的细胞质尾。此再一序列，命名为MCP-1RB，似乎是MCP-1RA的另一种拼接版本。美国专利5,707,815对其有进一步描述。
域(Domains)。使用BLAST分析，发现SEQ ID NO2与G蛋白趋化因子受体(CCR5)家族的多个成员同源。具体地，SEQ ID NO2含有与SEQ IDNO2含有与人MCP-1受体(MCP-1R)A MonoMac 6 mRNA翻译产物(GenBank索取号U03882；SEQ ID NO9)同源的域(图2)，包括以下保守域(a)预测的位于氨基酸约第1至36位的N端胞外域；(b)预测的位于氨基酸约第37至305位的跨膜域；和(c)预测的位于氨基酸约第306至352位的C端胞内域。预测的跨膜域包括位于氨基酸约第37至58位(区段1)、68至88位(区段2)、103至124位(区段3)、142至166位(区段4)、196至223位(区段5)、236至260位(区段6)、和287至305位(区段7)的7个跨膜区段；位于氨基酸约第59至67位(胞内环1)、125至141位(胞内环2)、和224至235位(胞内环3)的三个胞内环；和位于氨基酸约第89至102位(胞外环1)、167至195位(胞外环2)、和261至274位(胞外环3)的三个胞外环。特别地，本发明考虑以上定义的或保藏克隆编码(SEQ ID NO22)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)的这些多肽片段，本发明还考虑此处所公开的这些和其它区的组合。还考虑不包括这些域、区段和环中的一个或多个的多肽。“环(loop)”在本文和本领域中也称作“区”、“域”和“部分(portions)”，例如胞外“区”、胞内“区”、胞外“域”、和胞内“域”、胞外“部分”和胞内“部分”。
SEQ ID NO1和翻译的SEQ ID NO2足够准确并且另外还适合于本领域熟知的和以下进一步描述的多种用途。例如，SEQ ID NO1对于设计将检测SEQ ID NO1所含核酸序列或保藏克隆所含DNA的核酸杂交探针是有用的。这些探针也与生物样品中的核酸分子杂交，由此产生了本发明的多种法医和诊断方法。类似地，SEQ ID NO2确定的多肽可以用于例如制备特异与G蛋白趋化因子受体蛋白质结合的抗体。
然而，通过测序反应产生的DNA序列可能含有测序错误。这些错误在产生的DNA序列中作为错误鉴定的核苷酸、或作为插入或缺失的核苷酸存在。这些错误插入或缺失的核苷酸造成预测的氨基酸序列的阅读框发生移框。在这些情况下，即使产生的DNA序列可以与实际DNA序列有大于99.9％的一致性(例如，在超过1000个碱基的开放式阅读框中的一个碱基的插入或缺失)，该预测的氨基酸序列与实际的氨基酸仍是不同的。
因此，对于要求精确核苷酸序列或氨基酸序列的那些应用，本发明不仅提供产生的由SEQ ID NO1定义的核苷酸序列和预测的由SEQ IDNO2定义的翻译氨基酸序列，还提供在ATCC保藏的含有人G蛋白趋化因子受体(CCR5)DNA的质粒DNA样品。保藏的G蛋白趋化因子受体(CCR5)克隆的核苷酸序列可以容易地通过使用已知方法测定保藏克隆的序列来确定。然后可以从这些保藏物验证推测的G蛋白趋化因子受体(CCR5)氨基酸序列。而且，还可以通过肽测序，或通过在含有该保藏的人G蛋白趋化因子受体(CCR5)DNA的适当宿主细胞中表达该蛋白质、收集该蛋白质并测定其序列，直接确定保藏克隆编码的蛋白质的氨基酸序列。含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)开放式阅读框的保藏克隆的样品从ATCC获得，并经过了再次测序。来自重新测序的克隆的序列数据显示在SEQ ID NO21和22。Seq ID NO21与SEQ ID NO1在5个位置上(SEQ ID NO1的核苷酸第320、433、442、646和1289位)不同，SEQ ID NO22与SEQ ID NO2在5个位置上(氨基酸残基第21、59、62、130和344位)不同。
本发明还涉及相应于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或保藏克隆的G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因。该G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因可以根据已知方法使用本文所公开的序列信息来分离。这些方法包括从公开的序列制备探针或引物、和从适当来源的基因组物质中鉴定或扩增该G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因。
本发明还提供等位基因变体、直向同源基因、和/或种同系物。可以使用本领域已知方法，借助来自本文公开序列或ATCC保藏克隆的信息，获得相应于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或保藏克隆的基因的全长基因、等位基因变体、拼接变体、全长编码部分、直向同源基因和/或种同系物。例如，可以通过从本文提供的序列制备适当的探针或引物并从适当核酸来源中筛选出等位基因变体和/或期望的同系物，从而分离和鉴定到等位基因变体和/或种同系物。
可以按任何适当方式制备G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽。这些多肽包括分离的天然多肽、重组制备的多肽、合成产生的多肽、或通过这些方法的组合产生的多肽。制备这些多肽的手段是本领域熟知的。
该G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以是分泌蛋白形式，包括成熟形式，或可以是较大蛋白质例如融合蛋白的部分(见下)。通常有利的是将含有分泌或前导序列、前序列(pro-sequence)、有助纯化的序列如多个组氨酸残基、或在重组制备过程中起稳定作用的额外序列的额外氨基酸序列包括在内。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽优选以分离的形式提供、并优选是基本上纯化的。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的重组制备版本(包括分泌多肽)可以使用本文描述的技术、或本领域已知的其它技术例如Smith和Johnson，Gene 6731-40(1988)描述的一步法进行基本的纯化。还可以从天然、合成或重组来源中使用本文公开的技术、或本领域已知的其它技术如针对该G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白产生的本发明抗体，纯化该G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽。
本发明提供包含SEQ ID NO1的核酸序列和/或ATCC保藏号97183中所含克隆的多核苷酸、或者是由其组成的多核苷酸。本发明还提供包含SEQ ID NO2的多肽序列和/或ATCC保藏号97183中所含克隆编码的多肽的多肽、或者是由其组成的多肽。本发明还包括编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO2的多肽序列和/或ATCC保藏号97183中所含克隆编码的多肽序列、或者是由其组成。信号序列正如本文所述，本发明还包括信号序列与SEQ ID NO2的多肽、和其片段、和/或保藏克隆编码的多肽、和其片段形成的融合物，以指导该多肽或片段分泌。编码该融合物的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明还包括具有SEQ ID NO2的序列和其片段、和/或保藏克隆编码的多肽序列和其片段的多肽的成熟形式。编码该成熟形式的多核苷酸(例如SEQ ID NO1的多核苷酸序列、和其片段、和/或保藏克隆所含多核苷酸序列、和其片段)也包括在本发明内。
根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号或分泌前导序列，一旦成长的蛋白链跨越粗面内质网向外运输开始后，该序列将自成熟蛋白质上被切割下来。大多数哺乳动物细胞以及甚至昆虫细胞都以相同的特异性切割分泌蛋白。然而，在某些情况下，分泌蛋白的切割并不完全一致，这导致产生该蛋白质的两种或更多种的成熟形式。而且，很久就已知分泌蛋白的切割特异性最终是由完整蛋白质的一级结构决定的，即它是该多肽的氨基酸序列所固有的。
预测蛋白质是否具有信号序列、以及该序列的切割点的方法是现成的。例如，McGeoch，virus Res.3271-286(1985)的方法使用了来自完整(未切割的)蛋白的短N端带电荷区和随后的不带电荷区的信息。vonHeinje，Nucleic Acids Res.144683-4690(1986)的方法使用了来自切割位点周围的残基，典型地-13至+2的残基的信息，其中+1表示分泌蛋白的氨基端。对于所有这些方法，预测已知哺乳动物分泌蛋白的切割位点的准确性在75-80％的范围内。(von Heinje，同上)。然而，这两种方法对于给定的蛋白质并不总是产生相同的预测切割位点。
可以通过称作SignalP的计算机程序(Henrik Nielsen等，ProteinEngineering 101-6(1997))分析分泌多肽的推导氨基酸序列，该程序可基于该氨基酸序列预测蛋白质的细胞定位。McGeoch和von Heinje的方法被引入作为该计算机定位预测的一部分。
然而，正如本领域普通技术人员理解的，有时切割位点在不同生物之间是不同的，并不能以绝对的肯定性作预测。融合蛋白中异源信号序列的切割可以在该多肽序列的连接处发生，或者可以在连接点的任一侧发生切割。因此，本发明提供具有在该预测的切割位点5个残基内(即+或-5残基)起始的N端的具有SEQ ID NO2序列的分泌多肽、和其片段。类似地，还应意识到，在某些情况下，信号序列从分泌蛋白上的切割并不完全一致，这就导致一种以上的分泌类型。本发明考虑到这些多肽和片段、以及编码这些多肽和片段的多核苷酸。
而且，通过上述分析鉴定的信号序列可以不一定预示着天然信号序列。例如，天然信号序列可以位于该预测的信号序列的更上游。然而，可能的情况是该预测的信号序列将能够指导分泌蛋白向ER运输。然而，本发明提供通过SEQ ID NO1的多核苷酸序列或其片段和/或保藏克隆所含多核苷酸序列或其片段在哺乳动物细胞(例如COS细胞，见下述)中表达产生的成熟蛋白质或片段。这些多肽、和编码这些多肽的多核苷酸是本发明所考虑的。多核苷酸和多肽变体本发明涉及SEQ ID NO1中所公开的多核苷酸序列、其互补链和/或保藏克隆所含序列的变体。
本发明还包括SEQ ID NO2中所公开多肽序列和/或保藏克隆所编码多肽序列的变体。
“变体”是指不同于G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸或多肽，但仍保留了其基本特征的多核苷酸或多肽。一般地，变体大体极为类似于并在许多区域同于该G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸或多肽。
本发明还涉及包含如下核苷酸序列、或由其组成的核酸分子，所述核苷酸序列与例如SEQ ID NO1中核苷酸编码序列或其互补链、保藏克隆所含核苷酸编码序列或其互补链、编码SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列、编码HDGNR10保藏克隆所编码多肽的核苷酸序列、和/或这些核酸分子之任一个的多核苷酸片段(例如，此处所描述的那些)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。与这些核酸分子在严紧杂交条件或较低严紧性的杂交条件下杂交的多核苷酸也包括在本发明内，同样这些多核苷酸编码的多肽也包括在本发明内。
本发明还涉及包含如下氨基酸序列或由其组成的多肽，所述氨基酸序列与例如SEQ ID NO2所示多肽序列、保藏克隆所编码的多肽序列、和/或这些多肽之任一个的多肽片段(例如本文所述的那些片段)有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的一致性。
所谓具有与本发明的参考核苷酸序列有至少如95％“一致性”的核苷酸序列的核酸，旨在指该核酸的核苷酸序列可能相对于编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的参考核苷酸序列每100个核苷酸包括不超过5个点突变外，该核苷酸序列与参考序列一致。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列有至少95％“一致性”的核苷酸序列的核酸，可以对参考序列中不超过5％的核苷酸进行缺失、或用另一核苷酸进行替代，或可以将不超过参考序列总核苷酸5％数量的核苷酸插入该参考序列中。查询的序列可以是SEQ ID NO1所示完整序列、保藏克隆中HDGNR10 DNA的ORF(开放式阅读框)、或按本文所述规定的任何片段。
实际上，可以使用已知计算机程序常规地确定任意一个具体核酸分子或多肽是否与本发明核苷酸序列或多肽有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。确定查询序列(本发明序列)与对象序列之间的最佳整体匹配的优选方法，又称作整体序列比对(globalsequence alignment)，可以使用基于Brutlag等(Comp.App.Biosci.(1990)6237-245)的算法的FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询序列和对象序列均是DNA序列。可以通过将U转化成T进行RNA序列的比较。所述整体序列比对的结果表示为一致性百分数。用于DNA序列的FASTDB比对以计算一致性百分数的优选参数是矩阵＝Unitary、k-tuple＝4、错配罚分＝1、连接罚分(joining penalty)＝30、随机化组长＝0、截断值＝1、缺口罚分(Gap penalty)＝5、缺口大小罚分＝0.05、窗大小＝500或对象核苷酸序列的长度(较短的那一个)。
如果由于5’或3’缺失而非由于内部缺失造成对象序列比查询序列短，则必须对结果进行手工校正。这是因为FASTDB程序在计算一致性百分数时并不处理对象序列的5’和3’截短。对于与查询序列相比在5’或3’末端截短的对象序列，可以通过计算位于对象序列5’和3’的查询序列碱基数(属于不匹配/未对齐的)占查询序列总碱基的百分数，校正该一致性百分数。核苷酸是否是匹配/对齐的可以通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后从使用规定的参数以上述FASTDB程序计算的一致性百分数中减去此百分数，得到最后的一致性百分数值。为了本发明的目的使用的即是此经校正的值。仅FASTDB比对所显示的对象序列5’和3’碱基之外的碱基(属于与查询序列不匹配/未对齐的)才为了手工校正该一致性百分数值而计算。
例如，比对一个90个碱基的对象序列和一个100个碱基的查询序列以确定一致性百分数。缺失发生在该对象序列的5’末端，由此FASTDB比对不显示5’末端头10个碱基的匹配/对齐。这10个未配对的碱基代表了10％的该序列(未匹配的5’和3’末端碱基数/查询序列中总的碱基数)，因此从FASTDB程序计算的一致性百分数值中减去10％。如果剩余的90％碱基完全匹配，则最终的一致性百分数将是90％。再如，将一个90个碱基的对象序列和一个100个碱基的查询序列进行比较。这次缺失是内部缺失，因此在对象序列的5’或3’没有与查询序列不匹配/对齐的碱基。在此情况下，通过FASTDB计算的一致性百分数不需进行手工校正。再重申一次，仅与查询序列不匹配/对齐的对象序列5’和3’碱基才进行手工校正。根据本发明没有进行其它的手工校正。
所谓具有与本发明查询氨基酸序列至少例如95％“一致”的氨基酸序列的多肽，旨在指除了该对象多肽序列可能相对于该查询氨基酸序列每100个氨基酸包括不超过5个氨基酸改变外，该对象序列与查询序列一致。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列有至少95％“一致性”的氨基酸序列的多肽，可以在对象序列中插入、缺失、(indels)或用另一氨基酸替代不超过5％的氨基酸残基。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基端位置或这两个末端位置之间的任何位置，可以各自地分散在参考序列的残基中或以一或多个连续组的形式分散在参考序列中。
实际上，可以使用已知计算机程序常规地确定任意一个具体多肽是否与SEQ ID NO2的氨基酸序列或与保藏克隆编码的氨基酸序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。确定查询序列(本发明序列)与对象序列之间的最佳整体匹配的优选方法，又称作整体序列比对(global sequence alignment)，可以使用基于Brutlag等(Comp.App.Biosci.(1990)6237-245)的算法的FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询序列和对象序列均是核苷酸序列或均是氨基酸序列。所述整体序列比对的结果表示为一致性百分数。用于FASTDB氨基酸比对的优选参数是矩阵＝PAM 0、k-tuple＝2、错配罚分＝1、连接罚分(joining penalty)＝20、随机化组长＝0、截断值＝1、窗大小＝序列长度、缺口罚分(Gap penalty)＝5、缺口大小罚分＝0.05、窗大小＝500或对象氨基酸序列的长度(较短的那一个)。
如果由于N或C端缺失而非由于内部缺失造成对象序列比查询序列短，则必须对结果进行手工校正。这是因为FASTDB程序在计算整体一致性百分数时并不处理对象序列的N和C端截短。对于与查询序列相比在N或C端截短的对象序列，可以通过计算位于对象序列N和C端的查询序列残基数(与相应的对象残基不匹配/未对齐的)占查询序列总碱基的百分数，校正该一致性百分数。残基是否是匹配/对齐的可以通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后从使用规定的参数以上述FASTDB程序计算的一致性百分数中减去此百分数，得到最后的一致性百分数值。为了本发明的目的使用的即是此最后的一致性百分数值。仅与查询序列不匹配/未对齐的位于对象序列N和C端的残基才为了手工校正该一致性百分数值的目的而被考虑在内。即，仅查询残基位于对象序列N和C最远端残基之外时。
例如，比对一个90个氨基酸残基的对象序列和一个100个残基的查询序列以确定一致性百分数。缺失发生在该对象序列的N端，由此FASTDB比对不显示此N端头10个残基的匹配/对齐。这10个未配对的残基代表了10％的该序列(未匹配的N和C端碱基数/查询序列中总的残基数)，因此从FASTDB程序计算的一致性百分数值中减去10％。如果剩余的90个残基完全匹配，则最终的一致性百分数将是90％。再如，将一个90个残基的对象序列和一个100个残基的查询序列进行比较。这次缺失是内部缺失，因此在对象序列的N或C端没有与查询序列不匹配/对齐的残基。在此情况下，通过FASTDB计算的一致性百分数不需进行手工校正。再重申一次，仅FASTDB比对中显示的与查询序列不匹配/对齐的位于对象序列N和C端之外的残基位置才进行手工校正。根据本发明没有进行其它的手工校正。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)变体可以在编码区、非编码区、或两者中含有改变。尤其优选的是含有可造成沉默替代、添加或缺失但不改变编码多肽的性质或活性的改变的多核苷酸变体。优选由于遗传密码的简并性由沉默替代造成的核苷酸变体。而且，其中以任何组合替代、缺失或添加了5-10、1-5或1-2个氨基酸的变体也是优选的。可以为了多种原因，例如为了优化特定宿主中密码子的表达(将人mRNA的密码子改变为细菌宿主如大肠杆菌优选的密码子)，制备G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸变体。
天然存在的G蛋白趋化因子受体(CCR5)变体称作“等位基因变体”，是指占据生物染色体上指定位置的一个基因的几种替代形式中的一种。(Genes II，Lewin，B.编，John Wiley & Sons，纽约(1985))。这些等位基因变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上不同，并且包括在本发明内。或者，可以通过诱变技术或通过直接合成制备非天然变体。
使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可以制备变体以提高或改变G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的特征。例如，可以从该分泌蛋白的N端或C端缺失一或多个氨基酸但基本上不丧失生物功能。Ron等，J.Biol.Chem.2682984-1988(1993)的作者报道了甚至在缺失氨基酸端的3、8或27个氨基酸残基后仍具有肝素结合活性的KFG蛋白质变体。类似地，在从该蛋白质的羧基端缺失8-10个氨基酸残基后γ干扰素的活性表现出10倍增加。(Dobeli等，J.Biotechnology 7199-216(1988))。
而且，大量证据证明变体常保留了与该天然蛋白的活性类似的生物学活性。例如，Gayle和同事(J.Biol.Chem 26822105-22111(1993))对人细胞因子IL-1α进行大量的突变分析。它们使用随机诱变产生3,500多个不同的IL-1α突变，按该分子的整个长度计算每个变体平均有2.5个氨基酸改变。在每个可能的氨基酸位置处检测多种突变。研究者发现“[该分子大部分可以发生改变而几乎不影响结合或生物学活性]”。(见，摘要)。实际上，检测的3,500多个核苷酸序列中仅23个独特的氨基酸序列产生活性显著不同于野生型的蛋白质。
而且，即使从多肽的N端或C端缺失一个或多个氨基酸导致一种或多种生物学功能的修饰或丧失，也仍可以保留其它的生物学活性。例如，当从N端或C端除去该分泌形式的不足大多数的残基后，缺失变体诱导和/或结合识别该分泌形式的抗体的能力将可能得以保留。缺少蛋白质N或C端残基的特定多肽是否保留了此免疫原活性，可以通过本文描述的和其它本领域已知的常规方法容易地确定。
因此，本发明还包括显示出基本的生物学活性的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽变体。这些变体包括根据本领域已知的一般原则选择以致对活性几乎不造成影响的缺失、插入、倒位、重复和替代。
本申请涉及与本文公开的核酸序列(例如编码具有SEQ ID NO2的m-n所示N和/或C端缺失的氨基酸序列的多肽)或相应于保藏克隆所编码多肽的核酸序列有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸分子，而无论它们编码的多肽是否具有G蛋白趋化因子受体(CCR5)的功能活性。这是因为甚至当特定核酸分子不编码具有G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性的多肽时，本领域技术人员也仍然知道如何使用该核酸分子，例如作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括，尤其是(1)分离G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因或其等位基因或在cDNA文库中分离其拼接变体；(2)与中期染色体分散物原位杂交(例如“FISH”)以提供G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的精确染色体定位，参见Verma等，Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，纽约(1988)；和(3)Northern印迹分析以检测特定组织中G蛋白趋化因子受体(CCR5)mRNA的表达。
然而，优选具有与本文公开的核酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列、且实际上编码具有G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性的多肽的核酸分子。所谓“具有G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性的多肽”是指按在例如特定免疫测定法或生物学测定法中测定的，所表现出的活性与本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的活性类似但不一定相同的多肽(例如，完整(全长)G蛋白趋化因子受体(CCR5)、成熟的G蛋白趋化因子受体(CCR5)和可溶性G蛋白趋化因子受体(CCR5)(例如，具有G蛋白趋化因子受体胞外域或区中所含序列))。例如，G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性可以通过测定G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体的能力常规地确定。还可以通过测定多肽例如游离的或表达在细胞表面的关联配体诱导表达该多肽的细胞的能力来确定G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域技术人员将立即意识到大量具有与保藏克隆的核酸序列、图1所示核酸序列(SEQ ID NO1)或它们的片段至少90％、95％、96％、97％、98％、99％一致的序列的核酸分子可以编码“具有G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性”的多肽。实际上，由于这些核苷酸序列之任一个的简并变体都编码相同的多肽，所以在大多数情况下甚至不进行上述比较分析这对于本领域技术人员也是明显的。本领域还应意识到，对于非简并变体的那些核酸分子，合理数目的核酸分子也将编码具有G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性的多肽。这是由于本领域技术人员完全明了不大可能或不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸替代(例如，将一个脂肪族氨基酸替代为另一脂肪族氨基酸)，见以下进一步描述。
例如，关于如何进行表型沉默氨基酸替代的指导参见Bowie等“解码蛋白质序列中的信息对氨基酸替代的耐受性”，Science2471306-1310(1990)，其中作者指出有两种主要的策略可以用于研究氨基酸序列对改变的耐受性。
第一个策略利用由进化过程中的自然选择造成的氨基酸替代耐受性。通过比较不同物种的氨基酸序列，可以鉴定出保守氨基酸。这些保守氨基酸对于蛋白质的功能可能是重要的。相反，通过自然选择耐受替代的氨基酸位置则表明这些位置对于蛋白质功能不是关键的。因此，可以对耐受氨基酸替代的位置进行修饰而仍保持该蛋白质的生物学活性。
第二个策略使用遗传工程将氨基酸改变引入克隆基因的特定位置以鉴定出对蛋白质功能关键的区域。例如，可以使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(单独向分子的每一个残基位置引入丙氨酸突变)。(Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989))。然后可以测试所获突变分子的生物学活性。
正如该作者陈述的，这两个策略都揭示了蛋白质令人惊奇地耐受氨基酸替代。该作者还指出该蛋白质中在某些氨基酸位置可能允许的氨基酸改变。例如，大多数埋藏的(在蛋白质的三级结构中)氨基酸残基要求非极性侧链，而表面侧链的性质几乎一般都不是保守的。而且，耐受的保守氨基酸替代包括脂肪族或疏水氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替代；羟基残基Ser和Thr的替代；酸性残基Asp和Glu的替代；酰胺残基Asn和Gln的替代；碱性残基Lys、Arg和His的替代；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的替代；和小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替代。
例如，G蛋白趋化因子受体(CCR5)氨基酸水平上的定点改变可以通过用保守氨基酸替代特定的氨基酸来进行。G蛋白趋化因子受体(CCR5)(SEQ ID NO2)的优选保守突变包括M1替代为A，G，I，L，S，T，或V；D2替代为E；Y3替代为F，或W；Q4替代为N；V5替代为A，G，I，L，S，T，或M；S6替代为A，G，I，L，T，M，或V；S7替代为A，G，I，L，T，M，或V；I9替代为A，G，L，S，T，M，或V；Y10替代为F，或W；D11替代为E；I12替代为A，G，L，S，T，M，或V；N13替代为Q；Y14替代为F，或W；Y15替代为F，或W；T16替代为A，G，I，L，S，M，或V；S17替代为A，G，I，L，T，M，或V；E18替代为D；K22替代为H，或R；I23替代为A，G，L，S，T，M，或V；N24替代为Q；V25替代为A，G，I，L，S，T，或M；K26替代为H，或R；Q27替代为N；I28替代为A，G，L，S，T，M，或V；A29替代为G，I，L，S，T，M，或V；A30替代为G，I，L，S，T，M，或V；R31替代为H，或K；L32替代为A，G，I，S，T，M，或V；L33替代为A，G，I，S，T，M，或V；L36替代为A，G，I，S，T，M，或V；Y37替代为F，或W；S38替代为A，G，I，L，T，M，或V；L39替代为A，G，I，S，T，M，或V；V40替代为A，G，I，L，S，T，或M；F41替代为W，或Y；I42替代为A，G，L，S，T，M，或V；F43替代为W，或Y；G44替代为A，I，L，S，T，M，或V；F45替代为W，或Y；V46替代为A，G，I，L，S，T，或M；G47替代为A，I，L，S，T，M，或V；N48替代为Q；M49替代为A，G，I，L，S，T，或V；L50替代为A，G，I，S，T，M，或V；V51替代为A，G，I，L，S，T，或M；I52替代为A，G，L，S，T，M，或V；L53替代为A，G，I，S，T，M，或V；I54替代为A，G，I，S，T，M，或V；L55替代为A，G，I，S，T，M，或V；I56替代为A，G，L，S，T，M，或V；N57替代为Q；Q59替代为N；R60替代为H，或K；L61替代为A，G，I，S，T，M，或V；E62替代为D；S63替代为A，G，I，L，T，M，或V；M64替代为A，G，I，L，S，T，或V；T65替代为A，G，I，L，S，M，或V；D66替代为E；I67替代为A，G，L，S，T，M，或V；Y68替代为F，或W；L69替代为A，G，I，S，T，M，或V；L70替代为A，G，I，S，T，M，或V；N71替代为Q；L72替代为A，G，I，S，T，M，或V；A73替代为G，I，L，S，T，M，或V；I74替代为A，G，L，S，T，M，或V；S75替代为A，G，I，L，T，M，或V；D76替代为E；L77替代为A，G，I，S，T，M，或V；F78替代为W，或Y；F79替代为W，或Y；L80替代为A，G，I，S，T，M，或V；L81替代为A，G，I，S，T，M，或V；T82替代为A，G，I，L，S，M，或V；V83替代为A，G，I，L，S，T，或M；F85替代为W，或Y；W86替代为F，或Y；A87替代为G，I，L，S，T，M，或V；H88替代为K，或R；Y89替代为F，或W；A90替代为G，I，L，S，T，M，或V；A91替代为G，I，L，S，T，M，或V；A92替代为G，I，L，S，T，M，或V；Q93替代为N；W94替代为F，或Y；D95替代为E；F96替代为W，或Y；G97替代为A，I，L，S，T，M，或V；N98替代为Q；T99替代为A，G，I，L，S，M，或V；M100替代为A，G，I，L，S，T，或V；Q102替代为N；L103替代为A，G，I，S，T，M，或V；L104替代为A，G，I，S，T，M，或V；T105替代为A，G，I，L，S，M，或V；G106替代为A，I，L，S，T，M，或V；L107替代为A，G，I，S，T，M，或V；Y108替代为F，或W；F109替代为W，或Y；I110替代为A，G，L，S，T，M，或V；G111替代为A，I，L，S，T，M，或V；F112替代为W，或Y；F113替代为W，或Y；S114替代为A，G，I，L，T，M，或V；G115替代为A，I，L，S，T，M，或V；I116替代为A，G，L，S，T，M，或V；F117替代为W，或Y；F118替代为W，或Y；I119替代为A，G，L，S，T，M，或V；I120替代为A，G，L，S，T，M，或V；L121替代为A，G，I，S，T，M，或V；L122替代为A，G，I，S，T，M，或V；T123替代为A，G，I，L，S，M，或V；I124替代为A，G，L，S，T，M，或V；D125替代为E；R126替代为H，或K；Y127替代为F，或W；L128替代为A，G，I，S，T，M，或V；A129替代为G，I，L，S，T，M，或V；I130替代为A，G，L，S，T，M，或V；V131替代为A，G，I，L，S，T，或M；H132替代为K，或R；A133替代为G，I，L，S，T，M，或V；V134替代为A，G，I，L，S，T，或M；F135替代为W，或Y；A136替代为G，I，L，S，T，M，或V；L137替代为A，G，I，S，T，M，或V；K138替代为H，或R；A139替代为G，I，L，S，T，M，或V；R140替代为H，或K；T141替代为A，G，I，L，S，M，或V；V142替代为A，G，I，L，S，T，或M；T143替代为A，G，I，L，S，M，或V；F144替代为W，或Y；G145替代为A，I，L，S，T，M，或V；V146替代为A，G，I，L，S，T，或M；V147替代为A，G，I，L，S，T，或M；T148替代为A，G，I，L，S，M，或V；S149替代为A，G，I，L，T，M，或V；V150替代为A，G，I，L，S，T，或M；I151替代为A，G，L，S，T，M，或V；T152替代为A，G，I，L，S，M，或V；W153替代为F，或Y；V154替代为A，G，I，L，S，T，或M；V155替代为A，G，I，L，S，T，或M；A156替代为G，I，L，S，T，M，或V；V157替代为A，G，I，L，S，T，或M；F158替代为W，或Y；A159替代为G，I，L，S，T，M，或V；S160替代为A，G，I，L，T，M，或V；L161替代为A，G，I，S，T，M，或V；G163替代为A，I，L，S，T，M，或V；I164替代为A，G，L，S，T，M，或V；I165替代为A，G，L，S，T，M，或V；F166替代为W，或Y；T167替代为A，G，I，L，S，M，或V；R168替代为H，或K；S169替代为A，G，I，L，T，M，或V；Q170替代为N；K171替代为H，或R；E172替代为D；G173替代为A，I，L，S，T，M，或V；L174替代为A，G，I，S，T，M，或V；H175替代为K，或R；Y176替代为F，或W；T177替代为A，G，I，L，S，M，或V；S179替代为A，G，I，L，T，M，或V；S180替代为A，G，I，L，T，M，或V；H181替代为K，或R；F182替代为W，或Y；Y184替代为F，或W；S185替代为A，G，I，L，T，M，或V；Q186替代为N；Y187替代为F，或W；Q188替代为N；F189替代为W，或Y；W190替代为F，或Y；K191替代为H，或R；N192替代为Q；F193替代为W，或Y；Q194替代为N；T195替代为A，G，I，L，S，M，或V；L196替代为A，G，I，S，T，M，或V；K197替代为H，或R；I198替代为A，G，L，S，T，M，或V；V199替代为A，G，I，L，S，T，或M；I200替代为A，G，L，S，T，M，或V；L201替代为A，G，I，S，T，M，或V；G202替代为A，I，L，S，T，M，或V；L203替代为A，G，I，S，T，M，或V；V204替代为A，G，I，L，S，T，或M；L205替代为A，G，I，S，T，M，或V；L207替代为A，G，I，S，T，M，或V；L208替代为A，G，I，S，T，M，或V；V209替代为A，G，I，L，S，T，或M；M210替代为A，G，I，L，S，T，或V；V211替代为A，G，I，L，S，T，或M；I212替代为A，G，L，S，T，M，或V；Y214替代为F，或W；S215替代为A，G，I，L，T，M，或V；G216替代为A，I，L，S，T，M，或V；I217替代为A，G，L，S，T，M，或V；L218替代为A，G，I，S，T，M，或V；K219替代为H，或R；T220替代为A，G，I，L，S，M，或V；L221替代为A，G，I，S，T，M，或V；L222替代为A，G，I，S，T，M，或V；R223替代为H，或K；R225替代为H，或K；N226替代为Q；E227替代为D；K228替代为H，或R；K229替代为H，或R；R230替代为H，或K；H231替代为K，或R；R232替代为H，或K；A233替代为G，I，L，S，T，M，或V；V234替代为A，G，I，L，S，T，或M；R235替代为H，或K；L236替代为A，G，I，S，T，M，或V；I237替代为A，G，L，S，T，M，或V；F238替代为W，或Y；T239替代为A，G，I，L，S，M，或V；I240替代为A，G，L，S，T，M，或V；M241替代为A，G，I，L，S，T，或V；I242替代为A，G，L，S，T，M，或V；V243替代为A，G，I，L，S，T，或M；Y244替代为F，或W；F245替代为W，或Y；L246替代为A，G，I，S，T，M，或V；F247替代为W，或Y；W248替代为F，或Y；A249替代为G，I，L，S，T，M，或V；Y251替代为F，或W；N252替代为Q；I253替代为A，G，L，S，T，M，或V；V254替代为A，G，I，L，S，T，或M；L255替代为A，G，I，S，T，M，或V；L256替代为A，G，I，S，T，M，或V；L257替代为A，G，I，S，T，M，或V；N258替代为Q；T259替代为A，G，I，L，S，M，或V；F260替代为W，或Y；Q261替代为N；E262替代为D；F263替代为W，或Y；F264替代为W，或Y；G265替代为A，I，L，S，T，M，或V；L266替代为A，G，I，S，T，M，或V；N267替代为Q；N268替代为Q；S270替代为A，G，I，L，T，M，或V；S271替代为A，G，I，L，T，M，或V；S272替代为A，G，I，L，T，M，或V；N273替代为Q；R274替代为H，或K；L275替代为A，G，I，S，T，M，或V；D276替代为E；Q277替代为N；A278替代为G，I，L，S，T，M，或V；M279替代为A，G，I，L，S，T，或V；Q280替代为N；V281替代为A，G，I，L，S，T，或M；T282替代为A，G，I，L，S，M，或V；E283替代为D；T284替代为A，G，I，L，S，M，或V；L285替代为A，G，I，S，T，M，或V；G286替代为A，I，L，S，T，M，或V；M287替代为A，G，I，L，S，T，或V；T288替代为A，G，I，L，S，M，或V；H289替代为K，或R；I292替代为A，G，L，S，T，M，或V；N293替代为Q；I295替代为A，G，L，S，T，M，或V；I296替代为A，G，L，S，T，M，或V；Y297替代为F，或W；A298替代为G，I，L，S，T，M，或V；F299替代为W，或Y；V300替代为A，G，I，L，S，T，或M；G301替代为A，I，L，S，T，M，或V；E302替代为D；K303替代为H，或R；F304替代为W，或Y；R305替代为H，或K；N306替代为Q；Y307替代为F，或W；L308替代为A，G，I，S，T，M，或V；L309替代为A，G，I，S，T，M，或V；V310替代为A，G，I，L，S，T，或M；F311替代为W，或Y；F312替代为W，或Y；Q313替代为N；K314替代为H，或R；H315替代为K，或R；I316替代为A，G，L，S，T，M，或V；A317替代为G，I，L，S，T，M，或V；K318替代为H，或R；R319替代为H，或K；F320替代为W，或Y；K322替代为H，或R；S325替代为A，G，I，L，T，M，或V；I326替代为A，G，L，S，T，M，或V；F327替代为W，或Y；Q328替代为N；Q329替代为N；E330替代为D；A331替代为G，I，L，S，T，M，或V；E333替代为D；R334替代为H，或K；A335替代为G，I，L，S，T，M，或V；S336替代为A，G，I，L，T，M，或V；S337替代为A，G，I，L，T，M，或V；V338替代为A，G，I，L，S，T，或M；Y339替代为F，或W；T340替代为A，G，I，L，S，M，或V；R341替代为H，或K；S342替代为A，G，I，L，T，M，或V；T343替代为A，G，I，L，S，M，或V；G344替代为A，I，L，S，T，M，或V；E345替代为D；Q346替代为N；E347替代为D；I348替代为A，G，L，S，T，M，或V；S349替代为A，G，I，L，T，M，或V；V350替代为A，G，I，L，S，T，或M；G351替代为A，I，L，S，T，M，或V；和/或L352替代为A，G，I，S，T，M，或V。
HDGNR10保藏克隆编码的G蛋白趋化因子受体(CCR5)(SEQ ID NO22)的优选保守突变包括M1替代为A，G，I，L，S，T，或V；D2替代为E；Y3替代为F，或W；Q4替代为N；V5替代为A，G，I，L，S，T，或M；S6替代为A，G，I，L，T，M，或V；S7替代为A，G，I，L，T，M，或V；I9替代为A，G，L，S，T，M，或V；Y10替代为F，或W；D11替代为E；I12替代为A，G，L，S，T，M，或V；N13替代为Q；Y14替代为F，或W；Y15替代为F，或W；T16替代为A，G，I，L，S，M，或V；S17替代为A，G，I，L，T，M，或V；E18替代为D；Q21替代为N；K22替代为H，或R；123替代为A，G，L，S，T，M，或V；N24替代为Q；V25替代为A，G，I，L，S，T，或M；K26替代为H，或R；Q27替代为N；I28替代为A，G，L，S，T，M，或V；A29替代为G，I，L，S，T，M，或V；A30替代为G，I，L，S，T，M，或V；R31替代为H，或K；L32替代为A，G，I，S，T，M，或V；L33替代为A，G，I，S，T，M，或V；L36替代为A，G，I，S，T，M，或V；Y37替代为F，或W；S38替代为A，G，I，L，T，M，或V；L39替代为A，G，I，S，T，M，或V；V40替代为A，G，I，L，S，T，或M；F41替代为W，或Y；I42替代为A，G，L，S，T，M，或V；F43替代为W，或Y；G44替代为A，I，L，S，T，M，或V；F45替代为W，或Y；V46替代为A，G，I，L，S，T，或M；G47替代为A，I，L，S，T，M，或V；N48替代为Q；M49替代为A，G，I，L，S，T，或V；L50替代为A，G，I，S，T，M，或V；V51替代为A，G，I，L，S，T，或M；I52替代为A，G，L，S，T，M，或V；L53替代为A，G，I，S，T，M，或V；I54替代为A，G，L，S，T，M，或V；L55替代为A，G，I，S，T，M，或V；I56替代为A，G，L，S，T，M，或V；N57替代为Q；K59替代为H，或R；R60替代为H，或K；L61替代为A，G，I，S，T，M，或V；K62替代为H，或R；S63替代为A，G，I，L，T，M，或V；M64替代为A，G，I，L，S，T，或V；T65替代为A，G，I，L，S，M，或V；D66替代为E；I67替代为A，G，L，S，T，M，或V；Y68替代为F，或W；L69替代为A，G，I，S，T，M，或V；L70替代为A，G，I，S，T，M，或V；N71替代为Q；L72替代为A，G，I，S，T，M，或V；A73替代为G，I，L，S，T，M，或V；I74替代为A，G，L，S，T，M，或V；S75替代为A，G，I，L，T，M，或V；D76替代为E；L77替代为A，G，I，S，T，M，或V；F78替代为W，或Y；F79替代为W，或Y；L80替代为A，G，I，S，T，M，或V；L81替代为A，G，I，S，T，M，或V；T82替代为A，G，I，L，S，M，或V；V83替代为A，G，I，L，S，T，或M；F85替代为W，或Y；W86替代为F，或Y；A87替代为G，I，L，S，T，M，或V；H88替代为K，或R；Y89替代为F，或W；A90替代为G，I，L，S，T，M，或V；A91替代为G，I，L，S，T，M，或V；A92替代为G，I，L，S，T，M，或V；Q93替代为N；W94替代为F，或Y；D95替代为E；F96替代为W，或Y；G97替代为A，I，L，S，T，M，或V；N98替代为Q；T99替代为A，G，I，L，S，M，或V；M100替代为A，G，I，L，S，T，或V；Q102替代为N；L103替代为A，G，I，S，T，M，或V；L104替代为A，G，I，S，T，M，或V；T105替代为A，G，I，L，S，M，或V；G106替代为A，I，L，S，T，M，或V；L107替代为A，G，I，S，T，M，或V；Y108替代为F，或W；F109替代为W，或Y；I110替代为A，G，L，S，T，M，或V；G111替代为A，I，L，S，T，M，或V；F112替代为W，或Y；F113替代为W，或Y；S114替代为A，G，I，L，T，M，或V；G115替代为A，I，L，S，T，M，或V；I116替代为A，G，L，S，T，M，或V；F117替代为W，或Y；F118替代为W，或Y；I119替代为A，G，L，S，T，M，或V；I120替代为A，G，L，S，T，M，或V；L121替代为A，G，I，S，T，M，或V；L122替代为A，G，I，S，T，M，或V；T123替代为A，G，I，L，S，M，或V；I124替代为A，G，L，S，T，M，或V；D125替代为E；R126替代为H，或K；Y127替代为F，或W；L128替代为A，G，I，S，T，M，或V；A129替代为G，I，L，S，T，M，或V；V130替代为A，G，I，L，S，T，或M；V131替代为A，G，I，L，S，T，或M；H132替代为K，或R；A133替代为G，I，L，S，T，M，或V；V134替代为A，G，I，L，S，T，或M；F135替代为W，或Y；A136替代为G，I，L，S，T，M，或V；L137替代为A，G，I，S，T，M，或V；K138替代为H，或R；A139替代为G，I，L，S，T，M，或V；R140替代为H，或K；T141替代为A，G，I，L，S，M，或V；V142替代为A，G，I，L，S，T，或M；T143替代为A，G，I，L，S，M，或V；F144替代为W，或Y；G145替代为A，I，L，S，T，M，或V；V146替代为A，G，I，L，S，T，或M；V147替代为A，G，I，L，S，T，或M；T148替代为A，G，I，L，S，M，或V；S149替代为A，G，I，L，T，M，或V；V150替代为A，G，I，L，S，T，或M；I151替代为A，G，L，S，T，M，或V；T152替代为A，G，I，L，S，M，或V；W153替代为F，或Y；V154替代为A，G，I，L，S，T，或M；V155替代为A，G，I，L，S，T，或M；A156替代为G，I，L，S，T，M，或V；V157替代为A，G，I，L，S，T，或M；F158替代为W，或Y；A159替代为G，I，L，S，T，M，或V；S160替代为A，G，I，L，T，M，或V；L161替代为A，G，I，S，T，M，或V；G163替代为A，I，L，S，T，M，或V；I164替代为A，G，L，S，T，M，或V；I165替代为A，G，L，S，T，M，或V；F166替代为W，或Y；T167替代为A，G，I，L，S，M，或V；R168替代为H，或K；S169替代为A，G，I，L，T，M，或V；Q170替代为N；K171替代为H，或R；E172替代为D；G173替代为A，I，L，S，T，M，或V；L174替代为A，G，I，S，T，M，或V；H175替代为K，或R；Y176替代为F，或W；T177替代为A，G，I，L，S，M，或V；S179替代为A，G，I，L，T，M，或V；S180替代为A，G，I，L，T，M，或V；H181替代为K，或R；F182替代为W，或Y；Y184替代为F，或W；S185替代为A，G，I，L，T，M，或V；Q186替代为N；Y187替代为F，或W；Q188替代为N；F189替代为W，或Y；W190替代为F，或Y；K191替代为H，或R；N192替代为Q；F193替代为W，或Y；Q194替代为N；T195替代为A，G，I，L，S，M，或V；L196替代为A，G，I，S，T，M，或V；K197替代为H，或R；I198替代为A，G，L，S，T，M，或V；V199替代为A，G，I，L，S，T，或M；I200替代为A，G，L，S，T，M，或V；L201替代为A，G，I，S，T，M，或V；G202替代为A，I，L，S，T，M，或V；L203替代为A，G，I，S，T，M，或V；V204替代为A，G，I，L，S，T，或M；L205替代为A，G，I，S，T，M，或V；L207替代为A，G，I，S，T，M，或V；L208替代为A，G，I，S，T，M，或V；V209替代为A，G，I，L，S，T，或M；M210替代为A，G，I，L，S，T，或V；V211替代为A，G，I，L，S，T，或M；I212替代为A，G，L，S，T，M，或V；Y214替代为F，或W；S215替代为A，G，I，L，T，M，或V；G216替代为A，I，L，S，T，M，或V；I217替代为A，G，L，S，T，M，或V；L218替代为A，G，I，S，T，M，或V；K219替代为H，或R；T220替代为A，G，I，L，S，M，或V；L221替代为A，G，I，S，T，M，或V；L222替代为A，G，I，S，T，M，或V；R223替代为H，或K；R225替代为H，或K；N226替代为Q；E227替代为D；K228替代为H，或R；K229替代为H，或R；R230替代为H，或K；H231替代为K，或R；R232替代为H，或K；A233替代为G，I，L，S，T，M，或V；V234替代为A，G，I，L，S，T，或M；R235替代为H，或K；L236替代为A，G，I，S，T，M，或V；I237替代为A，G，L，S，T，M，或V；F238替代为W，或Y；T239替代为A，G，I，L，S，M，或V；I240替代为A，G，L，S，T，M，或V；M241替代为A，G，I，L，S，T，或V；I242替代为A，G，L，S，T，M，或V；V243替代为A，G，I，L，S，T，或M；Y244替代为F，或W；F245替代为W，或Y；L246替代为A，G，I，S，T，M，或V；F247替代为W，或Y；W248替代为F，或Y；A249替代为G，I，L，S，T，M，或V；Y251替代为F，或W；N252替代为Q；I253替代为A，G，L，S，T，M，或V；V254替代为A，G，I，L，S，T，或M；L255替代为A，G，I，S，T，M，或V；L256替代为A，G，I，S，T，M，或V；L257替代为A，G，I，S，T，M，或V；N258替代为Q；T259替代为A，G，I，L，S，M，或V；F260替代为W，或Y；Q261替代为N；E262替代为D；F263替代为W，或Y；F264替代为W，或Y；G265替代为A，I，L，S，T，M，或V；L266替代为A，G，I，S，T，M，或V；N267替代为Q；N268替代为Q；S270替代为A，G，I，L，T，M，或V；S271替代为A，G，I，L，T，M，或V；S272替代为A，G，I，L，T，M，或V；N273替代为Q；R274替代为H，或K；L275替代为A，G，I，S，T，M，或V；D276替代为E；Q277替代为N；A278替代为G，I，L，S，T，M，或V；M279替代为A，G，I，L，S，T，或V；Q280替代为N；V281替代为A，G，I，L，S，T，或M；T282替代为A，G，I，L，S，M，或V；E283替代为D；T284替代为A，G，I，L，S，M，或V；L285替代为A，G，I，S，T，M，或V；G286替代为A，I，L，S，T，M，或V；M287替代为A，G，I，L，S，T，或V；T288替代为A，G，I，L，S，M，或V；H289替代为K，或R；I292替代为A，G，L，S，T，M，或V；N293替代为Q；I295替代为A，G，L，S，T，M，或V；I296替代为A，G，L，S，T，M，或V；Y297替代为F，或W；A298替代为G，I，L，S，T，M，或V；F299替代为W，或Y；V300替代为A，G，I，L，S，T，或M；G301替代为A，I，L，S，T，M，或V；E302替代为D；K303替代为H，或R；F304替代为W，或Y；R305替代为H，或K；N306替代为Q；Y307替代为F，或W；L308替代为A，G，I，S，T，M，或V；L309替代为A，G，I，S，T，M，或V；V310替代为A，G，I，L，S，T，或M；F311替代为W，或Y；F312替代为W，或Y；Q313替代为N；K314替代为H，或R；H315替代为K，或R；I316替代为A，G，L，S，T，M，或V；A317替代为G，I，L，S，T，M，或V；K318替代为H，或R；R319替代为H，或K；F320替代为W，或Y；K322替代为H，或R；S325替代为A，G，I，L，T，M，或V；I326替代为A，G，L，S，T，M，或V；F327替代为W，或Y；Q328替代为N；Q329替代为N；E330替代为D；A331替代为G，I，L，S，T，M，或V；E333替代为D；R334替代为H，或K；A335替代为G，I，L，S，T，M，或V；S336替代为A，G，I，L，T，M，或V；S337替代为A，G，I，L，T，M，或V；V338替代为A，G，I，L，S，T，或M；Y339替代为F，或W；T340替代为A，G，I，L，S，M，或V；R341替代为H，或K；S342替代为A，G，I，L，T，M，或V；T343替代为A，G，I，L，S，M，或V；E344替代为D；E345替代为D；Q346替代为N；E347替代为D；I348替代为A，G，L，S，T，M，或V；S349替代为A，G，I，L，T，M，或V；V350替代为A，G，I，L，S，T，或M；G351替代为A，I，L，S，T，M，或V；和/或L352替代为A，G，I，S，T，M，或V。
可以就整个说明书描述的和本领域已知的活性或功能，常规地筛选所获结构。优选地，所获结构具有一种增加的和/或降低的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性或功能，而其余的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性或功能保持不变。更优选地，所获结构具有一种以上的增加和/或降低的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性或功能，而其余的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性或功能保持不变。
除了保守氨基酸替代外，G蛋白趋化因子受体(CCR5)的变体还包括(i)用一或多个非保守氨基酸残基进行的替代，其中这些替代氨基酸可以是或可以不是遗传密码编码的，或(ii)用一个或多个具有取代基团的氨基酸残基进行的替代，或(iii)成熟多肽与另一成分，如增加该多肽稳定性和/或可溶性的成分(例如聚乙二醇)的融合，或(iv)该多肽与额外氨基酸，例如IgG融合区肽、或前导或分泌序列、或利于纯化的序列的融合。从本文的教导这些多肽变体被认为属于本领域技术人员的范围。
例如，含有带电荷的氨基酸被其它带电荷的或中性的氨基酸作了氨基酸替代的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽变体可以产生具有改良特征如较少的凝聚性的蛋白质。由于凝聚物的免疫原性，药物制剂的凝聚既降低了活性又增加了清除。(Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10307-377(1993))。
例如，G蛋白趋化因子受体(CCR5)(SEQ ID NO2)的优选非保守性替代包括M1替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D2替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y3替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q4替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；V5替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S6替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S7替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P8替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；I9替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y10替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；D11替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I12替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N13替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y14替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Y15替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T16替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S17替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E18替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P19替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；C20替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；P21替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；K22替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I23替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N24替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；V25替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K26替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q27替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；I28替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A29替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A30替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R31替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L32替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L33替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P34替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；P35替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L36替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y37替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S38替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L39替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V40替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F41替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；I42替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F43替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G44替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F45替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V46替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G47替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N48替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；M49替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L50替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V51替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I52替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L53替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I54替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L55替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I56替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N57替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C58替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Q59替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R60替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L61替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E62替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S63替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M64替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T65替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D66替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I67替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y68替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L69替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L70替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N71替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L72替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A73替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I74替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S75替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D76替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L77替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F78替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F79替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L80替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L81替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T82替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V83替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P84替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；F85替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；W86替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A87替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H88替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y89替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A90替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A91替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A92替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q93替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；W94替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；D95替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F96替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G97替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N98替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T99替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M100替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C101替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Q102替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L103替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L104替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T105替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G106替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L107替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y108替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F109替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；I110替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G111替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F112替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F113替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S114替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G115替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I116替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F117替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F118替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；I119替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I120替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L121替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L122替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T123替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I124替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D125替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R126替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y127替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L128替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A129替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I130替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V131替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H132替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A133替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V134替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F135替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A136替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L137替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K138替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A139替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R140替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T141替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V142替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T143替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F144替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G145替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V146替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V147替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T148替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S149替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V150替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I151替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T152替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；W153替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V154替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V155替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A156替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V157替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F158替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A159替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S160替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L161替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P162替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G163替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I164替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I165替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F166替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T167替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R168替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S169替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q170替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K171替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E172替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G173替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L174替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H175替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y176替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T177替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C178替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S179替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S180替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H181替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F182替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；P183替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Y184替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S185替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q186替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y187替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q188替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F189替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；W190替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；K191替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N192替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F193替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q194替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T195替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L196替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K197替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I198替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V199替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I200替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L201替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G202替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L203替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V204替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L205替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P206替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L207替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L208替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V209替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M210替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V211替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I212替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C213替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Y214替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S215替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G216替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I217替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L218替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K219替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T220替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L221替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L222替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R223替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C224替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；R225替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N226替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E227替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K228替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K229替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R230替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H231替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R232替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A233替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V234替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R235替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L236替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I237替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F238替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T239替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I240替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M241替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I242替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V243替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y244替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F245替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L246替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F247替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；W248替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A249替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P250替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Y251替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N252替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；I253替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V254替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L255替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L256替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L257替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N258替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T259替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F260替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q261替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E262替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F263替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F264替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G265替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L266替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N267替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N268替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C269替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S270替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S271替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S272替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N273替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R274替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L275替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D276替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q277替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A278替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M279替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q280替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；V281替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T282替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E283替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T284替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L285替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G286替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M287替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T288替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H289替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C290替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；C291替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；I292替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N293替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P294替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；I295替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I296替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y297替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A298替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F299替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V300替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G301替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E302替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K303替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F304替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；R305替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N306替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y307替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L308替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L309替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V310替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F311替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F312替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q313替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K314替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H315替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I316替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A317替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K318替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R319替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F320替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C321替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；K322替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C323替代为D，E，H，K，K，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；C324替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S325替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I326替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F327替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q328替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Q329替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E330替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A331替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P332替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E333替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R334替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A335替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S336替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S337替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V338替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y339替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T340替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R341替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S342替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T343替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G344替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E345替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q346替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E347替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I348替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S349替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V350替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G351替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；和/或L352替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C。
HDGNR10保藏克隆(SEQ ID NO22)所编码的G蛋白趋化因子受体(CCR5)的其它优选非保守性替代包括M1替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D2替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y3替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q4替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；V5替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S6替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S7替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P8替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；I9替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y10替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；D11替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I12替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N13替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y14替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Y15替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T16替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S17替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E18替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；P19替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；C20替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Q21替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K22替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I23替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N24替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；V25替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K26替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q27替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；I28替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A29替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A30替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R31替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L32替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L33替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P34替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；P35替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L36替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y37替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S38替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L39替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V40替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F41替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；I42替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F43替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G44替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F45替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V46替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G47替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N48替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；M49替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L50替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V51替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I52替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L53替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I54替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L55替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I56替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N57替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C58替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；K59替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R60替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L61替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K62替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S63替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M64替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T65替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D66替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I67替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y68替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L69替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L70替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N71替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L72替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A73替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I74替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S75替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D76替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L77替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F78替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F79替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L80替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L81替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T82替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V83替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P84替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；F85替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；W86替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A87替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H88替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y89替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A90替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A91替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A92替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q93替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；W94替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；D95替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F96替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G97替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N98替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T99替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M100替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C101替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Q102替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；L103替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L104替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T105替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G106替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L107替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y108替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F109替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；I110替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G111替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F112替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F113替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S114替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G115替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I116替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F117替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F118替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；I119替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I120替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L121替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L122替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T123替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I124替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D125替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R126替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y127替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L128替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A129替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V130替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V131替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H132替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A133替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V134替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F135替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A136替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L137替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K138替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A139替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R140替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T141替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V142替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T143替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F144替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G145替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V146替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V147替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T148替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S149替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V150替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I151替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T152替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；W153替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V154替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V155替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A156替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V157替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F158替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A159替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S160替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L161替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P162替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G163替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I164替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I165替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F166替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T167替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R168替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S169替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q170替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K171替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E172替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G173替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L174替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H175替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y176替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T177替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C178替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S179替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S180替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H181替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F182替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；P183替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Y184替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S185替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q186替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y187替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q188替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F189替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；W190替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；K191替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N192替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；F193替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q194替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T195替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L196替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K197替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I198替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V199替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I200替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L201替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G202替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L203替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V204替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L205替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P206替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；L207替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L208替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V209替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M210替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V211替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I212替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C213替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Y214替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S215替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G216替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I217替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L218替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K219替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T220替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L221替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L222替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R223替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C224替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；R225替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N226替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E227替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K228替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K229替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R230替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H231替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R232替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A233替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V234替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R235替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L236替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I237替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F238替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T239替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I240替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M241替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I242替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V243替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y244替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F245替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L246替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F247替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；W248替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A249替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P250替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Y251替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N252替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；I253替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V254替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L255替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L256替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L257替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N258替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T259替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F260替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q261替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E262替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F263替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F264替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G265替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L266替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N267替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N268替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C269替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S270替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S271替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S272替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N273替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；R274替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L275替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D276替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q277替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A278替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M279替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q280替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；V281替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T282替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E283替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T284替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L285替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G286替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M287替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T288替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H289替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C290替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；C291替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；I292替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N293替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；P294替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；I295替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I296替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y297替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A298替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F299替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V300替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G301替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E302替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K303替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F304替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；R305替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N306替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y307替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L308替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L309替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V310替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F311替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F312替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q313替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K314替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H315替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I316替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A317替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K318替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R319替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F320替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；C321替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；K322替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C323替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；C324替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；S325替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I326替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F327替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q328替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Q329替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E330替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A331替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P332替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E333替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R334替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A335替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S336替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S337替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V338替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y339替代为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T340替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R341替代为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S342替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T343替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E344替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E345替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q346替代为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；E347替代为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I348替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S349替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V350替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G351替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；和/或L352替代为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C可以就整个说明书描述的和本领域已知的活性或功能，常规地筛选所获结构。优选地，所获结构具有一种增加的和/或降低的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性或功能，而其余的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性或功能保持不变。更优选地，所获结构具有一种以上的增加和/或降低的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性或功能，而其余的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性或功能保持不变。
此外，还可以用上述替代氨基酸(保守的或非保守的)替代一个以上的氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9和10)。替代的氨基酸可以出现在G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白质的全长、成熟或原蛋白质形式中，以及具有如下所列通用式m-n的N端和C端缺失突变体中。
本发明的再一实施方案涉及包含如下G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的氨基酸序列的多肽，所述G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽所具有的氨基酸序列中含有至少一个氨基酸替代、但不超过50个氨基酸替代，甚至更优选地不超过40个氨基酸替代，再更优选地不超过30个氨基酸替代、再甚至更优选地不超过20个氨基酸替代。当然，按递增优选性排列，高度优选多肽具有的氨基酸序列包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的氨基酸序列，且含有至少一个但不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸替代。在特定的实施方案中，图1氨基酸序列中或保藏克隆所编码的氨基酸序列中或它们的片段(例如本文所述的成熟形式和/或其它片段)中添加、替代和/或缺失的数目为1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150，优选保守氨基酸替代。多核苷酸和多肽片段本发明还涉及本发明多核苷酸的多核苷酸片段。本发明中，“多核苷酸片段”是指具有如下核酸序列的短多核苷酸，该核酸序列是保藏克隆所含核酸序列的部分、或编码保藏克隆所编码的多肽；是SEQ ID NO1所示核酸序列或其互补链的部分、或是编码SEQ ID NO2多肽的多核苷酸序列的部分。部分核苷酸片段优选长至少约15nt，更优选至少约20nt，更优选至少约30nt，甚至更优选至少约40nt，至少约50nt，至少约75nt，或至少约150nt。例如，“长至少20nt”的片段旨在包括保藏克隆所含HDGNR10 DNA序列或SEQ ID NO1所示核苷酸序列的20或更多个连续碱基。此上下文中“大约”包括具体引用的值、在一端或两端多或少几个(5、4、3、2或1)核苷酸的值。这些核苷酸片段的用途包括但不限于作为本文所讨论的诊断探针和引物。当然，优选较大的片段(例如50、150、500、600、1000个核苷酸)。
而且，本发明多核苷酸片段的代表性例子包括例如包含如下序列或由其组成的片段，所述序列为SEQ ID NO1或其互补链、或保藏克隆所含HDGNR10 DNA的约核苷酸数第1-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、5501-600、651-700、701-750、751-800、800-850、851-900、901-950、951-1000、1001-1050、1051-1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、1251-1300、1301-1350、1351-1400、或1401至末位。本上下文中“大约”包括具体引用的值、在一端或两端多或少几个(5、4、3、2或1)核苷酸的值。这些核苷酸片段的用途包括但不限于作为本文所讨论的诊断探针和引物。优选地，这些片段编码具有生物学活性的多肽。更优选地，这些多肽可以用作本文所讨论的探针或引物。与这些核酸分子在严紧杂交条件下或在较低严紧条件下杂交的多核苷酸也包括在本发明内，同样这些多核苷酸编码的多肽也包括在本发明内。本发明中，“多肽片段”是指这样的氨基酸序列，其是SEQ ID NO2所含氨基酸序列或保藏克隆所含HDGNR10 DNA编码的氨基酸序列的部分。蛋白质(多肽)片段可以是“游离状态”，或包含在较大多肽内，在该较大多肽内此片段形成一个部分或区、最优选地作为单一的连续区。本发明多肽片段的代表性例子包括例如包含编码区约氨基酸数第1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、102-120、121-140、141-160、161-至末位、或由其组成的片段。而且，多肽片段可以长约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸。在本上下文中“大约”包括具体引用的范围或值、和在一极或两极多或少几个(5、4、3、2或1)氨基酸的范围或值。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
即使从蛋白质的N端缺失一个或多个氨基酸导致该蛋白质的一种或多种生物学功能被修饰或丧失，也仍可以保留其它的生物学活性(例如，生物学活性、多聚化的能力、结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体的能力)。例如，当从N端除去完整或成熟多肽的不足大多数的残基后，缩短的G蛋白趋化因子受体(CCR5)突变蛋白诱导和/或结合识别该多肽的完整或成熟形式的抗体的能力一般也可得以保留。缺少完整多肽的N端残基的特定多肽是否保留了此免疫原活性，可以通过本文描述的和否则本领域已知的常规方法容易地确定。可能的情况是，缺失大数目的N端氨基酸残基的G蛋白趋化因子受体(CCR5)突变蛋白可以保留一些生物学或免疫原活性。实际上，由少至6个G蛋白趋化因子受体(CCR5)氨基酸残基组成的多肽常常可以激起免疫应答。
优选的多肽片段包括分泌蛋白以及成熟形式。其它优选的多肽片段包括从氨基或羧基端或两端连续地系列缺失残基的分泌蛋白或成熟形式。
因此，多肽片段包括分泌的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白以及成熟形式。其它优选的多肽片段包括从氨基或羧基端或两端连续地系列缺失残基的分泌G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白或成熟形式。例如，可以从分泌的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白或成熟形式的氨基端缺失范围在1-60的任何数目的氨基酸。类似地，可以从分泌的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白或成熟形式的羧基端缺失范围在1-30的任何数目的氨基酸。而且，优选上述氨基和羧基端缺失的任意组合。类似地，编码这些多肽片段的多核苷酸也是优选的。
具体地，可以通过通式m-352描述G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的N端缺失(deletions)，其中m是2至346的整数，其中m相应于SEQID NO2或保藏克隆所编码多肽中规定的氨基酸残基位置。更具体地，本发明提供编码包含如下氨基酸序列或由其组成的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列为N端残基缺失的SEQ ID NO2所示本发明多肽，包括包含具有如下残基的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2的D-2至L-352；Y-3至L-352；Q-4至L-352；V-5至L-352；S-6至L-352；S-7至L-352；P-8至L-352；I-9至L-352；Y-10至L-352；D-11至L-352；1-12至L-352；N-13至L-352；Y-14至L-352；Y-15至L-352；T-16至L-352；S-17至L-352；E-18至L-352；P-19至L-352；C-20至L-352；P-21至L-352；K-22至L-352；I-23至L-352；N-24至L-352；V-25至L-352；K-26至L-352；Q-27至L-352；I-28至L-352；A-29至L-352；A-30至L-352；R-31至L-352；L-32至L-352；L-33至L-352；P-34至L-352；P-35至L-352；L-36至L-352；Y-37至L-352；S-38至L-352；L-39至L-352；V-40至L-352；F-41至L-352；I-42至L-352；F-43至L-352；G-44至L-352；F-45至L-352；V-46至L-352；G-47至L-352；N-48至L-352；M-49至L-352；L-50至L-352；V-51至L-352；I-52至L-352；L-53至L-352；I-54至L-352；L-55至L-352；I-56至L-352；N-57至L-352；C-58至L-352；Q-59至L-352；R-60至L-352；L-61至L-352；E-62至L-352；S-63至L-352；M-64至L-352；T-65至L-352；D-66至L-352；I-67至L-352；Y-68至L-352；L-69至L-352；L-70至L-352；N-71至L-352；L-72至L-352；A-73至L-352；I-74至L-352；S-75至L-352；D-76至L-352；L-77至L-352；F-78至L-352；F-79至L-352；L-80至L-352；L-81至L-352；T-82至L-352；V-83至L-352；P-84至L-352；F-85至L-352；W-86至L-352；A-87至L-352；H-88至L-352；Y-89至L-352；A-90至L-352；A-91至L-352；A-92至L-352；Q-93至L-352；W-94至L-352；D-95至L-352；F-96至L-352；G-97至L-352；N-98至L-352；T-99至L-352；M-100至L-352；C-101至L-352；Q-102至L-352；L-103至L-352；L-104至L-352；T-105至L-352；G-106至L-352；L-107至L-352；Y-108至L-352；F-109至L-352；I-110至L-352；G-111至L-352；F-112至L-352；F-113至L-352；S-114至L-352；G-115至L-352；I-116至L-352；F-117至L-352；F-118至L-352；I-119至L-352；1-120至L-352；L-121至L-352；L-122至L-352；T-123至L-352；I-124至L-352；D-125至L-352；R-126至L-352；Y-127至L-352；L-128至L-352；A-129至L-352；I-130至L-352；V-131至L-352；H-132至L-352；A-133至L-352；V-134至L-352；F-135至L-352；A-136至L-352；L-137至L-352；K-138至L-352；A-139至L-352；R-140至L-352；T-141至L-352；V-142至L-352；T-143至L-352；F-144至L-352；G-145至L-352；V-146至L-352；V-147至L-352；T-148至L-352；S-149至L-352；V-150至L-352；1-151至L-352；T-152至L-352；W-153至L-352；V-154至L-352；V-155至L-352；A-156至L-352；V-157至L-352；F-158至L-352；A-159至L-352；S-160至L-352；L-161至L-352；P-162至L-352；G-163至L-352；I-164至L-352；I-165至L-352；F-166至L-352；T-167至L-352；R-168至L-352；S-169至L-352；Q-170至L-352；K-171至L-352；E-172至L-352；G-173至L-352；L-174至L-352；H-175至L-352；Y-176至L-352；T-177至L-352；C-178至L-352；S-179至L-352；S-180至L-352；H-181至L-352；F-182至L-352；P-183至L-352；Y-184至L-352；S-185至L-352；Q-186至L-352；Y-187至L-352；Q-188至L-352；F-189至L-352；W-190至L-352；K-191至L-352；N-192至L-352；F-193至L-352；Q-194至L-352；T-195至L-352；L-196至L-352；K-197至L-352；I-198至L-352；V-199至L-352；I-200至L-352；L-201至L-352；G-202至L-352；L-203至L-352；V-204至L-352；L-205至L-352；P-206至L-352；L-207至L-352；L-208至L-352；V-209至L-352；M-210至L-352；V-211至L-352；I-212至L-352；C-213至L-352；Y-214至L-352；S-215至L-352；G-216至L-352；1-217至L-352；L-218至L-352；K-219至L-352；T-220至L-352；L-221至L-352；L-222至L-352；R-223至L-352；C-224至L-352；R-225至L-352；N-226至L-352；E-227至L-352；N-352；K-228至L-352；K-229至L-352；R-230至L-352；H-231至L-352；R-232至L-352；A-233至L-352；V-234至L-352；R-235至L-352；L-236至L-352；I-237至L-352；F-238至L-352；T-239至L-352；I-240至L-352；M-241至L-352；I-242至L-352；V-243至L-352；Y-244至L-352；F-245至L-352；L-246至L-352；F-247至L-352；W-248至L-352；A-249至L-352；P-250至L-352；Y-251至L-352；N-252至L-352；I-253至L-352；V-254至L-352；L-255至L-352；L-256至L-352；L-257至L-352；N-258至L-352；T-259至L-352；F-260至L-352；Q-261至L-352；E-262至L-352；F-263至L-352；F-264至L-352；G-265至L-352；L-266至L-352；N-267至L-352；N-268至L-352；C-269至L-352；S-270至L-352；S-271至L-352；S-272至L-352；N-273至L-352；R-274至L-352；L-275至L-352；D-276至L-352；Q-277至L-352；A-278至L-352；M-279至L-352；Q-280至L-352；V-281至L-352；T-282至L-352；E-283至L-352；T-284至L-352；L-285至L-352；G-286至L-352；M-287至L-352；T-288至L-352；H-289至L-352；C-290至L-352；C-291至L-352；I-292至L-352；N-293至L-352；P-294至L-352；I-295至L-352；I-296至L-352；Y-297至L-352；A-298至L-352；F-299至L-352；V-300至L-352；G-301至L-352；E-302至L-352；K-303至L-352；F-304至L-352；R-305至L-352；N-306至L-352；Y-307至L-352；L-308至L-352；L-309至L-352；V-310至L-352；F-311至L-352；F-312至L-352；Q-313至L-352；K-314至L-352；H-315至L-352；I-316至L-352；A-317至L-352；K-318至L-352；R-319至L-352；F-320至L-352；C-321至L-352；K-322至L-352；C-323至L-352；C-324至L-352；S-325至L-352；I-326至L-352；F-327至L-352；Q-328至L-352；Q-329至L-352；E-330至L-352；A-331至L-352；P-332至L-352；E-333至L-352；R-334至L-352；A-335至L-352；S-336至L-352；S-337至L-352；V-338至L-352；Y-339至L-352；T-340至L-352；R-341至L-352；S-342至L-352；T-343至L-352；G-344至L-352；E-345至L-352；Q-346至L-352；和/或E-347至L-352。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
此外，本发明还提供编码包含如下氨基酸序列或由其组成的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列为N端残基缺失的保藏克隆HDGNR10所编码多肽(SEQ ID NO22)，包括包含具有如下残基的氨基酸序列的多肽SEQID NO22的D-2至L-352；Y-3至L-352；Q-4至L-352；V-5至L-352；S-6至L-352；S-7至L-352；P-8至L-352；I-9至L-352；Y-10至L-352；D-11至L-352；I-12至L-352；N-13至L-352；Y-14至L-352；Y-15至L-352；T-16至L-352；S-17至L-352；E-18至L-352；P-19至L-352；C-20至L-352；Q-21至L-352；K-22至L-352；I-23至L-352；N-24至L-352；V-25至L-352；K-26至L-352；Q-27至L-352；I-28至L-352；A-29至L-352；A-30至L-352；R-31至L-352；L-32至L-352；L-33至L-352；P-34至L-352；P-35至L-352；L-36至L-352；Y-37至L-352；S-38至L-352；L-39至L-352；V-40至L-352；F-41至L-352；I-42至L-352；F-43至L-352；G-44至L-352；F-45至L-352；V-46至L-352；G-47至L-352；N-48至L-352；M-49至L-352；L-50至L-352；V-51至L-352；I-52至L-352；L-53至L-352；I-54至L-352；L-55至L-352；I-56至L-352；N-57至L-352；C-58至L-352；K-59至L-352；R-60至L-352；L-61至L-352；K-62至L-352；S-63至L-352；M-64至L-352；T-65至L-352；D-66至L-352；I-67至L-352；Y-68至L-352；L-69至L-352；L-70至L-352；N-71至L-352；L-72至L-352；A-73至L-352；I-74至L-352；S-75至L-352；D-76至L-352；L-77至L-352；F-78至L-352；F-79至L-352；L-80至L-352；L-81至L-352；T-82至L-352；V-83至L-352；P-84至L-352；F-85至L-352；W-86至L-352；A-87至L-352；H-88至L-352；Y-89至L-352；A-90至L-352；A-91至L-352；A-92至L-352；Q-93至L-352；W-94至L-352；D-95至L-352；F-96至L-352；G-97至L-352；N-98至L-352；T-99至L-352；M-100至L-352；C-101至L-352；Q-102至L-352；L-103至L-352；L-104至L-352；T-105至L-352；G-106至L-352；L-107至L-352；Y-108至L-352；F-109至L-352；I-110至L-352；G-111至L-352；F-112至L-352；F-113至L-352；S-114至L-352；G-115至L-352；I-116至L-352；F-117至L-352；F-118至L-352；I-119至L-352；I-120至L-352；L-121至L-352；L-122至L-352；T-123至L-352；I-124至L-352；D-125至L-352；R-126至L-352；Y-127至L-352；L-128至L-352；A-129至L-352；V-130至L-352；V-131至L-352；H-132至L-352；A-133至L-352；V-134至L-352；F-135至L-352；A-136至L-352；L-137至L-352；K-138至L-352；A-139至L-352；R-140至L-352；T-141至L-352；V-142至L-352；T-143至L-352；F-144至L-352；G-145至L-352；V-146至L-352；V-147至L-352；T-148至L-352；S-149至L-352；V-150至L-352；I-151至L-352；T-152至L-352；W-153至L-352；V-154至L-352；V-155至L-352；A-156至L-352；V-157至L-352；F-158至L-352；A-159至L-352；S-160至L-352；L-161至L-352；P-162至L-352；G-163至L-352；I-164至L-352；I-165至L-352；F-166至L-352；T-167至L-352；R-168至L-352；S-169至L-352；Q-170至L-352；K-171至L-352；E-172至L-352；G-173至L-352；L-174至L-352；H-175至L-352；Y-176至L-352；T-177至L-352；C-178至L-352；S-179至L-352；S-180至L-352；H-181至L-352；F-182至L-352；P-183至L-352；Y-184至L-352；S-185至L-352；Q-186至L-352；Y-187至L-352；Q-188至L-352；F-189至L-352；W-190至L-352；K-191至L-352；N-192至L-352；F-193至L-352；Q-194至L-352；T-195至L-352；L-196至L-352；K-197至L-352；I-198至L-352；V-199至L-352；I-200至L-352；L-201至L-352；G-202至L-352；L-203至L-352；V-204至L-352；L-205至L-352；P-206至L-352；L-207至L-352；L-208至L-352；V-209至L-352；M-210至L-352；V-211至L-352；I-212至L-352；C-213至L-352；Y-214至L-352；S-215至L-352；G-216至L-352；I-217至L-352；L-218至L-352；K-219至L-352；T-220至L-352；L-221至L-352；L-222至L-352；R-223至L-352；C-224至L-352；R-225至L-352；N-226至L-352；E-227至L-352；K-228至L-352；K-229至L-352；R-230至L-352；H-231至L-352；R-232至L-352；A-233至L-352；V-234至L-352；R-235至L-352；L-236至L-352；I-237至L-352；F-238至L-352；T-239至L-352；I-240至L-352；M-241至L-352；I-242至L-352；V-243至L-352；Y-244至L-352；F-245至L-352；L-246至L-352；F-247至L-352；W-248至L-352；A-249至L-352；P-250至L-352；Y-251至L-352；N-252至L-352；I-253至L-352；V-254至L-352；L-255至L-352；L-256至L-352；L-257至L-352；N-258至L-352；T-259至L-352；F-260至L-352；Q-261至L-352；E-262至L-352；F-263至L-352；F-264至L-352；G-265至L-352；L-266至L-352；N-267至L-352；N-268至L-352；C-269至L-352；S-270至L-352；S-271至L-352；S-272至L-352；N-273至L-352；R-274至L-352；L-275至L-352；D-276至L-352；Q-277至L-352；A-278至L-352；M-279至L-352；Q-280至L-352；V-281至L-352；T-282至L-352；E-283至L-352；T-284至L-352；L-285至L-352；G-286至L-352；M-287至L-352；T-288至L-352；H-289至L-352；C-290至L-352；C-291至L-352；I-292至L-352；N-293至L-352；P-294至L-352；I-295至L-352；I-296至L-352；Y-297至L-352；A-298至L-352；F-299至L-352；V-300至L-352；G-301至L-352；E-302至L-352；K-303至L-352；F-304至L-352；R-305至L-352；N-306至L-352；Y-307至L-352；L-308至L-352；L-309至L-352；V-310至L-352；F-311至L-352；F-312至L-352；Q-313至L-352；K-314至L-352；H-315至L-352；I-316至L-352；A-317至L-352；K-318至L-352；R-319至L-352；F-320至L-352；C-321至L-352；K-322至L-352；C-323至L-352；C-324至L-352；S-325至L-352；I-326至L-352；F-327至L-352；Q-328至L-352；Q-329至L-352；E-330至L-352；A-331至L-352；P-332至L-352；E-333至L-352；R-334至L-352；A-335至L-352；S-336至L-352；S-337至L-352；V-338至L-352；Y-339至L-352；T-340至L-352；R-341至L-352；S-342至L-352；T-343至L-352；E-344至L-352；E-345至L-352；Q-346至L-352；和/或E-347至L-352。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
本发明还涉及包含如下多核苷酸序列或由其组成的核酸分子，所述多核苷酸序列与编码上述G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的多核苷酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％一致。本发明还包括与异源多核苷酸序列融合的上述多核苷酸序列。
而且正如以上提及的，即使从多肽的C端缺失一个或多个氨基酸导致该蛋白质的一种或多种生物学功能被修饰或丧失，也仍可以保留其它的功能活性(例如生物学活性、多聚化能力、结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体的能力)。例如，当从C端除去该完整或成熟多肽的不足大多数的残基后，此缩短的G蛋白趋化因子受体(CCR5)突变蛋白诱导和/或结合识别该多肽的完整或成熟形式的抗体的能力一般可以得以保留。缺少完整蛋白质C端残基的特定多肽是否保留了此免疫原活性，可以通过本文描述的和否则本领域已知的常规方法容易地确定。缺失大数目的C端氨基酸残基的G蛋白趋化因子受体(CCR5)突变蛋白可以保留一些生物学或免疫原活性，这不是不可能的。实际上，由少至6个G蛋白趋化因子受体(CCR5)氨基酸残基组成的肽常常可以激起免疫应答。
因此，本发明还提供从图1所示G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或保藏克隆所编码的该多肽的氨基酸序列羧基端缺失一或多个残基的多肽，见通式1-n，其中n是6至346的整数，其中n相应于SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽中所规定的氨基酸残基位置。更具体地，本发明提供编码包含如下氨基酸序列或由其组成的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列为SEQ ID NO2的残基D-2至G-351；D-2至V-350；D-2至S-349；D-2至I-348；D-2至E-347；D-2至Q-346；D-2至E-345；D-2至G-344；D-2至T-343；D-2至S-342；D-2至R-341；D-2至T-340；D-2至Y-339；D-2至V-338；D-2至S-337；D-2至S-336；D-2至A-335；D-2至R-334；D-2至E-333；D-2至P-332；D-2至A-331；D-2至E-330；D-2至Q-329；D-2至Q-328；D-2至F-327；D-2至I-326；D-2至S-325；D-2至C-324；D-2至C-323；D-2至K-322；D-2至C-321；D-2至F-320；D-2至R-319；D-2至K-318；D-2至A-317；D-2至I-316；D-2至H-315；D-2至K-314；D-2至Q-313；D-2至F-312；D-2至F-311；D-2至V-310；D-2至L-309；D-2至L-308；D-2至Y-307；D-2至N-306；D-2至R-305；D-2至F-304；D-2至K-303；D-2至E-302；D-2至G-301；D-2至V-300；D-2至F-299；D-2至A-298；D-2至Y-297；D-2至I-296；D-2至I-295；D-2至P-294；D-2至N-293；D-2至I-292；D-2至C-291；D-2至C-290；D-2至H-289；D-2至T-288；D-2至M-287；D-2至G-286；D-2至L-285；D-2至T-284；D-2至E-283；D-2至T-282；D-2至V-281；D-2至Q-280；D-2至M-279；D-2至A-278；D-2至Q-277；D-2至D-276；D-2至L-275；D-2至R-274；D-2至N-273；D-2至S-272；D-2至S-271；D-2至S-270；D-2至C-269；D-2至N-268；D-2至N-267；D-2至L-266；D-2至G-265；D-2至F-264；D-2至F-263；D-2至E-262；D-2至Q-261；D-2至F-260；D-2至T-259；D-2至N-258；D-2至L-257；D-2至L-256；D-2至L-255；D-2至V-254；D-2至I-253；D-2至N-252；D-2至Y-251；D-2至P-250；D-2至A-249；D-2至W-248；D-2至F-247；D-2至L-246；D-2至F-245；D-2至Y-244；D-2至V-243；D-2至I-242；D-2至M-241；D-2至I-240；D-2至T-239；D-2至F-238；D-2至I-237；D-2至L-236；D-2至R-235；D-2至V-234；D-2至A-233；D-2至R-232；D-2至H-231；D-2至R-230；D-2至K-229；D-2至K-228；D-2至E-227；D-2至N-226；D-2至R-225；D-2至C-224；D-2至R-223；D-2至L-222；D-2至L-221；D-2至T-220；D-2至K-219；D-2至L-218；D-2至I-217；D-2至G-216；D-2至S-215；D-2至Y-214；D-2至C-213；D-2至I-212；D-2至V-211；D-2至M-210；D-2至V-209；D-2至L-208；D-2至L-207；D-2至P-206；D-2至L-205；D-2至V-204；D-2至L-203；D-2至G-202；D-2至L-201；D-2至I-200；D-2至V-199；D-2至I-198；D-2至K-197；D-2至L-196；D-2至T-195；D-2至Q-194；D-2至F-193；D-2至N-192；D-2至K-191；D-2至W-190；D-2至F-189；D-2至Q-188；D-2至Y-187；D-2至Q-186；D-2至S-185；D-2至Y-184；D-2至P-183；D-2至F-182；D-2至H-181；D-2至S-180；D-2至S-179；D-2至C-178；D-2至T-177；D-2至Y-176；D-2至H-175；D-2至L-174；D-2至G-173；D-2至E-172；D-2至K-171；D-2至Q-170；D-2至S-169；D-2至R-168；D-2至T-167；D-2至F-166；D-2至I-165；D-2至I-164；D-2至G-163；D-2至P-162；D-2至L-161；D-2至S-160；D-2至A-159；D-2至F-158；D-2至V-157；D-2至A-156；D-2至V-155；D-2至V-154；D-2至W-153；D-2至T-152；D-2至I-151；D-2至V-150；D-2至S-149；D-2至T-148；D-2至V-147；D-2至V-146；D-2至G-145；D-2至F-144；D-2至T-143；D-2至V-142；D-2至T-141；D-2至R-140；D-2至A-139；D-2至K-138；D-2至L-137；D-2至A-136；D-2至F-135；D-2至V-134；D-2至A-133；D-2至H-132；D-2至V-131；D-2至I-130；D-2至A-129；D-2至L-128；D-2至Y-127；D-2至R-126；D-2至D-125；D-2至I-124；D-2至T-123；D-2至L-122；D-2至L-121；D-2至I-120；D-2至I-119；D-2至F-118；D-2至F-117；D-2至I-116；D-2至G-115；D-2至S-114；D-2至F-113；D-2至F-112；D-2至G-111；D-2至I-110；D-2至F-109；D-2至Y-108；D-2至L-107；D-2至G-106；D-2至T-105；D-2至L-104；D-2至L-103；D-2至Q-102；D-2至C-101；D-2至M-100；D-2至T-99；D-2至N-98；D-2至G-97；D-2至F-96；D-2至D-95；D-2至W-94；D-2至Q-93；D-2至A-92；D-2至A-91；D-2至A-90；D-2至Y-89；D-2至H-88；D-2至A-87；D-2至W-86；D-2至F-85；D-2至P-84；D-2至V-83；D-2至T-82；D-2至L-81；D-2至L-80；D-2至F-79；D-2至F-78；D-2至L-77；D-2至D-76；D-2至S-75；D-2至I-74；D-2至A-73；D-2至L-72；D-2至N-71；D-2至L-70；D-2至L-69；D-2至Y-68；D-2至I-67；D-2至D-66；D-2至T-65；D-2至M-64；D-2至S-63；D-2至E-62；D-2至L-61；D-2至R-60；D-2至Q-59；D-2至C-58；D-2至N-57；D-2至I-56；D-2至L-55；D-2至I-54；D-2至L-53；D-2至I-52；D-2至V-51；D-2至M-49；D-2至N-48；D-2至G-47；D-2至V-46；D-2至F-45；D-2至G-44；D-2至F-43；D-2至I-42；D-2至F-41；D-2至V-40；D-2至L-39；D-2至S-38；D-2至Y-37；D-2至L-36；D-2至P-35；D-2至P-34；D-2至L-33；D-2至L-32；D-2至R-31；D-2至A-30；D-2至A-29；D-2至I-28；D-2至Q-27；D-2至K-26；D-2至V-25；D-2至N-24；D-2至I-23；D-2至K-22；D-2至P-21；D-2至C-20；D-2至P-19；D-2至E-18；D-2至S-17；D-2至T-16；D-2至Y-15；D-2至Y-14；D-2至N-13；D-2至I-12；D-2至D-11；D-2至Y-10；D-2至I-9；和/或D-2至P-8。而且，可以向所有这些C端结构的N端添加甲硫氨酸。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
此外，本发明提供编码包含如下氨基酸序列或由其组成的多肽的多核苷酸，其中所述氨基酸序列具有SEQ ID NO22的残基D-2至G-351；D-2至V-350；D-2至S-349；D-2至I-348；D-2至E-347；D-2至Q-346；D-2至E-345；D-2至E-344；D-2至T-343；D-2toS-342；D-2至R-341；D-2至T-340；D-2至Y-339；D-2至V-338；D-2至S-337；D-2至S-336；D-2至A-335；D-2至R-334；D-2至E-333；D-2至P-332；D-2至A-331；D-2至E-330；D-2至Q-329；D-2至Q-328；D-2至F-327；D-2至I-326；D-2至S-325；D-2至C-324；D-2至C-323；D-2至K-322；D-2至C-321；D-2至F-320；D-2至R-319；D-2至K-318；D-2至A-317；D-2至I-316；D-2至H-315；D-2至K-314；D-2至Q-313；D-2至F-312；D-2至F-311；D-2至V-310；D-2至L-309；D-2至L-308；D-2至Y-307；D-2至N-306；D-2至R-305；D-2至F-304；D-2至K-303；D-2至E-302；D-2至G-301；D-2至V-300；至D-2至F-299；D-2至A-298；D-2至Y-297；D-2至I-296；D-2至I-295；D-2至P-294；D-2至N-293；D-2至I-292；D-2至C-291；D-2至C-290；D-2至H-289；D-2至T-288；D-2至M-287；D-2至G-286；D-2至L-285；D-2至T-284；D-2至E-283；D-2至T-282；D-2至V-281；D-2至Q-280；D-2至M-279；D-2至A-278；D-2至Q-277；D-2至D-276；D-2至L-275；D-2至R-274；D-2至N-273；D-2至S-272；D-2至S-271；D-2至S-270；D-2至C-269；D-2至N-268；D-2至N-267；D-2至L-266；D-2至G-265；D-2至F-264；D-2至F-263；D-2至E-262；D-2至Q-261；D-2至F-260；D-2至T-259；D-2至N-258；D-2至L-257；D-2至L-256；D-2至L-255；D-2至V-254；D-2至I-253；D-2至N-252；D-2至Y-251；D-2至P-250；D-2至A-249；D-2至W-248；D-2至F-247；D-2至L-246；D-2至F-245；D-2至Y-244；D-2至V-243；D-2至I-242；D-2至M-241；D-2至I-240；D-2至T-239；D-2至F-238；D-2至I-237；D-2至L-236；D-2至R-235；D-2至V-234；D-2至A-233；D-2至R-232；D-2至H-231；D-2至R-230；D-2至K-229；D-2至K-228；D-2至E-227；D-2至N-226；D-2至R-225；D-2至C-224；D-2至R-223；D-2至L-222；D-2至L-221；D-2至T-220；D-2至K-219；D-2至L-218；D-2至I-217；D-2至G-216；D-2至S-215；D-2至Y-214；D-2至C-213；D-2至I-212；D-2至V-211；D-2至M-210；D-2至V-209；D-2至L-208；D-2至L-207；D-2至P-206；D-2至L-205；D-2至V-204；D-2至L-203；D-2至G-202；D-2至L-201；D-2至I-200；D-2至V-199；D-2至I-198；D-2至K-197；D-2至L-196；D-2至T-195；D-2至Q-194；D-2至F-193；D-2至N-192；D-2至K-191；D-2至W-190；D-2至F-189；D-2至Q-188；D-2至Y-187；D-2至Q-186；D-2至S-185；D-2至Y-184；D-2至P-183；D-2至F-182；D-2至H-181；D-2至S-180；D-2至S-179；D-2至C-178；D-2至T-177；D-2至Y-176；D-2至H-175；D-2至L-174；D-2至G-173；D-2至E-172；D-2至K-171；D-2至Q-170；D-2至S-169；D-2至R-168；D-2至T-167；D-2至F-166；D-2至I-165；D-2至I-164；D-2至G-163；D-2至P-162；D-2至L-161；D-2至S-160；D-2至A-159；D-2至F-158；D-2至V-157；D-2至A-156；D-2至V-155；D-2至V-154；D-2至W-153；D-2至T-152；D-2至I-151；D-2至V-150；D-2至S-149；D-2至T-148；D-2至V-147；D-2至V-146；D-2至G-145；D-2至F-144；D-2至T-143；D-2至V-142；D-2至T-141；D-2至R-140；D-2至A-139；D-2至K-138；D-2至L-137；D-2至A-136；D-2至F-135；D-2至V-134；D-2至A-133；D-2至H-132；D-2至V-131；D-2至V-130；D-2至A-129；D-2至L-128；D-2至Y-127；D-2至R-126；D-2至D-125；D-2至I-124；D-2至T-123；D-2至L-122；D-2至L-121；D-2至I-120；D-2至I-119；D-2至F-118；D-2至F-117；D-2至I-116；D-2至G-115；D-2至S-114；D-2至F-113；D-2至F-112；D-2至G-111；D-2至I-110；D-2至F-109；D-2至Y-108；D-2至L-107；D-2至G-106；D-2至T-105；D-2至L-104；D-2至L-103；D-2至Q-102；D-2至C-101；D-2至M-100；D-2至T-99；D-2至N-98；D-2至G-97；D-2至F-96；D-2至D-95；D-2至W-94；D-2至Q-93；D-2至A-92；D-2至A-91；D-2至A-90；D-2至Y-89；D-2至H-88；D-2至A-87；D-2至W-86；D-2至F-85；D-2至P-84；D-2至V-83；D-2至T-82；D-2至L-81；D-2至L-80；D-2至F-79；D-2至F-78；D-2至L-77；D-2至D-76；D-2至S-75；D-2至I-74；D-2至A-73；D-2至L-72；D-2至N-71；D-2至L-70；D-2至L-69；D-2至Y-68；D-2至I-67；D-2至D-66；D-2至T-65；D-2至M-64；D-2至S-63；D-2至K-62；D-2至L-61；D-2至R-60；D-2至K-59；D-2至C-58；D-2至N-57；D-2至I-56；D-2至L-55；D-2至I-54；D-2至L-53；D-2至I-52；D-2至V-51；D-2至L-50；D-2至M-49；D-2至N-48；D-2至G-47；D-2至V-46；D-2至F-45；D-2至G-44；D-2至F-43；D-2至I-42；D-2至F-41；D-2至V-40；D-2至L-39；D-2至S-38；D-2至Y-37；D-2至L-36；D-2至P-35；D-2至P-34；D-2至L-33；D-2至L-32；D-2至R-31；D-2至A-30；D-2至A-29；D-2至I-28；D-2至Q-27；D-2至K-26；D-2至V-25；D-2至N-24；D-2至I-23；D-2至K-22；D-2至Q-21；D-2至C-20；D-2至P-19；D-2至E-18；D-2至S-17；D-2至T-16；D-2至Y-15；D-2至Y-14；D-2至N-13；D-2至I-12；D-2至D-11；D-2至Y-10；D-2至I-9；和/或D-2至P-8。而且，可以向所有这些C端结构的N端添加甲硫氨酸。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
本发明申请还涉及包含如下多核苷酸序列或由其组成的核酸分子，所述多核苷酸序列与编码上述G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的多核苷酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％一致。本发明还包括与异源多核苷酸序列融合的上述多核苷酸序列。
此外，所有以上所列N或C端缺失均可以相组合以产生N和C端缺失的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽。本发明还提供从氨基和羧基两端缺失一或多个氨基酸的多肽，该多肽可以一般地描述为具有SEQ ID NO2或保藏克隆所编码多肽的m-n位残基，其中n和m是如上所述的整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明还包括编码由ATCC保藏克隆97183所编码的完整G蛋白趋化因子受体(CCR5)氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中该部分从ATCC保藏克隆97183所编码完整氨基酸序列的氨基端排除了1至约342之间的任意整数个氨基酸残基、或从ATCC保藏克隆97183所编码完整氨基酸序列的羧基端排除了1至约342之间的任意整数个氨基酸残基、或以上氨基和羧基端缺失的任何组合。本发明还提供编码所有上述缺失突变多肽形式的多核苷酸。
本发明申请还涉及含有与此处所列m-n的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽至少90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽的蛋白质。在优选实施方案中，本申请涉及含有与具有此处所引特定G蛋白趋化因子受体(CCR5)N和C端缺失物的氨基酸序列的多肽有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽的蛋白质。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
其它优选的多肽片段包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO2的残基M-1至Y-15；D-2至T-16；Y-3至S-17；Q-4至E-18；V-5至P-19；S-6至C-20；S-7至P-21；P-8至K-22；I-9至I-23；Y-10至N-24；D-11至V-25；I-12至K-26；N-13至Q-27；Y-14至I-28；Y-15至A-29；T-16至A-30；S-17至R-31；E-18至L-32；P-19至L-33；C-20至P-34；P-21至P-35；K-22至L-36；I-23至Y-37；N-24至S-38；V-25至L-39；K-26至V-40；Q-27至F-41；I-28至I-42；A-29至F-43；A-30至G-44；R-31至F-45；L-32至V-46；L-33至G-47；P-34至N-48；P-35至M-49；L-36至L-50；Y-37至V-51；S-38至I-52；L-39至L-53；V-40至I-54；F-41至L-55；I-42至I-56；F-43至N-57；G-44至C-58；F-45至Q-59；V-46至R-60；G-47至L-61；N-48至E-62；M-49至S-63；L-50至M-64；V-51至T-65；I-52至D-66；L-53至I-67；I-54至Y-68；L-55至L-69；I-56至L-70；N-57至N-71；C-58至L-72；Q-59至A-73；R-60至I-74；L-61至S-75；E-62至D-76；S-63至L-77；M-64至F-78；T-65至F-79；D-66至L-80；I-67至L-81；Y-68至T-82；L-69至V-83；L-70至P-84；N-71至F-85；L-72至W-86；A-73至A-87；I-74至H-88；S-75至Y-89；D-76至A-90；L-77至A-91；F-78至A-92；F-79至Q-93；L-80至W-94；L-81至D-95；T-82；至F-96；V-83至G-97；P-84至N-98；F-85至T-99；W-86至M-100；A-87至C-101；H-88；至Q-102；Y-89至L-103；A-90至L-104；A-91至T-105；A-92至G-106；Q-93至L-107；W-94至Y-108；D-95至F-109；F-96至I-110；G-97至G-111；N-98至F-112；T-99至F-113；M-100至S-114；C-101至G-115；Q-102至I-116；L-103至F-117；L-104至F-118；T-105至I-119；G-106至I-120；L-107至L-121；Y-108至L-122；F-109至T-123；I-110至I-124；G-111至D-125；F-112至R-126；F-113至Y-127；S-114至L-128；G-115至A-129；I-116至I-130；F-117至V-131；F-118至H-132；I-119至A-133；I-120至V-134；L-121至F-135；L-122至A-136；T-123至L-137；I-124至K-138；D-125至A-139；R-126至R-140；Y-127至T-141；L-128至V-142；A-129至T-143；I-130至F-144；V-131至G-145；H-132至V-146；A-133至V-147；V-134至T-148；F-135至S-149；A-136至V-150；L-137至I-151；K-138至T-152；A-139至W-153；R-140至V-154；T-141至V-155；V-142至A-156；T-143至V-157；F-144至F-158；G-145至A-159；V-146至S-160；V-147至L-161；T-148至P-162；S-149至G-163；V-150至I-164；I-151至I-165；T-152至F-166；W-153至T-167；V-154至R-168；V-155至S-169；A-156至Q-170；V-157至K-171；F-158至E-172；A-159至G-173；S-160至L-174；L-161至H-175；P-162至Y-176；G-163至T-177；I-164至C-178；I-165至S-179；F-166至S-180；T-167至H-181；R-168至F-182；S-169至P-183；Q-170至Y-184；K-171至S-185；E-172至Q-186；G-173至Y-187；L-174至Q-188；H-175至F-189；Y-176至W-190；T-177至K-191；C-178至N-192；S-179至F-193；S-180至Q-194；H-181至T-195；F-182至L-196；P-183至K-197；Y-184至I-198；S-185至V-199；Q-186至I-200；Y-187至L-201；Q-188至G-202；F-189至L-203；W-190至V-204；K-191至L-205；N-192至P-206；F-193至L-207；Q-194至L-208；T-195至V-209；L-196至M-210；K-197至V-211；I-198至I-212；V-199至C-213；I-200至Y-214；L-201至S-215；G-202至G-216；L-203至I-217；V-204至L-218；L-205至K-219；P-206至T-220；L-207至L-221；L-208至L-222；V-209至R-223；M-210至C-224；V-211至R-225；I-212至N-226；C-213至E-227；Y-214至K-228；S-215至K-229；G-216至R-230；I-217至H-231；L-218至R-232；K-219至A-233；T-220至V-234；L-221至R-235；L-222至L-236；R-223至I-237；C-224至F-238；R-225至T-239；N-226至I-240；E-227至M-241；K-228至I-242；K-229至V-243；R-230至Y-244；H-231至F-245；R-232至L-246；A-233至F-247；V-234至W-248；R-235至A-249；L-236至P-250；I-237至Y-251；F-238至N-252；T-239至I-253；I-240至V-254；M-241至L-255；I-242至L-256；V-243至L-257；Y-244至N-258；F-245至T-259；L-246至F-260；F-247至Q-261；W-248至E-262；A-249至F-263；P-250至F-264；Y-251至G-265；N-252至L-266；I-253至N-267；V-254至N-268；L-255至C-269；L-256至S-270；L-257至S-271；N-258至S-272；T-259至N-273；F-260至R-274；Q-261至L-275；E-262至D-276；F-263至Q-277；F-264至A-278；G-265至M-279；L-266至Q-280；N-267至V-281；N-268至T-282；C-269至E-283；S-270至T-284；S-271至L-285；S-272至G-286；N-273至M-287；R-274至T-288；L-275至H-289；D-276至C-290；Q-277至C-291；A-278至I-292；M-279至N-293；Q-280至P-294；V-281至I-295；T-282至I-296；E-283至Y-297；T-284至A-298；L-285至F-299；G-286至V-300；M-287至G-301；T-288至E-302；H-289至K-303；C-290至F-304；C-291至R-305；I-292至N-306；N-293至Y-307；P-294至L-308；I-295至L-309；I-296至V-310；Y-297至F-311；A-298至F-312；F-299至Q-313；V-300至K-314；G-301至H-315；E-302至I-316；K-303至A-317；F-304至K-318；R-305至R-319；N-306至F-320；Y-307至C-321；L-308至K-322；L-309至C-323；V-310至C-324；F-311至S-325；F-312至I-326；Q-313至F-327；K-314至Q-328；H-315至Q-329；I-316至E-330；A-317至A-331；K-318至P-332；R-319至E-333；F-320至R-334；C-321至A-335；K-322至S-336；C-323至S-337；C-324至V-338；S-325至Y-339；I-326至T-340；F-327至R-341；Q-328至S-342；Q-329至T-343；E-330至G-344；A-331至E-345；P-332至Q-346；E-333至E-347；R-334至I-348；A-335至S-349；S-336至V-350；S-337至G-351；和/或V-338至L-352。
其它优选的多肽片段包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO22的残基M-1至Y-15；D-2至T-16；Y-3至S-17；Q-4至E-18；V-5至P-19；S-6至C-20；S-7至Q-21；P-8至K-22；I-9至I-23；Y-10至N-24；D-11至V-25；I-12至K-26；N-13至Q-27；Y-14至I-28；Y-15至A-29；T-16至A-30；S-17至R-31；E-18至L-32；P-19至L-33；C-20至P-34；Q-21至P-35；K-22至L-36；I-23至Y-37；N-24至S-38；V-25至L-39；K-26至V-40；Q-27至F-41；I-28至I-42；A-29至F-43；A-30至G-44；R-31至F-45；L-32至V-46；L-33至G-47；P-34至N-48；P-35至M-49；L-36至L-50；Y-37至V-51；S-38至I-52；L-39至L-53；V-40至I-54；F-41至L-55；I-42至I-56；F-43至N-57；G-44至C-58；F-45至K-59；V-46至R-60；G-47至L-61；N-48至K-62；M-49至S-63；L-50至M-64；V-51至T-65；I-52至D-66；L-53至I-67；I-54至Y-68；L-55至L-69；I-56至L-70；N-57至N-71；C-58至L-72；K-59至A-73；R-60至I-74；L-61至S-75；K-62至D-76；S-63至L-77；M-64至F-78；T-65至F-79；D-66至L-80；I-67至L-81；Y-68至T-82；L-69至V-83；L-70至P-84；N-71至F-85；L-72至W-86；A-73至A-87；I-74至H-88；S-75至Y-89；D-76至A-90；L-77至A-91；F-78至A-92；F-79至Q-93；L-80至W-94；L-81至D-95；T-82至F-96；V-83至G-97；P-84至N-98；F-85至T-99；W-86至M-100；A-87至C-101；H-88至Q-102；Y-89至L-103；A-90至L-104；A-91至T-105；A-92至G-106；Q-93至L-107；W-94至Y-108；D-95至F-109；F-96至I-110；G-97至G-111；N-98至F-112；T-99至F-113；M-100至S-114；C-101至G-115；Q-102至I-116；L-103至F-117；L-104至F-118；T-105至I-119；G-106至I-120；L-107至L-121；Y-108至L-122；F-109至T-123；I-110至I-124；G-111至D-125；F-112至R-126；F-113至Y-127；S-114至L-128；G-115至A-129；I-116至V-130；F-117至V-131；F-118至H-132；I-119至A-133；I-120至V-134；L-121至F-135；L-122至A-136；T-123至L-137；I-124至K-138；D-125至A-139；R-126至R-140；Y-127至T-141；L-128至V-142；A-129至T-143；V-130至F-144；V-131至G-145；H-132至V-146；A-133至V-147；V-134至T-148；F-135至S-149；A-136至V-150；L-137至I-151；K-138至T-152；A-139至W-153；R-140至V-154；T-141至V-155；V-142至A-156；T-143至V-157；F-144至F-158；G-145至A-159；V-146至S-160；V-147至L-161；T-148至P-162；S-149至G-163；V-150至I-164；I-151至I-165；T-152至F-166；W-153至T-167；V-154至R-168；V-155至S-169；A-156至Q-170；V-157至K-171；F-158至E-172；A-159至G-173；S-160至L-174；L-161至H-175；P-162至Y-176；G-163至T-177；I-164至C-178；I-165至S-179；F-166至S-180；T-167至H-181；R-168至F-182；S-169至P-183；Q-170至Y-184；K-171至S-185；E-172至Q-186；G-173至Y-187；L-174至Q-188；H-175至F-189；Y-176至W-190；T-177至K-191；C-178至N-192；S-179至F-193；S-180至Q-194；H-181至T-195；F-182至L-196；P-183至K-197；Y-184至I-198；S-185至V-199；Q-186至I-200；Y-187至L-201；Q-188至G-202；F-189至L-203；W-190至V-204；K-191至L-205；N-192至P-206；F-193至L-207；Q-194至L-208；T-195至V-209；L-196至M-210；K-197至V-211；I-198至I-212；V-199至C-213；I-200至Y-214；L-201至S-215；G-202至G-216；L-203至I-217；V-204至L-218；L-205至K-219；P-206至T-220；L-207至L-221；L-208至L-222；V-209至R-223；M-210至C-224；V-211至R-225；I-212至N-226；C-213至E-227；Y-214至K-228；S-215至K-229；G-216至R-230；I-217至H-231；L-218至R-232；K-219至A-233；T-220至V-234；L-221至R-235；L-222至L-236；R-223至I-237；C-224至F-238；R-225至T-239；N-226至I-240；E-227至M-241；K-228至I-242；K-229至V-243；R-230至Y-244；H-231至F-245；R-232至L-246；A-233至F-247；V-234至W-248；R-235至A-249；L-236至P-250；I-237至Y-251；F-238至N-252；T-239至I-253；I-240至V-254；M-241至L-255；I-242至L-256；V-243至L-257；Y-244至N-258；F-245至T-259；L-246至F-260；F-247至Q-261；W-248至E-262；A-249至F-263；P-250至F-264；Y-251至G-265；N-252至L-266；I-253至N-267；V-254至N-268；L-255至C-269；L-256至S-270；L-257至S-271；N-258至S-272；T-259至N-273；F-260至R-274；Q-261至L-275；E-262至D-276；F-263至Q-277；F-264至A-278；G-265至M-279；L-266至Q-280；N-267至V-281；N-268至T-282；C-269至E-283；S-270至T-284；S-271至L-285；S-272至G-286；N-273至M-287；R-274至T-288；L-275至H-289；D-276至C-290；Q-277至C-291；A-278至I-292；M-279至N-293；Q-280至P-294；V-281至I-295；T-282至I-296；E-283至Y-297；T-284至A-298；L-285至F-299；G-286至V-300；M-287至G-301；T-288至E-302；H-289至K-303；C-290至F-304；C-291至R-305；I-292至N-306；N-293至Y-307；P-294至L-308；I-295至L-309；I-296至V-310；Y-297至F-311；A-298至F-312；F-299至Q-313；V-300至K-314；G-301至H-315；E-302至I-316；K-303至A-317；F-304至K-318；R-305至R-319；N-306至F-320；Y-307至C-321；L-308至K-322；L-309至C-323；V-310至C-324；F-311至S-325；F-312至I-326；Q-313至F-327；K-314至Q-328；H-315至Q-329；I-316至E-330；A-317至A-331；K-318至P-332；R-319至E-333；F-320至R-334；C-321至A-335；K-322至S-336；C-323至S-337；C-324至V-338；S-325至Y-339；I-326至T-340；F-327至R-341；Q-328至S-342；Q-329至T-343；E-330至E-344；A-331至E-345；P-332至Q-346；E-333至E-347；R-334至I-348；A-335至S-349；S-336至V-350；S-337至G-351；和/或V-338至L-352。
这些多肽片段可以保留本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的生物学活性和/或可以用于制备或筛选抗体，见以下进一步描述。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明还涉及包含如下多核苷酸序列或由其组成的核酸分子，所述多核苷酸序列与编码上述G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的多核苷酸序列至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％一致。本发明还包括与异源多核苷酸序列融合的以上多核苷酸序列。
此外，本申请还涉及含有与上述G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽至少90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽的蛋白质。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
优选地，本发明多核苷酸片段编码表现出G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能活性的多肽。所谓表现出G蛋白趋化因子受体(CCR5)“功能活性”的多肽，是指能够表现出与全长(完整)G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白质相关的一种或多种已知功能活性的多肽。这些功能活性包括，但不限于生物学活性、抗原性[结合(或与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽竞争结合)抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体的能力]、免疫原性(产生与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合的抗体的能力)、与本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽形成多聚体的能力、和与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的受体或配体结合的能力。
可以通过多种方法分析G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽、和片段、变体、衍生物和类似物的功能活性。
例如，在一个实施方案中，测定结合或与全长G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽竞争结合抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体的能力，就可以使用多种已知的免疫测定法，包括但不限于使用例如放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定法、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫分析(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹、沉淀反应、凝集分析(例如凝胶凝集分析、血细胞凝集测定)、补体结合分析法、免疫荧光测定法、蛋白A测定法、和免疫电泳分析法等技术的竞争和非竞争测定系统。在一个实施方案中，通过检测一抗上的标记检测抗体的结合。在另一实施方案中，通过检测二抗或试剂与一抗的结合检测一抗。在再一实施方案中，二抗是标记的。用于在免疫测定法中检测结合的许多手段是本领域已知的并属于本发明的范围。
在另一实施方案中，若鉴定G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体、或对编码多肽片段、变体或衍生物多聚化的能力作评价，则可以通过例如本领域熟知的手段测定结合，这些手段的例子有还原和非还原凝胶层析、蛋白亲和层析和亲和印迹。一般参见Phizicky，E.等1995，Microbiol.Rev.5994-123。在另一实施方案中，可以测定G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合其底物(信号转导)的相关生理情况。
此外，可以将本文所描述的(见实施例)和其它本领域已知的测定法常规地应用于测量G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽和其片段、变体、衍生物和类似物引起G蛋白趋化因子受体(CCR5)相关生物学活性(体外或体内)的能力。其它方法是本领域技术人员已知的并属于本发明范围。
以G蛋白趋化因子受体的结构或功能属性为特征的片段属于本发明尤其优选的片段。这些片段包括如下氨基酸残基，它们包含完整(即全长)G蛋白趋化因子受体(CCR5)(SEQ ID NO2)或保藏克隆编码的该完整多肽的α螺旋和α螺旋形成区(“α区”)、β片层和β片层形成区(“β区”)、转角和转角形成区(“转角区”)、卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)、亲水区、疏水区、α两亲性区、β两亲性区、表面形成区、和高抗原指数区(即含有4或更多个具有大于或等于1.5的抗原指数的连续氨基酸，使用Jameson-Wolf程序的默认参数进行鉴定)。某些优选区列在表3中，包括但不限于通过对图1(SEQ ID NO2)所示的或保藏克隆编码的氨基酸序列进行分析鉴定的上述类型的区域，这些优选区域包括Garnier-Robson预测的α区、β区、转角区、和卷曲区；Chou-Fasman预测的α区、β区、转角区、和卷曲区；Kyte-Doolittle预测的亲水和疏水区；Eisenberg α和β两亲性区；Emini表面形成区；和Jameson-Wolf的高抗原性指数区，这些均是使用这些计算机程序的默认参数进行预测的。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
其它实施方案中，本发明多核苷酸编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的功能属性(attributes)。在此方面，本发明的优选实施方案包括包含G蛋白趋化因子受体的α螺旋和α螺旋形成区(“α区”)、β片层和β片层形成区(“β区”)、转角和转角形成区(“转角区”)、卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)、亲水区、疏水区、α两亲性区、β两亲性区、柔性区、表面形成区和高抗原指数区的片段。
使用按默认参数设置的DNA*STAR的多个模块和算法，我们得到代表上述图1所示或保藏克隆编码的G蛋白趋化因子受体(CCR5)的结构或功能属性的数据和/或表1的数据。在一个优选实施方案中，列于表1栏VIII、IX、XIII和XIV中的数据可以用于确定表现出高度抗原性潜力的G蛋白趋化因子受体(CCR5)区域。高抗原性区域可以从栏VIII、IX、XIII和/或IV中的数据通过选择代表如下环境中可能暴露在多肽表面的多肽区域的值来确定，在所述环境中抗原的识别可能发生在免疫应答的起始过程中。
在这些方面，某些优选的区域列在图3中，但正如表1所示可以通过使用图3所示数据的列表形式来表示或确定。用于产生图3的DNA*STAR计算机算法(按原始默认参数设置的)被用于按列表格式陈述图3的数据(见表1)。可以使用图3中数据的列表格式容易地确定优选区域的具体边界。
图3和表1中给出的上述优选区域包括但不限于通过对图1所示的或保藏克隆编码的氨基酸序列进行分析而鉴定的上述类型区域。正如图3和表1中所示，这些优选区域包括Garnier-Robson α区、β区、转角区、和卷曲区；Chou-Fasman α区、β区、转角区、和卷曲区；Kyte-Doolittle亲水和疏水区；Eisenberg α和β两亲性区；Karplus-Schulz柔性区；Emini表面形成区；和Jameson-Wolf高抗原性指数区。表1Res 位置IIIIIIIVVVIVII VIIIIX XXI XII XIIIXIVMet1 . . B .. . .0.240.06 .*.0.051.68Asp2 . . B B. . .0.330.27 .*.-0.30 0.98Tyr3 . . B B. . .0.420.23 .*.-0.15 1.02Gln4 . . B B. . .0.600.19 .*.-0.15 1.38Val5 . . B B. . .0.100.00 .*F0.001.28Ser6 . . B B. . .0.460.69 **F-0.45 0.57Ser7 . . B B. . .0.460.69 **F-0.45 0.52Pro8 . . B B. . .-0.19 0.29 **F0.001.17Ile9 . . B B. . .-0.19 0.33 **.-0.30 0.61Tyr10 . . B B. . .0.420.34 *..-0.30 0.73Asp11 . . B .. T .0.480.71 ...-0.20 0.74Ile12 . . B .. T .0.471.04 ...-0.05 1.66Asn13 . . B .. T .0.380.84 *..-0.05 1.53Tyr14 . . B .. T .1.270.47 *..-0.05 1.23Tyr15 . . . BT . .1.300.47 .*.-0.05 3.03Thr16 . . . BT . .0.630.21 .*F0.652.91Ser17 . . . BT . .1.310.39 .*F0.751.00Glu18 . . B .. . .1.360.06 .*F0.800.98Pro19 . . . .T . .0.71-0.70 .*F2.501.36Cys20 . . . TT . .0.96-0.50 .*F2.500.71Pro21 . . . .T T .0.41-0.49 .*F2.250.66Lys22 . . . .T T .0.760.16 .*F1.400.32Ile23 A . . .. T .0.76-0.27 **F1.501.19Asn24 A A . .. . .0.08-0.44 .*F0.851.33Val25 A A . .. . .0.16-0.19 .*.0.300.47Lys26 . A B .. . .-0.220.31 .*.-0.30 0.67Gln27 . A B .. . .-0.160.13 **.-0.30 0.42Ile28 . A B .. . .-0.08-0.27 **.0.451.11Ala29 . A B .. . .-0.89-0.23 **.0.300.46Ala30 . A B .. . .-0.240.46 **.-0.60 0.22Arg31 . A B .. . .-0.500.49 **.-0.60 0.48Leu32 . A B .. . .-1.310.23 **.-0.30 0.74Leu33 . A B .. . .-0.670.41 **.-0.60 0.60Pro34 . . . .. T C-0.380.67 **F0.150.48Pro35 . . . .T T .-0.601.06 **F0.350.78Leu36 . . B .. T .-1.571.06 **.-0.20 0.78Tyr37 . . B .. T .-1.461.01 ...-0.20 0.38Ser38 . . B B. . .-1.531.37 ...-0.60 0.21Leu39 . . B B. . .-2.021.63 ...-0.60 0.18Val40 . . B B. . .-2.161.73 ...-0.60 0.10Phe41 . . B B. . .-2.041.40 ...-0.60 0.07Ile42 . . B B. . .-2.661.80 ...-0.60 0.08Phe43 . . B B. . .-2.701.76 ...-0.60 0.08Gly44 . . B B. . .-1.891.54 ...-0.60 0.09Phe45 . . . BT . .-1.631.16 ...-0.20 0.20Val46 . . . B. . C-1.741.09 ...-0.40 0.23Gly47 . . . B. . C-1.710.99 ...-0.40 0.19Asn48 A . . B. . .-1.901.20 ...-0.60 0.16Met49 A . . B. . .-2.371.10 ...-0.60 0.15Leu50 A . . B. . .-2.561.14 ...-0.60 0.13Val51 . . B B. . .-2.511.40 ...-0.60 0.06Ile52 . . B B. . .-3.061.69 ...-0.60 0.05Leu53 . . B B. . .-3.061.76 ...-0.60 0.04Ile54 . . B B. . .-3.121.47 .*.-0.60 0.09Leu55 . . B B. . .-2.311.40 *..-0.60 0.07Ile56 . . B B. . .-1.341.11 *..-0.60 0.14表1(续)Res 位置I II III IVV VI VII VIIIIX XXI XIIXIIIXIVAsn57 ..B B...-1.27 0.43.*.-0.600.39Cys58 .AB B...-0.46 0.43...-0.600.39Gln59 AA. B...0.13-0.26 *..0.30 0.96Arg60 AA. B...0.34-0.56 ..F0.75 0.80Leu61 AA. B...0.92-0.34 ..F0.60 1.47Glu62 .AB B...0.92-0.43 .*F0.60 1.23Ser63 .AB ....0.70-0.83 **F0.90 1.05Met64 .AB B...0.46-0.14 **F0.45 0.89Thr65 .AB B...-0.47 -0.07 .*F0.45 0.80Asp66 AA. B...-0.47 0.61.*.-0.600.50Ile67 AA. B...-0.47 0.91...-0.600.41Tyr68 AA. B...-0.98 0.70...-0.600.46Leu69 AA. B...-0.97 0.90...-0.600.23Leu70 AA. B...-1.54 1.40.*.-0.600.33Asn71 AA. B...-1.84 1.40...-0.600.15Leu72 .AB B...-0.96 1.03*..-0.600.24Ala73 AA. B...-1.52 0.34*..-0.300.48Ile74 AA. B...-1.41 0.34...-0.300.25Ser75 AA. B...-1.30 0.73.*.-0.600.26Asp76 AA. B...-2.11 0.83...-0.600.22Leu77 .AB B...-2.11 1.01...-0.600.26Phe78 .AB B...-1.83 1.01...-0.600.16Phe79 .AB B...-1.80 1.11...-0.600.14Leu80 .AB B...-1.71 1.76.*.-0.600.13Leu81 .AB B...-2.41 1.50.*.-0.600.22Thr82 .AB B...-1.89 1.50.*.-0.600.22Val83 .A. B..C-1.78 1.63.*.-0.400.29Pro84 AA. B...-1.11 1.44.*.-0.600.35Phe85 AA. B...-0.54 1.26...-0.600.33Trp86 AAB ....-0.32 1.53.*.-0.600.70Ala87 AA. B...-0.60 1.39...-0.600.45His88 AA. B...-0.33 1.46...-0.600.53Tyr89 AA. B...-0.12 1.17...-0.600.51Ala90 AA. B...0.290.66.*.-0.600.87Ala91 AA. ....0.581.07.*.-0.600.67Ala92 AA. ....0.470.57.*.-0.600.72Gln93 AA. ....0.160.60.*.-0.600.62Trp94 AA. ....0.400.53.*.-0.600.60Asp95 ... .TT.0.680.43.*.0.20 0.96Phe96 ... .TT.0.670.41.*.0.20 0.80Gly97 ... .TT.0.590.63**F0.35 0.75Asn98 ... .TT.0.590.29**F0.65 0.24Thr99 ... BT..0.070.69*..-0.200.48Met100... BT..-0.74 0.59*..-0.200.40Cys101..B B...-0.36 0.84*..-0.600.21Gln102..B B...-0.36 0.93*..-0.600.21Leu103..B B...-1.17 0.87*..-0.600.21Leu104..B B...-1.10 0.94...-0.600.32Thr105..B B...-1.20 1.13*..-0.600.29Gly106..B B...-1.42 1.51*..-0.600.30Leu107..B B...-1.77 1.51...-0.600.26Tyr108..B B...-1.66 1.26...-0.600.18Phe109..B B...-1.54 1.56...-0.600.15Ile110..B B...-1.53 1.91...-0.600.16Gly111..B B...-1.53 1.61...-0.600.14Phe112..B B...-1.61 1.29...-0.600.16表1(续)Res位置 I II III IV V VI VII VIIIIX XXI XII XIIIXIVPhe113..BB...-2.07 1.19... -0.600.16Ser114...B..C-2.07 1.29... -0.400.14Gly115...B..C-2.07 1.64... -0.400.14Ile116...B..C-2.61 1.54... -0.400.11Phe117..BB...-2.72 1.44... -0.600.06Phe118..BB...-2.83 1.74... -0.600.05Ile119..BB...-2.84 2.00... -0.600.06Ile120..BB...-3.39 1.80.*. -0.600.10Leu121..BB...-2.50 1.70*.. -0.600.08Leu122..BB...-1.69 0.91*.. -0.600.18Thr123A..B...-1.23 0.23*.. -0.300.52Ile124A..B...-1.16 0.30*.. -0.300.98Asp125A....T.-0.86 0.30*.F 0.25 0.98Arg126A....T.-0.93 0.11*.. 0.10 0.69Tyr127A....T.-0.98 0.31*.. 0.10 0.69Leu128A....T.-0.70 0.27*.. 0.10 0.30Ala129A..B...-0.40 0.77*.. -0.600.21Ile130A..B...-1.26 1.27*.. -0.600.14Val131A..B...-2.07 1.16*.. -0.600.12His132A..B...-2.41 1.26... -0.600.11Ala133A..B...-2.41 1.26.*. -0.600.15Val134A..B...-1.78 1.26.*. -0.600.17Phe135A..B...-1.48 0.61.*. -0.600.25Ala136A..B...-0.51 0.61.*. -0.600.25Leu137A..B...-0.79 0.11.*. -0.300.65Lys138A..B...-1.06 -0.04 .*F 0.60 1.09Ala139A..B...-0.51 -0.19 .*F 0.45 0.80Arg140A..B...-0.51 -0.20 .*F 0.60 1.40Thr141..BB...-0.27 -0.10 .*F 0.45 0.61Val142..BB...-0.31 0.33.*. -0.300.59Thr143..BB...-1.21 0.47.*. -0.600.23Phe144..BB...-0.93 1.11... -0.600.12Gly145..BB...-1.34 1.11... -0.600.23Val146..BB...-1.89 0.86... -0.600.21Val147..BB...-1.92 1.01... -0.600.18Thr148..BB...-1.92 0.91... -0.600.13Ser149..BB...-1.51 0.97*.. -0.600.25Val150..BB...-2.02 1.24*.. -0.600.35Ile151..BB...-2.02 1.24*.. -0.600.18Thr152..BB...-1.76 1.40*.. -0.600.10Trp153..BB...-2.30 1.51*.. -0.600.14Val154..BB...-2.70 1.51*.. -0.600.14Val155..BB...-2.43 1.61*.. -0.600.09Ala156..BB...-1.84 1.63*.. -0.600.08Val157..BB...-2.34 1.10... -0.600.15Phe158..BB...-2.27 1.14... -0.600.17Ala159..BB...-1.76 0.93... -0.600.25Ser160...B..C-1.79 0.86... -0.400.34Leu161...B..C-2.09 0.90... -0.400.27Pro162...B..C-1.93 0.80... -0.400.19Gly163...BT..-1.54 1.09*.. -0.200.12Ile164..BB...-0.84 1.19... -0.600.22Ile165..BB...-0.84 0.50.*. -0.600.27Phe166..BB...-0.03 0.46... -0.260.37Thr167..B..T.0.22 0.43*.F 0.63 0.91Arg168..B..T.0.57 -0.26 *.F 2.02 2.60表1(续)Res 位置I II III IVVVI VII VIIIIX X XI XII XIIIXIVSer169.... TC1.11-0.94 * .F 2.865.21Gln170....TT.1.19-1.30 * .F 3.403.57Lys171....T..1.86-1.10 * .F 2.861.50Glu172....T..1.92-0.60 * .F 2.521.53Gly173...BT..1.50-0.23 * *F 1.681.38Leu174..BB...1.13-0.14 . .. 0.641.00His175..BB...0.830.43. .. -0.60 0.31Tyr176..BB...0.490.81. .. -0.60 0.42Thr177..BB...0.460.77. *. -0.60 0.68Cys178..B..T.0.100.59. *. -0.20 0.68Ser179....TT.0.700.87. *. 0.200.38Ser180....TT.0.490.54. .. 0.200.40His181....TT.0.430.81. .. 0.351.18Phe182.....TC0.740.63. .. 0.151.18Pro183....TT.1.170.64. .. 0.351.52Tyr184....TT.1.471.01. *. 0.351.75Ser185....TT.1.070.91. .. 0.353.50Gln186..BB...0.810.91* .. -0.45 1.96Tyr187...BT..1.561.40* .. -0.05 1.31Gln188...BT..1.770.64* .. -0.05 1.96Phe189...BT..1.310.66* *. -0.05 1.82Trp190...BT..1.611.04* .. -0.05 1.01Lys191..BB...1.300.69* *. -0.45 1.01Asn192...BT..0.730.77* .. -0.05 1.68Phe193...BT..0.780.67* *. -0.05 1.32Gln194A..B...0.59-0.24 * .F 0.601.32Thr195...B..C0.020.44* *F -0.25 0.57Leu196..BB...-0.91 0.69* .. -0.60 0.49Lys197..BB...-1.72 0.59. .. -0.60 0.20Ile198..BB...-1.37 0.87* .. -0.60 0.11Val199..BB...-2.18 0.81* *. -0.60 0.14Ile200..BB...-2.72 0.81. *. -0.60 0.06Leu201..BB...-2.72 1.46. *. -0.60 0.06Gly202..BB...-2.98 1.46. *. -0.60 0.07Leu203..BB...-2.90 1.24. .. -0.60 0.15Val204..BB...-2.86 1.24. .. -0.60 0.15Leu205..BB...-2.82 1.24. .. -0.60 0.12Pro206..BB...-2.61 1.46. .. -0.60 0.11Leu207..BB...-3.12 1.39. .. -0.60 0.15Leu208..BB...-3.20 1.39. .. -0.60 0.13Val209..BB...-3.01 1.39. .. -0.60 0.06Met210..BB...-2.44 1.53. .. -0.60 0.04Val211..BB...-2.53 1.60. .. -0.60 0.07Ile212..BB...-2.07 1.30. .. -0.60 0.13Cys213..B..T.-2.14 1.09. .. -0.20 0.13Tyr214..B..T.-2.10 1.16. .. -0.20 0.13Ser215..B..T.-1.46 1.20. .. -0.20 0.15Gly216..B..T.-0.91 0.51* .. -0.20 0.55Ile217..BB...-0.83 0.43. .. -0.60 0.51Leu218..BB...-0.98 0.36* *. -0.30 0.31Lys219..BB...-0.62 0.66* *F -0.45 0.26Thr220..BB...-0.99 0.23* *. -0.30 0.73Leu221..BB...-0.53 0.11* *. -0.30 0.47Leu222A..B...0.36-0.57 * *. 0.600.46Arg223A..B...1.17-0.17 * *. 0.300.52Cys224A....T.1.17-0.66 . *. 1.151.08表1(续)Res位置 III III IV VVI VII VIII IXXXI XII XIIIXIVArg225A....T.1.52-1.34 **F 1.302.63Asn226A....T.2.44-2.03 **F 1.302.68Glu227A....T.3.22-2.03 .*F 1.309.80Lys228A......3.22-2.10 .*F 1.106.81Lys229A......3.30-2.10 **F 1.108.29Arg230A......2.33-2.00 *.F 1.104.83His231A..B...2.44-1.36 **. 0.751.79Arg232A..B...1.63-1.36 *.. 0.751.76Ala233A..B...0.70-0.67 **. 0.600.74Val234A..B...-0.04 0.01 *.. -0.30 0.38Arg235A..B...-0.47 0.30 **. -0.30 0.17Leu236..BB...-1.32 0.79 **. -0.60 0.24Ile237..BB...-2.03 0.97 **. -0.60 0.23Phe238..BB...-2.33 0.94 **. -0.60 0.11Thr239..BB...-2.33 1.63 **. -0.60 0.10Ile240..BB...-2.69 1.59 **. -0.60 0.10Met241..BB...-2.58 1.66 ... -0.60 0.19Ile242..BB...-2.50 1.66 ... -0.60 0.11Val243..BB...-2.50 1.86 ... -0.60 0.13Tyr244..BB...-2.48 1.96 ... -0.60 0.12Phe245..BB...-2.18 2.26 ... -0.60 0.17Leu246..BB...-1.79 2.07 ... -0.60 0.24Phe247...BT..-1.14 1.86 ... -0.20 0.23Trp248...B..C-0.29 1.86 .*. -0.40 0.42Ala249.....TC-0.93 1.47 ... 0.000.82Pro250.....TC-1.09 1.47 .*. 0.000.67Tyr251....TT.-1.09 1.33 ... 0.200.47Asn252..B..T.-1.20 1.10 .*. -0.20 0.38Ile253..BB...-1.72 1.29 .*. -0.60 0.20Val254..BB...-1.13 1.54 .*. -0.60 0.11Leu255..BB...-1.23 1.19 *.. -0.60 0.11Leu256..BB...-1.69 1.27 *.. -0.60 0.22Leu257..BB...-1.69 1.37 *.. -0.60 0.26Asn258..BB...-0.80 1.13 *.. -0.60 0.54Thr259A..B...-0.64 0.44 *.. -0.45 1.14Phe260A..B...-0.53 0.54 *.. -0.45 1.20Gln261..BB...-0.07 0.64 *.. -0.60 0.64Glu262..BB...-0.07 0.67 *.. -0.60 0.44Phe263..B....-0.07 0.87 *.. -0.40 0.42Phe264....T..0.240.49 ... 0.000.39Gly265....T..0.280.49 ... 0.000.36Leu266....T..-0.02 1.06 ... 0.000.22Asn267....T..-0.32 0.66 ... 0.000.35Asn268....T..0.080.26 ..F 0.450.47Cys269....TT.0.780.21 **F 0.650.76Ser270....TT.1.23-0.07 **F 1.250.76Ser271....TT.1.23-0.47 .*F 1.250.93Ser272.....TC1.23-0.19 **F 1.201.43Asn273.A..T..1.23-0.76 .*F 1.301.79Arg274.A..T..1.31-0.74 **F 1.302.31Leu275AA.....1.01-0.63 **F 0.901.74Asp276AA.....1.31-0.40 **F 0.601.07Gln277AA.....0.76-0.40 **. 0.300.95Ala278A..B...0.440.24 **. -0.30 0.85Met279..BB...0.330.04 **. -0.30 0.74Gln280..BB...0.830.04 **. -0.30 0.74表1(续)Res 位置III III IV VVI VII VIIIIXXXI XII XIIIXIVVal281..BB...0.020.13 *.. -0.15 1.05Thr282A..B...-0.32 0.31 *.F -0.15 0.88Glu283A..B...-0.33 0.13 *.F -0.15 0.50Thr284A..B...-0.04 0.34 .*F -0.15 0.67Leu285A..B...-0.08 0.19 ... -0.30 0.67Gly286...BT..0.110.20 ... 0.100.52Met287...BT..-0.24 0.77 ... -0.20 0.19Thr288..BB...-1.13 0.86 ... -0.60 0.13His289..BB...-0.82 0.86 ... -0.60 0.09Cys290..BB...-0.22 0.83 ... -0.60 0.15Cys291.BB....-0.77 0.64 ... -0.60 0.16Ile292..BB...-1.06 0.84 ... -0.60 0.08Asn293..BB...-0.99 1.03 **. -0.60 0.11Pro294..BB...-1.54 1.21 *.. -0.60 0.31Ile295.ABB...-1.58 1.14 *.. -0.60 0.44Ile296.ABB...-1.77 1.24 *.. -0.60 0.24Tyr297.ABB...-1.22 1.49 *.. -0.60 0.11Ala298.ABB...-1.22 1.49 ... -0.60 0.16Phe299.ABB...-0.97 0.80 ... -0.60 0.40Val300.ABB...-0.78 0.11 **. -0.30 0.51Gly301AA.B...0.220.14 **F -0.15 0.44Glu302AA.....0.47-0.36 **F 0.450.99Lys303AA.....0.81-0.74 **F 0.902.14Phe304A....T.0.70-0.63 **F 1.303.39Arg305A....T.0.74-0.37 **. 0.851.62Asn306A....T.0.230.31 **. 0.100.67Tyr307A....T.-0.47 0.96 **. -0.20 0.57Leu308A..B...-1.21 0.96 **. -0.60 0.25Leu309A..B...-0.51 1.74 **. -0.60 0.14Val310A..B...-0.58 1.74 ... -0.60 0.15Phe311A..B...-0.61 0.99 *.. -0.60 0.36Phe312A..B...-1.26 0.80 *.. -0.60 0.60Gln313A..B...-1.03 0.80 *.. -0.60 0.57Lys314A..B...-0.18 0.66 *.. -0.60 0.66His315AA.....0.79-0.13 **. 0.451.53Ile316AA.....0.79-0.91 *.. 0.751.73Ala317AA.....0.82-0.53 *.. 0.880.75Lys318AA.....0.870.04 *.. 0.260.30Arg319.A..T..0.16-0.46 *.. 1.540.84Phe320.A..T..-0.48 -0.57 *.. 2.120.45Cys321....TT.0.11-0.50 *.. 2.800.12Lys322....TT.-0.19 -0.11 *.. 2.220.08Cys323....TT.-0.93 0.57 *.. 1.040.07Cys324....TT.-1.04 0.57 *.. 0.760.11Ser325.A..T..-0.34 0.40 *.. 0.380.09Ile326.AB....0.320.80 *.. -0.60 0.30Phe327.AB....-0.31 0.23 *.. -0.30 0.97Gln328AA.....0.140.16 ..F -0.15 0.73Gln329AA.....0.810.20 .*F 0.001.61Glu330AA.....1.22-0.49 .*F 0.603.22Ala331.A....C1.52-1.27 .*F 1.103.64Pro332AA.....1.92-1.17 **F 0.902.13Glu333AA.....1.62-1.19 **F 0.901.64Arg334AA.....0.77-0.80 *.F 0.902.18Ala335AA.B...0.52-0.66 **F 0.90T.05Ser336.ABB...0.80-0.33 **F 0.450.95表1(续)Res 位置III III IV VVI VII VIIIIX XXI XII XIII XIVSer337..BB...1.120.16*.F-0.150.70Val338..BB...0.820.16**.-0.151.35Tyr339..BB...0.400.04**F0.30 1.35Thr340..BB...0.640.14**F0.60 1.46Arg341...B..C0.940.19.*F1.10 1.94Ser342.....TC1.24-0.46 .*F2.40 2.15Thr343.....TC2.10-0.81 .*F3.00 2.58Gly344.....TC1.46-1.30 .*F2.70 2.28Glu345.....TC1.47-0.61 .*F2.40 1.19Gln346..BB...0.50-0.61 .*F1.50 1.11Glu347..BB...0.46-0.46 .*F0.75 0.83Ile348..BB...-0.04 -0.46 .*F0.45 0.47Ser349..BB...-0.09 0.23.*.-0.300.23Val350..BB...-0.48 0.26.*.-0.300.17Gly351..BB...-0.87 0.69.*.-0.600.30Leu352A..B...-1.26 0.43.*.-0.600.29在此方面，包含结合了几种结构特征如上述的几种特征的G蛋白趋化因子受体(CCR5)区域的那些片段是高度优选的片段。
其它优选的多肽片段是具有生物学活性的G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段。生物活性片段是表现出的活性与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的活性类似但不必相同的那些片段。这些片段的生物活性可以包括改良的期望活性、或降低的非期望活性。编码这些多肽片段的多核苷酸也包括在本发明内。
然而，许多多核苷酸序列，如EST序列是可公开获得的并可以通过序列数据库得到。这些序列中的一些与SEQ ID NO1或保藏克隆相关，并可能在本发明构思前就已可公开获得。优选地，这些相关多核苷酸被特别地排除在本发明范围之外。列出所有的相关序列将是麻烦的。因此，包含通式a-b表示的核苷酸序列的一或多个多核苷酸优选被排除在本发明外，其中a是SEQ ID NO1的1-1400间的任意整数，b是15至1414间的整数，其中a和b都相应于SEQ ID NO1所示的或保藏克隆的核苷酸残基的位置，且b大于或等于a+14。表位和抗体本发明包括含有如下表位或由其组成的多肽，所述表位为具有SEQ IDNO2的氨基酸序列的多肽的表位、或是ATCC保藏物97183所含多核苷酸序列编码的或与SEQ ID NO1或ATCC保藏物97183所含的序列的互补链在严紧杂交条件或较低的严紧杂交条件(定义同上)下杂交的多核苷酸编码的多肽序列的表位。本发明还包括编码本发明多肽序列(例如SEQ IDNO1中所公开的序列或保藏克隆的序列)的表位的多核苷酸序列、编码本发明表位的多核苷酸序列的互补链的多核苷酸序列、和与该互补链在严紧杂交条件或较低严紧杂交条件(定义同上)下杂交的多核苷酸序列。
术语“表位”在本文中是指在动物，优选哺乳动物、最优选人体中具有抗原性或免疫原活性的多肽部分。在一个优选实施方案中，本发明包括含有表位的多肽、以及编码该多肽的多核苷酸。“免疫原性表位”在本文中定义为按本领域任何已知方法进行测定在动物中引起抗体应答的蛋白质部分，所述已知方法的例子有下文所述的产生抗体的方法。(见例如Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。术语“抗原性表位”在本文中定义为按本领域任何熟知方法测定的使抗体能够以免疫特异性方式与其抗原结合的蛋白质部分，所述方法的例子有本文所述的免疫测定法。免疫特异性结合不包括非特异性结合但不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位不一定具有免疫原性。可以使用全长蛋白或抗原性肽片段。具有高抗原性指数的区域显示在表1和图3中。
抗体优选从这些区域或从这些区域的离散片段制备。然而，抗体也可以从本文所述肽的任何区域制备。优选的片段产生可减少或完全防止配体结合的抗体。抗体可以针对完整的受体或受体的部分如胞内羧基端域、胞外氨基端域、整个跨膜域或特定的跨膜区段、任何胞内或胞外环、或这些区域的任何部分而生成。抗体还可以针对特定的功能性位点如配体结合位点、G蛋白偶联位点、或糖基化、磷酸化、豆蔻酰化或酰胺化位点生成。
具有表位功能的片段可以通过任何常规方法制备(见例如，Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135(1985)，进一步描述在美国专利4,631,211中)。
在本发明中，抗原性表位优选含有长至少4、至少5、至少6、至少7、更优选至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、最优选约15至约30个氨基酸的序列。包含免疫原性或抗原性表位的优选多肽长至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个氨基酸残基。其它非排他的优选抗原表位包括本文公开的抗原性表位、以及其部分。抗原性表位可以用于例如产生特异结合该表位的抗体，包括单克隆抗体。优选的抗原性表位包括本文公开的抗原性表位，以及其中的2个、3个、4个、5个或更多个抗原性表位的任何组合。抗原性表位可以用作免疫测定中的靶分子。(见例如Wilson等，Cell 37767-778(1984)；Sutcliffe等，Science 219660-666(1983))。然而，这些片段不应理解为包括可能在本发明之前公开的任何片段。
类似地，免疫原性表位可以用于例如根据本领域熟知技术诱导抗体。(见例如Sutcliffe等，同上；Wilson等，同上；Chow等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82910-914；和Bittle等，J.Gen.Virol.66；2347-2354(1985)。优选的免疫原性表位包括本文公开的免疫原性表位，以及这些免疫原性表位中的2个、3个、4个、5个或更多个的任何组合。包含一或多个免疫原性表位的多肽可以和载体蛋白例如白蛋白一起被呈递以引起动物系统(例如大鼠或小鼠)的抗体应答，或如果该多肽足够长(至少约25个氨基酸)则该多肽可以无需载体进行呈递。然而，已证明包含少至8-10个氨基酸的免疫原性表位就足以引起至少能够与变性多肽中的线性表位结合(例如在Western印迹中)的抗体产生。
本发明带有表位的多肽可以用于根据本领域熟知方法诱导抗体，所述方法包括但不限于体内免疫、体外免疫和噬菌体展示法。见例如Sutcliffe等，同上；Wilson等，同上；和Bittle等，J.Gen.Virol.662347-2354(1985)。如果使用体内免疫，则可以用游离肽免疫动物，然而，可以通过将肽与大分子载体如匙孔血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素偶联，增强抗肽抗体的滴度。例如，含有半胱氨酸残基的肽可以使用接头如N-羟基琥珀酰亚胺马来酰亚氨基苯甲酰基酯(MBS)与载体偶联，而其它肽可以使用更一般的连接剂如戊二醛与载体偶联。
本发明带有表位的肽还可以以多抗原肽(MAP)的形式合成，MAP最先描述在J.P.Tam，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855409中，该文献完整地并入本文作为参考。MAP由多个拷贝的特定肽附着在非免疫原性的赖氨酸核心上构成。MAP肽通常含有4或8个拷贝的肽，常称作MAP-4或MAP-8肽。非限制性地举例，MAP可以在与聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持物连接的赖氨酸核心基质上合成。目的肽使用芴基(Fmoc)化学在赖氨酸残基上合成。例如，Applied Biosystems(Foster City，CA)提供MAP树脂，例如Fmoc Resin 4 Branch和Fmoc Resin 8 Branch，它们可以用于合成MAP。使用本领域已知的标准基于三氟乙酸(TFA)的鸡尾酒法将MAP自树脂上切割下。除了脱盐外，纯化MAP是不必的。MAP肽可以用作免疫疫苗引起识别MAP和该肽所来源的天然肽的抗体。
还可以将本发明带有表位的肽并入病毒衣壳蛋白中，然后可以使用此衣壳蛋白作为免疫原或疫苗免疫动物，包括人类，以刺激抗表位抗体的产生。例如，人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的gp120糖蛋白V3环经过工程化在鼻病毒表面表达。使用展示V3环肽的此鼻病毒进行免疫，产生HIV-1免疫原的显然有效的模拟物(通过其被抗HIV抗体中和的能力和其在细胞培养中引起能够中和HIV-1的抗体产生的能力)。使用工程化病毒颗粒作为免疫原的技术更为详细地描述在Smith等，Behring Inst MitFeb；(98)229-39(1997)；Smith等，J Virol 72651-9(1998)；和Zhang等，Biol Chem 380365-74(1999)，特此将它们完整地并入本文作为参考。
本发明带有表位的多肽可以通过例如在肽的氨基和/或羧基端添加氨基酸进行修饰。可以进行这些修饰例如以改变此带有表位的多肽的构象以便该表位具有与天然蛋白中的表位结构更紧密相关的构象。本发明修饰的带有表位的多肽的例子有这样的多肽，该多肽中添加了一个或多个半胱氨酸残基以允许两个半胱氨酸之间形成二硫键，导致带有表位的多肽在非还原条件下具有稳定的环结构。二硫键可以在添加至多肽的半胱氨酸残基和天然表位的半胱氨酸残基之间形成，或可以在两个添加至带有天然表位的多肽上的半胱氨酸之间形成。此外，还可以通过用半胱氨酸进行替代修饰此带有天然表位的多肽的一个或多个氨基酸残基，从而促进二硫键环结构的形成。可以常规地使用本领域已知技术制备合成肽的环状硫醚分子，它们描述在PCT公开文本WO 97/46251中，特此完整地并入本文作为参考。本发明考虑的对带有表位的多肽的其它修饰包括生物素化。
用游离的或与载体偶联的肽或MAP肽，例如通过腹膜内和/或皮内注射含有约100μg肽或载体肽和弗氏佐剂或任何其它已知用于刺激免疫应答的佐剂的乳剂，免疫动物如兔、大鼠和小鼠。可能需要几次加强注射(例如每间隔约2周)，以提供有用的抗肽抗体滴度，即该滴度可以通过例如ELSA测定使用吸附在固相表面的游离肽检测到。免疫动物血清中的抗肽抗体滴度可以通过筛选抗肽抗体、例如根据本发明方法将该肽吸附在固相支持物上然后洗脱所选抗体来增加。
正如本领域技术人员明了的，也正如以上讨论的，包含免疫原性或抗原性表位的本发明多肽可以和其它多肽序列融合。例如，可以将本发明多肽和免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)恒定区或其部分(CH1、CH2、CH3或其任何组合和其部分)或白蛋白(包括但不限于重组人白蛋白或其片段或变体(参见例如1998年3月2日提交的美国专利5,876,969、EP专利0 413 622和1998年6月6日提交的美国专利5,766,883，均完整地并入本文作为参考))融合形成嵌合多肽。这些融合蛋白可以有利于纯化并可以增加体内半衰期。对于由人CD4多肽头两个域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的不同域组成的嵌合蛋白，这已得到证实。见例如EP 394,827；Traunecker等，Nature，33184-86(1988)。对于与FcRn结合部分如IgG或Fc片段偶联的抗原(如胰岛素)，已经证实抗原跨过上皮屏障向免疫系统的递送增加(见例如PCT公开文本WO 96/22024和WO 99/04813)。已经发现，由于IgG部分的二硫键而具有二硫键连接的二聚体结构的IgG融合蛋白可以比单独的单体多肽或其片段更为有效地结合和中和其它分子。见例如Fountoulakis等，J.Biochem.，2703959-3964(1995)。编码上述表位的核酸也可以和目的基因重组作为表位标签(例如血凝素(“HA”)标签或Flag标签)以有助于该表达多肽的检测和纯化。例如，Janknecht等描述的系统使得可以容易地纯化在人类细胞系中表达的非变性融合蛋白(Janknecht等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888972-897)。在此系统中，将目的基因亚克隆至痘苗病毒重组质粒中以便该基因的开放式阅读框在翻译上与由6个组氨酸残基组成的氨基端标签融合。该标签用作融合蛋白的基质结合域。将用此重组痘苗病毒感染的细胞的提取物加载到Ni2+氮川乙酸琼脂糖柱上，然后可以用含有咪唑的缓冲液选择性地将带有组氨酸标签的蛋白质洗脱下来。
本发明的其它融合蛋白可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称作“DNA改组”)技术来制备。DNA改组可以用于调节本发明多肽的活性，该方法可以用于制备具有不同活性的多肽、以及这些多肽的激动剂和拮抗剂。一般参见美国专利5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458，和Patten等，Curr.Opinion Biotechnol.8724-33(1997)；Harayama，Trends Biotechnol.16(2)76-82(1998)；Hansson等，J.Mol.Biol.287265-76(1999)；和Lorenzo和Blasco，Biotechniques 24(2)308-13(1998)(所有这些专利和出版物均特此并入本文作为参考)。在一个实施方案中，可以通过DNA改组改变相应于SEQ ID NO1的多核苷酸和这些多核苷酸编码的多肽。DNA改组涉及通过同源或位点特异性重组将两个或多个DNA区段组装起来以在多核苷酸序列中造成改变。在另一实施方案中，可以在重组前通过错误倾向性PCR进行的随机诱变、随机核苷酸插入或其它方法改变本发明的多核苷酸或编码的多肽。在另一实施方案中，可以在编码本发明多肽的多核苷酸的一个或多个成分、基序、节段、部分、域、片段等和一个或多个异源分子的一个或多个成分、基序、节段、部分、域、片段等之间进行重组。抗体本发明的其它多肽涉及免疫特异性地结合SEQ ID NO2多肽或保藏克隆编码的多肽、它们的多肽片段或变体、和/或本发明表位(通过本领域熟知用于测定特异性抗体-抗原结合的免疫测定法确定的)的抗体和T细胞抗原受体(TCR)。
已知此基本抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每一条链的氨基端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每一条链的羧基端部分规定了恒定区，其主要负责效应功能。人类轻链划分为κ和λ轻链。重链划分为μ、δ、γ、α或ε，并分别将抗体的同种型规定为IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。一般参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.等，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))(特此完整地并入本文作为参考)。每对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点。
因此，完整的IgG抗体有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体外，这两个结合位点是相同的。
这些链均表现出相同的一般结构，即通过三个超变区(又称作互补决定区或CDR)连接起来的相对保守构架区(FR)。来自每对重链和轻链的CDR通过构架区进行排列，使得可以与特异表位结合。从N端至C端，轻链和重链包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。依据Kabat具有免疫意义的蛋白质的序列(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等，Nature 342878-883(1989)的定义可以将氨基酸分配到每个域。
双特异性或双功能抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法制备，这些方法包括融合杂交瘤或连接Fab’片段。参见例如Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)，Kostelny等，J Immunol.1481547-1553(1992)。此外，双特异性抗体可以形成为“ diabodies”(Holliger等，“Diaboies小二价双特异性抗体片段”PNAS USA906444-6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，“双特异性单链分子(Janusins)使细胞毒淋巴细胞靶向HIV感染细胞”EMBO J 10；3655-3659(1991)和Trasunecker等，“Janusin设计为双特异性试剂的新分子”Int J Cancer Suppl 7；51-52(1992))。
本发明抗体包括，但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab’)片段，通过Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)，细胞内产生的抗体(即，intrabodies)，和上述所有的结合表位的片段。术语“抗体”在本文中用于指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分或片段，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。在一个优选实施方案中，此免疫球蛋白是IgG1同种型。在另一优选实施方式中，免疫球蛋白是IgG2同种型。在另一优选实施方案中，此免疫球蛋白是IgG4同种型。免疫球蛋白可以具有重链和轻链。一组IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY重链可以和κ或λ轻链形式配对。
最优选地，抗体是本发明的人类抗原结合性抗体片段，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH域的片段。抗原结合性抗体片段，包括单链抗体，可以仅包含可变区或还包含以下所有或部分铰链区、CH1、CH2、和CH3域。本发明还包括包含可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3域的任何组合的抗原结合片段。本发明抗体可以来自任何动物来源包括鸟类和哺乳动物类。优选地，该抗体是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。本文中，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白文库或分离自不表达内源性免疫球蛋白的一或多种人类免疫球蛋白转基因动物的抗体，见下文描述以及例如Kucherlapati等的美国专利5,939,598。
本发明抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更多的多特异性的。多特异性抗体可以对于本发明多肽的不同表位具有特异性，或可以对本发明多肽以及对异源表位如异源多肽或固体支持材料具有特异性。见例如PCT公开文本WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等，J.Immunol.14760-69(1991)；美国专利4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等，J.Immunol.1481547-1553(1992)。
本发明抗体可以根据其识别或特异结合的本发明表位或多肽部分来描述或规定。该表位或多肽部分可以按本文所述规定，例如通过N端和C端位置、通过连续氨基酸残基的大小来规定、或列在表和图中。本发明的优选表位包括SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽的Thr16-Va125，Gln59-Thr65，Thr167-Leu174，Ser179-Ser185，Leu222-Ala233，Asn268-Gln277，His315-Ser325，Glu330-Ser336，Tyr339-Ile348。本发明包括编码这些表位的多核苷酸。本发明的甚至更优选表位包括相应于本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)的胞外环或其片段和变体的肽，例如SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽的氨基酸第89-102、167-195和/或261-274位。也可以排除特异结合本发明的任何表位或多肽的抗体。因此，本发明包括特异结合本发明多肽的抗体，且本发明允许将其排除在外。
本发明抗体也可以根据其交叉反应性来描述或规定。包括不结合本发明多肽的任何其它类似物、直向同源物、同系物的抗体。结合与本发明多肽至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％一致(使用本领域已知的和本文描述的方法计算)的多肽的抗体也包括在本发明内。在具体实施方案中，本发明抗体与人蛋白质的鼠、猴、大鼠和/或兔同系物以及它们的相应表位交叉反应。不和与本发明多肽不足95％、不足90％、不足85％、不足80％、不足75％、不足70％、不足65％、不足60％、不足55％、不足50％一致(使用本领域已知的和本文描述的方法计算)的多肽结合的抗体也包括在本发明中。在一个具体实施方案中，上述交叉反应性是就任何单独的抗原性或免疫原性多肽、或本文所述的2、3、4、5或更多个特异抗原性和/或免疫原性多肽的组合而言的。本发明还包括结合严紧条件(见本文所述)杂交下与本发明多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽的抗体。
本发明抗体(包括含有抗体片段或其变体、或由其组成的分子)可以免疫特异性地结合人G蛋白趋化因子受体(CCR5)(SEQ ID NO2或保藏克隆所编码多肽)和/或猴G蛋白趋化因子受体(CCR5)的多肽或多肽片段或变体。优选地，本发明抗体免疫特异性地与人类G蛋白趋化因子受体结合。优选地，本发明抗体免疫特异性地与人和猴的G蛋白趋化因子受体结合。而且，优选地，本发明抗体免疫特异性地结合人G蛋白趋化因子受体(CCR5)和鼠G蛋白趋化因子受体(CCR5)。更优选地，本发明抗体免疫特异性地与人G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合，其中该抗体对人G蛋白趋化因子受体比对鼠G蛋白趋化因子受体具有较高的亲和性。
在优选实施方案中，本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体，或由其组成的分子)免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)而且不与任何其它抗原发生交叉反应。在优选实施方案中，本发明抗体免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)并且不与其它趋化因子受体如US28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和/或CXCR5发生交叉反应。
在其它优选实施方案中，本发明抗体免疫特异性地与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合并且与其它其它趋化因子受体如US28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和/或CXCR5发生交叉反应。在更优选的实施方案中，本发明抗体免疫特异性地与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合并且与CCR3和/或CXCR4发生交叉反应。
在一个优选实施方案中，相对于其结合其它抗原(例如其它趋化因子受体)的能力而言，本发明抗体优先地与G蛋白趋化因子受体(CCR5)(SEQID NO2或保藏克隆编码的多肽)或其片段和变体结合。
作为非限制性例子，如果抗体与第一抗原结合的解离常数(KD)小于抗体对于第二抗原的KD时，可以认为该抗体优先地结合第一抗原。在另一非限制性实施方案中，如果抗体结合第一抗原的亲和性比该抗体对于第二抗原的KD小至少一个数量级时，则可以认为该抗体优先地与第一抗原结合。在另一非限制性实施方案中，如果抗体结合第一抗原的亲和性比该抗体对于第二抗原的KD小至少两个数量级时则可以认为抗体优先地与第一抗原结合。
在另一非限制性实施方案中，如果抗体与第一抗原结合的关闭速率(off rate)(Koff)比该抗体对于第二抗原的Koff小时则认为该抗体优先与第一抗原结合。在另一非限制性实施方案中，如果抗体与第一抗原结合的亲和性比该抗体对于第二抗原的Koff小至少一个数量级时，则认为该抗体优先与第一抗原结合。在另一非限制性实施方案中，如果抗体与第一抗原结合的亲和性比该抗体对于第二抗原的Koff小至少两个数量级时，则认为该抗体优先与第一抗原结合。
本发明抗体还可以根据其与本发明多肽结合的亲和性来描述或定义。优选的结合亲和性包括具有小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M的解离常数或Kd的那些。更优选的结合亲和性包括具有小于5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M或10-8M的解离常数或Kd的那些。甚至更优选的结合亲和性包括具有小于5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M的解离常数或Kd的那些。
在具体实施方案中，本发明抗体结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或其片段或变体的关闭速率(Koff)小于或等于5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1或10-3秒-1。更优选地，本发明抗体结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或其片段或变体的关闭速率(Koff)小于或等于5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1、10-5秒-1、5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1或10-7秒-1。
在其它实施方案中，本发明抗体结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或其片段或变体的开启速率(on rate)(Kon)大于或等于103M-1秒-1、5×103M-1秒-1、104M-1秒-1、5×104M-1秒-1。更优选地，本发明抗体结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或其片段或变体的开启速率(on rate)(Kon)大于或等于105M-1秒-1、5×105M-1秒-1、106M-1秒-1、5×106M-1秒-1或107M-1秒-1。
本发明还提供竞争地抑制抗体与本发明表位结合的抗体，这是通过本领域已知用于确定竞争性结合的任何方法例如本文描述的免疫测定法确定的。在优选实施方案中，该抗体竞争性地抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％的表位结合。
本发明抗体可以用作本发明多肽的激动剂或拮抗剂。例如，本发明包括部分或完全地破坏受体/配体与本发明多肽相互作用的抗体。优选地，本发明抗体与本文公开的抗原表位或其部分结合。本发明的特征在于受体特异性抗体和配体特异性抗体。本发明还以不妨碍配体结合但阻止受体激活的受体特异性抗体为特征。受体激活(即信号传递)可以通过本文所述或其它本领域已知的技术来确定。例如，可以通过使用免疫沉淀及随后的western印迹分析(见上述)检测受体或其底物的磷酸化(例如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)，确定受体激活。在具体实施方案中，提供抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％的配体活性或受体活性的抗体，其中所述活性是指无此抗体时的活性。
本发明还涉及既阻止配体结合又阻止受体激活的受体特异性抗体、以及识别受体-配体复合物并优选地不特异识别未结合的受体或未结合的配体的抗体。同样，本发明还包括与配体结合并阻止配体与受体结合的中和抗体、以及与配体结合由此阻止受体激活但不阻止配体与受体结合的抗体。本发明还包括激活受体的抗体。这些抗体可以作为受体激动剂起作用，即通过例如诱导受体二聚化，增强或激活所有或部分的配体介导的受体激活的生物学活性。这些抗体可以被确定为生物学活性(包括本文公开的本发明肽的特定生物学活性)的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。上述抗体激动剂可以使用本领域已知方法制备。参见例如PCT公开文本WO 96/40281；美国专利5,811,097；Deng等，Blood92(6)1981-1988(1998)；Chen等，Cancer Res.58(16)3668-3678(1998)；Harrop等，J.Immunol.161(4)；1786-1794(1998)；Zhu等，Cancer Res.58(15)3209-3214(1998)；Yoon等，J.Immunol.160(7)3170-3179(1998)；Prat等，J.Cell.Sci.111(Pt20237-247(1998)；Pitard等，J.Immunol.Methods 205(2)177-190(1997)；Liautard等，Cytokine 9(4)233-241(1997)；Carlson等，J.Biol.Chem.272(17)11295-11301(1997)；Taryman等，Neuron14(4)755-762(1995)；Muller等，Structure 6(9)1153-1167(1998)；Bartunek等，Cytokine 8(1)14-20(1996)(所有这些均完整地并入本文作为参考)。
本发明一个实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的任何一条重链和/或本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的任何一条轻链的氨基酸序列的多肽。本发明另一实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的任何一个重链VH域和/或本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的任何一个轻链VL域的氨基酸序列的多肽。在优选实施方案中，本发明抗体包含本发明单一抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的VH域和VL域的氨基酸序列。在替代实施方案中，本发明抗体包含本发明两种不同抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系所表达的VH域和VL域的氨基酸序列。本发明还包括如下分子，所述分子包含免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的、本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的VH和/或VL域的抗体片段或变体，或由其组成，本发明还包括编码这些VH和VL域、分子、片段和/或变体的核酸分子。
本发明还提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含如下多肽或由如下多肽组成，该多肽具有本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链中任何一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列。尤其是，本发明提供包含如下多肽或由如下多肽组成的、免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体，所述多肽具有本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链中VH CDR1的氨基酸序列。在另一实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体包含如下多肽或由其组成，其中所述多肽具有本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链中VH CDR2的氨基酸序列。在优选实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体包含如下多肽或由其组成，其中所述多肽具有本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链中VH CDR3的氨基酸序列。包含这些抗体或抗体片段或其变体、并免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段或其变体的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子也包括在内。
本发明还提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有具有本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链中任何一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列。尤其是，本发明提供包含如下多肽或由如下多肽组成的、免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体，所述多肽具有本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链中VLCDR1的氨基酸序列。在另一实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体包含如下多肽或由其组成，其中所述多肽具有本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链中VL CDR2的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体包含如下多肽或由其组成，其中所述多肽具有本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链中VL CDR3的氨基酸序列。包含这些抗体或抗体片段或其变体、并免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段或其变体的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子也包括在内。
本发明还提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽片段或变体的抗体(包括含有抗体片段或变体或由其组成的分子)，其中所述抗体包含本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系所表达的重链或轻链中的一个、两个、三个或更多个VH CDR以及一个、两个、三个或更多个VL CDR，或由它们组成。尤其是，本发明提供免疫特异性结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或多肽变体或变体的抗体，其中所述抗体包含本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系所表达的重链或轻链中VH CDR和VL CDR的VH CDR1和VL CDR1、VH CDR1和VL CDR2、VH CDR1和VL CDR3、VH CDR2和VL CDR1、VH CDR2和VL CDR2、VH CDR2和VLCDR3、VH CDR3和VH CDR1、VH CDR3和VL CDR2、VH CDR3和VL CDR3、或它们的任何组合，或由它们组成。在一个优选实施方案中，这些组合中的一种或多种来自于本发明单一抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系。包含这些抗体的片段或变体或由其组成的、免疫特异性结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的分子也包含在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段或变体的核酸分子也包括在内。
本发明还提供编码本发明抗体(包括含有抗体片段或其变体或由其组成的分子)的核酸分子，一般是分离的核酸分子。在一个具体实施方案中，本发明核酸分子编码如下抗体(包括含有抗体片段或其变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链的任一个VH域的氨基酸序列的VH域和具有本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的轻链的氨基酸序列的VL域，或由它们组成。在另一实施方案中，本发明核酸分子编码如下抗体(包括含有抗体片段或其变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的重链的任一个VH域的氨基酸序列的VH域或具有本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的轻链的氨基酸序列的VL域，或由它们组成。
本发明还提供包含本文所述抗体分子(例如VH域和/或VL域)的变体(包括衍生物)或由其组成的抗体，其中该抗体免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体。可以使用本领域技术人员已知的标准技术将突变引入编码本发明分子的核苷酸序列中，这些技术包括例如导致氨基酸替代的定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，该变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸替代、少于40个氨基酸替代、少于30个氨基酸替代、少于25个氨基酸替代、少于20个氨基酸替代、少于15个氨基酸替代、少于10个氨基酸替代、少于5个氨基酸替代、少于4个氨基酸替代、少于3个氨基酸替代或少于2个氨基酸替代(相对于参考VH域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL域、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3而言)。“保守氨基酸替代”是指将氨基酸残基替代为具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族在现有技术中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，可以沿着全部或部分的编码序列，例如通过饱和诱变随机地引入突变，并可以就生物学活性筛选所获突变体以鉴定保留活性(例如结合G蛋白趋化因子受体的能力)的突变体。
例如，可以仅在抗体分子的构架区或仅在CDR区引入突变。引入的突变可以是沉默突变或中性错义突变，即不或几乎不影响抗体结合抗原的能力。这些突变的类型可以用于优选密码子使用、或提高杂交瘤的抗体产生。或者，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默突变和中性错义突变的定位可能在构架区中，而大多数非中性错义突变的定位可能在CDR中，但是这并不是绝对的必要条件。本领域技术人员将能够设计和检测到具有期望性质(例如不改变抗原结合活性或改变结合活性(例如提高抗原结合活性或改变抗体特异性))的突变分子。诱变后，可以常规地表达编码蛋白、并使用本文所述技术或通过本领域已知的常规修饰的技术测定编码蛋白的功能和/或生物学活性(例如免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体的能力)。
在一个具体实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或其片段或变体的本发明抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，包含如下核苷酸序列编码的氨基酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与互补于本发明一种或多种抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系表达的一个VH或VL域的编码序列的核苷酸序列杂交，所述杂交的条件是严紧条件，例如与滤膜结合DNA在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，之后在0.2×SSC/0.1％SDS中于约50-65℃下作一或多次洗涤；高度严紧条件，例如与滤膜结合核酸在6×SSC中约45℃下杂交，之后在0.1×SSC/0.2％SDS中于约68℃下作一或多次洗涤；或本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件(参见例如Ausubel，F.M.等编，1989，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，纽约，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
正如本领域熟知的，具有相似氨基酸序列的多肽、或其片段或变体常常具有相似的结构和许多相同的生物学活性。因此，在一个实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽片段或变体的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VH域或由其组成，所述氨基酸序列与本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系所表达的重链的VH域的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的一致性。
在另一实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的片段或变体的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VL域或由其组成，所述氨基酸序列与本发明抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体表达细胞系所表达的轻链的VL域的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的一致性。
本发明还包括与本文所述一种或多种抗体具有一种或多种相同生物学特征的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)。所谓“生物学特征”是指抗体的体外或体内活性或性质，如结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)(例如表达在细胞表面的G蛋白趋化因子受体(CCR5)、膜嵌合G蛋白趋化因子受体(CCR5)、和/或G蛋白趋化因子受体(CCR5)的片段或变体)的能力；基本上抑制或破坏G蛋白趋化因子受体(CCR5)与G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体(例如MIP1-β、见如实施例61)结合的能力；下调细胞表面上G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽表达的能力；抑制或破坏G蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的生物学活性(例如HIV结合、感染(进入/融合)G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞、和/或在其中复制)的能力(见例如实施例60)；抑制或破坏MIP1-β诱导的外周血单个核细胞PBMC(或其它G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞)的趋化性的能力；或诱导G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞中细胞内钙流的能力(见实施例63)。任选地，本发明抗体与本文具体提及的至少一种抗体结合相同的表位。该表位结合可以使用本领域已知的测定法确定。
本发明还提供中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，所述抗体包含本发明抗体VH或VL域的部分(例如VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和/或VL CDR3)、或由其组成。例如，“中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体”的抗体可以是减小或彻底破坏G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体结合其配体(例如HIV和MIP1-β)的能力的抗体；减小或彻底破坏MIP-1β诱导的PBMC或其它CCR5表达细胞的趋化性的抗体；和/或彻底破坏或抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)信号传递级联(例如由激活的G蛋白趋化因子受体(CCR5)发动的钙流，见如实施例63)的抗体。在一个实施方案中，中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体以及本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。在另一实施方案中，中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体，包含具有本发明单一抗体(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。在一个实施方案中，中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。在另一个实施方案中，中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体，包含具有本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。在另一个实施方案中，中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。在一个优选实施方案中，中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR3域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。在另一实施方案中，中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗体VLCDR域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。在另一优选实施方案中，中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体，包含具有本发明抗体VL CDR3域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽，或由其组成。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供降低或彻底破坏HIV病毒(尤其是利用G蛋白趋化因子受体(CCR5)作为共同受体的那些)结合、感染(进入/融合)G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞和/或在其中复制的能力(按本领域已知的任何方法测定，例如实施例60所示测定法)的抗体。所述抗体可以包含具有本发明抗体的氨基酸序列的VH或VL域或其片段或变体的部分(例如VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)、或由其组成。在一个实施方案中，降低或彻底破坏HIV病毒(尤其是利用G蛋白趋化因子受体(CCR5)作为共同受体的那些)结合、感染(进入/融合)G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞和/或在其中复制的能力的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体和本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，降低或彻底破坏HIV病毒(尤其是利用G蛋白趋化因子受体(CCR5)作为共同受体的那些)结合、感染(进入/融合)G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞和/或在其中复制的能力的抗体，包含具有来自本发明单一抗体(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在一个实施方案中，降低或彻底破坏HIV病毒(尤其是利用G蛋白趋化因子受体(CCR5)作为共同受体的那些)结合、感染(进入/融合)G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞和/或在其中复制的能力的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，降低或彻底破坏HIV病毒(尤其是利用G蛋白趋化因子受体(CCR5)作为共同受体的那些)结合、感染(进入/融合)G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞和/或在其中复制的能力的抗体，包含具有本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在一个优选实施方案中，降低或彻底破坏HIV病毒(尤其是利用G蛋白趋化因子受体(CCR5)作为共同受体的那些)结合、感染(进入/融合)G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞和/或在其中复制的能力的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一优选实施方案中，降低或彻底破坏HIV病毒(尤其是利用G蛋白趋化因子受体(CCR5)作为共同受体的那些)结合、感染(进入/融合)G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞和/或在其中复制的能力的抗体，包含具有本发明抗体VL CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供抑制或彻底破坏MIP-1β诱导的外周血单个核细胞PBMC或其它CCR5表达细胞的趋化性(通过本领域任何已知方法测定，例如实施例62所述测定法)的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)。所述抗体包含具有本发明抗体的氨基酸序列的VH或VL域或其片段或变体的部分(例如VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)、或由其组成。在一个实施方案中，抑制或彻底破坏MIP-1β诱导的外周血单个核细胞PBMC或其它CCR5表达细胞的趋化性的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体和本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，抑制或彻底破坏MIP-1β诱导的外周血单个核细胞PBMC或其它CCR5表达细胞的趋化性的抗体，包含具有来自本发明单一抗体(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在一个实施方案中，抑制或彻底破坏MIP-1β诱导的外周血单个核细胞PBMC或其它CCR5表达细胞的趋化性的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，抑制或彻底破坏MIP-1β诱导的外周血单个核细胞PBMC或其它CCR5表达细胞的趋化性的抗体，包含具有本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在一个优选实施方案中，抑制或彻底破坏MIP-1β诱导的外周血单个核细胞PBMC或其它CCR5表达细胞的趋化性的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一优选实施方案中，抑制或彻底破坏MIP-1β诱导的外周血单个核细胞PBMC或其它CCR5表达细胞的趋化性的抗体，包含具有本发明抗体VL CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞表面表达(通过本领域任何已知方法测定，例如FACS分析/实施例61或63所述测定法)的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)。作为一种非限制性假设，该下调可能是抗体诱导的G蛋白趋化因子受体(CCR5)内化的结果。所述抗体包含具有本发明抗体的氨基酸序列的VH或VL域或其片段或变体的部分(例如VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)、或由其组成。在一个实施方案中，下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体和本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞表面表达的抗体，包含具有来自本发明单一抗体(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在一个实施方案中，下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在一个优选实施方案中，下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一优选实施方案中，下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞表面表达的抗体，包含具有本发明抗体VLCDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有本发明抗体的VH或VL域或其片段或变体的部分(例如VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)、或由其组成。作为非限制性例子，“增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的活性”的抗体是增强了G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合以刺激PBMC(或其它G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞)的趋化性、和/或刺激G蛋白趋化因子受体(CCR5)信号传递级联(例如起始胞内钙流，见实施例63)的能力的抗体。在一个实施方案中，增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体和本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体，包含具有来自本发明单一抗体(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在一个实施方案中，增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体，包含具有本发明抗体VH域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体，包含具有本发明抗体VL域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体，包含具有表2所示VH CDR域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在一个优选实施方案中，增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体，包含具有本发明抗体VH CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一实施方案中，增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体，包含具有本发明抗体VL CDR域或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。在另一优选实施方案中，增加G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性的抗体，包含具有本发明抗体VL CDR3或其片段或变体的氨基酸序列的多肽、或由其组成。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供包含免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体(包括含有其抗体片段或变体)和异源多肽或由其组成的融合蛋白。优选地，与抗体融合的异源蛋白是对于功能有用的或对于靶向G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞有用的，其包括但不限于MIP-1β；CD4结合多肽如抗CD4抗体；CXCR4结合多肽如基质来源因子1-α(SDF1-α)；和/或CCR3结合蛋白如MIP-1-α。在一个替代优选实施方案中，与抗体融合的异源多肽对于T细胞、巨噬细胞和/或单核细胞的细胞功能是有用的，或对于使抗体靶向T细胞、巨噬细胞、或单核细胞是有用的，其包括但不限于MIP-1β；CD4结合多肽如抗CD4抗体；CXCR4结合多肽如基质来源因子1-α(SDF1-α)；和/或CCR3结合蛋白如MIP-1-α。在一个实施方案中，本发明融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列或由它们组成，所述多肽具有本发明抗体任意一个或多个VH域的氨基酸序列或本发明抗体任意一个或多个VL域的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列，所述多肽具有本发明抗体的任意一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列、或本发明抗体的任意一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，该融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列，其中所述多肽具有本发明抗体VH CDR3的氨基酸序列，而该融合蛋白可以免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)。在另一实施方案中，融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列，其中所述多肽具有本发明抗体至少一个VH域的氨基酸序列和本发明抗体至少一个VL域的氨基酸序列。优选地，融合蛋白的VH和VL域相应于本发明的单一抗体(或scFv或Fab片段)。在再另一实施方案中，本发明融合蛋白包含如下多肽或其片段或变体和异源多肽序列或由它们组成，所述多肽具有本发明抗体的任意一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列和本发明抗体的任意一个、两个、三个或更多个VL CDR的氨基酸序列。优选地，这些VHCDR或VLCDR中的两个、三个、四个、五个、六个或更多个相应于本发明的单一抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明内。
本发明抗体可以用于例如但不限于纯化、检测和靶向本发明多肽，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，可以将这些抗体用于免疫测定以定量和定性地测量生物学样品中本发明多肽的水平。见例如Harlow等，抗体实验室手册(AntibodiesA Laboratory Manual)，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)(完整地并入本文作为参考)。
作为另一非限制性例子，本发明抗体可以以被动免疫的方式给予个体。或者，可以使用本发明多肽进行表位作图以鉴定该抗体所结合的表位。以此方式鉴定的表位又可以例如用作疫苗候选物，即用于免疫个体引起针对天然形式的G蛋白趋化因子受体的抗体。
正如以下更详细描述的，本发明抗体可以单独使用或与其它组合物组合使用。还可以通过重组方式使这些抗体域异源多肽在N或C端融合，或通过化学方式使这些抗体与多肽或其它组合物缀合(包括共价和非共价缀合)。例如，本发明抗体可以通过重组方式与在检测实验中用作标记的分子以及效应分子如异源多肽、药物、放射性核素或毒素融合或缀合。见例如PCT公开文本WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利5,314,995；和EP 396,387。
本发明抗体包括例如通过使该抗体共价结合任何类型分子而修饰的衍生物。例如，但不构成限制，该抗体衍生物包括经过修饰的抗体，所述修饰的例子有糖基化、乙酰化、PEG化(pegylation)、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白连接等。许多化学修饰都可以通过已知技术进行，包括但不限于特异化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，该衍生物还可以含有一个或多个非经典氨基酸。
本发明抗体可以通过本领域任何适当的已知方法产生。针对目的抗原的多克隆抗体可以通过本领域熟知的多种方法制备。例如，可以将本发明多肽施用于多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导含有特异针对该抗原的多克隆抗体的血清产生。根据宿主物种，可以使用多种佐剂增强此免疫应答，这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全的和不完全的)、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油性乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、和潜在有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂是本领域熟知的。
单克隆抗体可以使用本领域已知的广泛多种技术来制备，这些技术包括使用杂交瘤、重组、噬菌体展示技术、或它们的组合。例如，可以使用杂交瘤技术，包括本领域已知的和如Harlow等，抗体实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤563-581(Elsevier，N.Y.1981)(所述参考文献完整地并入本文作为参考)中教导的杂交瘤技术制备单克隆抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单一克隆，包括真核、原核、或噬菌体克隆的抗体，而非指其制备方法。
使用杂交瘤技术制备和筛选特异抗体的方法是常规的和本领域熟知的，在实施例中有详细描述。在非限制性实例中，可以使用本发明多肽或表达该肽的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答，即在小鼠的血清中检测到特异针对该抗原的抗体后，收获小鼠的脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知技术将这些脾细胞和任何适当的骨髓瘤细胞(例如来自可从ATCC获得的细胞系SP20或P3X63-AG8.653的细胞)融合。通过有限稀释筛选并克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法分析杂交瘤细胞，以寻找分泌能够结合本发明多肽的抗体的细胞。可以通过使用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生一般含有高水平抗体的腹水。
因此，本发明提供制备单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地该杂交瘤是通过将分离自使用本发明抗原免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合产生，然后筛选融合产生的杂交瘤以寻找分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。
制备多克隆和单克隆人类B细胞系的另一熟知方法是使用埃-巴二氏病毒(EBV)进行转化。制备EBV转化的B细胞系的操作方法是本领域通常已知的，例如Current Protocols in Immunology(Coligan等编，1994，John Wiley & Sons，NY)(特此完整地并入本文作为参考)第7.22章所给操作方法。用于转化的B细胞的来源通常是人外周血，但用于转化的B细胞也可以来源于其它来源，包括但不限于淋巴结、扁桃体、脾、肿瘤组织和感染的组织。一般在EBV转化前将组织制成单细胞悬浮液。此外，可以采取步骤以物理除去或失活含B细胞的样品中的T细胞，因为来自抗EVB抗体血清阳性个体的T细胞会抑制EBV造成的B细胞永生化。一般，用EBV接种含有人类B细胞的样品，并培养3-4周。EBV的典型来源是B95-8细胞系(ATCC #VR-1492)的培养物上清液。一般可以在3-4周培养期结束时观察到EVB转化的物理征兆。通过相差显微镜，转化细胞可以表现为大、明亮、多毛并倾向聚集为紧密的细胞簇。最初，EBV系一般是多克隆的。然而，经过长期的细胞培养，EBV系可以由于特定B细胞克隆的选择性快速生长而变位单克隆的或多克隆的。或者，可以将多克隆EBV转化系亚克隆(例如通过有限稀释培养)或使之与适当的融合伙伴融合并有限稀释铺板以获得单克隆B细胞系。对于EBV转化细胞系，适当的融合伙伴包括小鼠骨髓瘤细胞系(例如SP2/0、X63-Ag8.653)、异源杂交瘤细胞系(人×小鼠例如SPAM-8、SBC-H20和CB-F7)、和人细胞系(例如GM 1500、SKO-007、RPMI 8826和KR-4)。因此，本发明还提供制备针对本发明多肽或其片段的多克隆或单克隆人抗体的方法，该方法包括EBV转化人B细胞。
识别特异表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，本发明Fab和F(ab’)2片段可以通过使用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)蛋白水解免疫球蛋白分子产生。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1区。
例如，本发明抗体也可以使用本领域已知的多种噬菌体展示文库产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体域被展示在带有编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。在一个具体实施方案中，该噬菌体可以用于展示从所有组成成分或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合域。可以使用抗原，例如使用标记的抗原或与固体表面或珠结合或被其捕获的抗原，选择或鉴定表达结合目的抗原的抗原结合域的噬菌体。用于这些方法的噬菌体典型地是丝状噬菌体，包括fd和M13，噬菌体表达的结合域有重组方式与噬菌体的基因III或基因VIII蛋白融合的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体域。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括公开在如下文献中的那些Brinkman等，J.Immunol.Methods 18241-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic等，Gene 1879-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology57191-280(1994)；PCT申请PCT/GB91/01134；PCT公开文本WO90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18169；WO 93/11236；WO95/15982；2O 95/20401；和美国专利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；所有均完整地并入本文作为参考。
正如以上参考文献所述，在噬菌体筛选后，可以从噬菌体分离到抗体编码区并用于产生完整抗体，包括人抗体，或任何其它期望的抗原结合片段，并使其在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达，参见以下详细描述。例如，重组制备Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术也可以通过本领域已知方法进行应用，例如公开在PCT公开文本WO 92/22324；Mullinax等，BioTechniques12(6)864-869(1992)；和Sawai等，AJRI 3426-34(1995)；和Better等，Science 2401041-1043(1988)(所述文献完整地并入本文作为参考)中的那些。
可以用于制备单链Fv和抗体的技术实例包括描述在美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods in Enzymology 20346-88(1991)；Shu等，PNAS 907995-7999(1993)；和Skerra等，Science2401038-1040(1988)中的那些。对于一些应用，包括抗体的人体内使用和体外检测法，可以优选使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是其中该抗体的不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison，Science 2291202(1985)；Oi等，BioTechniques 4214(1986)；Gillies等(1989)J.Immunol.Methods 125191-202；美国专利5,807,715；4,816,567；和4,816,397，所有均完整地并入本文作为参考。人源化抗体是来自结合期望抗原的非人物种抗体的抗体分子，其具有来自此非人物种的一或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。常常，人构架区中的构架残基被CDR供体抗体的相应残基替代，以改变优选提高抗原结合。这些构架替代可以通过本领域熟知技术确定，例如通过模拟该CDR和构架残基的相互作用以将非寻常构架残基确定在具体位置。(见例如Queen等，美国专利5,585,089；Riechmann等，Nature 332323(1988)，所有均完整地并入本文作为参考)。抗体可以使用本领域已知的多种技术人源化，这些技术包括例如CDR嫁接(CDR-grafting)(EP 239,400；PCT公开文本WO 91/09967；美国专利5,225,539；5,301,101；和5,585,089)、镶饰(veneering)或重修表面(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)489-498(1991)；；Studnicka等，Protein Engineering 7(6)805-814(1994)；Roguska等，PNAS91969-973(1994))、链改组(美国专利5,565,332)。
完全的人抗体尤其适合于治疗人类患者。人抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库进行的上述噬菌体展示方法。见例如美国专利4,444,887和4,716,111；和PCT公开文本WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741；所有均完整地并入本文作为参考。
还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备人抗体。例如，可以随机地或通过同源重组向小鼠胚胎干细胞中引入人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物。或者，可以向小鼠胚胎干细胞中引入人可变区、恒定区和多变区以及人重链和轻链基因。可以单独地或在通过同源重组引入人免疫球蛋白位点的同时造成小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因的功能丧失。尤其是，JH区的纯合缺失可以阻止内源性抗体产生。扩增该修饰的胚胎干细胞并将其注射至胚泡中以产生嵌合小鼠。然后饲养嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。以正常方式使用所选抗原，例如本发明多肽的全部或部分免疫该转基因小鼠。使用常规杂交瘤技术可以从该免疫的转基因小鼠获得针对该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并随后经过类别转换和体细胞突变。由此，使用该技术可以制备治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于制备人抗体的该技术的综述，见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93(1995)。对于制备人抗体和人单克隆抗体的此技术的详细讨论和制备这些抗体的操作方法，参见例如PCT公开文本WO 98/24893；WO 92/01047；WO96/33735；欧洲专利0 598 877；美国专利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181；和6,114,598，所有均完整地并入本文作为参考。此外，可以雇用公司例如Abgenix公司(Fremont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)使用类似于上述方法的技术提供针对所选抗原的人抗体。
识别所选表位的完全的人抗体可以使用称作“导向选择(guidedselection)”的技术产生。在此分中所选非人单克隆抗体即小鼠抗体用于指导选择识别相同表位的完全人抗体。(Jespers等，Bio/technology12899-903(1988))。
而且，使用本领域技术人员熟知的技术，又可以使用本发明多肽的抗体制备“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体。(见例如Greenspan & Bona，FASEB J.7(5)437-444(1989)和Nissinoff，J.Immunol。147(8)2429-2438(1991))。例如，结合并竞争抑制本发明多肽的多肽多聚化和/或与配体的结合的抗体可以用于制备“模拟”多肽多聚化和/或结合域的抗独特型抗体，并由此用于结合并中和多肽和/或其配体。该中和抗独特型抗体或该抗独特型的Fab片段可以用于治疗法以中和多肽配体。例如，可以使用该抗独特型抗体结合本发明多肽和/或结合其配体/受体，并由此激活或封闭其生物学活性。
intrabody是自重组核酸分子表达的并经改造被滞留在细胞内(例如被滞留在细胞质、内质网或周质)的抗体，常常是scFv。Intrabody可以用于例如破坏该intrabody结合的蛋白质的功能。intrabody的表达还可以通过在包含该intrabody的核酸表达载体中使用诱导型启动子进行调节。本发明intrabody可以使用本领域已知方法制备，例如公开并综述在下列文献中的那些方法Chen等，Hum.Gene Ther.5595-601(1994)；Marasco，W.A.Gene Ther.411-15(1997)；Rondon和Marasco，Annu.Rev.Microbiol.51；257-283(1997)；Proba等，J.Mol.Biol.275245-253(1998)；Cohen等，Oncogene 172445-2456(1998)；Ohage和Steipe，J.Mol.Biol.2911119-1128(1999)；Ohage等，J.Mol.Biol.2911129-1134(1999)；Wirtz和Steipe，Protein Sci.82245-2250(1999)；Zhu等，J.Immunol.Methods 231207-222(1999)；和其中所引用文献。尤其是，Steinberger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97805-810(2000)已经制备了CCR5的intrabody。XenoMouse技术根据本发明的抗体优选通过利用如下转基因小鼠制备，所述转基因小鼠插入了人抗体产生基因的实质性部分但在内源性鼠源抗体的产生上具有缺陷(例如可以从Abgenix Inc.，Fremont，CA获得的XenoMouse系)。然后，这些小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体并无法产生鼠源免疫球蛋白分子和抗体。用于实现此目的的技术公开在本文公开的专利、申请和参考文献中。
在YAC中克隆和重构兆碱基大小的人类位点和将其引入小鼠生殖系的能力提供了强有力的工具，以阐明极大或粗略作图的位点的功能性成分以及产生有用的人类疾病模型。而且，用人类等价物取代小鼠位点的该技术的应用也可以提供关于发育期间人类基因产物的表达和调节、它们与其它系统的通讯、和它们参与的疾病诱导和进程的独特看法。
该策略的一个重要实际应用是小鼠的体液免疫系统“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)位点引入内源性Ig基因已失活的小鼠中，为研究抗体程序化表达和组装的机制以及它们在B细胞发育中的作用提供了机会。而且，该策略可以为制备全人单克隆抗体(Mab)提高了理想的来源，这是朝向实现抗体治疗人类疾病希望的一个重要里程碑。
预期全人抗体可以最小化免疫应答和过敏反应，这些是小鼠或小鼠衍生的单克隆抗体所固有的，从而由此增加所施用抗体的效率和完全性。可以预期全人抗体在要求重复施用抗体的慢性和复发性人类疾病(例如癌症)的治疗中能够提供实质性的优点。
达到此目的的一种方法是使用大片段的人Ig位点改造在小鼠抗体制备方面有缺陷的小鼠，预期此小鼠将产生大量的人抗体所有组成成分而缺少小鼠抗体。大的人Ig片段将保存大可变基因的多样性以及适当地调节抗体的产生和表达。通过利用小鼠机器使抗体多样化和进行筛选以及缺乏对人类蛋白的耐受性，在这些小鼠中复制的人抗体所有组成成分应产生针对任何目的抗原(包括人抗原)的高亲和性抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地制备和选择具有期望特异性的抗原特异性人单克隆抗体。
此一般策略联系1994公开的第一只XenoMouseTM系的制备进行了阐明。见Green等，Nature Genetics 713-21(1994)。该XenoMouseTM系是利用酵母人工染色体(YACS)改造的，所述YACS分别含有245kb和10190kb大小的人重链位点和κ轻链座位的生殖系构象片段，其含有核心可变区和恒定区的序列。对于抗体的重排和表达而言含有人Ig的YAC证明与小鼠系统相容，并能够替代失活的小鼠Ig基因。这由其诱导B细胞发育、产生全人抗体的成熟样人所有组成成分、以及产生抗原特异性人单克隆抗体的能力得到证实。这些结果还提示，含有较大数量的V基因、附加的调节元件和人Ig恒定区的较大部分人Ig座位的引入可以基本上概括对感染和免疫的人体液应答特征性的所有组成成分。近来，Green等的工作扩展到通过分别引入人重链座位和κ轻链座位的兆碱基大小生殖系构象YAC片段而导入约80％以上人抗体所有组成成分以产生XenoMouseTM小鼠。见Mendez等Nature Genetics 15146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)，Green，Journal of Immunological Methods 23111-23(1999)和1996年12月3日提交的美国专利申请08/759,620，所有这些的公开均特此并入作为参考。
该方法还在以下文献中进行了讨论和描绘1990年1月12日提交的美国专利申请07/466,008，1990年11月8日提交的07/710,515，1992年7月24日提交的07/919,297，1992年7月30日提交的07/922,649，1993年3月15日提交的08/031,801，1993年8月27日提交的08/112,848，1994年4月28日提交的08/234,145，1995年1月20日提交的08/376,279，1995年4月27日提交的08/430,938，1995年6月5日提交的08/464,584，1995年6月5日提交的08/464,582，1995年6月5日提交的08/471,191，1995年6月5日提交的08/462,837，1995年6月5日提交的08/486,853，1995年6月5日提交的08/462,857，1995年6月5日提交的08/486,859，1995年6月5日提交的08/462,513，1996年10月2日提交的08/724,752和1996年12月3日提交的08/759,620。也参见Mendez等Nature Genetics 15146-156(1997)和Green和Jakobovits J Exp.Med.188483-495(1998)。也参见1996年6月12日授权公开的欧洲专利EP 0 471 151 B1，1994年2月3日公布的国际专利申请WO 94/02602，1996年10月31日公布的国际专利申请WO 96/34096，1998年6月11日公布的WO 98/24893。所有以上引用的专利、申请、和文献的公开均特此完整地并入作为参考。
人抗小鼠抗体(HAMA)应答导致制备嵌合或人源化抗体的工业。尽管嵌合抗体具有人恒定区和鼠可变区，但预期会观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)应答，尤其是在长期或多剂量使用抗体时。因此，可能期望提供针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的完全人类抗体，以便降低HAMA或HACA应答的影响和/或效果。
特异针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的单克隆抗体是使用杂交瘤技术制备的。(Kohler等，Nature 256495(1975)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6511(1976)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6292(1976)；Hammerling等，《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》，Elsevier，N.Y.第571-681页(1981))。简而言之，用G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达载体转染的细胞免疫XenoMouseTM小鼠(详情见实施例54)。免疫后，提取该小鼠的脾细胞并将其与适当的骨髓瘤细胞系融合。任何适当的骨髓瘤细胞系均可以用于本发明；然而，优选使用亲本骨髓瘤细胞系(P3X63-AG8.653)(可从ATCC获得)。融合后，所获杂交瘤细胞在HAT培养基上选择性地维持，然后通过有效稀释进行克隆，参见Wands等的描述(Gastroenterology 80225-232(1981))。然后对通过该选择获得的杂交瘤细胞进行分析以鉴定分泌能够结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的抗体的克隆。
本发明涉及免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的完全人类抗体，一般是分离的。基本上是，用G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞免疫来自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)表达人抗体的XenMouse小鼠系(免疫操作方法的详情，见实施例54)；从具有高滴度抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体的小鼠回收脾和/或淋巴结细胞(含有B细胞)；并将此回收细胞与髓样细胞系融合以制备永生化杂交瘤细胞系。筛选杂交瘤细胞系以选择和鉴定产生特异针对免疫原的抗体的杂交瘤细胞系。我们利用这些技术根据本发明制备特异针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的抗体。此处，我们描述了产生特异针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的抗体的多杂交瘤细胞系的制备。而且，我们提供了该细胞系产生的此抗体的表征。
来源于本文讨论的杂交瘤细胞系的抗体列在表2中。本发明优选抗体包括如下细胞系表达的抗体XF11.1D8、XF11.4D10、XF11.4C4、XF11.5H1、和XF11.1G8。Abgenix，Inc.的XenoMouse小鼠系表达人κ轻链以及人IgG1、IgG2或IgG4。表达IgG2的品系被用于制备本发明细胞系和抗体，因此细胞系产生的所有抗体均是具有人κ轻链的完全人类IgG2重链。这些杂交瘤细胞系在表2所列日期保藏在美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，被给予表2所列的ATCC保藏号。ATCC位于10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。ATCC保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行的。
杂交瘤XF11.1D8于2001年2月7日保藏在ATCC，ATCC保藏号_____。杂交瘤XF11.4D10于2001年2月7日保藏在ATCC，ATCC保藏号____。杂交瘤XF11.4C4于2001年2月7日保藏在ATCC，ATCC保藏号____。杂交瘤XF11.5H1于2001年2月7日保藏在ATCC，ATCC保藏号______。杂交瘤XF11.1G8于2001年2月7日保藏在ATCC，ATCC保藏号____。这些ATCC保藏号和杂交瘤命名也列于表2中。表2表达抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体的杂交瘤细胞系
在一个实施方案中，本发明提供表达本发明抗体的杂交瘤细胞系。在特定实施方案中，本发明的杂交瘤细胞系是XF11.1D8。在另一特定实施方案中，本发明的杂交瘤细胞系是XF11.4D10。在另一特定实施方案中，本发明的杂交瘤细胞系是XF11.4C4。在另一特定实施方案中，本发明的杂交瘤细胞系是XF11.5H1。在另一特定实施方案中，本发明的杂交瘤细胞系是XF11.1G8。
本发明包括免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或其片段、变体或融合蛋白的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽包括但不限于SEQ ID NO；2的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或1995年7月1日保藏的ATCC保藏物97183中所含克隆HDGNR10的DNA编码的多肽；G蛋白趋化因子受体(CCR5)可以通过重组表达编码SEQ ID NO2的多肽的核酸或ATCC保藏号97183中HDGNR10 DNA来制备。
在本发明一个实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体包含具有表2所示至少一种细胞系表达的任意一条重链和/或表2所示至少一种细胞系表达的任意一条轻链的氨基酸序列的多肽。在本发明另一实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体的抗体，包含具有表2所示至少一种细胞系表达的任意一个重链VH域和/或表2所示至少一种细胞系表达的任意一个轻链VL域的氨基酸序列的多肽。在优选实施方案中，本发明抗体包含选自表2所示细胞系的相同细胞系表达的VH域和VL域的氨基酸序列。在替代实施方案中，本发明抗体包含来自表2所示的不同细胞系的VH域和VL域的氨基酸序列。包含至少一种表2所示细胞系表达的VH和/或VL域的抗体片段或变体的或由它们组成的、免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的分子也包括在本发明内，编码这些VH和VL域、分子、片段、和/或变体的核酸分子也包括在内。
本发明还提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽、或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有表2所示一种或多种细胞系表达的重链中所含的任意一个、两个、三个或更多个VH CDR的氨基酸序列。尤其是，本发明提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)并包含如下多肽或由其组成的抗体，所述多肽具有表2所示一种或多种细胞系表达的重链中所含的VHCDR1的氨基酸序列。在另一实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有表2所示一种或多种细胞系表达的重链所含的VH CDR2的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有表2所示一种或多种细胞系表达的重链所含的VH CDR3的氨基酸序列。包含这些抗体或其抗体片段或变体或由它们组成的、免疫特异性结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段或其变体的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子也包括在内。
本发明还提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽、或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有表2所示一种或多种细胞系表达的重链中任意一个、两个、三个、或更多个VL CDR的氨基酸序列。尤其是，本发明提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)、并包含如下多肽或由其组成的抗体，所述多肽具有表2所示一种或多种细胞系表达的重链中VL CDR1的氨基酸序列。在另一实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有表2所示一种或多种细胞系表达的重链中VL CDR2的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体包含如下多肽或由其组成，所述多肽具有表2所示一种或多种细胞系表达的重链所含的VLCDR3的氨基酸序列。包含这些抗体或其抗体片段或变体或由它们组成的、免疫特异性结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段或变体的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段和/或变体的核酸分子也包括在内。
本发明还提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或G蛋白趋化因子受体(CCR5)的多肽片段或变体的抗体(包括含有抗体片段或其变体或由其组成的分子)，其中所述抗体包含表2所示一种或多种细胞系表达的重链或轻链中的一个、两个、三个或更多个VH CDR和一个、两个、三个或更多个VL CDR，或由它们组成。尤其是，本发明提供免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含表2所示一种或多种细胞系表达的重链或轻链中VHCDR和VL CDR的VH CDR1和VL CDR1、VH CDR1和VL CDR2、VH CDR1和VL CDR3、VH CDR2和VL CDR1、VH CDR2和VL CDR2、VH CDR2和VL CDR3、VH CDR3和VH CDR1、VH CDR3和VL CDR2、VH CDR3和VL CDR3、或它们的任何组合，或所述抗体由它们组成。在一个优选实施方案中，这些组合中的一个或多个来自于表2公开的相同scFv。包含这些抗体的片段或变体或由它们组成的、免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的分子也包括在本发明内，同样编码这些抗体、分子、片段或变体的核酸分子也包括在内。编码相应于Xenomous系来源抗体的抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体的核酸分子本发明还提供编码本发明抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)的核酸分子，其一般是分离的。在一个特定实施方案中，本发明核酸分子编码如下抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有至少一种表2所示细胞系所表达的重链的任一个VH域的氨基酸序列的VH域和具有至少一种表2所示细胞系表达的轻链的氨基酸的VL域，或由它们组成。在另一实施方案中，本发明核酸分子编码如下抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，所述抗体包含具有至少一种表2所示细胞系所表达重链的任一个VH域的氨基酸序列的VH域或具有至少一种表2所示细胞系表达的轻链的氨基酸的VL域，或由它们组成。
本发明还提供包含本文所述抗体分子(例如VH域和/或VL域)的变体(包括衍生物)或由其组成的抗体，其中该抗体免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其片段或变体。本领域技术人员已知的标准技术可以用于将突变引入编码本发明分子的核苷酸序列中，包括例如导致氨基酸替代的定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸替代、少于40个氨基酸替代、少于30个氨基酸替代、少于25个氨基酸替代、少于20个氨基酸替代、少于15个氨基酸替代、少于10个氨基酸替代、少于5个氨基酸替代、少于4个氨基酸替代、少于3个氨基酸替代、或少于2个氨基酸替代(相对于参考VH域，即VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3，VL域，即VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3而言)。“保守氨基酸替代”是指将氨基酸残基替代为具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族在现有技术中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬暗算、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，可以沿着全部或部分的编码序列，例如通过饱和诱变，随机地引入突变，并可以就生物学活性筛选所获突变体以鉴定保留活性(例如结合G蛋白趋化因子受体的能力)的突变体。
例如，可以仅在抗体分子的构架区或仅在CDR区引入突变。引入的突变可以是沉默突变或中性错义突变，即不或几乎不影响抗体结合抗原的能力。这些突变的类型可以用于优化密码子使用、或提高杂交瘤的抗体产生。另一方面，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默突变和中性错义突变的定位可能在构架区中，而大多数非中性错义突变的定位可能在CDR中，但是这并不是绝对的必要条件。本领域技术人员将能够设计和检测到具有期望性质(例如不改变抗原结合活性或改变结合活性(例如提高抗原结合活性或改变抗体特异性))的突变分子。诱变后，可以常规地表达编码蛋白、并使用本文所述技术或通过本领域已知的常规修饰的技术测定编码蛋白的功能和/或生物学活性(例如免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体的能力)。
在一个具体实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或其片段或变体的本发明抗体(包括含有其抗体片段或变体或由其组成的分子)，包含如下核苷酸序列编码的氨基酸序列或由其组成，所述核苷酸序列可与互补于表2所列一种或多种细胞系表达的一种VH或VL域的编码序列的核苷酸序列杂交，所述杂交的条件是严紧条件，例如与滤膜结合的DNA在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，之后在0.2×SSC/0.1％SDS中于约50-65℃下作一或多次洗涤；高度严紧条件，例如与滤膜结合的核酸在6×SSC中约45℃下杂交，之后在0.1×SSC/0.2％SDS中于约68℃下作一或多次洗涤；或本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件(参见例如Ausubel，F.M.等编，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，Green PublishingAssociates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，纽约，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。编码这些抗体的核酸分子也包括在本发明内。
正如本领域熟知的，具有相似氨基酸序列的多肽、或其片段或变体常常具有相似的结构和许多相同的生物学活性。因此，在一个实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽片段或变体的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VH域或由其组成，所述氨基酸序列与表2所列至少一种细胞系所表达的重链的VH域的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的一致性。
在另一实施方案中，免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的片段或变体的抗体(包括含有其抗体片段或变体或由它们组成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VL域或由其组成，所述氨基酸序列与表2所列至少一种细胞系所表达的轻链的VL域的氨基酸序列有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的一致性。编码抗体的多核苷酸本发明抗体(包括抗体片段或变体)可以通过本领域任何已知方法制备。例如，应当理解根据本发明的抗体可以在非杂交瘤细胞系的细胞系中表达。例如，可以使用编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列转化适当哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞或制备噬菌体展示文库。此外，本发明多肽抗体可以通过化学方法合成或通过使用重组表达系统产生。
制备本发明抗体的一个途径是克隆表2所列任何一种或多种杂交瘤细胞系表达的VH和/或VL域。为了从这些杂交瘤细胞系分离VH和VL域，可以使用包括VH或VL核苷酸序列(见实施例55)的PCR引物从分离自杂交瘤细胞系的总RNA中扩增表达的VH和VL序列。然后可以使用载体，例如具有由5’和3’单个T核苷酸突出端组成的PCR产物克隆位点的载体(该突变端可以与用于PCR反应的许多DNA聚合酶添加在PCR产物5’和3’末端的单个腺嘌呤核苷酸突变端互补)，克隆PCR产物。然后可以使用本领域已知的常规方法对此VH和VL域测序。
可以将克隆的VH和VL基因置于一种或多种适当表达载体中。作为非限制性例子，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点、和保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物扩增该VH或VL域。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将此PCR扩增的VH域克隆至表达适当免疫球蛋白恒定区(例如分别地用于VH域的人IgG1或IgG4恒定区，和用于κ和λVL域的人κ或λ恒定区)的载体中。优选地，表达该VH或VL域的载体包含适合指导该重链和轻链在所选表达系统中表达的启动子；分泌信号；用于免疫球蛋白可变区、免疫球蛋白恒定区的克隆位点；和选择标记如新霉素。还可以将该VH和VL域克隆至表达必要恒定区的单一载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术(见例如Guo等，J.Clin.Endocrinol.Metab.82925-31(1997)，和Ames等，J.Immunol.Methods 184177-86(1995)，将它们完整地并入本文作为参考)，将重链转换载体(conversion vector)和轻链转换载体共转染至细胞系中以产生表达全长抗体如IgG的稳定或瞬时细胞系。
本发明还提供包含编码本发明多肽和其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还包括在严紧或较低严紧杂交条件下(例如上文所定义的)与编码如下抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中优选地所述抗体是特异地结合本发明多肽的抗体、优选地是结合具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽或保藏克隆编码的多肽的抗体。
该多核苷酸的获得和该多核苷酸的核苷酸序列的确定可以通过本领域任何已知方法实现。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则可以从化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸(例如，Kutmeier等，BioTechniques 17242(1994)描述的方法)，简而言之，这包括合成含有编码该抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，将这些寡核苷酸退火并连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，可以从适当来源的核酸制备编码抗体的多核苷酸。如果不能得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成、或使用可与该序列3’和5’末端杂交的合成引物通过PCR扩增从适当来源(例如从产生自或分离自表达该抗体的任何组织或细胞，如经选择表达本发明抗体的杂交瘤细胞的抗体cDNA文库或cDNA文库或核酸、优选poly A+RNA)获得(见实施例55)，或通过使用特异针对特定基因序列的寡核苷酸探针，例如从cDNA文库鉴定编码该抗体的cDNA克隆来进行克隆。然后，使用本领域任何熟知的方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆至可复制克隆载体中。
一旦测定了该抗体的核苷酸序列和相应氨基酸序列，即可以使用本领域用于操作核苷酸序列的熟知方法，如重组DNA技术、定点诱变、PCR等操作该抗体的核苷酸序列(见例如描述在以下文献中的技术Sambrook等，1990，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning，A laboratoryManual)第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等编，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY，两者均完整地并入本文作为参考)，以制备具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸替代、缺失和/或插入。
在一个特定实施方案中，可以通过本领域熟知方法，例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较以确定序列高变区，检查重链和/或轻链可变区的氨基酸序列来鉴定互补决定区(CDR)的序列。使用常规重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入构架区内，例如插入人构架区中以人源化非人抗体，参见以上描述。构架区可以是天然存在的或共有构架区，优选人构架区(参见例如Chothia等，J.Mol.Biol.278457-479(1998)列出的人构架区)。优选通过组合构架区和CDR制备的多核苷酸编码特异结合本发明多肽的抗体。优选地，正如以上讨论的，可以在构架区中进行一个或多个氨基酸替代，而且优选氨基酸替代提高抗体与其抗原的结合。此外，可以使用这些方法造成参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸替代或缺失，以产生缺失一个或多个链内二硫键的抗体分子。对该多核苷酸的其它改变也包括在本发明内并属于本领域技术人员的范围。
对于一些应用，例如本发明抗体的体外亲和力成熟，可能有用的是将一种或多种本发明抗体的重链和轻链VH和VL域在噬菌体展示文库中表达为单链抗体或Fab片段。例如，可以使用噬菌体展示文库，将编码一种或多种本发明抗体的VH和VL域的cDNA以所有可能的组合进行表达，从而允许选择以优选的结合特征(例如提高的亲和性或提高的关闭速率)结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的VH/VL组合。此外，尤其是，VH和VL区段——本发明一种或多种抗体的VH和VL域的CDR区，可以在体外进行突变。具有“突变”的CDR的VH和VL域在噬菌体展示文库中的表达使得可以选择出以优选的结合特征(例如提高的亲和性或提高的关闭速率)结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的VH/VL组合。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体域展示在带有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。具体地，从动物cDNA文库(例如人或鼠淋巴样组织的cDNA文库)或合成的cDNA文库扩增编码VH和VL域的DNA序列。通过PCR经scFv接头将编码VH和VL域的DNA连接起来并将其克隆至噬菌粒载体(例如PCANTAB 6或pComb 3 HSS)中。通过电穿孔使用该载体转化大肠杆菌，并用辅助噬菌体感染该大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体典型地是丝状噬菌体如fd和M13。该VH和VL域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可以使用抗原，例如标记的抗原或与固体表面或珠结合或被其捕获的抗原，筛选或鉴定表达结合目的抗原(例如G蛋白趋化因子受体多肽或其片段)的抗原结合域的噬菌体。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括但不限于公开在如下文献中的那些Brinkman等，J.Immunol.Methods 18241-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic等，Gene 1879-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology 57191-280(1994)；PCT申请PCT/GB91/01 134；PCT公开文本WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18719；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401 WO 97/13844；和美国专利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427；908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,717；5,780,225；5,658,727；5,735,743和5,969,108；所有均完整地并入本文作为参考。
此外，可以使用通过将具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起而开发用于制备“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855(1984)；Neuberger等，Nature 312604-608(1984)；Takeda等，Nature314452-454(1985))。正如以上讨论的，嵌合抗体是具有来源于不同动物物种的不同部分的分子，例如具有来源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些抗体，如人源化抗体。
或者，可以采用描述用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778；Bird，Science 242423-42(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；和Ward等，Nature 334544-54(1989))以制备单链抗体。通过将重链和轻链的Fv区片段经氨基酸桥连接导致单链多肽而形成单链抗体。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等，Science 2421038-1041(1988))。制备抗体的方法本发明抗体可以通过本领域已知用于合成抗体的任何方法制备，尤其是化学合成、细胞内免疫(即intrabody技术)、或优选地重组表达技术。制备抗体的方法包括但不限于杂交瘤技术、EBV转化、和本文讨论的其它方法以及重组DNA技术的使用，见如下讨论。
本发明抗体或其片段、衍生物、变体或类似物(例如本发明抗体的重链或轻链或本发明单链抗体)的重组表达要求构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得了编码本发明抗体分子或抗体重链或轻链、或它们的部分(优选地含有重链或轻链可变区)的多核苷酸后，则可以通过重组DNA技术使用本领域熟知的技术制备用于产生该抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建含有抗体编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。因此，本发明提供包含与启动子可操作地连接的、编码本发明抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变区的核苷酸序列的可复制载体。这些载体可以包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见例如PCT公开文本WO 86/05807；PCT公开文本WO 89/01036；和美国专利5,122,464)，并且可以将抗体的可变区克隆至该载体中用于表达完整的重链或轻链。
通过常规技术将表达载体转染至宿主细胞中，然后通过常规技术培养该转染的细胞以制备本发明抗体。因此，本发明包括含有与异源启动子可操作地连接的、编码本发明抗体、或其重链或轻链、或本发明单链抗体的多核苷酸的宿主细胞。在用于表达双链抗体的优选实施方案中，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链的载体以表达完整的免疫球蛋白分子，见如下详述。
可以利用多种宿主表达载体系统表达本发明抗体分子。这些宿主表达系统可以是这样的载体，通过它可以产生并随后纯化该目的编码序列，这些宿主表达系统也可以是当用适当核苷酸编码序列转化或转染后可以原位表达本发明抗体分子的细胞。这些系统包括但不限于用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或将含有哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)来源的启动子的重组表达结构包含在内的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3、NSO细胞)。优选地，使用细菌细胞如大肠杆菌(Escherichiacoli)，更优选地真核细胞，尤其是用于表达整个重组抗体分子的真核细胞，进行重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)与载体如人巨细胞病毒主要立即早期基因启动子元件组合构成抗体的有效表达系统(Foecking等，Gene 45101(1986)；Cockett等，Bio/Technology 82(1990))。
在细菌系统中，可以根据所表达的抗体分子的预期用途有利地对许多表达载体进行选择。例如，当需要产生大量此类蛋白质用于制备抗体分子的药物组合物时，可能期望使用指导表达高水平易于纯化的融合蛋白产物的载体。这些载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.21791(1983))，其中抗体编码序列可以单独地按与lacZ编码区符合阅读框的形式连接至载体中以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.133101-3109(1985)；VanHeeke & Schuster，J.Biol.Chem.245503-5509(1989))；等等。pGEX载体也可以用于将外源多肽和谷胱苷肽S转移酶(GST)表达为融合蛋白。一般地，这些融合蛋白是可溶性的，并且可以容易地从裂解的细胞中通过吸附和结合谷胱苷肽琼脂糖珠基质、然后在游离谷胱苷肽存在下洗脱而得以纯化。pGEX载体被设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以致可以从GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)被用作载体以表达外源基因。病毒生长在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。抗体编码序列可以单独地克隆至病毒的非必需区(例如多角体基因)并置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用大量基于病毒的系统。当使用腺病毒作为表达载体时，可以将目的抗体编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物如晚期启动子和三联前导序列连接。然后可以将此嵌合基因通过体外或体内重组插入腺病毒基因组中。在病毒基因非必需区(例如E1或E3区)中的插入将导致在感染宿主中可存活的并能够表达抗体分子的重组病毒。(例如参见Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81533-359(1984))。还可能需要特异的起始信号以有效地翻译插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。而且，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框同相(in frame)以保证整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，既可以是天然的也可以是合成的。表达效率可以通过包括适当的转录增强元件、转录终止子等来增加(见Bittner等，Methods in Enzymol。153；51-544(1987))。
此外，还可以选择调节插入序列表达、或以期望的特定方式修饰并加工基因产物的宿主细胞系。蛋白质产物的这些修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有特征性的和特异的机制控制蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰。可以选择适当的细胞系或宿主系统以保证表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。因此，可以使用具有适当加工原始转录本、糖基化、和磷酸化基因产物的细胞机器的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38，尤其是乳腺癌细胞系如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常哺乳动物腺细胞系如CRL7030和Hs578Bst。
对于长期高产量的产生重组蛋白，优选稳定表达。例如，可以对稳定表达抗体分子的细胞系进行改造。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，可以使用适当表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的具有选择标记的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可以使经改造的细胞在丰富培养基中生长1-2天，然后转移至选择培养基上。重组质粒中的选择标记孵育选择物抗性并选择细胞稳定地将质粒整合至其染色体中以及生长形成转化灶，又可以克隆这些转化灶并将其扩增为细胞系。该方法可以有利地用于改造表达抗体分子的细胞系。这些经改造的细胞系尤其可以用于筛选和评价直接或间接与抗体分子相互作用的化合物。
许多筛选系统都可以使用，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11223(1977))，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48；202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 22817(1980))基因可以分别用于tk-、hgprt-或apt-细胞。而且，可以使用抗代谢物抗体作为如下基因的筛选基础dhfr，其赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 77357(1980)；O’Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527(1981))；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981)；neo，其赋予氨基糖苷G418抗性(Clinical Pharmacy 12；488-505)；Wu和Wu，Biotherapy 3；87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32；573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，1993，TIB TECH11(5)155-215)；和hygo，其赋予潮霉素抗性(Santerre等，Gene 30147(1984))。本领域一般已知的重组DNA技术方法可以常规地用于筛选期望重组克隆，这些方法描述在例如Ausubel等(编)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；和第12和13章，Dracopoli等(编)，Current Protocols in HumanGenetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.1501(1981)，它们完整地并入本文作为参考。
抗体分子表达水平可以通过载体的扩增而增加(综述见Bebbington和Hentschel，DNA克隆中基于基因扩增使用载体在哺乳动物细胞表达克隆基因，Vol.3(Academic Press，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，则宿主细胞培养基中存在的抑制剂的水平的增加将使标记基因的拷贝数增加。由于扩增区域与抗体基因相关，因此也将增加了抗体的产量(Crouse等，Mol.Cell Biol.3257(1983))。
使用谷氨酰胺合成酶(GS)或DHFR作为选择标记的载体可以分别在药物甲硫氨酸sulphoximine或氨甲蝶呤存在下扩增。基于谷氨酸合成酶的载体的优点在于可获得谷氨酰胺合成酶阴性的细胞系(例如鼠骨髓瘤细胞系，NSO)。谷氨酰胺合成酶表达系统也可以在谷氨酰胺合成酶表达细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中通过提供其它的抑制剂防止内源性基因的功能而起功能。使用谷氨酰胺合成酶作为选择标记的载体包括但不限于pEE6表达载体，其描述在Stephens和Cockett，Nucl.Acids.Res177110(1989)。谷氨酰胺合成酶表达系统和其成分描述在PCT公开文本WO 87/04462；WO 86/05807；WO 89/01036；WO 89/10404；和WO91/06657，这些均完整地并入本文作为参考。此外，根据本发明可以使用的谷氨酰胺合成酶表达载体可从供应商处购买，它们包括例如LonzaBiologics，Inc.(Portsmouth，NH)。使用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达和制备单克隆抗体，描述在Bebbington等，Bio/technology10169(1992)和Biblia和Robinson，Biotechnol.Prog.111(1995)，它们完整地并入本文作为参考。
可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，其中第一载体编码重链来源的多肽而第二载体编码轻链来源的多肽。两个载体可以含有相同的选择标记，从而使得可以均等地表达重链和轻链多肽。或者，可以使用编码并能够表达重链和轻链多肽的单一载体。在此情况下，轻链应放置在重链前面以避免毒性游离重链的过量(Proudfoot，Nature 322；52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197(1980))。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
一旦通过动物、化学合成、或重组表达产生了本发明抗体分子后，可以通过本领域已知用于纯化免疫球蛋白的任何方法对其进行纯化，这些方法的例子有层析(例如离子交换、亲和、尤其是用于纯化蛋白质A之后的特异抗原的亲和层析，和大小排阻柱层析)、离心、差异溶解、或任何其它用于纯化蛋白质的标准技术。此外，本发明抗体或其片段可以和本文描述的或本领域已知的异源多肽序列融合以利于纯化。抗体缀合物本发明包括通过重组方式融合或通过化学方式缀合(包括共价和非共价缀合)了本发明多肽(或其部分，优选该多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)产生融合蛋白的抗体。该融合不一定是直接的，也可以通过接头序列进行。抗体可以特异针对非本发明多肽(或其部分，优选该多肽的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的抗原。例如，可以通过将本发明多肽和特异针对特定细胞表面受体的抗体融合或缀合，而使用该抗体体内或体外将本发明多肽靶向特定细胞系。本发明多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可以和异源蛋白(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端融合。本发明抗体还可以和白蛋白(包括但不限于重组人血清白蛋白)融合(见例如1999年3月2日提交的美国专利5,876,969、EP专利0 413 622、和1998年6月16日提交的美国专利5,766,883，特此完整地并入作为参考)，获得嵌合多肽。在一个优选实施方案中，本发明多肽和/或抗体(包括其片段或变体)与人血清白蛋白的成熟形式(即EP 0322 094图1和2中所示人血清白蛋白第1-585位氨基酸)融合，该文献完整地并入本文作为参考。在另一优选实施方案中，本发明多肽和/或抗体(包括其片段或变体)与如下多肽片段融合，所述多肽片段包含人血清白蛋白第1-z位氨基酸残基或由它们组成，其中z是369至419的整数，参见美国专利5,766,883，其被完整地并入作为参考。编码本发明融合蛋白的多核苷酸也包括在本发明内。这些融合蛋白可以例如有利于纯化并可以增加体内半衰期。与本发明多肽融合或缀合的抗体也可以采用本领域已知的方法用于体外免疫测定和纯化方法中。见例如Harbor等，同上和PCT公开文本WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，Immunol.Lett.39；91-99(1994)；美国专利5,474,981；Gillies等，PNAS 891428-1432(1992)；Fell等，J.Immunol.1462446-2452(1991)，所有均完整地并入作为参考。
本发明还包括包含与非可变区的抗体域融合或缀合的本发明多肽的组合物。例如，本发明多肽可以与抗体Fc区或其部分融合或缀合。与本发明多肽融合的抗体部分可以包含恒定区、铰链区、CH1域、CH2域和CH3域、或所有域或其部分的任意组合。这些多肽还可以与上述抗体部分融合或缀合形成多聚体。例如，与本发明多肽融合的Fc部分可以通过两个Fc部分之间的二硫键形成二聚体。更高的多聚体形式可以通过将该多肽与IgA和IgM的部分融合来制备。使本发明多肽与抗体部分融合或缀合的方法是本领域已知的。见例如美国专利5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,112,946；EP 307,434；EP367,166；PCT公开文本WO 96/04388；WO 9I/06570；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810535-10539(1991)；Zheng等，J.Immunol.1545590-5600(1995)；和Vil等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8911337-11341(1992)(所述文献完整地并入本文作为参考)。
正如以上所讨论的，相应于SEQ ID NO2或保藏克隆编码多肽的多肽、多肽片段、或变体的多肽可以通过使用本领域已知方法和上述抗体部分融合或缀合以增加该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。而且，相应于SEQ ID NO2或保藏克隆所编码多肽的多肽可以和上述抗体部分融合或缀合以利于纯化。一个报道的例子描述了由人CD4多肽的头两个域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的不同域组成的嵌合蛋白。(EP394,827；Traunecker等，Nature 33184-86(1988))。与具有二硫键连接的二体结构(由于IgG)的抗体融合或缀合的本发明多肽也可以比单纯的单体分泌蛋白或蛋白片段在结合和中和其它分子方面更有效(Fountoulakis等，J.Biochem.2703958-3964(1995))。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有益的，因此可以导致例如提高的药物动力学性质。(EP A 232,262)。或者，在融合蛋白质表达、检测和纯化后可能期望除去该Fc部分。例如，当融合蛋白用作免疫抗原时，该Fc部分可能阻碍治疗和诊断。在药物发现上，例如为了高通量地筛选分析以鉴定hIL-5的拮抗剂，将人蛋白质hIL-5与Fc部分融合。(见Bennett等，J.Molecular Recognition 852-58(1995)；Johanson等，J.Biol.Chem.2709459-9471(1995))。
而且，可以将本发明抗体或其片段与标记序列如利于纯化的肽融合。在优选实施方案中，该标记氨基酸序列是六组氨酸肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的该标签，尤其是它们中许多已可商业购买获得。正如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)中所述，六组氨酸使得可以方便地纯化融合蛋白。对于纯化有用的其它肽标签包括但不限于“HA”标签，其相应于流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell37767(1984))，和“flag”标签。
本发明还包括域诊断或治疗剂缀合的抗体或其片段。这些抗体可以在诊断上用于例如监测肿瘤的发生或进展而作为临床测试程序的一部分，例如以确定给定治疗法的效率。可以通过将该抗体与可检测物质偶联有利检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射活性物质、使用多种正电子发射断层扫描术的正电子发射金属、和非放射活性顺磁金属离子。可检测物质可以直接地与抗体(或其片段)或间接地通过中间体(例如本领域已知的接头)使用本领域技术与抗体偶联或缀合。见例如用于可以根据本发明和抗体偶联作为诊断剂的金属离子的美国专利4,741,900。适当的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适当荧光物质的例子包括伞形酮、萤光素、异硫氰酸萤光素、罗丹明、二氯三嗪基胺萤光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素、水母发光蛋白；适当的放射活性物质的例子包括碘(121I、123I、125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(111In、112In、113mIn、115mIn)、锝(99Tc，99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga，67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh和97Ru。
在特定实施方案中，本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽与对于使多肽偶联放射金属离子(包括但不限于111In、177Lu、90Y、166Ho和153Sm)有用的大环螯合剂连接。在一个优选实施方案中，与结合本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的大环螯合剂连接的放射金属离子是111In。在另一个优选实施方案中，与结合本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的大环螯合剂连接的放射金属离子是90Y。在特定实施方案中，该大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N_-四乙酸(DOTA)。在其它特定实施方案中，DOTA与本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽通过接头分子连接。用于将DOTA和多肽偶联的接头分子的例子是本领域通常已知的-见例如DeNardo等，Clin Cancer Res.4(10)2483-90，1998；Peterson等，Bioconjug.Chem.10(4)553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.26(8)943-50，1999，特此经它们完整地并入作为参考。此外，美国专利5,652,361和5,756,065公开了可以和抗体缀合的螯合剂和它们的制备和使用方法，特此将它们完整地并入作为参考。尽管美国专利5,652,361和5,756,065集中于使螯合剂与抗体缀合，但本领域技术人员可以容易地改动其中所公开的方法使螯合剂与其它多肽缀合。
细胞毒素或细胞毒性剂包括损伤细胞的任何药剂。例子包括紫杉醇(paclitaxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、tenoposide、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素、以及它们的类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、decarbazine)、烷化剂(例如氮芥，thioepa chlorambucil，苯丙氨酸氮芥、亚硝基脲氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露糖醇、链脲菌素、丝裂霉素C、和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺氯氨铂)、蒽环类药(例如道诺红霉素(以前称道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称放线菌素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如长春花新碱和长春花碱)。
本发明抗体缀合物可以用于修饰指定的生物学反应，治疗剂或药物部分不应理解为限制于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望生物学活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质包括例如毒素如相思豆毒蛋白、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α干扰素、β干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂如TNF-α、TNF-β、AIM I(见国家公开WO 97/33899)、AIM II(见国际公开WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等，Int.Immunol.6；1567-1574(1994))，VEGI(见国际公开WO99/23015)、thromobotic剂或抗血管生成剂如制管张素或endostatin；或生物反应修饰剂例如淋巴因子、白介素1(“IL-1”)、白介素2(“IL-2”)、白介素6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其它生长因子。
还可以使抗体与固体支持物连接，这对于免疫测定或纯化靶抗原尤其有用。该固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚丙乙烯、聚乙烯氯或聚丙烯。
将这些治疗部分与抗体偶联的技术是熟知的，见例如Arnon等，“癌症治疗中用于药物的免疫打靶的单克隆抗体”，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antiboides and Cancer Therapy)，Reisfeld等(编)，pp243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“用于药物递送的抗体”，《受控的药物递送》(Controlled Drug Delivery)(第2版)，Robinson等(编)pp623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体综述”，《单克隆抗体’84生物学和临床应用》(Monoclonal Antibodies’84Biological and ClinicalApplications)，Pinchera等(编)，pp 475-506(1985)“癌症治疗中放射标记抗体治疗用途的分析、结果、和前景”，《用于癌症检测和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection andTherapy)，Baldwin等(编)，pp 303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性”，Immunol.Rev.62119-58(1982)。
或者，可以将抗体与二抗缀合形成抗体杂缀合物(heteroconjugate)，参见Segal的美国专利4,676,980，其完整地并入作为参考。
与治疗部分偶联或未偶联的抗体用作治疗剂时可以单独使用或联合细胞毒性因子和/或细胞因子一起使用。免疫表型分型(Immunophenotyping)本发明抗体可以用于对细胞系和生物样品进行免疫表型分型。本发明基因的翻译产物可以用作细胞特异标记，或更具体地用作差异表达在特定细胞类型发育和/或成熟不同阶段时的细胞标记。指向特定表位、或表位的组合的单克隆抗体将允许筛选表达该标记的细胞群。在使用单克隆抗体筛选表达该标记的细胞群时，多种技术可以使用，包括使用抗体包被的磁珠进行的磁性分离、使用与固体基质(即板)附着的抗体进行的“淘选”、和流式细胞技术(见例如美国专利5,985,660；和Morrison等，Cell，96737-49(1999))。
这些技术使得可以选择特定细胞群体，例如可以在血液恶性肿瘤(例如急性白血病患者的最小残余疾病(minimal residual disease)(MRD))中发现的那些，和移植物中的“非自体”细胞以防止移植物抗宿主疾病(GVHD)。或者，这些技术允许筛选能够经历增殖和/或分化的造血干细胞和祖先细胞，例如可以在人脐带血中找到的那些。抗体结合的测定法本发明抗体可以通过本领域任何已知方法分析其免疫特异性的结合。可以使用的免疫测定法包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性分析系统，所述技术的例子有BIAcore分析(见如实施例59)、FACS(荧光激活细胞分拣术)分析(见例如实施例54)、免疫荧光(见例如实施例56)、免疫细胞化学法、western印迹(见如实施例64和65)、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)(见如实施例54)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集试验、补体结合试验、免疫放射分析、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定，但这仅是举出的几个例子。这些测定是常规的并是本领域熟知的(见例如Ausubel等编1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，其完整地并入本文作为参考)。示例性免疫测定法简要地描述如下(但并不旨在构成限制)。
免疫沉淀操作方法一般包括在补加蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA，PMSF，抑酶肽、钒酸钠)的裂解缓冲液如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠(pH7.2)，1％Trasylol)中裂解细胞群，向细胞裂解物加入目的抗体，于4℃孵育一段时间(例如1-4小时)，向细胞裂解物加入蛋白A和/或蛋白G Sepharose珠，4℃孵育约1小时或更长，在裂解缓冲液中洗涤这些珠、并将这些珠重现悬浮在SDS/样品缓冲液中。目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如Western印迹分析评价。本领域技术人员应指导可以经修饰增加抗体与抗原的结合并降低背景的参数(例如用sepharose珠预先清洁细胞裂解物)。对于免疫沉淀操作方法的进一步讨论，参见例如Ausubel等，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，10.16.1。
Western印迹分析一般包括制备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如根据抗原的分子量的8％-20％SDS-PAGE)上电泳此蛋白样品，将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶上转移至膜如硝酸纤维素、PVDF或尼龙膜上，在封闭缓冲液(例如具有3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭膜，在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween 20)中洗涤膜，使用稀释在封闭缓冲液中的一抗(目的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，使用与酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射活性分子(例如32P或125I)缀合的二抗(识别一抗的抗体，如抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员将指导可以改变以增加检测信号并降低背景噪音的参数。对于western印迹操作方法的进一步讨论，见例如Ausubel等(编)1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，JohnWiley & Sons，Inc.，纽约，10.8.1。
ELISA包括制备抗原，用该抗原包被96孔微量滴定板的孔，孔中加入与可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合的目的抗体并孵育一段时间，检测抗原的存在。在ELISA中，目的抗体不必与可检测化合物缀合；相反，可以向孔中加入与可检测化合物偶联的二抗(识别目的抗体)。而且，替代用抗原包被孔，可以用抗体包被孔。在此情况下，可以在向包被孔中加入目的抗原后加入与可检测化合物缀合的二抗。本领域技术人员将指导可以改变以增加检测信号的参数以及本领域已知的ELISA的其它变体。对于ELISA的进一步讨论，参见Ausubel等(编)1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，JohnWiley & Sons，Inc.，纽约，11.2.1。
抗体与抗原的结合亲和性和抗体-抗原相互作用的关闭速率可以通过竞争性结合分析测定。竞争性结合分析的一个例子是放射免疫测定，其包括在存在增加量的未标记抗原下使标记抗原(例如3H或125I)和目的抗体孵育，并检测与标记抗原结合的抗体。目的抗体对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的亲和性以及结合关闭速率可以从斯卡查德作图分析的数据确定。也可以使用放射免疫测定确定与二抗的竞争。在此情况下，将G蛋白趋化因子受体(CCR5)与偶联了标记化合物(例如3H或125I标记的化合物)的目的抗体在增加量的未标记二抗存在下孵育。两种抗体间的此类竞争性测定也可以用于确定两种抗体是结合相同还是不同表位。
在一个优选实施方案中，BIAcore动力学分析被用于确定抗体(包括抗体片段或其变体)与G蛋白趋化因子受体(CCR5)或G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段的结合开启和关闭速率。BIAcore动力学分析包括分析抗体与表面固定了G蛋白趋化因子受体(CCR5)的芯片结合和解离，参见实施例59。治疗用途本发明还涉及基于抗体的治疗，其包括给动物，优选哺乳动物、更优选人类患者施用本发明抗体以治疗公开的一种或多种疾病、紊乱或病症。本发明治疗性化合物包括但不限于本发明抗体(包括本文所述其片段、类似物和衍生物)和编码本发明抗体(包括本文所述其片段、类似物和衍生物以及抗独特型抗体)的核酸。本发明抗体可以用于治疗、抑制或预防与本发明多肽的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱和病症，包括但不限于本文所述的任何一种或多种疾病、紊乱或病症。与本发明多肽的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱或病症的治疗和/或预防包括但不限于缓解与这些疾病、紊乱或病症有关的症状。本发明抗体可以按本领域已知的或本文所述的方式在可药用组合物中提供。
本发明抗体可以治疗使用的方式的概要包括局部或系统地在体内或通过抗体的直接细胞毒性如补体介导的细胞毒性(CDC)或通过效应细胞介导的细胞毒性(ADCC)结合多核苷酸或本发明多肽。这些方法的一些在下面作了更为详细的描述。借助本文提供的教导，本领域普通技术人员将知道如何将本发明抗体用于诊断、监测或治疗目的而无需过度的实验。
本发明抗体可以有利地和其它单克隆抗体或嵌合抗体、或和淋巴因子或造血生长因子(例如IL-2，IL-3和IL-7)组合使用，所述这些物质可以例如起到增加与抗体相互作用的效应细胞的数量或活性的作用。
本发明抗体可以单独地使用或组合其它类型的治疗(例如放疗、化疗、激素疗法、免疫疗法、抗肿瘤剂、和抗逆转录病毒剂)使用(见如下实施例28)。在一个高度优选的实施方案中，本发明抗体可以单独地使用或联合抗逆转录病毒剂使用(见如下实施例28)。一般地，优选施用与患者相同物种来源或物种反应性(就抗体而言)的产物。因此，在一个优选实施方案中，给人类患者施用人抗体、片段、衍生物、类似物或核酸以进行治疗或预防。
优选使用高亲和性和/或能够体内抑制和/或中和的针对本发明多肽或多核苷酸、或其片段或区域的抗体，进行涉及本发明多核苷酸或多肽(包括其片段)的免疫测定和与本发明多核苷酸或多肽(包括其片段)相关的疾病的治疗。这些抗体、片段或区域将优选对本发明多核苷酸或多肽(包括其片段)具有亲和性。优选的结合亲和性包括具有小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M的解离常数或Kd的那些。更优选的结合亲和性包括具有小于5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M或10-8M的解离常数或Kd的那些。甚至更优选的结合亲和性包括具有小于5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M的解离常数或Kd的那些。基因治疗在一个特定实施方案中，通过基因治疗，施用包含编码抗体或其功能性衍生物的核酸以治疗、抑制或预防与本发明多肽的异常表达和/或活性有关的疾病或病症。基因治疗是指通过向对象施用表达的或可表达的核酸进行治疗。在本发明该实施方案中，核酸产生介导治疗性效果的编码蛋白。
根据本发明，本领域现有基因治疗的所有方法均可以使用。示例性方法描述如下。
对于基因治疗方法的一般综述，见Goldspiel等，Clinical Pharmacy12488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32537-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)155-215(1993)。可以使用的本领域通常已知的重组DNA技术方法描述在Ausubel等(编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，Stockton Press，NY(1990)。
在一个优选方面，该化合物包含编码抗体的核酸序列，所述核酸序列是在适当宿主中表达该抗体或片段或嵌合蛋白或其重链或轻链的表达载体的部分。具体地，所述核酸序列具有可操作地连接该抗体编码区的启动子，所述启动子是诱导型或组成型的、并任选是组织特异的。在另一具体实施方案中，使用其中抗体编码序列和任何其它的期望序列被利于在基因组中期望位置进行同源重组的区域所包围的核酸分子，由此提供抗体编码核酸的染色体内表达(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989)。在特定实施方案中，该表达抗体分子是单链抗体；或者，该核酸序列包括编码抗体重链和轻链或它们的片段的序列。
向患者递送核酸分子可以是直接的，在此情况下患者被直接暴露于核酸或携带核酸的载体，或可以是间接的，在此情况下首先体外用核酸转化细胞，然后将细胞移植至患者体内。这两种方法分别被称作体内或离体基因治疗。
在一个特定实施方案中，直接体内施用核酸序列，这些核酸序列在其中被表达产生编码产物。这可以通过本领域许多已知方法来实现，例如将它们构建为适当核酸表达载体的部分并施用之以便它们进入细胞内，借助缺陷性或减毒型逆转录病毒或其它病毒载体进行感染(见美国专利4,980,286)、或直接裸DNA注射、或使用微粒轰击(例如基因枪；生物轰击，Dupont)、或用脂或细胞表面受体或转染剂包被、包封在脂质体、微颗粒或微胶囊中、或施用与已知进入细胞核的肽连接的这些核酸序列、施用与经历受体介导的内吞的配体连接的这些核酸序列(见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(其可以用于靶向特异表达该受体的细胞类型)等等。在另一实施方案中，可以形成其中配体包含破坏内体的病毒融合肽的核酸-配体复合物，从而使得核酸可以避免溶酶体的降解。在再一实施方案中，可以通过靶向特定受体而体内使核酸定向以便实现细胞特异摄取和表达(见例如PCT公开WO 92/06180；WO 92/22635；WO 92/20316；WO 93/14188；WO 93/20221)。或者，可以将核酸引入细胞内并通过同源重组(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989))使之整合在宿主细胞DNA中以便表达。
在一个特定实施方案中，使用含有编码本发明抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(见Miller等，Meth.Enzymol.217581-599(1993))。这些逆转录病毒含有正确包装病毒基因组并使之整合入宿主细胞DNA所必需的成分。将编码待用于基因治疗的抗体的核酸序列克隆至一种或多种载体中，这有利于将基因递送至患者体内。关于逆转录病毒载体的更多细节可以参见Boesen等，Biotherapy6291-302(1994)，其描述了使用逆转录病毒向造血干细胞递送mdr1基因以使该干细胞对化疗具有更大抗性。其它描述逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的文献有Clowes等，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem等，Blood 831467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，Human Gene Therapy 4129-141(1993)；和Grossman和Wilson，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3110-114(1993)。
腺病毒是可以用于基因治疗的其它病毒载体。对于向呼吸道上皮递送基因，腺病毒尤其是具有吸引力的载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮，它们在其中引起轻微的疾病。基于腺病毒的递送系统的其它靶标有肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，Current Opinion in Genetics and Development3499-503(1993)对基于腺病毒的基因治疗进行了综述。Bout等，HumanGene Therapy 53-10(1994)阐述了腺病毒载体在将基因转移至恒河猴呼吸道上皮中的应用。腺病毒在基因治疗中的用途的其它例子可以参见Rosenfeld等，Science 252431-434(1991)；Rosenfeld等，Cell68143-155(1992)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest.91225-234(1993)；PCT公开文本WO 94/12649；和Wang等，Gene Therapy 2775-783(1995)。在一个优选实施方案中，使用腺病毒载体。
腺相关病毒(AAV)也已被提议用于基因治疗(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)；美国专利5,436,146)。
基因治疗的另一方法涉及通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的沉淀、或病毒感染等方法将基因转移至组织培养细胞。通常，转移方法包括向细胞转移选择标记。然后对细胞进行选择以分离摄取并表达转移基因的那些细胞。然后将这些细胞递送给患者。
在此实施方案中，将核酸引入细胞，然后体内施用所获重组细胞。该引入可以通过本领域任何已知方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。用于将外源基因引入细胞的许多技术是本领域已知的(见例如Loeffler和Behr，Meth.Enzymol.217；599-618(1993)；Cohen等，Meth.Enzymol.217618-644(1993)；Cline，Pharmac.Ther.2969-92m(1985)，并可以根据本发明使用，前提是不破坏受体细胞的必需发育和生理功能。该技术应使得可以向细胞稳定转移核酸，以便该核酸可以被该细胞表达、并优选可以遗传并可由其细胞后代表达。
可以通过本领域已知的方法将所获重组细胞递送给患者。优选静脉内施用重组血液细胞(例如造血干细胞或祖先细胞)。预期使用的细胞量取决于期望的效果、患者的状态等，并可以由本领域技术人员确定。
为了基因治疗目的可以将核酸细胞导入其中的细胞包括任何期望的现有细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞、血液细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖先细胞，尤其是造血干细胞或祖先细胞，如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的造血干细胞或祖先细胞。
在一个优选实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。
在重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将编码抗体的核酸序列引入细胞中以便它们可以被细胞或其后代表达，然后体内施用这些重组细胞以便获得治疗效果。在一个特定实施方案中，使用干细胞或祖先细胞。可以体外分离和维持的任何干细胞和/或祖先细胞均可以潜在地用于本发明此实施方案(见例如PCT公开文本WO 94/08598；Stemple和Anderson，Cell，71973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Biol.21A229(1980)；和Pittelkow和Scott，Mayo Clinic Proc.61771(1986))。
在一个特定实施方案中，为了基因治疗目的待引入的核酸包含可操作地连接编码区的诱导型启动子，以便该核酸的表达可以通过控制适当转录诱导剂的存在或缺失而得到控制。治疗或预防活性的证明优选在用于人之前，体外然后体内测定本发明化合物或药物组合物的期望治疗或预防活性。例如，证明化合物或药物组合物的治疗或预防用途的体外测定法包括化合物对细胞系或患者组织样品的影响。化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的影响可以利用本领域技术人员已知的技术确定，包括但不限于花结形成试验和细胞裂解试验。根据本发明，可以用于确定是否需要使用特定化合物的体外试验包括体外细胞培养试验，其中将患者组织样品进行培养，并使之暴露于或向其施用化合物，然后观察该化合物对此组织样品的影响。治疗性/预防性给药和组合物本发明提供通过向对象施用有效量的本发明化合物或药物组合物，优选本发明抗体进行治疗、抑制和预防的方法。在一个优选方面，该化合物基本上是纯的(例如基本上不含有限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。对象优选是动物，包括但不限于诸如牛、猪、马、鸡、猫、狗等的动物，并优选是哺乳动物，更优选是人。
当化合物包含核酸或免疫球蛋白时，可以使用的制剂和给药方法参见上述。可以从以下描述的那些选择其它适当的制剂和给药途径。
多种递送系统是已知的并可以用于施用本发明化合物，它们例如包封在脂质体、微颗粒、微胶囊中、能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的内吞(见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262；4429-4432(1987))、将核酸构建为逆转录病毒或其它载体的部分，等等。导入方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、和口服途径。这些化合物或组合物可以通过任何常规途径施用，例如灌注或大量注射、通过上皮或粘膜皮肤的衬里(例如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等)吸收，并可以和其它生物学活性剂一起施用。可以系统或局部给药。此外，可能期望通过任何适当途径将本发明药物化合物或组合物导入中枢神经系统，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可以通过心室内导管例如与储液器如Ommaya储液器连接的心室内导管进行。也可以通过利用吸入器或喷雾器、并与气雾剂进行配制实现肺给药。
在一个特定实施方案中，可能期望在需要治疗的区域局部给予本发明药物化合物或组合物；这可以通过例如但不限制手术后局部灌注、局部应用，例如手术后与伤口敷料一起使用、注射、利用导管、利用栓剂、或利用植入物实现，其中所述植入物是多孔的、无孔的或胶状的物质，包括膜如硅橡胶(sialastic)膜或纤维。优选地，当使用本发明蛋白质(包括抗体)时，必须小心使用蛋白质不吸附于其上的物质。
在另一实施方案中，化合物或组合物可以在载体、尤其是脂质体中递送(见Langer，Science 2491527-1533(1999)；Treat等，《感染性疾病和癌症治疗中的脂质体》(Liposomes in the Therapy of InfectiousDisease and Cancer)，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，纽约，pp 353-365(1989)；Lopez-Berestein同上pp 317-327；一般参见文献同上)。
在再一实施方案中，化合物或组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(见Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，Surgery 88；507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med 321；574(1989))。在另一实施方案中，可以使用聚合材料(见Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编)，CRC Press，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball(编)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也见Levy等，Science 228190(1985)；During等，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71105(1989))。在再一实施方案中，可以将控释系统放置在治疗靶标如脑的附近，由此仅需要系统剂量的一部分(见例如Goodson，《控释的医学应用》(Medical Applicationsof Controlled Release)，同上，Vol.2，pp 115-138(1984))。
其它控释系统的讨论见Langer的综述(Science 249；1527-1533(1990))。
在本发明化合物是编码蛋白质的核酸的一个具体实施方案中，可以通过如下方式体内使用该核酸以促进其编码蛋白的表达，所述方式有例如将它们构建为适当核酸表达载体的部分并施用之以便它们进入细胞内，借助逆转录病毒(见美国专利4,980,286)、或直接裸DNA注射、或使用微粒轰击(例如基因枪；生物轰击，Dupont)、或用脂或细胞表面受体或转染剂包被、或施用与已知进入细胞核的同源框样肽连接的这些核酸序列(见例如Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868(1991))，等等。或者，可以将核酸引入细胞内，并通过同源重组使之整合在宿主细胞DNA中以便表达。
本发明还提供药物组合物。该药物组合物包含治疗有效量的化合物和可药用载体。在一个特定实施方案中，术语“可药用”是指被联邦或州政府管理机构批准或列在美国药典中或用于动物、更优选人的其它一般认可药典中。术语“载体(carrier)”是指稀释剂、佐剂、赋形剂、或治疗物质一起施用的载体工具(vehicle)。这些药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和含水葡聚糖和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是用作注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、但硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙烯、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要的话，组合物还可以含有微量润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等等的形式。可以将组合物与传统结合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适当的药物载体的例子描述在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。该组合物将含有治疗有效量的该化合物(优选纯化形式的)以及适当量的载体，以便提供用于向患者适当给药的形式。该制剂应适合给药模式。
在一个优选实施方案中，该组合物根据常规方法配制成适用于向人静脉内给药的药物组合物。典型地，用于静脉内给药的组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因以缓解注射位置的疼痛。一般地，这些成分单独提供或混合在一起以单位剂量形式提供，例如放置在密封容器如指示活性剂量的安瓿或药袋中作为冻干的干粉或无水浓缩物。当组合物通过注射施用时，可以提供安瓿注射用无菌水或盐水，以便成分可以在施用前混合。
本发明化合物可以配制成中性或盐形式。可药用盐包括与阴离子如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子形成的可药用盐，以及与阳离子如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙基胺、三乙基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的可药用盐。
对于治疗、抑制和预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病或紊乱有效的本发明化合物量可以通过标准临床技术确定。此外，可以任选地使用体外测定法帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中所用准确剂量也取决于给药途径、疾病或紊乱的严重性，并应根据医师的判断和每个患者的情况来确定。有效剂量可以从体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线来推断。
对于抗体，给患者的施用剂量典型地为0.1mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，给患者施用的剂量在0.1mg/kg至20mg/kg患者体重之间，更优选在1mg/kg至10mg/kg患者体重之间。一般地，由于针对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内比来自其它物种的抗体具有较长的半衰期。因此，较低剂量的人抗体和较少频率的给药常常是可以的。而且，本发明抗体的施用剂量和频率可以通过修饰如脂化增加抗体摄取和组织渗透(例如进入脑)而得以降低。
本发明还提供包含一个或多个容器的药包或试剂盒，所述容器装有本发明药物组合物中的一种或多种成分。任选地，可以在这些容器中装入具有管理药物或生物产品制造、使用或销售的政府机构签发形式的通知，该通知反映得到制造、使用或销售人用药品的管理机构的批准。诊断和成像特异结合目的多肽的标记抗体和其衍生物和类似物可以用于诊断目的以检测、诊断、或监测与本发明多肽的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱和/或病症。本发明为目的多肽异常表达的检测提供了方法，其包括(a)使用特异针对目的多肽的一种或多种抗体测定目的多肽在个体细胞或体液中的表达，和(b)将此基因表达水平和标准基因表达水平比较，籍此测定到的多肽基因表达水平与标准表达水平相比的增加或降低反映了异常表达。
本发明提供用于诊断紊乱的诊断方法，包括(a)使用特异针对目的多肽的一种或多种抗体测定目的多肽在个体细胞或体液中的表达，和(b)将此基因表达水平和标准基因表达水平比较，籍此测定到的多肽基因表达水平与标准表达水平相比的增加或降低反映了异常表达。就癌症而言，来自个体的活检组织中存在相对高量的转录本可以指示易发生该疾病，或可以为实际临床症状出现前检测疾病提供方法。更为明确的此类诊断可以允许保健专家较早使用预防措施或主动治疗方法，由此预防癌症的发生或进一步发展。
本发明抗体可以通过使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法用于分析生物样品中的蛋白质水平(见例如Jalkanen等，J.Cell Biol.101976-985(1985)；Jalkanen等，J.Cell Biol.1053087-3096(1987))。对于检测G蛋白基因表达有用的其它基于抗体的方法包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。适当的抗体测定标记是本领域已知的，包括酶标记如葡萄糖氧化酶；放射性同位素如碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)、和锝(99Tc)；发光标记，如鲁米诺；和荧光标记如荧光素和罗丹明；和生物素。
本发明一个方面是检测和诊断动物(优选哺乳动物、最优选人)中与本发明多肽的异常表达有关的疾病或紊乱。在一个实施方案中，诊断包括a)给对象施用(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)有效量的特异结合目的多肽的标记分子；b)施用后间隔一段时间以便允许标记分子优先地在对象的表达该多肽的位置聚集(并允许将未结合的标记分子清除至背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测对象中的标记分子，以致检测到高于背景水平的标记分子就表示该对象患有与目的多肽的异常表达有关的特定疾病或紊乱。背景水平可以通过多种方法确定，包括将检测到的标记分子的量与用于特定系统的先前确定的标准值进行比较。
本领域将理解对象的大小和所用成像系统将决定需要产生诊断影像所需的成像部分(moiety)的量。对于放射同位素部分，就人对象而言，注射的放射活性的量正常在约5至20毫居里的99mTc范围内。然后，标记的抗体或抗体片段会优先地聚集在含有特异蛋白质的细胞位置。体内肿瘤成像描述在S.W.Burchiel等，“放射标记的抗体和其片段的免疫药物动力学”(肿瘤成像放射化学检测癌症(Tumor ImagingTheRadiochemical Detection of Cancer)第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，Masson Publishing Inc.(1982)。
根据几个变量，包括所用标记的类型和给药模式，施用后允许标记分子优先在对象中某些位置聚集并允许将未结合的标记分子清除至背景水平的时间间隔为6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一实施方案中，施用后的时间间隔为5至20天或5至10天。
在一个实施方案中，通过重复诊断该疾病或病症的方法，例如最初诊断后一个月、最初诊断后六个月、最初诊断后一年等，检测该疾病或病症。
使用本领域已知用于体内扫描的方法可以在患者中检测到标记分子的存在。这些方法取决于所用标记的类型。技术人员将能够确定用于检测特定标记的适当方法。可以用于本发明诊断方法的方法和装置包括，但不限于电脑断层摄影(CT)、全身扫描如正电子发射断层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)和声波图。
在一个特定实施方案中，使用放射性同位素标记该分子并使用辐射反应手术装置(radiation responsive surgival instrument)(Thurston等，美国专利5,441,050)对患者进行检测。在一个实施方案中，用正电子发射金属标记分子，并使用正电子发射断层摄影法对患者进行检测。在另一实施方案中，使用顺磁标记对分子作标记，并使用磁共振成像(MRI)对患者进行检测。试剂盒本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器中的本发明的抗体，优选纯化的抗体。在一个特殊实施方案中，本发明的试剂盒含有基本上分离的包含与试剂盒中所含抗体发生特异性免疫反应的表位的多肽。优选，本发明的试剂盒进一步包括不与感兴趣的多肽发生反应的对照抗体。在另一个特殊实施方案中，本发明的试剂盒含有检测抗体与感兴趣的多肽结合的工具(如抗体可以与可检测的底物结合，如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物，或识别一抗的二抗可以与可检测的底物结合)。
在本发明的另一个特殊实施方案中，试剂盒是用于筛选含特异性抗增殖和/或癌性多核苷酸和多肽的抗体的血清的诊断试剂盒。这种试剂盒可以包括不与感兴趣的多肽发生反应的对照抗体。这种试剂盒可以包括基本上分离的含有与至少一个抗多肽抗原抗体发生特异性免疫反应的表位的多肽抗原。此外，这种试剂盒包括检测所述抗体与抗原结合的工具(如抗体可以与荧光化合物结合，如可被流式细胞计数检测的荧光素或碱性蕊香红B)。在特殊的实施方案中，试剂盒可以包括重组生产的或化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原也可以与固相支持体附着。
在一个更具体的实施方案中，上述试剂盒的检测工具包括与所述多肽抗原附着的固相支持体。这种试剂盒也可以包括未附着的报道分子标记的抗人抗体。在这个实施方案中，所述报道分子标记的抗体的结合可检测抗体与多肽抗原的结合。
在一个另外的实施方案中，本发明包括用于筛选含有本发明多肽抗原的血清的诊断试剂盒。诊断试剂盒包括基本上分离的与多肽或多核苷酸抗原发生特异性免疫反应的抗体，和检测多核苷酸或多肽抗原与抗体结合的工具。在一个实施方案中，抗体与固相支持体附着。在一个特殊实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。试剂盒的检测工具可以包括第二个标记的单克隆抗体。可供选择地，或另外，检测工具可以包括标记的竞争抗原。
在一个诊断结构中，待测血清与表面结合本发明方法得到的抗原的固相试剂发生反应。特异性抗原抗体与试剂结合并洗涤去除未结合的血清成分后，试剂与报道分子标记的抗人抗体发生反应，报道分子与试剂结合的比例与固相支持体上结合的抗抗原抗体的量成比例。再次洗涤试剂以去除未结合的标记抗体，确定与试剂相联的报道分子的量。典型地，报道分子是在合适的荧光、发光或比色底物(Sigma，St.Louis，MO)存在下孵育固相可检测到的酶。
上面试验中的固相表面试剂可用已知技术制备，将蛋白材料与固相支持体材料附着，如聚合株、浸棒(dip sticks)、96孔板或过滤材料。这些附着方法通常包括蛋白与支持体的非特异性吸附或蛋白典型地通过游离胺基与固相支持体上的化学反应基团，如羧基、羟基或醛基共价附着。可供选择地，链霉抗生物素包被板可用于与生物素化的抗原结合。
因此，本发明提供了实施这个诊断方法的检测体系或试剂盒。试剂盒通常包括表面结合重组抗原的支持体，和检测表面结合抗抗原抗体的报道分子标记的抗人抗体。融合蛋白任何G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可用于产生融合蛋白。例如，与第二蛋白融合时，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可用作抗原标记。抗G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的抗体通过与G蛋白趋化因子受体结合可用于间接检测第二蛋白。而且，由于分泌蛋白基于运输信号靶向细胞位置，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽一旦与其它蛋白融合可用于对准分子。
可与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽融合的结构域的实例不仅包括异源信号序列，还包括其它异源功能区。融合不是必须直接进行，也可以通过接头序列。
在某个优选实施方案中，本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白包含融合蛋白，其中G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽是上面描述为m-n的那些。在优选的实施方案中，本申请指向至少90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于编码这里引用的具有特殊N和C末端缺失的氨基酸序列的多肽的核酸序列的核酸分子。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
此外，融合蛋白也可以基因工程改造以改善G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的特性。例如，另外的氨基酸尤其是带电荷氨基酸区域可以添加到G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的N末端以提高从宿主细胞纯化或后来操作和保存期间的稳定性和持续性。而且，肽部分也可以添加到G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽上以利于纯化。这种区域可以在G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的最终制备前去除。添加肽部分以利于多肽的操作是本领域熟悉的和常规的技术。
如本领域技术人员会认识到的，本发明的多肽及其上述的含表位片段可以与异源多肽序列组合。例如，本发明的多肽(包括其片段或变异体)可以与免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)恒定区，或其部分(CH1，CH2，CH3)，或其任何组合和其部分进行融合产生嵌合多肽。作为另一个非限制性的实例，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变异体)可以与白蛋白(包括但不限于重组人血清白蛋白或其片段或变异体(如见美国专利号5,876,969，1999年3月2日颁发，EP专利0 413 622和美国专利号5,766,883，1998年6月16日颁发，这里以其完整形式引入作为参考))融合。在一个优选实施方案中，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变异体)与这里以完整形式引入作为参考的成熟形式的人血清白蛋白(即如EP专利0 322 094图1和2所示的人血清白蛋白的氨基酸1-585)融合。在另一个优选实施方案中，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变异体)与多肽片段(包括或可供选择地由人血清白蛋白的氨基酸残基1-z组成，这里z是从369至419的整数)进行融合，如这里以完整形式引入作为参考的美国专利5,766,883。本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变异体)可以与异源蛋白(如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端融合。编码本发明融合蛋白的多肽也包括在本发明中。
这些融合蛋白利于纯化并显示出体内半衰期增加。一个报道的实例描述了由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各种结构域组成的嵌合蛋白(EP A 394,827；Traunecker等，Nature 33184-86(1988))。具有二硫化物连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白与其它分子的结合和中和也可比单独单体分泌蛋白或蛋白片段更加有效(Fountoulakis等，J.Biochem.2703958-3964(1995).)。
同样地，EP-A-0 464 533(相应的加拿大2045869)公开了包含免疫球蛋白分子恒定区的各种部分和另一种人蛋白或其一部分的融合蛋白。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中有益，因此可产生如，提高药物动力学性能(EP-A 0232 262.)。可供选择地，融合蛋白被表达、检测和纯化后，期望缺失Fc部分。例如，如果融合蛋白用作免疫的抗原，Fc部分可能阻碍治疗和诊断。例如，在药物发现中，为了高生产量筛选试验以鉴定hIL-5的拮抗剂，人蛋白，如hIL-5已经与Fc部分融合(见D.Bennett等，J.Molecular Recognition 852-58(1995)；K.Johanson等，J.Biol.Chem.2709459-9471(1995))。
而且，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以与标记序列融合，如利于G蛋白趋化因子受体纯化的肽。在优选实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，尤其是如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)提供的标记，其中许多是商业上可得到的。例如，如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)中描述，六组氨酸为融合蛋白方便纯化做了准备。另一个对纯化有用的肽标记“HA”标记相当于来自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell37767(1984).)。
因此，使用G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸或多肽可改造任何上述这些融合物。载体、宿主细胞和蛋白生产本发明也涉及含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的载体、宿主细胞和重组技术生产多肽。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是可复制的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒增殖通常只在补充宿主细胞中发生。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可以与含有在宿主细胞中增殖的可选择性标记的载体连接。通常，质粒载体用沉淀导入，如磷酸钙沉淀，或用带电荷脂质的复合体导入。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外包装，然后导入宿主细胞。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸插入片段应当可操作连接适当的启动子，如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTRs的启动子，等等。其它合适启动子将是本领域技术人员已知的。表达构建体会进一步含有转录起始、终止位点，和在转录区，用于翻译的核糖体结合位点。优选构建体表达的转录物的编码部分包括待翻译的多肽起始处的翻译起始密码子，和适当位于末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。
正如所指出的，优选表达载体包括至少一个可选择标记。这种标记包括二氢叶酸还原酶，G418，谷氨酰胺合成酶或用于真核细胞培养的新霉素抗性和用于在大肠杆菌(E.Coli)和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄西林抗性。适当宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，如E.Coli，链霉菌属和鼠伤寒杆菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如啤酒酵母或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(ATCC登记号201178)))；昆虫细胞如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞如CHO、NSO、COS、293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。本领域已知上述宿主细胞的适当培养基和条件。
使用谷氨酰胺合成酶(GS)或DHFR作为可检测标记的载体可以分别在药物甲硫氨酸sulphoximine或氨甲喋呤存在下扩增。抑制这些可选择标记编码的酶功能的药物的有效性允许选择整合进入宿主细胞DNA后已扩增的载体序列的细胞系。基于谷氨酰胺合成酶的载体的优点是谷氨酰胺合成酶阴性细胞系(如鼠骨髓瘤细胞系，NSO)的可利用。谷氨酰胺合成酶表达系统通过提供另外的抑制剂以妨碍内源性基因的功能，也可在表达谷氨酰胺合成酶的细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。使用谷氨酰胺合成酶作为可检测标记的载体包括Stephens和Cockett，Nucl.Acids.Res 177110(1989)中描述的pEE6表达载体。谷氨酰胺合成酶表达系统及其成分在PCT出版物中有详述这里以其完整形式引入作为参考文献的WO87/04462；WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404和WO91/06657。另外，根据本发明的可以使用的谷氨酰胺合成酶表达载体可从供应商购买得到，包括例如Lonza Biologics，Inc.(Portsmouth，NH)。使用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达和生产单克隆抗体在Bebbington等，Bio/technology 10169(1992)以及Biblia和Robinson Biotechnol.Prog.111(1995)中描述，这里引入作为参考。
优选用于细菌的载体中包括可从QIAGEN，Inc.获得的pQE70，pQE60和pQE9；可从Stratagene Cloning Systems，Inc.获得的pBluescript载体，Phagescript载体，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A；和可从Pharmacia Biotech，Inc.获得的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。优选的真核载体是得可从Stratagene获得的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXTl和pSG；和可从Pharmacia获得的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL。优选的用于酵母系统的表达载体包括但不限于pYES2，pYDl，pTEFl/Zeo，pYES2/GS，pPICZ，pGAPZ，pGAPZalph，pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-Sl，pPIC3.5K，pPIC9K和PA0815(全部得自InVitrogen，Carlbad，CA)。其它合适的载体对本领域技术人员来说很明显。
构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，感染和其它方法。这种方法在许多标准实验室手册中有述，如Davis等，Basic Methods In MolecularBiology(1986)。特别预期缺乏重组载体的宿主细胞确实可以表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽。
可以采用熟知的方法从细胞培养物中回收和纯化G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、硫酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选，使用高压液相层析(“HPLC”)纯化。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽，优选分泌形式的，也可以从下列回收天然来源中纯化的产物，包括体液、组织和细胞，无论直接分离的还是培养的；化学合成步骤的产物；和重组技术从原核或真核宿主，包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞产生的产物。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以是糖基化的或非糖基化的，依赖于重组生产步骤中使用的宿主。而且，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽也可以包括修饰的起始甲硫氨酸残基，有些情况下是宿主介导过程的结果。因此，本领域熟知任何蛋白在所有真核细胞翻译后，翻译起始密码子编码的N末端甲硫氨酸从蛋白中被高效去除。而大多数蛋白N末端甲硫氨酸在大多数真核细胞也被有效去除，对于有些蛋白，这个原核去除过程效率低，依赖于N末端甲硫氨酸共价连接的氨基酸的性质。
在一个实施方案中，用酵母巴斯德毕赤氏酵母在真核系统中表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白。巴斯德毕赤氏酵母是可代谢甲醇作为其唯一碳源的甲基营养酵母。甲醇代谢途径的主要步骤是甲醇利用O2氧化为甲醛。这个反应由醇氧化酶催化。为了代谢甲醇作为其唯一碳源，巴斯德毕赤氏酵母应该产生高水平的醇氧化酶，部分因为醇氧化酶与O2的亲和力相对较低。所以，在依赖甲醇作为主要碳源的生长培养基中，两个醇氧化酶基因(AOX1)之一的启动子区域高度活化。在甲醇存在下，AOX1基因产生的醇氧化酶在巴斯德毕赤氏酵母中含总溶解蛋白的大约30％。见Ellis，S.B等，Mol.Cell.Biol.51111-21(1985)；Koutz，P.J，等，Yeast 5167-77(1989)；Tschopp，J.F等，Nucl.AcidsRes.153859-76(1987)。因此，异源编码序列，例如，本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸，在全部或部分AOX1调控序列的转录调控下，在甲醇存在下生长的巴斯德毕赤氏酵母中以很高水平表达。
在一个实例中，如这里阐述，质粒载体pPIC9K用于在Pichea酵母系统中表达编码本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的DNA，在″Pichia ProtocolsMethods in Molecular Biology，″D.R.Higginsand J.Cregg，eds.The Humana Press，Totowa，NJ，1998中有述。这个表达载体允许本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白依靠位于多克隆位点上游的与巴斯德毕赤氏酵母碱性磷酸酶(PHO)分泌信号肽(即引导肽)相联的强AOX1启动子而表达和分泌。
可使用许多其它酵母载体代替pPIC9K，例如本领域技术人员很容易认识到的pYES2，pYD1，pTEF1/Zeo，pYES2/GS，pPICZ，pGAPZ，pGAPZalpha，pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-Sl，pPIC3.5K和PA0815，只要提出的表达构建体为转录、翻译、分泌(如果期望的话)等等提供了适当的定位信号，包括所需的框内AUG。
在另一个实施方案中，异源编码序列高水平表达，例如本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可以通过将本发明的异源多核苷酸克隆进入表达载体，例如pGAPZ或pGAPZα，并在无甲醇存在下使酵母培养物生长而获得。
除了包括含有这里讨论的载体构建体的宿主细胞外，本发明还包括脊椎动物源的原代、二代和永生宿主细胞，尤其是哺乳动物源的，其已被改造删除或取代了内源性遗传材料(如G蛋白趋化因子受体(CCR5)编码序列)，和/或包含与本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可操作连接的并活化、改变和/或放大内源性G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的遗传材料(如异源多核苷酸序列)。例如，可以使用本领域所知的技术，通过同源重组可操作连接异源调控区域(如启动子和/或增强子)和内源性G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸序列，产生新的转录单位(如见美国专利号5,641,670，1997年6月24日颁发；美国专利号5,733,761，1998年3月31日颁发；国际出版物WO 96/29411，1996年9月26日公开；国际出版物WO 94/12650，1994年8月4日公开；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；和Zijlstra等，Nature 342435-438(1989)，这里以其完整形式引入作为参考)。
此外，本发明的多肽可使用本领域已知技术化学合成(如见Creighton，1983，ProteinsStructures and Molecular Principles，W.H.Freeman & Co.，N.Y和Hunkapiller等，Nature，310105-111(1984))。例如，可使用肽合成仪合成相当于G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽片段的多肽。而且，如果希望，可导入非经典氨基酸或化学氨基酸类似物置换或添加到G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽序列。非经典氨基酸包括但不限于普通氨基酸D异构体，2，4-二氨基丁酸、a-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己丙氨酸、b-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸如b-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸和一般氨基酸类似物。而且，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)型。
本发明包括在翻译过程中或翻译后不同修饰的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽，如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、与抗体分子或其它细胞配体连接等。很多化学修饰中任何一个都可通过已知技术实施，包括但不限于溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特异性化学切割；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；在衣霉素存在下代谢合成；等。
本发明包括另外的翻译后修饰，例如N连接的或O连接的碳水化合物链、加工(N末端或C末端)、与氨基酸主链附着的化学部分、N连接的或O连接的碳水化合物链的化学修饰和原核宿主细胞表达结果N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。该多肽也可以用可检测标记修饰，如酶、荧光、同位素或亲和标记允许蛋白的检测和分离。
本发明也提供了本发明多肽的化学修饰衍生物，它可以提供另外的优点，如溶解度增加、稳定性和多肽的循环时间，或免疫原性降低(见美国专利号4,179,337)。衍生的化学部分可以选自水溶性聚合物如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羟甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇等。多肽可以在分子内的任意位置，或在分子内的预定位置被修饰，并可以包括一个、两个或更多附着的化学部分。
聚合物可以是任何分子量的，可以有分支或无分支。对于聚乙二醇，优选分子量在大约1kDa和大约100kDa之间(术语“大约”是指在聚乙二醇的制剂中，有些分子可以重于，有些低于所述的分子量)，为了易于操作和制备。也可以使用其它大小，依赖于期望的治疗效果(如期望缓释持续时间、是否对生物活性有任何影响、易于操作、抗原性程度或缺乏以及聚乙二醇对治疗蛋白或类似物的其它已知作用)。
考虑到对蛋白功能或抗原结构域的作用，聚乙二醇分子(或其它化学部分)应该与蛋白附着。本领域技术人员可利用的粘附方法有很多，如EP 0 401 384，这里引入作为参考(PEG耦联G-CSF)，也可参见Malik等，Exp.Hematol.201028-1035(1992)(报道了氯化tresyl对GM-CSFpegylation)。例如，聚乙二醇可以通过反应基团如游离氨基或羧基共价结合氨基酸残基。反应基团是活化聚乙二醇分子可以结合的基团。具有游离氨基的氨基酸残基可以包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；具有游离羧基的氨基酸残基可以包括天门冬氨酸残基、谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基也可以用作反应基团附着聚乙二醇分子。治疗目的优选的是在氨基端附着，如在N末端或赖氨酸基团处附着。
人们可能特别期望在N末端化学修饰蛋白。使用聚乙二醇作为本发明组合物的示例，人们可以选择各种聚乙二醇分子(通过分子量、分支等)，混合物中聚乙二醇分子与蛋白(多肽)分子的比例，实施聚乙二醇化反应类型，以及所选N末端聚乙二醇化蛋白获得的方法。N末端聚乙二醇化蛋白获得的方法(即如果需要，从其它单聚乙二醇化部分中分离该部分)可以通过从大量聚乙二醇化蛋白分子中纯化N末端聚乙二醇化材料得到。在N末端选择性蛋白化学修饰可以通过利用特殊蛋白质衍生可得到的不同类型的伯氨基基团(赖氨酸对N末端)的不同反应性的还原性烷化来完成。在适当的反应条件下，得到了用含羧基聚合物在N末端基本上选择性衍生蛋白。
本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以是单体或多聚体(即二聚体、三聚体、四聚体和更多聚体)。因此，本发明涉及本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的单体和多聚体、其制备方法和包含它们的组合物(优选，治疗组合物)。在特殊实施方案中，本发明的多肽是单体、二聚体、三聚体或四聚体。在另外的实施方案中，本发明的多聚体是至少二聚体，至少三聚体，或至少四聚体。
本发明包括的多聚体可以是同源聚体或异源聚体。如这里使用的术语同源聚体是指只包含相当于SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽或保藏克隆中包含的HDGNR10 DNA编码的多肽(包括片段、变异体、剪切变异体和融合蛋白，相当于这里描述的这些)的多聚体。这些同源聚体可以包含具有等同或不同氨基酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽。在特殊实施方案中，本发明的同源聚体是只含有等同氨基酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的多聚体。在另一个特殊实施方案中，本发明的同源聚体是含有不同氨基酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的多聚体。在特殊实施方案中，本发明的多聚体是同源二聚体(如含有等同或不同氨基酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽)或同源三聚体(如含有具有等同和/或不同氨基酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽)。在另外的实施方案中，本发明的同源多聚体至少是同源二聚体，至少是同源三聚体，或至少是同源四聚体。
如这里所述的术语异源聚体是指除本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽之外，含有一个或多个异源多肽(即不同蛋白的多肽)的多聚体。在特殊实施方案中，本发明的多聚体是异源二聚体、异源三聚体或异源四聚体。在另外的实施方案中，本发明的异源多聚体至少是异源二聚体、至少是异源三聚体，或至少是异源四聚体。
本发明的多聚体可以是疏水性的、亲水性的、离子的和/或共价连接的结果和/或可以是通过例如形成脂质体间接连接的。因此，在一个实施方案中，当本发明的多肽在溶液中彼此接触形成本发明的多聚体例如同源二聚体或同源三聚体。在另一个实施方案中，当本发明的多肽在溶液中接触本发明多肽的抗体(包括本发明融合蛋白的异源多肽序列的抗体)时而形成本发明的异源多聚体，例如异源三聚体或异源四聚体。在其它实施方案中，本发明的多聚体由与本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽共价相联和/或彼此之间共价相联而形成。这种共价相联可以包括多肽序列中(SEQ ID NO2中引用的，或克隆HDGNR10编码的多肽中所含)包含的一个或多个氨基酸残基。在一种情况下，共价相联是位于与天然(即天然产生的)多肽相互作用的多肽序列内的半胱氨酸残基间的交联。在另一种情况下，共价相联是化学或重组操作的结果。可供选择地，这种共价相联可以包括G蛋白趋化因子受体(CCR5)融合蛋白中异源多肽序列所含的一个或多个氨基酸残基。在一个实例中，共价相联发生在本发明融合蛋白中所含的异源序列间(如见美国专利号5,478,925)。在一个特殊实例中，共价相联发生在本发明G蛋白趋化因子受体-Fc融合蛋白(如这里所述)所含的异源序列间。在另一个特殊实例中，本发明融合蛋白的共价相联发生在来自另一个能够形成共价相联多聚体的蛋白的异源多肽序列间，例如Oseteoprotegerin(如见国际出版物WO 98/49305，其内容在这里以其完整形式引入作为参考)。在另一个实施方案中，本发明的两个或更多多肽通过肽接头连接。实例包括美国专利号5,073,627(这里引入作为参考)中描述的那些肽接头。可以使用常规重组DNA技术制备包含肽接头分隔开的多种本发明多肽的蛋白。
本发明的多聚体多肽的另一个制备方法包括使用本发明的多肽与亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列融合。亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链域是促进发现它们的蛋白多聚化的多肽。赖氨酸拉链最初在几个DNA结合蛋白中鉴定(Landschulz等，Science 2401759，(1988))，已经在各种不同的蛋白中发现。已知的亮氨酸拉链是天然产生的肽及其二聚或三聚衍生物。适合产生本发明可溶性多聚体蛋白的亮氨酸拉链域的实例是在PCT申请WO 94/10308中所述的那些，因此引入作为参考。包含本发明多肽的与在溶液中二聚或三聚的多肽序列融合的重组融合蛋白在合适的宿主细胞中表达，使用本领域已知技术从培养上清中回收所得可溶多聚体融合蛋白。
本发明的三聚多肽可提供生物活性增强的优点。优选的亮氨酸拉链部分和异亮氨酸部分是偏好形成三聚体的那些。一个实例是肺表面活性蛋白D(SPD)衍生的亮氨酸拉链，如Hoppe等(FEBS Letters 344191，(1994))和美国专利申请号08/446,922中描述，这里引入作为参考。天然产生的三聚体蛋白衍生的其它肽可以用于制备本发明的三聚多肽。
在另一个实例中，本发明的蛋白通过本发明含Flag_多肽序列的融合蛋白中所含的Flag_多肽片段间的相互作用而关联。在进一步的实施方案中，本发明的关联蛋白通过本发明Flag_融合蛋白所含的异源多肽序列和抗Flag_抗体间的相互作用而关联。
本发明的多聚体可以用本领域已知的化学技术产生。例如，可以使用本领域所知的接头分子和接头分子长度优化技术化学交联期望在本发明的多聚体中包含的多肽(如见美国专利号5,478,925，这里以其完整形式引入作为参考)。另外，可以使用本领域已知技术产生本发明的多聚体以在位于期望在多聚体中含有的多肽序列中的半胱氨酸残基之间形成一个或多个分子内交联(如见美国专利号5,478,925，这里以其完整形式引入作为参考)。此外，本发明的多肽可在多肽的C末端或N末端添加半胱氨酸或生物素进行常规修饰，可以利用本领域已知的技术产生含有一个或多个这些修饰过的多肽的多聚体(如见美国专利号5,478,925，这里以其完整形式引入作为参考)。此外，可以利用本领域已知的技术产生含有期望在本发明的多聚体中含有的多肽成分的脂质体(如见美国专利号5,478,925，这里以其完整形式引入作为参考)。
可供选择地，可以使用本领域已知的基因工程技术产生本发明的多聚体。在一个实施方案中，使用这里描述的融合蛋白技术或其它本领域已知的技术重组产生本发明的多聚体中所含多肽(如见美国专利号5,478,925，这里以其完整形式引入作为参考)。在一个特殊实施方案中，将编码本发明多肽的多核苷酸序列与编码接头多肽的序列连接，然后进一步连接编码从起始C末端至N末端的反方向上多肽翻译后产物的合成多核苷酸，从而产生本发明同源二聚体的多核苷酸(缺乏前导序列)(如见美国专利号5,478,925，这里以其完整形式引入作为参考)。在另一个实施方案中，使用这里描述的重组技术或本领域已知的其它技术产生含跨膜域的(或疏水性或信号肽)，可用膜重建技术导入脂质体的本发明的重组多肽(如见美国专利号5,478,925，这里以其完整形式引入作为参考)。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的用途这里鉴定的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可在许多方法中用作试剂。下列说明书应该认为是示例性的并利用了已知技术。
存在鉴定新的染色体标记的不断需求，因为目前只可得到很少的基于真实序列数据(重复多态性)的染色体标记试剂。
简言之，由SEQ ID NO1所示序列或由保藏的克隆制备PCR引物(优选15-25bp)可对染色体作序列图谱。采用计算机分析可选择引物使得引物不跨越基因组DNA中一个以上的预知外显子。然后，这些引物用于PCR筛选含有各个人染色体的体细胞杂种。只有那些含有相当于SEQ ID NO1或保藏克隆的人G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的杂种会产生扩增的片段。
同样地，体细胞杂种提供了多核苷酸PCR作图为特定染色体的快速方法。然而，使用单个热循环仪每天可分配三个或更多克隆。而且，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的亚定位可以由特异染色体片段系列完成。可使用的其它基因作图策略包括原位杂交，用标记的流式细胞分选染色体预筛，和杂交预选以构建染色体特异性cDNA文库。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的精确染色体位置也可使用中期染色体涂布的荧光原位杂交(FISH)完成。这个技术使用短至500或600个碱基的多核苷酸；然而，优选2,000-4,000bp的多核苷酸。这个技术的综述，见Verma等，″Human Chromosomesa Manual of BasicTechniques，″Pergamon Press，New York(1988)。
对于染色体作图，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可单独使用(可标记单一染色体或那个染色体上单一位点)或成组使用(用于标记多个位点和/或多个染色体)。优选相当于cDNAs或基因组克隆的非编码区的多核苷酸，因为编码序列更可能是基因家族内的保守序列，因此增加染色体作图过程中交叉杂交的机会。
一旦多核苷酸作图至精确的染色体定位，多核苷酸的自然位置可用于连锁分析。连锁分析在染色体位置和特定疾病的表象之间建立了共同遗传(Coinheritance)。(疾病图谱数据在如V.McKusick，人类孟德尔遗传(Johns Hopkins大学Welch医学图书馆联网可获得)中发现)。假定1兆碱基图谱分辨率和每kb一个基因，精确定位到与疾病相关的染色体区的cDNA可能是50-500个潜在的成因基因之一。
因此，一旦建立了共同遗传，就可检测患病和不患病的个体间在G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸和相应基因间的差异。首先，在染色体涂布中或用PCR可检测染色体中可见的结构改变，如缺失或易位。如果不存在结构改变，可确定点突变的存在。在有些或全部患病的个体观察到，但不在正常个体中观察到的突变表明突变可以引起疾病。然而，需要完整测序来自几个正常个体G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽和相应基因，以区分突变和多态性。如果鉴定了新的多态性，这个多态性多肽可用于进一步连锁分析。
此外，使用G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可估计患病个体与未患病个体中基因表达的增加或降低。任何这些改变(表达改变、染色体重排或突变)可用作诊断或预后标志。
因此，本发明也提供了在诊断紊乱中有效的诊断方法，包括测定个体细胞或体液中本发明多肽的表达水平，并与标准多核苷酸表达水平比较测定的基因表达水平，由此与标准比较基因表达水平增加或降低是紊乱的指标。
在另一个实施方案中，本发明还包括分析样品中来自待测受试者存在增殖和/或癌性多核苷酸的试剂盒。在一般实施方案中，试剂盒至少包括含有会与本发明的多核苷酸特异性杂交的核苷酸序列的多核苷酸探针和合适的容器。在一个特殊的实施方案中，试剂盒包括限定本发明多核苷酸内部区域的两个多核苷酸探针，每条探针含区域内31’mer末端的一条链。在进一步的实施方案中，该探针可有效用作聚合酶链式反应扩增的引物。
根据常规方法对疾病作出诊断时，本发明可有效作为预后指示剂，因此，本发明多核苷酸表达增强或受抑的患者，相对于基因表达接近标准水平的患者，将经历较差的临床后果。
“测定本发明多核苷酸表达水平”指定性或定量测定或估计第一生物样品中本发明多肽或编码多肽的mRNA的绝对(如通过测定或估计绝对蛋白水平或mRNA水平)或相对(如通过与第二生物样品中的多肽水平或mRNA水平相比较)水平。优选，测定或估计第一生物样品中多肽水平或mRNA水平并与标准多肽水平或mRNA水平进行比较，标准得自无疾病个体的第二生物样品或大量无疾病个体测定的平均水平。如本领域可领会到，一旦标准多肽水平或mRNA水平已知，它可重复用作用于比较的标准。
“生物样品”是指从含有本发明多肽或mRNA的个体、体液、细胞系、组织培养物或其它来源得到的任何生物样品。如所指出的，生物样品包括含有本发明多肽的体液(例如精液、淋巴、血清、血浆、尿、滑膜液和脊液)，和发现表达本发明多肽的其它组织来源。从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域熟知的。生物样品欲包括mRNA，则组织活检是优选的来源。
上面提供的方法可以优选用于诊断方法和/或其中多核苷酸和/或多肽与固相支持体附着的试剂盒。在一个示例的方法中，支持体可以是美国专利5,837,832，5,874,219和5,856,174中描述的“基因芯片”或“生物芯片”。此外，这种粘附本发明多核苷酸的基因芯片可以用于鉴定从待测受试者分离的多核苷酸中多核苷酸序列间的多态性。这种多态性的知识(即它们的位置以及它们的存在)将在鉴定许多紊乱的疾病位点中有益，包括癌症疾病和情况。这种方法在美国专利5,858,659和5,856,104中有述。前面提及的美国专利这里以其完整形式引入作为参考。
本发明包括化学合成或作为肽核酸(PNA)复制的或根据其它本领域所知的方法得到的本发明的多核苷酸。如果多核苷酸掺入到固相支持体或基因芯片上的话，使用PNAs将作为优选的形式。为了本发明的目的，肽核酸(PNA)是聚酰胺型DNA类似物，且商业上可获得(PerceptiveBiosystems)腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的单体单位。DNA的某些成分，如磷、氧化磷或脱氧核糖衍生物，在PNAs中不存在。如P.E.Nielsen，M.Egholm，R.H.Berg和O.Buchardt，Science 254，1497(1991)；和M.Egholm，0.Buchardt，L.Christensen，C.Behrens，S.M.Freier，D.A.Driver，R.H.Berg，S.K.Kim，B.Norden，和P.E.Nielsen，Nature 365，666(1993)公开，PNAs与互补DNA链特异性且紧密结合，且不被核酸酶降解。事实上，PNA与DNA结合比DNA本身结合更强。这可能是因为两条链间没有静电排斥力，以及聚酰胺猪肝更灵活。由于此，PNA/DNA双螺旋与DNA/DNA双螺旋相比，能在更广泛的严格条件下结合，使得多样杂交更容易实施。较小的探针由于结合力强，与和DNA结合相比更可使用。而且，更可能用PNA/DNA杂交测定单个碱基错配，因为PNA/DNA 15-mer中单一错配使解链温度(Tm)降低8℃-20℃，对于DNA/DNA 15-mer双螺旋降低4℃-16℃。而且，PNA中不存在带电荷基团意味着可在低离子强度下杂交，并降低分析过程中盐可能造成的干扰。
本发明在检测哺乳动物癌症中有用。特别是，本发明在诊断病理性细胞增生瘤中有用，包括但不限于急性骨髓白血病包括急性单核细胞性白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性红白血病、急性巨核细胞白血病、急性未分化白血病等；和慢性骨髓白血病包括慢性粒-单核细胞白血病、慢性粒细胞白血病等。优选哺乳动物包括猴、无尾猿、猫、狗、牛、猪、马、兔和人。特别优选的是人。
病理性细胞增生紊乱常常与原癌基因不适当激活相关(Gelmann，E.P.等，″The Etiology of Acute LeukemiaMolecular Genetics and ViralOncology，″in Neoplastic Diseases of the Blood，1卷.，Wiernik，P.H.等主编，161-182(1985))。现在认为瘤是正常细胞基因产物性质改变造成的结果，或通过插入病毒序列到染色体，基因染色体易位到更活跃的转录区域，或通过一些其它机制发生基因表达数量改变造成的结果。(前述Gelmann等)。除了其它组织和细胞型外，可能特殊基因的突变或改变表达参与有些白血病的致病。(前述Gelmann等)。实际上，在人白血病和癌的有些情况下，参与有些动物瘤形成的癌基因人副本已经被扩增或易位。(前述Gelmann等)例如，c-myc表达在非淋巴细胞白血病细胞系HL-60中被大大扩增。当化学导入HL-60细胞终止增殖时，发现从c-myc水平被下调。(国际出版物WO 91/15580)然而，已经表明HL-60接触与c-myc或c-myb的5’末端互补的DNA构建体会阻断相应mRNAs的翻译，这下调c-myc或c-myb蛋白的表达并引起细胞增生和处理细胞的分化停止。(国际出版物WO91/15580；Wickstrom等，Proc.Natl.Acad.Sci.851028(1988)；Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.863379(1989))。然而，本领域技术人员会认识到本发明的有效性不会限于治疗造血细胞和组织的增生性疾病、紊乱和/或情况，因为已知各种来源的大量细胞和细胞类型可显示出增生表型。
除了前述的，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可以通过三股螺旋形式或反义DNA或RNA用于控制基因表达。反义技术在例如Okano，J.Neurochem.56560(1991)；″Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)中讨论。三股螺旋形式在例如Lee等，Nucleic Acids Research 63073(1979)；Cooney等，Science 241456(1988)；和Dervan等，Science 2511360(1991)中讨论。两种方法都依赖于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。对于这些技术，优选的多核苷酸通常是长度20至40个碱基的寡核苷酸且与参与转录的基因区域互补(triple helix-see Lee等，Nucl.Acids Res.63073(1979)；Cooney等，Science 241456(1988)；和Dervan等，Science 2511360(1991))或与mRNA本身互补(antisense-Okano，J.Neurochem.56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988).)。三股螺旋形式最佳地切断从DNA进行RNA转录，而反义RNA杂交阻断mRNA分子翻译为多肽。两种技术在模型系统中都有效，这里公开的信息可用于设计反义或三股螺旋多核苷酸以治疗或预防疾病。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸在基因治疗中也有效。基因治疗的一个目的是将正常基因插入具有缺陷基因的生物体中，努力纠正基因缺陷。G蛋白趋化因子受体(CCR5)提供了以非常准确的方式靶向这种基因缺陷的方法。另一个目的是插入宿主基因组中不存在的新基因，因此在宿主细胞中产生新的性状。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸也可从小生物样本有效鉴定个体。例如，美国军队正考虑使用限制性片段长度多态性(RFLP)用于鉴定其人员。在这个技术中，用一个或多个限制性酶消化个体基因组DNA，在Southern印迹探查以产生鉴定人员的独特片段。这个方法不受目前可丢失、转换或被窃取从而使阳性鉴定困难的“Dog Tags”的限制。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可用作RFLP另外的DNA标记。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸也可通过确定所选部分个体的基因组中真实的逐个碱基的DNA序列用作RFLP的替换物。这些序列可用于制备用于扩增和分离这种所选DNA的PCR引物，然后可进行测序。使用这种技术，可以鉴定个体，因为每个个体将具有独特的DNA序列组。一旦建立个体的独特ID数据库，即可从非常小的组织样品进行那个个体(无论死体或活体)的阳性鉴定。
法医生物学也从使用如这里公开的基于DNA鉴定技术中获益。从非常小的生物样品中获得的DNA序列，如组织，如头发或皮肤，或体液，如血液、唾液、精液、滑膜液、羊膜液、乳汁、淋巴、肺痰或上清、尿、粪渣等，可使用PCR进行扩增。在一个现有技术中，从多态性位点扩增的基因系列，如Dqa II类HLA基因用于法医生物学以鉴定个体。(Erlich，H.，PCR Technology，Freeman and Co.(1992).)。一旦扩增了这些特异性多态性位点，可用一种或多种限制性酶消化它们，在用相当于Dqa II类HLA基因的DNA探查的Southern印迹中产生和鉴定条带组。同样地，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸也可用作法医目的的多态性标记。
还需要一种能够鉴定特殊组织的来源的试剂。这种需要在例如提供了未知来源组织的法医学中出现。适当的试剂可以包括，例如，由G蛋白趋化因子受体(CCR5)序列制备的特异性针对特殊组织的DNA探针或引物。这种试剂板可通过物种和/或器官类型鉴定组织。在相似的方式中，这些试剂也可用于筛选污染组织培养物。
由于G蛋白趋化因子受体(CCR5)在巨噬细胞和记忆T细胞中表达，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可有效作为生物样品中存在的组织或细胞类型的差异鉴定的杂交探针。类似地，多肽和针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的抗体可用于提供组织或细胞类型差异鉴定的免疫探针。此外，对于上述组织或细胞的或这些细胞在其中起作用的许多疾病、紊乱和/或情况，相对于“标准”G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因表达水平，即不具有免疫相关紊乱的个体健康组织G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达水平，具有这些紊乱的个体得到的某些组织(如癌和受伤组织)或体液(如血清、血浆、尿、滑膜液或脊液)可以检测到G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因表达水平显著增高或降低。
因此，本发明提供了紊乱的诊断方法，它包括(a)检测个体细胞或体液中G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因表达水平；(b)将G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因表达水平与标准G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因表达水平进行比较，由此测定的G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因表达水平与标准表达水平相比增加或降低是免疫系统的或免疫系统相关的紊乱的指示。
在进一步的实施方案中，本发明提供了使用G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸或其片段或变异体作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体的免疫反应的方法。在一个优选实施方案中，本发明提供了使用G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸或其片段或变异体作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体的体液免疫反应(抗体介导的)的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含一个或多个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQID NO22)的氨基酸序列89-102，167-195和/或261-274)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第一个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第二个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列167-195)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第三个细胞外环(即SEQ IDNO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列261-274)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的免疫反应的方法。
在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)的一个或更多个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102，167-195和/或261-274)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的体液免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第一个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQID NO22)的氨基酸序列89-102)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的体液免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第二个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列167-195)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的体液免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第三个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列261-274)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸作为DNA疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的体液免疫反应的方法。
在其它实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸或其片段或变异体组成的DNA疫苗。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的一个或多个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102，167-195和/或261-274)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸组成的DNA疫苗。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第一个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸组成的DNA疫苗。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第二个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQID NO22)的氨基酸序列167-195)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸组成的DNA疫苗。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第三个细胞外环(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列261-274)的核苷酸序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸组成的DNA疫苗。
在非常优选的实施方案中，上述疫苗给予动物，包括人，以预防病毒感染。在甚至更加优选的实施方案中，上述疫苗给予动物，包括人，以预防HIV感染。仍在其它非常优选的实施方案中，上述疫苗给予动物，包括人，以预防痘病毒感染。仍在其它非常优选的实施方案中，上述疫苗给予动物，包括人，以预防巨细胞病毒感染。
最少，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可用作Southern凝胶中的分子量标准，作为检测特殊细胞型中存在特异性mRNA的诊断探针，作为探针在发现新多核苷酸的处理过程中“减掉”已知序列，用于选择和产生与“基因芯片”或其它支持体附着的低聚体，和使用DNA免疫技术产生抗DNA抗体，以及作为抗原引起免疫反应。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的用途G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可用于许多方法。下列说明书应该认为是示范性的且利用已知技术。
使用基于抗体的技术，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可用于检测在生物样品中蛋白水平。例如，可用经典免疫组化方法研究蛋白在组织中的表达。(Jalkanen，M.，等，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.，等，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987).)。有效用于检测蛋白基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定法，如酶链免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。合适的抗体试验标记是本领域已知的且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素，如碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)，和荧光标记，如荧光素和碱性蕊香红B和生物素。
除了检测生物样品中蛋白水平，也可通过成像在体内检测蛋白。用于体内蛋白成像的抗体标记或标志包括X-放射照像术、NMR或ESR可检测的那些。对于X-放射照像术，合适的标记包括放射性同位素如钡或铯，它发出可检测放射线但对受试者无明显损害。NMR和ESR合适的标记包括有可检测特征性自旋的那些，如氘，可以通过标记相关杂交瘤的营养素而掺入抗体。
已用适当的可检测成像部分如放射性同位素(例如131I、112In、99mTc)、不透射线物质或核磁共振可检测材料标记的蛋白特异性抗体或抗体片段被导入(例如，胃肠外、皮下或腹膜内)哺乳动物。本领域会理解受试者大小和所用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人受试者，注射的放射性量将正常从大约5至20毫居里99mTc的范围。标记的抗体或抗体片段将优先在含特殊蛋白的细胞位置蓄积。体内肿瘤成像在S.W.Burchiel等，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments.″(Chapter 13 in Tumor ImagingThe RadiochemicalDetection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，MassonPublishing Inc.(1982).)中描述。
因此，本发明提供了紊乱的诊断方法，包括(a)检测个体细胞或体液中G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的表达；(b)将基因表达水平与标准基因表达水平进行比较，由此测定的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽基因表达水平与标准表达水平相比增加或降低是紊乱的指示。关于癌症，个体活检组织中存在的转录物量相对高可能表明发生疾病的易感性，或可以提供在实际临床症状出现前检测疾病的方法。这种类型的一个更确定的诊断可允许健康专家尽早采取预防措施或主动治疗，因此防止癌症发展或进一步进展。
此外，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可用于治疗、预防和/或诊断疾病。例如，可给患者给予G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽以代替G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽(如胰岛素)水平缺乏或降低，补充不同多肽(如血红蛋白S、血红蛋白B、SOD、过氧化氢酶、DNA修复酶)水平的缺乏或降低，抑制多肽(如癌基因或肿瘤抑制剂)的活性，激活多肽(如通过结合受体)的活性，通过与其竞争结合游离配体而降低膜结合受体(如用于降低发炎的可溶性TNF受体)的活性，或引起期望的反应(如血管生长抑制，增强对增生细胞或组织的免疫反应)。
类似地，针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的抗体也可以用于治疗、预防和/或诊断疾病。例如，给予针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的抗体可结合多肽和降低多肽产生过度。类似地，给予抗体可激活多肽，例如通过结合膜上结合的多肽(受体)。
在进一步的实施方案中，本发明提供了使用G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或片段或变异体作为疫苗引起针对G蛋白趋化因子受体的免疫反应的方法。在优选的实施方案中，本发明提供了使用G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或片段或变异体作为疫苗引起针对G蛋白趋化因子受体的体液(抗体介导的)免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含一个或多个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ IDNO22)的氨基酸序列89-102，167-195和/或261-274)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体的免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含第一个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含第二个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环的氨基酸序列(即SEQID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列167-195)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含第三个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列261-274)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的免疫反应的方法。
在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含一个或多个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102，167-195和/或261-274)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体的体液免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含第一个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的体液免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含第二个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列167-195)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的体液免疫反应的方法。在其它非常优选的实施方案中，本发明提供了使用包含第三个G蛋白趋化因子受体(CCR5)细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列261-274)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为疫苗引起对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的体液免疫反应的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或其片段或变异体组成的疫苗。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的一个或多个细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102，167-195和/或261-274)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽组成的疫苗。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第一个细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列89-102)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽组成的疫苗。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第二个细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQID NO22)的氨基酸序列167-195)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽组成的疫苗。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含或可供选择地由编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的第三个细胞外环的氨基酸序列(即SEQ ID NO2或保藏克隆编码的多肽(SEQ ID NO22)的氨基酸序列261-274)的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽组成的疫苗。
在非常优选的实施方案中，上述疫苗给予动物，包括人，以预防病毒感染。在甚至更加优选的实施方案中，上述疫苗给予动物，包括人，以预防HIV感染。仍在其它非常优选的实施方案中，上述疫苗给予动物，包括人，以预防痘病毒感染。仍在其它非常优选的实施方案中，上述疫苗给予动物，包括人，以预防巨细胞病毒感染。
最少，可使用本领域技术人员熟知的方法，用G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽作为SDS-PAGE凝胶中或分子筛凝胶过滤柱的分子量标准。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽也可用于产生抗体，抗体反过来用于测定重组细胞中的蛋白表达，作为估计宿主细胞转化的方法。此外，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽也可用于测定下列生物学活性。基因治疗方法本发明的另一个方面是治疗或预防紊乱、疾病和情况的基因治疗方法。基因治疗方法涉及将核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)序列导入动物以获得本发明G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的表达。这个方法需要编码与启动子或目的组织表达多肽所需的任何其它基因元件可操作连接的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的多核苷酸。这种基因治疗和送递技术是本领域已知的，例如WO90/11092，这里引入作为参考。
因此，例如，可以用包含与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸可操纵连接启动子的多核苷酸(DNA或RNA)离体改造来自患者的细胞，然后改造的细胞提供给待用该多肽治疗的患者。这种方法是本领域熟知的。例如，见Belldegrun，A.，等，J.Natl.Cancer Inst.85207-216(1993)；Ferrantini，M.等，Cancer Research 531107-1112(1993)；Ferrantini，M.等，J.Immunology 1534604-4615(1994)；Kaido，T.，等，Int.J.Cancer 60221-229(1995)；Ogura，H.，等，Cancer Research 505102-5106(1990)；Santodonato，L.，等，HumanGene Therapy 71-10(1996)；Santodonato，L.，等，Gene Therapy41246-1255(1997)；和Zhang，J.-F.等，Cancer Gene Therapy 331-38(1996))，这里引入作为参考。在一个实施方案中，改造的细胞是动脉细胞。动脉细胞可以通过直接注射到动脉、动脉周围的组织或通过导管注射再次导入患者。
如下面更详细讨论的，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建体可通过将可注射材料送递给动物细胞，如注射到组织(心、肌肉、皮肤、肺、肝等)间隙的任何方法送递。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建体可通过药物可接受液体或含水载体来送递。
在一个实施方案中，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸以裸多核苷酸送递。术语“裸”多核苷酸、DNA或RNA是指没有任何协助、促进或利于进入细胞的送递载体包括病毒序列、病毒微粒、脂质体制剂、脂质转染或沉淀试剂等的序列。然而，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸也可通过脂质体制剂和脂质转染制剂等可用本领域技术人员熟知的方法制备的物质可来送递。这种方法在例如美国专利号5,593,972，5,589,466和5,580,859中有述，这里引入作为参考。
优选用于基因治疗方法的G蛋白趋化因子受体多核苷酸载体构建体是不会整合入宿主基因组，且它们也不含允许复制的序列的构建体。适当的载体包括从Stratagene获得的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；从Pharmacia获得的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL；和从Invitrogen获得的pEF1/V5，pcDNA3.1和pRc/CMV2。其它合适的载体对本领域技术人员很明显。
本领域技术人员所知的任何强启动子可用于驱动G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸序列的表达。合适的启动子包括腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导启动子，例如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子，例如单纯疱疹胸腺嘧啶核苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs；b-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子也可以是G蛋白趋化因子受体的天然启动子。
不象其它基因治疗技术，裸核酸序列导入目的细胞的一个主要优点是多核苷酸在细胞中合成的短暂性质。研究表明非复制DNA序列可导入细胞以使期望多肽产生达六个月的时期。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建体可传递到动物内组织的胞间隙，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、膀胱、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼睛、腺体和结缔组织的。组织的胞间隙包括器官组织网状纤维的细胞间、液体、粘多糖基质，血管或腔壁中的弹性纤维，纤维组织中的胶原纤维，或结缔组织内包裹肌肉细胞或骨腔隙中的相同基质。它类似于循环血浆和淋巴管的淋巴液占据的空间。由于下述原因，优选送递到肌肉组织胞间隙。它们可通过给包含这些细胞的组织注射来方便送递。优选将它们送递给持久不分裂的分化细胞并在其中表达，尽管在未分化或很少完全分化的细胞，例如血液或皮肤成纤维细胞的干细胞中也可送递和表达。体内肌肉细胞是优选的能够有效接受和表达多核苷酸的细胞。
对于裸核酸序列注射，DNA或RNA的有效剂量是大约0.05mg/kg体重至大约50mg/kg体重的范围。优选剂量是大约0.005mg/kg体重至大约20mg/kg的范围，和更优选大约0.05mg/kg体重至大约5mg/kg的范围。当然，如本领域普通技术人员会认识到的，这个剂量可根据注射的组织部位变化。本领域普通技术人员可很容易确定适当和有效的核酸序列剂量并且它可依赖于正在治疗的情况和给药途径。
优选给药途径是通过注射到组织胞间隙的胃肠外途径。然而，也可使用其它胃肠外途径，例如，特别针对传递给肺或支气管组织、咽喉或鼻粘膜的气雾剂制剂吸入。此外，可在血管成形术中通过步骤中使用的导管将裸G蛋白趋化因子受体(CCR5)DNA构建体传递到动脉。
裸多核苷酸可通过本领域已知的任何方法传递，包括但不限于，在传递部位直接用针注射、静脉内注射、局部注射、导管注射和所谓的“基因枪”。这些传递方法是本领域已知的。
构建体也可以用送递载体，例如病毒序列、病毒微粒、脂质体制剂、脂质体转染、沉淀试剂等送递。这种送递方法是本领域已知的。
在某些实施方案中，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建体混合在脂质体制剂中。用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(正电荷)、阴离子(负电荷)和中性制剂。然而，特别优选阳离子脂质体，因为阳离子脂质体和多阴离子核酸之间可形成紧密的电荷复合体。已经显示阳离子脂质体以功能形式介导质粒DNA(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)847413-7416，这里引入作为参考)；mRNA(Malone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)866077-6081，这里引入作为参考)；和纯化转录因子(Debs等，J.Biol.Chem.(1990)26510189-10192，这里引入作为参考)的细胞内送递。
阳离子脂质体容易获得。例如，N[1-2，3-二油氧基)丙基]-N，N，N-三乙铵(DOTMA)脂质体特别有效，可按商标Lipofectin，从GIBCOBRL，Grand Island，N.Y.获得(Felgner等，Proc.Natl Acad.Sci.USA(1987)847413-7416，这里引入作为参考)。其它商业上可获得的脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。
其它阳离子脂质体可使用本领域熟知的技术由容易获得的材料制备。如见，PCT出版物WO90/11092(这里引入作为参考)中关于DOTAP(1，2-二(油氧基)-3-(三甲铵)丙烷)脂质体合成的描述。文献中描述了DOTMA脂质体的制备，如见P.Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413-7417，这里引入作为参考。可用类似方法从其它阳离子脂质材料中制备脂质体。
类似地，阴离子和中性脂质体很容易获得，如从Avanti Polar Lipids(Birmingham，Ala.)，或使用容易获得材料可容易制备。这种材料包括磷脂酰基、胆碱、胆固醇、磷脂酰基胆胺、二油基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油基磷脂酰甘油(DOPG)、二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)等等。这些材料也可以与DOTMA和DOTAP起始材料以适当比例混合。使用这些材料制备脂质体的方法是本领域熟知的。
例如，商业上的二油基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油基磷脂酰甘油(DOPG)和二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)可按各种组合用于制备传统脂质体，添加或不添加胆固醇。因此，例如在氮气流流入超声处理小瓶下，干燥DOPG和DOPC各50mg可制备DOPG/DOPC载体。样品放在真空泵下过夜，第二天用去离子水使其成水化合物。然后，样品在带盖小瓶中超声处理2小时，使用装备了转化杯(浴型)的热系统350型超声处理仪在最大设置下，浴室在15EC下循环。可供选择地，负电荷载体的制备可不用超声处理，以产生多层载体或通过核孔膜挤出以产生离散大小的单层载体。其它方法本领域技术人员知道并可利用。
脂质体可包括多层载体(MLVs)、小单层载体(SUVs)或大单层载体(LUVs)，优选SUVs。使用本领域熟知的方法制备各种脂质体-核酸复合体。如见Straubinger等，Methods of Immunology(1983)，101512-527，这里引入作为参考。例如，含核酸的MLVs可通过磷脂薄膜沉积在玻璃管壁上，随后用待包围的溶液材料使其成水化合物而制备。SUVs是通过延长MLV超声处理产生同种单层脂质体群而制备的。嵌入的材料加入到悬浮的预先成型MLVs中，然后超声处理。使用含阳离子脂类的脂质体时，干燥的脂类膜悬浮于适当溶液中，如无菌水或等渗缓冲溶液如10mM Tris/NaCl，超声处理，然后预先成型的脂质体直接与DNA混合。脂质体和DNA形成非常稳定的复合体，由于正电荷脂质体与阳离子DNA结合，发现SUVs可与小核酸片段使用。LUVs通过本领域熟知的许多方法制备。通常使用的方法包括Ca2+-EDTA螯合(Papahadjopoulos等，Biochim.Biophys.Acta(1975)394483；Wilson等，Cell(1979)1777)；醚注射(Deamer，D.and Bangham，A.，Biochim.Biophys.Acta(1976)443629；Ostro等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1977)76836；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)763348)；去污剂透析(Enoch，H.and Strittmatter，P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76145)；和反相蒸发(REV)(Fraley等，J.Biol.Chem.(1980)25510431；Szoka，F.and Papahadjopoulos，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75145；Schaefer-Ridder等，Science(1982)215166)，这里引入作为参考。
通常，DNA与脂质体的比例从大约10∶1至大约1∶10。优选，比例从大约5∶1至1∶5。更优选，比例从大约3∶1至1∶3。仍更优选，比例大约1∶1。
美国专利号5,676,954(这里引入作为参考)报道了遗传材料与阳离子脂质体复合注射给小鼠。美国专利4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和国际公开号WO 94/9469(这里引入作为参考)提供了阳离子脂类用于DNA转染细胞和哺乳动物。美国专利号5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和国际公开号WO 94/9469(这里引入作为参考)提供了DNA-阳离子脂类复合体传递哺乳动物的方法。
在某些实施方案中，离体或在体使用包括含编码G蛋白趋化因子受体序列的RNA的逆转录病毒微粒改造细胞。逆转录病毒质粒载体中的逆转录病毒可以来自，包括但不限于，莫洛尼小鼠白血病病毒、脾坏死病毒、鲁斯氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、鸟白血病组织增生病毒、长臂无尾猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、脊髓增生肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒。
使用逆转录病毒质粒载体转到包装细胞系形成生产细胞系。可转染的包装细胞的实例包括但不限于，PE501，PA317，R-2，R-AM，PA12，T19-14X，VT19-17-H2，RCRE，RCRIP，GP+E-86，GP+envAml2和Miller，Human Gene Therapy 15-14(1990)中描述的DNA细胞系，这里以其完整形式引入作为参考。载体可以通过本领域所知的任何方法转导包装细胞。这种方法包括但不限于电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。在可供选择的方案中，逆转录病毒质粒载体可以包入脂质体，或与脂类联结，然后给予宿主。
生产细胞系产生包括编码G蛋白趋化因子受体的多核苷酸的传染性逆转录病毒载体微粒。然后可以使用这种逆转录病毒载体微粒转导真核细胞，或体外或体内。转导的真核细胞将表达G蛋白趋化因子受体。
在某些其它实施方案中，离体或在体内，用含G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的腺病毒载体改造细胞。可处理腺病毒使之编码并表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)，同时使之就在正常溶菌病毒生活史中复制的能力而言失活。腺病毒的表达没有将病毒DNA整合导宿主细胞染色体而完成，因此减轻了有关插入诱变的关注。此外，腺病毒作为活肠疫苗已经以极好的安全性框架使用多年(Schwartz，A.R等(1974)Am.Rev.Respir.Dis.109233-238)。最后，大量例子已经证明了腺病毒介导的基因转移，包括α-1-抗胰蛋白酶和CFTR转移到棉鼠肺中(Rosenfeld，M.A.等.(1991)Science 252431-434；Rosenfeld等，(1992)Cell68143-155)。此外，进一步的研究尝试确立腺病毒作为人癌症的成因物质都统一被否定(Green，M等(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 766606)。
本发明中有用的合适的腺病毒载体在例如Kozarsky and Wilson，Curr.Opin.Genet.Devel.3499-503(1993)；Rosenfeld等，Cell68143-155(1992)；Engelhard et al.，Human Genet.Ther.4759-769(1993)；Yang等，Nature Genet.7362-369(1994)；Wilson等，Nature 365691-692(1993)；和美国专利号5,652,224中描述，这里引入作为参考。例如，腺病毒载体Ad2是有效的并可在人293细胞中生长。这些细胞含有腺病毒E1区，组成表达E1a和E1b，通过提供从载体中删除基因的产物补充缺陷腺病毒。除了Ad2，其它腺病毒变种(如Ad3，Ad5和Ad7)在本发明中也有用。
优选，用于本发明的腺病毒是复制缺陷型的。复制缺陷腺病毒需要辅助病毒和/或包装细胞系的协助以形成传染性微粒。所得病毒能够感染细胞并可表达可操作连接启动子的感兴趣的多核苷酸，但在大多细胞中不复制。复制缺陷腺病毒可以缺失下列基因的全部或部分中一个或多个E1a，E1b，E3，E4，E2a或L1直到L5。
在某些其它实施方案中，使用腺伴随病毒(AAV)离体或在体内改造细胞。AAVs是天然产生的缺陷病毒，需要辅助病毒以产生传染性微粒(Muzyczka，N.，Curr.Topics in Microbiol.Immunol.15897(1992))。它也是其DNA可以整合至未分裂细胞的少数病毒之一。含少至300碱基对的AAV载体可被包装并整合，但外源DNA的间隔限于大约4.5kb。产生和使用这种AAVs的方法是本领域已知的。例如，见美国专利号5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,935、5,478,745和5,589,377。
例如，用于本发明的适当的AAV载体将包括DNA复制、包壳和宿主细胞整合所需的所有序列。使用标准克隆方法将G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建体插入AAV载体，如Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1989)中发现的。然后，使用标准技术将重组AAV载体转染到被辅助病毒感染的包装细胞，包括脂质体转染、电穿孔、磷酸钙沉淀等。适当的辅助病毒包括腺病毒、巨细胞病毒、牛痘病毒或疱疹病毒。一旦包装细胞被转染和感染，它们将产生含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建体的传染性AAV病毒微粒。然后用这些病毒微粒离体或在体转导真核细胞。这些转导细胞将含有整合至其基因组的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建体，并将表达G蛋白趋化因子受体。
基因治疗的另一个方法包括通过同源重组(如见美国专利号5,641,670，1997年6月24日颁发；国际公开号WO 96/29411，1996年9月26日公开；国际公开号WO 94/12650，1994年8月4日公开；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；和Zijlstra等，Nature342435-438(1989))可操作相联异源调控区和内源多核苷酸序列(如编码G蛋白趋化因子受体)。这个方法包括存在于目的细胞中，但不在细胞中正常表达或以低于期望水平表达的基因的活化。
使用本领域已知的标准技术制备多核苷酸构建体，它含有启动子侧翼的靶向序列。合适的启动子在这里描述。靶向序列与内源性序列充分互补以允许启动子-靶向序列与内源性序列进行同源重组。靶向序列与G蛋白趋化因子受体(CCR5)期望内源性多核苷酸序列的5’端足够近，因此启动子在同源重组基础上可操作连接内源性序列。
使用PCR扩增启动子和靶向序列。优选，扩增的启动子在5’和3’端含有不同的限制性酶切位点。优选，第一靶向序列的3’端含有与扩增启动子的5’端相同的限制性酶切位点，以及第二靶向序列的5’端含有与扩增启动子的3’端相同的限制性酶切位点。消化扩增的启动子和靶向序列并连接起来。
启动子-靶向序列构建体作为裸多核苷酸，或与利于转染试剂如上面更详细描述的脂质体、病毒序列、病毒微粒、整个病毒、脂质转染试剂、沉淀试剂等连接送递到细胞中。可用任何方法送递启动子-靶向序列，包括直接用针注射、静脉内注射、局部给药、导管注入、微粒加速器等。该方法在下面更详细描述。
启动子-靶向序列构建体被细胞接受。构建体与内源序列间发生同源重组，使内源性G蛋白趋化因子受体(CCR5)序列位于该启动子的控制之下。然后，启动子驱动内源性G蛋白趋化因子受体(CCR5)序列的表达。
编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸可以与编码血管形成蛋白的其它多核苷酸共同给予。血管形成蛋白的实例包括但不限于，酸性和碱性成纤维细胞生长因子VEGF-1，VEGF-2，VEGF-3，上皮生长因子α和β，来自血小板的内皮细胞生长因子，来自血小板的生长因子，肿瘤坏死因子α，肝细胞生长因子，胰岛素样生长因子，集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和一氧化氮合成酶。
在一个优选的实施方案中，编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸含有利于蛋白分泌的分泌信号序列。典型地，信号序列位于待表达多核苷酸的编码区，朝向或位于编码区的5’端。信号序列可以与感兴趣的多核苷酸同源或异源，也可以与待转染的细胞同源或异源。另外，可以使用本领域已知方法化学合成信号序列。
可使用任何上述多核苷酸构建体的任何给药方式，只要该方式使得一个或多个分子表达量足以提供治疗效果。这包括直接用针注射、全身注射、导管注入、生物轰击注射器、微粒加速器(即“基因枪”)、明胶海绵保藏，其它商业上可获得的保藏材料，渗透泵(如Alza小泵)、口服或固态栓剂(片剂或丸剂)药物制剂和手术过程中移注或局部应用。例如，裸磷酸钙沉淀质粒直接注射给大鼠肝脏和大鼠脾脏或蛋白包被质粒直接注射给门静脉导致大鼠肝脏中外源基因表达(Kaneda等，Science243375(1989))。
局部给药的优选方法是直接注射。优选，与送递载体复合的本发明的重组分子通过直接注射至动脉区中或局部内而给予。动脉区内局部给予组合物是指动脉内数厘米，优选数毫米注射组合物。
局部给药的另一种方法是本发明的多核苷酸构建体接触手术伤口内或手术伤口周围。例如，患者可接受手术，多核苷酸构建体可包裹在伤口内的组织表面或构建体可注射到伤口内组织区。
用于全身注射的治疗组合物包括与本发明目的送递载体复合的本发明的重组分子。用于全身注射的合适的送递载体包括含有将载体靶向特殊部位的配体的脂质体。
全身给药的优选方法包括静脉内注射、气雾剂、口服和经皮(局部)传递。可使用本领域的标准方法实施静脉内注射。也可使用本领域的标准方法实施气雾剂送递(如见Stribling等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA18911277-11281，1992，这里引入作为参考)。口服送递可通过将本发明的多核苷酸构建体与能够经得起动物中肠消化酶降解的载体复合而实施。这种载体的例子包括塑料胶囊或片剂，如本领域所知的那些。局部送递可以通过将本发明的多核苷酸构建体与能够透过皮肤的亲脂性试剂(如DMSO)混合来实施。
送递物质的有效量的确定可以依赖于许多因素包括。例如物质的化学结构和生物活性，动物的年龄和体重，治疗精确条件和其严重性，以及给药途径。治疗的频率依赖于许多因素，例如每剂给予的多核苷酸构建体的量，以及受试者的健康状况和病史。精确量、剂量数量和剂量时间将由护理的医师和兽医来确定。
本发明的治疗组合物可以给予任何动物，优选给予哺乳动物和鸟。优选的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马和猪，特别优选的是人。G蛋白趋化因子受体的生物活性G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸或多肽，或G蛋白趋化因子受体(CCR5)激动剂或拮抗剂可用于试验中检测一种或多种生物活性。如果G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸或多肽，或G蛋白趋化因子受体(CCR5)激动剂或拮抗剂在特殊试验中确实显示出活性，那么G蛋白趋化因子受体(CCR5)可能参与生物活性相关的疾病。因此，G蛋白趋化因子受体(CCR5)可以用于治疗、预防和/或诊断相关疾病。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体包括MIP-1α，MIP-1β，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，RANTES和Eotaxin。G蛋白趋化因子受体(CCR5)也是HIV主要的共同受体，也可以被其它传染性物质识别，如其它病毒，以允许进入细胞。因此，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸、多肽，其激动剂和拮抗剂可有效治疗、预防和诊断与任何上述配体相关的疾病，例如这里公开的疾病。在非常优选的实施方案中，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸、多肽，其激动剂和拮抗剂能有效治疗、预防和诊断HIV感染和/或与HIV感染相关的情况，如名为“HIV感染的治疗和预防”的部分中描述。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)主要在单核细胞和T细胞表达。在小神经胶质细胞、树突状和有些造血干细胞中发现了G蛋白趋化因子受体(CCR5)的表达。G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体(特别是RANTES，MIP-1β和MIP1α)活化巨噬细胞和淋巴细胞上的G蛋白趋化因子受体(CCR5)主要导致这些细胞型向炎症部位，常常是感染部位趋化。G蛋白趋化因子受体(CCR5)也可以参与诱导NK细胞、嗜酸性细胞和嗜碱细胞中的趋化性。G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体(特别是RANTES，MIP-1β和MIP1α)活化巨噬细胞和淋巴细胞上的G蛋白趋化因子受体(CCR5)可促进T细胞和抗原呈递细胞(如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)间的相互作用。G蛋白趋化因子受体(CCR5)也可以参与细胞附着和通过粘附分子迁移通过血管到达炎症部位。因此，本发明的组合物(包括本发明的多核苷酸、多肽和抗体，及其片段和变异体)可以用于诊断、预后、预防和/或治疗G蛋白趋化因子受体(CCR5)如上述的那些的生物活性缺陷相关的疾病和/和紊乱。
在优选的实施方案中，本发明的组合物(包括本发明的多核苷酸、多肽和抗体，及其片段和变异体)可以用于诊断、预后、预防和/或治疗免疫功能(如病毒感染，特别是HIV感染、痘病毒感染和/或巨细胞病毒感染)；自身免疫疾病(如类风湿性关节炎、Grave’s病和多发性硬化症)；免疫细胞趋化性；炎性情况；和/或“免疫活性”中描述的)相关的疾病和/和紊乱和瘤性疾病如下面“过度增生性疾病”所述的那些。
本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸、多肽、激动剂和拮抗剂(包括抗体)可有效诊断、预后、预防和/或治疗与包括但不限于免疫细胞趋化性、免疫细胞活化、抗原呈递、炎症和病毒感染的活性相关的疾病和/或紊乱。
更一般地，本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸、多肽、激动剂和拮抗剂(包括抗体)可有效诊断、预后、预防和/或治疗下述疾病和/或紊乱。
HIV感染的治疗和预防。G-蛋白趋化因子受体(CCR5)是巨噬细胞亲和性HIV的HIV共同受体，因此，它可对HIV感染和疾病的发展产生巨大的影响，尤其是对HIV感染早期，此时R5巨噬细胞亲和性株的HIV占主导地位。因此，CCR5的多核苷酸或多肽，或者其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，可用来诊断、治疗、预防和/或改善HIV感染。
在具体实施方案中，CCR5的多核苷酸或多肽，或者其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，可用来诊断、治疗、预防和/或改善与HIV感染有关的疾病、功能紊乱或相关状况，其中包括，但并不仅限于卡氏肺囊虫性肺炎，消耗综合征(Wasting综合征)，卡波西肉瘤，食道白色念珠菌病和肺白色念珠菌病，扩散性或肺外鸟胞内分支杆菌感染综合征，扩散性或肺外堪萨斯分支杆菌病，巨细胞病毒病，巨细胞病毒性视网膜炎，HIV感染性脑病，单纯性疱疹病，肺外隐球菌病，脑的弓形体病，慢性隐孢子虫病，慢性肠道隐孢子虫病，免疫母细胞性淋巴瘤，肺外分支杆菌性结核病，肺分支杆菌性结核病，分支杆菌性病，肺外分支杆菌性病，伯基特氏淋巴瘤，进行性多病灶性脑白质病，原始脑淋巴瘤，慢性等孢子球虫病，慢性肠道等孢子球虫病(Isosporiasis)，扩散性或肺外球孢子菌病(Coccidioidomycosis)，沙门氏菌属(Salmonella)败血症，复合性或复发性细菌感染，浸润性子宫颈癌，扩散性或肺外组织胞浆菌病(Histoplasmosis)，淋巴样间质性肺炎，复发性肺炎，严重的免疫力低下和/或爱滋病性痴呆。
在优选的实施方案中，CCR5的多核苷酸或多肽，或者其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，可用来诊断、治疗、预防和/或改善与HIV感染有关的机会性感染(如，疱疹病毒感染，结核分支杆菌感染，巨细胞病毒感染)。
在优选的实施方案中，CCR5的多核苷酸或多肽，或者其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，可用来诊断、治疗、预防和/或改善与HIV感染有关的机会性卡氏肺囊虫感染。
在优选的实施方案中，CCR5的多核苷酸或多肽，或者其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，可用来诊断、治疗、预防和/或改善与HIV感染有关的卡波西肉瘤。
在其它优选的实施方案中，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，可用来诊断、治疗、预防和/或改善早期阶段的HIV感染。
在其它实施方案中，CCR5的多核苷酸或多肽，或者其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，可用来诊断、治疗、预防和/或改善HIV感染的晚期阶段。
在另一些实施方案中，CCR5的多核苷酸或多肽，或者其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，作为一种预防剂可用来预防某些人感染HIV，这些人是拥有HIV感染性伙伴或者有理由认为接触过HIV的人(如，那些被曾与其他人或动物的生物性体液接触过的针刺过的人，或被强奸的受害者)。
在另一些实施方案中，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂(包括抗体)或拮抗剂(包括抗体)，作为一种预防剂可用来预防HIV的母婴传播。
免疫活性。CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，通过激动或抑制免疫细胞的增殖、分化或迁移(趋化性)，可有助于治疗免疫系统性疾病、功能紊乱和/或相关状况。免疫细胞通过造血过程而逐渐发展，从多能干细胞分化出髓样细胞(血小板、红细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)和淋巴细胞(B淋巴细胞和T淋巴细胞)。这些免疫性疾病、功能紊乱和/或相关状况的病因学可能是遗传性的，自发性的，比如癌症或某些自身免疫性疾病、功能紊乱和/或相关状况，获得性的(如，由于化疗或中毒)，或感染性的。并且，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，能作为特定免疫系统疾病或功能紊乱的标记物或检测物。
本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来调节造血活动(血液细胞的形成)。举例来说，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来增加全部或部分血细胞的量，如，红细胞，淋巴细胞(B细胞或T细胞)，骨髓样细胞(如，噬碱性粒细胞、噬酸心性粒细胞、噬中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞)和血小板。可以减少全部或部分血细胞的量的能力，有助于预防，检测，诊断和/或治疗下述的贫血和白细胞减少症。或者，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来减少全部或部分血细胞的量，例如，红细胞，淋巴细胞(B细胞或T细胞)，骨髓样细胞(如，噬碱性粒细胞、噬酸性粒细胞、噬中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞)和血小板。可以减少全部或部分血细胞的量的这一能力，有助于预防，检测，诊断和/或治疗白细胞增多症，如，噬酸性粒细胞增多症。
CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，有助于治疗、预防、和/或诊断造血细胞性疾病、功能紊乱和/或相关状况。复制、原来的保留在致力于治疗或预防那些与一种(或多种)造血细胞减少有关的疾病时，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用来增强造血细胞的分化和增殖，其中包括多功能干细胞。免疫缺陷综合征的例子包括，但并不仅限于血液蛋白性疾病、功能紊乱和/或相关状况(如，无丙种球蛋白白血症，血丙种球蛋白异常)，运动失调性毛细血管扩张症，常见的变异性免疫缺陷症，迪格奥尔综合征，HIV感染，HTLV-BLV感染，白细胞粘附力低下综合征，淋巴细胞减少症，巨噬细胞杀菌机能障碍，重型联合性免疫缺陷病(SCIDs，)威-奥功能紊乱(Wiskott-AldrichDisorder)，贫血，血少板减少症，白细胞减少症，噬中性粒细胞减少症，贫血或血红蛋白尿。或者，在致力于治疗或预防那些与一种(或多种)造血细胞增多有关的疾病、功能紊乱和/或相关状况(其中包括，但并不仅限于组织细胞增生症)时，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，可用来增强造血细胞的分化和增殖，其中包括多功能干细胞。
在另一实施方案中，本发明中CCR5的多肽，或与此多肽相对应的多核苷酸、抗体、激动剂或拮抗剂，可用于治疗免疫系统疾病和功能紊乱，和/或用来抑制或增强由一些组织内细胞所产生的免疫反应，在这些组织内本发明中的多肽得以表达。
本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗、预防、诊断、和/或预后免疫缺陷症，其中包括先天性和获得性免疫缺陷。免疫球蛋白水平B细胞作用和/或B细胞数量减少性B细胞性免疫缺陷症的例子包括X连锁性无丙种球蛋白白血症(布鲁顿氏病)，X连锁性婴幼儿无丙种球蛋白白血症，高IgM性X连锁性免疫缺陷症，高IgM非X连锁性免疫缺陷症，X连锁性淋巴细胞增生综合证(XLP)，无丙种球蛋白白血症，其中包括先天性和获得性无丙种球蛋白白血症，成人发作型无丙种球蛋白白血症，晚年发作型无丙种球蛋白白血症，血丙种球蛋白异常，低丙种球蛋白血症，非标准型低丙种球蛋白血症，隐性无丙种球蛋白白血症(瑞士人型)，选择性IgM缺乏症，选择性IgA缺乏症，选择性IgG亚型缺乏症，IgG亚型缺乏症(伴或不伴有IgA缺乏)，高IgM性免疫球蛋白(Ig)缺乏症，高IgM性IgG和IgA缺乏症，伴免疫球蛋白(Igs)水平正常或升高性抗体缺乏症，Ig重链缺失症，κ链缺失症，B淋巴细胞增生失调症(BLPD)，常见的变异性免疫缺陷病(CVID)，常见的变异性免疫缺陷病(CVI)(获得性的)，和婴儿暂时性低丙种球蛋白血症。
在具体实施方案中，使用本发明中CCR5的多核苷酸或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，可以来治疗、预防、诊断和/或预后运动失调性毛细血管扩张症或与其有关的状况。
T细胞和/或B细胞作用下降和/或数量减少性先天性免疫缺陷症的例子包括，但并不仅限于迪格奥尔异常，重型联合性免疫缺乏症(SCID)(其中包括，但并不仅限于X连锁性SCID，常染色体隐性SCID，腺苷脱氨酶缺乏症，嘌呤核苷酸磷酸化酶缺乏症(PNP)，II型NHC缺乏症(少淋巴细胞综合征)，威-奥二氏综合征，和运动失调性毛细血管扩张症)，胸腺发育不全，第三、第四咽囊综合征，22q11.2缺失症，慢性粘膜皮肤白色念珠菌病，自然杀伤性细胞缺乏症，自发性CD4+T淋巴细胞减少症，显著性T细胞(非特异性)缺乏性免疫缺陷症，和细胞介导的非特异性免疫缺陷症。
在具体的实施方案中，应用本发明中CCR5的多肽或多核苷酸、或其激动剂或拮抗剂，来治疗、预防、诊断和/或预后迪格奥尔异常症或与迪格奥尔异常症有关的状况。
应用本发明中CCR5的多肽或多核苷酸，和/或其激动剂或拮抗剂，可治疗、预防、诊断和/或预后其他一些免疫缺陷病，其中包括，但并不仅限于慢性肉芽肿病，白细胞颗粒异常综合征，髓过氧化物酶缺乏症，白细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，X连锁性淋巴细胞增生综合征(XLP)，白细胞粘附缺乏症，补体成分缺乏症(包括C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8和/或C9缺乏)，网状组织发育不全，胸腺淋巴组织发育不全，伴胸腺瘤的免疫缺陷病，重型先天性白细胞减少症，四肢短小性矮小，和胸腺发育异常综合征联合免疫球蛋白性免疫缺陷症。
在一优选的实施方案中，应用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，对上述的免疫缺陷性疾病和/或与免疫缺陷性疾病相关的状况进行治疗、预防、诊断和/或预后。
在一优选的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽、和/或其激动剂或拮抗剂，可用作提高免疫缺陷个体的免疫反应能力的试剂。在特定的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，作为一种试剂可用来提高B细胞性和/或T细胞性免疫缺陷个体的免疫反应能力。
而且，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，也可用来调节止血活性(阻止出血)或血栓溶解活性(血块形成)。例如，通过增强止血或溶栓的活性，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用来治疗或预防凝血性疾病、功能紊乱和/或相关状况(如，无纤维蛋白原症，因子缺乏症)，血小板性疾病，功能紊乱和/或相关状况(如，血小板减少症)，或由外伤、手术或其他疾病所导致的创伤。或者，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可降低止血剂或溶栓剂的活性，从而可用来抑制血块形成或溶解血块。这些分子可在治疗或预防心脏病发作(梗死)、中风或结痂方面起着重要作用。
CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，也可有助于治疗、预防、和/或诊断自身免疫性疾病、功能紊乱和/或相关状况。许多自身免疫性疾病、功能紊乱和/或相关状况是由于免疫细胞把自体误认为外来物而引起的。这种错误的识别导致了一种引起宿主组织破坏的免疫反应。CCR5的多核苷酸或多肽、或其激动剂或拮抗剂能够抑制免疫反应，尤其是T细胞的增殖、分化或趋向性，因此，它们的应用，可能是预防自身免疫性疾病、功能紊乱和/或相关状况的一种有效治疗方案。
可用CCR5来治疗、预防和/或诊断或检测的自身免疫性疾病、功能紊乱和/或相关状况的例子包括，但并不仅限于艾迪生病(Addison’sDisease)，溶血性贫血，抗磷脂综合征，类风湿性关节炎，皮炎，变态反应性脑脊髓炎，肾小球肾炎，肾炎-肺出血综合征(Goodpasture’sSyndrome)，突眼性甲状腺肿(Graves’Diseases)，多发性硬化症，重症肌无力，神经炎，眼炎，大疱性类天疱疮(Bullous Pemphigoid)，天疱疮(Pemphigus)，多内分泌腺病，紫癜，赖特病，人僵直综合征(Stiff-Man Syndrome)，自身免疫性甲状腺炎，系统性红斑狼疮，自身免疫性肺炎，急性感染性多神经炎(Guillain-Barre Syndrome)，胰岛素依赖性糖尿病，和自身免疫性炎性眼病。
相似地，也可用CCR5的多核苷酸或多肽、或其激动剂或拮抗剂来治疗、预防和/或诊断过敏反应和相关状况，如哮喘(尤其是过敏性哮喘)或其它呼吸性问题。而且，这些分子能用于治疗过敏反应，对抗原分子的超敏反应，或血型不相容。
另外，本发明中CCR5的多肽或多核苷酸，和/或其激动剂或拮抗剂，可用来治疗、预防、诊断和/或预后IgE介导的过敏反应。这些过敏反应包括，但并不仅限于哮喘、鼻炎和湿疹。在特定的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，可用来调节离体或在体时IgE浓度。
CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可治疗、预防、和/或诊断器官排斥或移植物抗宿主病(GVHD)。器官排斥发生于宿主免疫细胞通过免疫发应摧毁被移植组织时。相似地，免疫反应也参与了GVHD，但是在此情况下，外来的被移植的免疫细胞摧毁了宿主组织。CCR5的多核苷酸或多肽、或其激动剂或拮抗剂能够抑制免疫反应，尤其是T细胞的增殖、分化或趋向性，因此，它们的应用，可能是预防器官排斥或GVHD的一种有效治疗方案。在特定的实施方案中，本发明中的多肽、抗体或多核苷酸，和/或其激动剂或拮抗剂能够抑制免疫反应，尤其是T细胞的活性、增殖、分化或趋向性，因此，它们的应用，可能是预防实验性过敏排斥和超急性异种移植排斥的一种有效治疗方案。
相似地，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，也可用来调控炎症。举例来说，既然本发明中多肽、抗体或多核苷酸，和/或其激动剂或拮抗剂，能够抑制参与炎性反应的细胞的活性、增殖、分化或趋向性，那么这些分子就能够用来预防或治疗急慢性炎性状况。这些炎性状况包括，但并不仅限于以下状况，如，与感染有关的炎症(如，败血症性休克，脓毒，或系统性炎性反应综合征)，缺血再灌注损伤，内毒素致死现象，补体介导的超急性排斥，肾炎，细胞因子或趋化因子诱导的肺损伤，炎性肠道疾病，节段性回肠炎(Crohn’s disease)，细胞因子过剩(如，TNF或IL-1)，呼吸性功能紊乱(如，哮喘或过敏)；胃肠道功能紊乱(如，炎性肠道疾病)，癌症(如，胃、卵巢、肺、膀胱、肝和胸)，中枢神经系统功能紊乱(如，多发性硬化病；缺血性脑损伤和/或中风，外伤性脑损伤，神经退性性功能紊乱(如，帕金森氏病和老年性痴呆)；AIDS相关性痴呆；和朊病毒病)；心血管功能紊乱(如，动脉粥样硬化，心肌炎，心血管疾病和心肺旁路并发症)；以及许多其它以炎症为特征的疾病、相关状况和功能紊乱(如，肝炎，类风湿性关节炎，痛风，创伤，胰腺炎，肉样瘤病，皮炎，肾的缺血再灌注损伤，突眼性甲状腺肿，系统性红斑狼疮，糖尿病和异基因型移植排斥)。
因为炎症是一种基本的防卫机制，所以炎性功能紊乱能够实质性地影响任何机体组织。相应地，本发明中多核苷酸、多肽和抗体，以及其激动剂或拮抗剂，有助于治疗组织特异性炎性功能紊乱，其中包括，但并不仅限于肾上腺炎，牙槽炎，胆囊胆管炎，阑尾炎，龟头炎，睑缘炎，支气管炎，滑囊炎，心炎，蜂窝组织炎，宫颈炎，胆囊炎，精索炎，耳蜗炎，结肠炎，结膜炎，膀胱炎，皮炎，憩室炎，脑炎，心内膜炎，咽鼓管炎，纤维织炎，毛囊炎，胃肠炎，牙龈炎，舌炎，肝脾炎，角膜炎，迷路炎，喉炎，淋巴管炎，乳腺炎，中耳炎，脑膜炎，粘膜炎，心肌炎，肌炎，鼓膜炎，肾炎，神经炎，睾丸炎，骨软骨炎，骨炎，心包炎，腱鞘炎，腹膜炎，咽炎，静脉炎，脊髓灰质炎，前列腺炎，牙髓炎，视网膜炎，鼻炎，输卵管炎，巩膜炎，巩膜脉络膜炎，阴囊炎，鼻窦炎，脊椎炎，脂肪组织炎，口炎，滑膜炎，咽鼓管炎，腱炎，扁桃体炎，尿道炎，和阴道炎。
在其它实施方案中，本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂作为一种试剂可有助于提高噬中性粒细胞、噬酸性粒细胞和巨噬细胞的迁移、吞噬作用、超氧离子的生产和抗体依赖性细胞毒作用。
在另一实施方案中，本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗某些疾病或功能紊乱，它们以血液白细胞数量的增减为特征或是与其有关。白细胞减少症发生于血液中白细胞数量减少至正常水平以下时。白细胞减少症包括，但并不仅限于噬中性粒细胞减少和淋巴细胞减少。血液中白细胞数量与正常水平相比有所增加，即称为白细胞增多症。机体在感染过程中会产生较多量的血液白细胞，因此，白细胞数量的增多可单纯地作为一种正常生理参数来反映感染。或者，白细胞增多可作为损伤或其它疾病如癌症的指示物。白细胞增多包括，但并不仅限于噬酸性粒细胞增多和巨噬细胞的聚集。在特定的实施方案中，本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗白细胞减少症。在其它特定的实施方案中，本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗白细胞增多症。
白细胞减少可能是所有类型白细胞普遍性地减少，或者是某特定类型的白细胞的特定衰竭。因此，在特定的实施方案中，本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗噬中性粒细胞数量的减少，即噬中性粒细胞减少症。可以用本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来诊断、预后、预防和/或治疗的噬中性粒细胞减少症包括，但并不仅限于婴幼儿遗传性粒性白血球缺乏症，家族性中性粒细胞减少症，周期性粒细胞减少症，由饮食缺乏(如，维生素B12缺乏或叶酸缺乏)引起的或是与其有关的中性粒细胞减少症，由药物治疗(如，抗生素疗法，象青霉素治疗、磺胺类药物治疗，抗凝剂治疗，抗痉挛药，和癌症的化疗)引起的中性粒细胞减少症，和中性粒细胞破坏增强而导致的中性粒细胞减少症，这种中性粒细胞破坏增强与某些细菌或病毒感染、过敏性功能紊乱、自身免疫性疾病、巨脾患者的相关状况(如，费耳提氏综合征，疟疾和结节病)和某些药物治疗有关。
本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗淋巴细胞减少症(B淋巴细胞和/或T淋巴细胞数量减少)，其中包括，但并不仅限于由以下因素引起的或是与其有关的淋巴细胞减少症。这些因素包括应激，药物治疗(如，类皮质固醇疗法，癌症的化疗，和/或放射疗法)，AIDS，和/或其它疾病，如，癌症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，慢性感染，某些病毒感染和/或遗传性功能紊乱(如，迪格奥尔格综合征，威-奥二氏综合征，重型联合性免疫缺陷症，运动失调性毛细血管扩张综合征)。
本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗与巨嗜细胞数量和/或功能有关的疾病和功能紊乱，其中包括，但并不仅限于戈谢病(Gaucher’s disease)，尼曼病，非类脂组织细胞增多症(Letterer-Siwe disease)和慢性特发性组织细胞增多(Hand -Schuller-Christisn disease)。
在另一实施方案中，本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗与噬酸性粒细胞数量和/或功能有关的疾病和功能紊乱，其中包括，但并不仅限于自发性噬酸性粒细胞过度增生综合征，噬酸性粒细胞增生-肌痛综合征，和/或慢性特发性组织细胞增多(Hand -Schuller-Christisn disease)。
在另一实施方案中，本发明中的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗白血病和淋巴瘤，其中包括，但并不仅限于急性淋巴细胞性(淋巴细胞增生性)白血病(ALL)，急性髓样(髓细胞的、骨髓性的、成髓细胞的、或骨髓单核细胞的)白血病，慢性淋巴细胞性白血病(如，B细胞性白血病、T细胞性白血病、赛塞利综合征、多毛细胞白血病)，慢性髓细胞性(髓样、骨髓性的、或粒细胞生成性)白血病，何杰金氏淋巴瘤，非何杰金氏淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，和蕈样霉菌病。
在其它实施方案中，本发明中的多肽、抗体或多核苷酸，和/或其激动剂或拮抗剂有助于诊断、预后、预防和/或治疗免疫复合物疾病，其中包括，但并不仅限于血清病，链球菌感染后的肾小球肾炎，多发性动脉炎性结节病和免疫综合征导致的脉管炎。
本发明中的多肽、抗体或多核苷酸，和/或其激动剂或拮抗剂能用来治疗、检测和/或预防感染因子。举例来说，通过增强免疫反应，尤其是增强B细胞和/或T细胞的增殖活动和/或分化，可以治疗、检测、和/或预防感染性疾病。增强免疫反应可以是通过增强已有的免疫反应，也可以是通过启动一种新的免疫反应。或者，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂也可能直接抑制感染因子(参照列举感染因子的应用部分，等)，而无须诱导免疫反应。
在另一实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用作疫苗佐剂，增强了对抗原的免疫反应。在特定的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用作佐剂，增强肿瘤特异性免疫反应。
在另一实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用作佐剂，增强抗病毒免疫反应。应用本发明中的组合物作为佐剂增强了的抗病毒免疫反应，包括病毒和与某些疾病或症状有关的病毒，这些疾病或症状可能是此文描述过的，或是本领域中已知的。在特定的实施方案中，本发明中的组合物可作为佐剂，增强对病毒、疾病或症状的免疫反应，这些病毒，疾病或症状选自AIDS，脑膜炎，登革热，EBV和肝炎(如，B型肝炎)。在另一实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用作佐剂，增强对病毒、疾病或症状的免疫反应，这些病毒，疾病或症状选自HIV/ADIS，呼吸道合胞体病毒，登革热，轮状病毒，日本B型脑炎，A型和B型流行性感冒，副流感，麻疹，狂犬病，Junin，基孔肯雅病(Chikungunya)，立夫特山谷热，单纯疱疹，和黄热病。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用作佐剂，来增强抗细菌或抗真菌免疫反应。应用本发明中的组合物作为佐剂增强了的抗细菌或抗真菌免疫反应，包括细菌或真菌和与本文提到过的或本领域中已知的疾病或症状有关的细菌或真菌。在特定的实施方案中，本发明中的组合物可用作佐剂，来增强抗某种细菌或真菌、疾病、或症状的免疫反应，这些细菌或真菌、疾病或症状选自破伤风、白喉、肉毒中毒和B型脑脊膜炎。
在另一具体的实施方案中，本发明中的组合物可用作佐剂，来增强抗某种细菌或真菌、疾病、或症状的免疫反应，这些细菌或真菌、疾病或症状选自霍乱弧菌属、麻风分支杆菌属、伤寒沙门氏菌属，副伤寒沙门氏菌属，Meisseria脑脊膜炎、肺炎链球菌、B组链球菌、志贺氏杆菌、肠毒性大肠杆菌、肠出血大肠杆菌和包柔氏螺旋体。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用作佐剂，来增强抗寄生虫性免疫反应。应用本发明中的组合物作为佐剂增强了的抗寄生虫性免疫反应，包括寄生虫和与本文提到过的或本领域中已知的疾病或症状有关的寄生虫。在特定的实施方案中，本发明中的组合物可用作佐剂，来增强抗某种寄生虫性免疫反应。在另一特定实施方案中，本发明中组合物可用作佐剂，来增强抗疟原虫(疟疾)或利什曼原虫性免疫反应。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用于治疗感染性疾病，其中包括矽肺、肉样瘤病和原发性肺纤维化；例如，通过防止单核吞噬细胞的聚集和激活。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种抗原，来产生抗体抑制或提高抗本发明中的多肽的免疫介导性反应。
在一实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可应用于动物(如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪、鸡、骆驼、山羊、马、牛、绵羊、狗、猫、非人类灵长类动物和人，最优选人)，来促进免疫系统产生大量的一种或多种抗体(如，IgG、IgA、IgM和IgE)，诱导高亲和性抗体的产生和免疫球蛋白族的激活(如，IgG、IgA、IgM和IgE)，和/或提高免疫反应。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为B细胞对病原体进行反应的一种刺激物。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用作T细胞的激活物。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，在个体受到免疫抑制性治疗之前，可作为一种试剂来提高他们的免疫状况。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种试剂来诱导高亲和性抗体的产生。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种试剂来增强血清中免疫球蛋白的浓度。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种试剂来加速免疫损伤个体的恢复。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种试剂来提高老年群体和/或新生儿的免疫反应。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种免疫系统增强剂，用于骨髓移植和/或其它移植(如，同种异体或异种器官移植)的之前、期间或之后。在移植方面，本发明中的组合物可应用于移植之前、同时和/或之后。在一特定的实施方案中，本发明中的组合物可应用于移植之后、T细胞群恢复之前。在另一具体的实施方案中，本发明中的组合物可首先在移植后T细胞群开始恢复之后给与，但在B细胞群全面恢复之前。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种试剂来促进获得性B细胞功能丧失个体的免疫反应。可通过应用本发明中多肽、抗体、多核苷酸和/或其激动剂或拮抗剂得到改善或治疗的导致获得性B细胞功能丧失的状况，包括，但并不仅限于HIV感染、AIDS、骨髓移植，和B细胞性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种试剂，来促进暂时性免疫低下个体的免疫反应。由暂时性免疫低下所导致的状况，可通过应用本发明中多肽、抗体、多核苷酸和/或其激动剂或拮抗剂得到改善或治疗，其中包括，但并不仅限于病毒感染(如，流感)恢复期，营养不良相关状况，传染性单核细胞增多症恢复期，或与应激有关的状况，麻疹恢复期，输血恢复期和手术恢复期。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为由单核细胞、树状突细胞和/或B细胞所产生的抗原呈递的调节剂。在一实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可增强或对抗离体或在体条件下的抗原呈递。并且，在相关的实施方案中，上述增强或对抗抗原呈递的作用，可作为一种抗肿瘤疗法或有助于调节免疫系统。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种试剂，来指导个体的免疫系统发展与TH1型细胞反应相反的体液反应(如TH2)。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种手段来诱导肿瘤的繁殖，从而使之对抗肿瘤试剂更敏感。例如，多发性骨髓瘤是一种慢性分裂性疾病，因此它对几乎所有的抗肿瘤药物都不敏感。如果能强迫这些细胞增殖得更快，那么它们的敏感性就有可能会改变。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种B细胞产生的刺激物，应用于某些疾病，如，AIDS，慢性淋巴细胞性病症和/或常见的变异性免疫缺乏症。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种治疗方法，用于治疗手术、外伤或遗传性缺陷后淋巴样组织的产生和/或再生。在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用于移植前骨髓样本的预处理。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂作为一种基于基因基础上的治疗方法，用来治疗遗传性功能紊乱，这些功能紊乱导致了免疫机能不全/免疫低下，如从SCID患者身上所观察到的。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂作为一种手段可激活单核细胞或巨噬细胞来对抗影响单核细胞的寄生虫性疾病，如利氏曼原虫病。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂作为一种手段，可调控由本发明中的多肽所诱导的分泌的细胞因子。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用于一种或多种本文所描述过的应用中，如它们可应用于兽医医学。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂作为一种手段，可用来阻断对外来物或自身的免疫反应的多个方面。需要阻断免疫反应一定方面的疾病或相关状况的例子包括自身免疫性病症，如狼疮和关节炎，以及皮肤过敏、炎症、肠道疾病、与病原体有关的损伤和疾病或功能紊乱。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂作为一种治疗方法，用来抑制与自身免疫性疾病有关的B细胞分化和免疫球蛋白分泌，如自发性血小板减少性紫癜，系统性红斑狼疮和多发性硬化症。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为B细胞和/或T细胞在内皮细胞内迁移的抑制剂。这一活性可破坏组织结构或相关反应，并且有助于，如，破坏免疫反应和抑制脓毒症。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可作为一种治疗方法，用来治疗慢性高球蛋白血症，这一症状在下列疾病中较明显，如不明确定型单克隆丙种球蛋白病(MGUS)，瓦尔登斯特伦氏病，相关性自发性单克隆丙种球蛋白病，和浆细胞瘤。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用于某种自身免疫性慢性炎症和感染性疾病，如用来抑制巨噬细胞及其前体的多肽趋化性和活化，和中性粒细胞、碱性粒细胞、B淋巴细胞以及某些T细胞亚族的多肽趋向性和活化，如活化的CD8细胞毒性T细胞和自然杀伤性细胞。自身免疫性疾病的例子包括本文中所提到过的以及多发性硬化症和胰岛素依赖性糖尿病。
本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来治疗自发性高噬酸性粒细胞综合征，比如通过抑制噬酸性粒细胞的产生和移动。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来提高或抑制补体介导性细胞溶解。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来提高或抑制抗体依赖性细胞毒作用。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂也可用来治疗动脉粥样硬化，如，通过抑制单核细胞在动脉壁上的浸润。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来治疗成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可有助于刺激伤口和组织的修复，刺激血管生成，和/或刺激血管或淋巴性疾病或功能紊乱的恢复。另外，本发明中的激动剂和拮抗剂可有助于刺激粘膜表面的再生。
在一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来诊断、预后、治疗和/或预防以原发性或获得性免疫缺陷、血清免疫球蛋白产生低下、复发性感染、和/或免疫系统机能不全为特征的病症。而且，本发明中的多核苷酸或多肽，和/或激动剂可用来治疗或预防关节、骨、皮肤和/或耳下腺的感染，血传播性感染(如，脓毒症，脑脊膜炎，浓度性关节炎，和/或骨髓炎)，自身免疫性疾病(如，那些在本文已提到过的)，炎症性功能紊乱，和恶性病，和/或与这些感染、疾病、病症和/或恶性病有关的疾病或功能紊乱或相关状况；其中包括，但并不仅限于CVID、其它原发性免疫缺陷病、HIV疾病、CLL、复发性支气管炎、窦炎、中耳炎、结膜炎、肺炎、肝炎、脑脊膜炎、带状疱疹(如，重型带状疱疹)，和/或卡氏肺囊虫病。可用本发明中的多核苷酸或多肽，和/或激动剂来预防、诊断、预后和/或治疗的其它疾病或功能紊乱包括，但并不仅限于HIV感染、HTLV-BLV感染、淋巴细胞减少症，巨噬细胞杀毒机能不全性贫血，血少板减少症和血红蛋白尿。
在另一实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用治疗和/或诊断患有常见性变异性免疫缺陷病(CVID；即“获得性无丙种球蛋白血症”和“获得性低丙种球蛋白血症”)或这一疾病亚型的个体。
在一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来诊断、预后、预防和/或治疗癌症或肿瘤，包括与免疫细胞或免疫组织有关的癌症或肿瘤。可以用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来预防、诊断或治疗的癌症或肿瘤的例子包括，但并不仅限于急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、何杰金氏病、非何杰金氏病、急性淋巴细胞性贫血(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病，浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、伯基特氏淋巴瘤、变异性BEV疾病、和/或本文中名为“过度增生性功能紊乱”部分所提到过的疾病和功能紊乱。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂作为一种治疗方法可用来降低大B细胞性淋巴瘤的细胞增生。
在另一具体的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂作为一种手段用来减轻与慢性骨髓性白血病有关的B细胞和Ig的参与。
在具体的实施方案中，本发明中的组合物可用作一种试剂来促进B细胞性免疫缺陷个体的免疫反应，例如，一个刚经历过部分或全部脾切除术的患者。
本发明中的拮抗剂包括，如，本发明的结合性和/或抑制性抗体、反义核酸、核酶或可溶形式多肽(如，Fc融合蛋白)。本发明中的激动剂包括，如，本发明中的结合性或刺激性抗体和可溶形式多肽(如，Fc融合蛋白)。本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用于一种组合物中，此组合物带有药物可受性载体，如本文所描述过的。
在另一实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用于动物身上(包括，但并不仅限于上文所列出的，也包括转基因动物)，这种动物不能产生功能性的内源性抗体或者其内源性免疫系统已受到其它方面的损害，但能够通过从其它动物获得的重建或部分重建免疫系统来产生免疫球蛋白(参照，如已公布的PCTApplication Nos.WO98/24893，WO/9634096，，WO/9633735和WO/9110741)。本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂应用于这些动物身上，有助于产生抗本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂的单克隆抗体。
趋化性。本发明中CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可能拥有趋化活性。一种趋化性分子能够吸引或使细胞(如，单核细胞、成纤维细胞、噬中性粒细胞、T细胞、肥大细胞、噬酸性粒细胞、上皮细胞和/或内皮细胞)移动到机体内某特定位置，如，炎症、感染、或高增生区域。从而这些被移动的细胞能够治疗和/或治愈特定外伤或异常。
本发明中CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可增强特定细胞的趋化活动。这些趋化性分子通过增加靶向机体某特定位置的细胞数量，来治疗、预防和/或诊断炎症、感染、高增生性疾病、功能紊乱和/或相关状况、或任何一种免疫系统功能紊乱。例如，趋化分子通过吸引免疫细胞到达受伤部位来治疗、预防和/或诊断伤口和其它组织创伤。本发明中的趋化分子也能吸引成纤维细胞来治疗、预防和/或诊断伤口。
同时也考虑到CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可能会抑制趋化活性。这些分子也能用来治疗、预防和/或诊断疾病、功能紊乱和/或相关状况。因此，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可作为趋化性的抑制剂。
感染性疾病。CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂能用来治疗、预防和/或诊断感染性因素。例如，通过增强免疫反应，尤其是增强B细胞和/或T细胞的增生和分化，来治疗、预防和/或诊断感染性疾病。增强免疫反应可以是通过增强已有的免疫反应，或通过启动新的免疫反应。或者，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂也可直接抑制感染性因素，而无需诱发免疫反应。
病毒是感染性因素中的实例，它所引起的疾病或症状可用本发明中的多核苷酸或多肽，和/或激动剂或拮抗剂来治疗、预防和/或诊断。病毒的例子包括，但并不仅限于下述的DNA和RNA病毒及病毒科虫媒病毒(Arbovirus)，腺病毒科(Adenavirideae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)，马动脉炎病毒属，双节段RNA病毒科，本雅病毒科(Bunyaviridae)，杯状病毒科(Caliciviridae)，Circoviridae，冠状病毒科，登格热，EB病毒，HIV，黄病毒科(Flaviridae)，肝DNA病毒科(肝炎)，疱疹病毒科(如，巨细胞病毒，单纯疱疹，带状疱疹)，Mononegavirus(如，副粘病毒科，麻疹病毒属，弹状病毒科)，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如，流感病毒A，流感病毒B和副流感病毒)，乳头瘤病毒(papiloma)，乳头多瘤空泡病毒科(Parvoviridae)，细小病毒科(Picornaviridae)，小RNA病毒科，痘病毒科(天花或牛痘)，呼肠孤病毒科(如，轮状病毒属)，逆转录病毒科(HTLV-I，HTLV-II，慢病毒)，和披膜病毒科(如，风疹病毒科)。属于这些家族的病毒能够引起一系列的疾病或症状，包括，但并不仅限于关节炎，毛细支气管炎，呼吸性合胞体病毒，脑炎，眼睛感染(如，结膜炎，角膜炎)，慢性疲劳综合征，肝炎(A，B，C，E，慢性活动性，Delta)，日本B型脑炎，Junin，基孔肯雅病(Chikungunya)，立夫特山谷热，和黄热病，脑脊膜炎，机会性感染(如，AIDS)，肺炎，伯基特氏淋巴瘤，水痘，出血热，麻疹，流行性腮腺炎，副流感，狂犬病，感冒，脊髓灰质炎，白血病，风疹，性传播疾病，皮肤疾病(如，卡波西疣)，和病毒血症。本发明中多核苷酸或多肽，或激动剂或拮抗剂能用来治疗、预防和/或诊断任何一种这些疾病或症状。在特定的实施方案中，本发明中多核苷酸、多肽，或激动剂或拮抗剂能用来治疗脑脊膜炎，登革热，EB病毒，和/或肝炎(如，B型肝炎)。在另一具体的实施方案中，本发明中多核苷酸、多肽，或激动剂或拮抗剂能用来治疗那些对一种或多种其它商业性可用肝炎疫苗无反应的患者。在一更为具体的实施方案中，本发明中多核苷酸、多肽，或激动剂或拮抗剂能用来治疗、预防、和/或诊断AIDS。
在一高度优选的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来诊断、治疗、预防或改善HIV感染。
在其它高度优选的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来诊断、治疗、预防或改善巨细胞病毒感染。
在其它高度优选的实施方案中，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂可用来诊断、治疗、预防或改善痘病毒感染。
相似地，某些细菌或真菌性因子，它们所引起的疾病或症状可以用本发明中多核苷酸或多肽，和/或激动剂或拮抗剂来治疗、预防和/或诊断，其中包括，但并不仅限于下列革兰氏阴性和阳性细菌和细菌科以及真菌放线菌目(如，棒状杆菌属，分支杆菌属，诺卡氏菌属(Norcardia)，新型隐球醇母，曲霉属(Aspergillosis)，芽胞杆菌科(Bacillaceae)(如，炭疽，梭状芽胞杆菌属)，类杆菌科(Bacteroidaceae)，芽生菌(Blastomycosis)，博德特氏杆菌属(Bordetella)，包柔氏螺旋体属(Borrelia)(如，Borrelia burgdorferi)，布鲁氏菌属(Brucellosis)，念珠菌病，弯曲杆菌属(Campylobacter)，球孢子菌病，隐球菌病，Dermatocycoses，大肠杆菌(如，肠毒性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌)，肠杆菌科(克雷白氏杆菌属，沙门氏菌属(如，伤寒沙门氏菌，和副沙门氏菌)，沙雷氏菌属，耶尔赞氏菌属)，丹毒丝菌属，螺旋菌属，军团杆菌病，钩端螺旋体病，李斯特菌属，支原体目，麻风分支杆菌科，霍乱弧菌科，奈瑟氏杆菌科(如，不动杆菌属，淋病属，脑膜炎球菌)，Meisseria meningitidis，巴斯德氏菌感染(如，放线杆菌属，Heamophilus(如，B型Heamophilus influenza)，巴斯德氏菌属)，假单胞菌属，立克次氏体科，衣原体科，梅毒，志贺氏杆菌属，葡萄球菌，脑膜炎球菌，肺炎球菌和链球菌(如，肺炎链球菌和B组链球菌)。这些细菌或真菌家族能引起下列疾病或症状，其中包括，但并不仅限于菌血症，心内膜炎，眼睛感染(结膜炎，结核，眼色素蹭层炎)，牙龈炎，机会性感染(如，AIDS相关性感染)，甲沟炎，修复术相关性感染，莱特氏病，呼吸道感染，如百日咳或脓胸，脓毒症，莱姆病，Cat-Scratch病，痢疾，副伤寒热，食物中毒，伤寒，肺炎，淋病，脑脊膜炎(如，A和B型脑脊膜炎)，衣原体病，梅毒，白喉，麻风，类结核，结核，狼疮，肉毒中毒，坏疽，破伤风，脓疱病，风湿热，猩红热，性传播疾病，皮肤病(如，蜂窝织炎，dermatocycoses)，毒血症，尿路感染，伤口感染。本发明中的多核苷酸或多肽，激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断任何一种这些症状或疾病。在特定的实施方案中，本发明中的多核苷酸，多肽，激动剂或拮抗剂可用来治疗破伤风，Diptheria，肉毒中毒，和/或B型脑脊膜炎。
并且，引起的疾病或症状可用本发明中的多核苷酸或多肽、和/或其激动剂或拮抗剂来治疗、预防和/或诊断的寄生虫性因素，包括，但并不仅限于下述科或纲阿米巴病，巴贝虫病，球虫病，隐孢子虫病，双核阿米巴病，马类锥病，体外寄生虫病，梨形鞭毛虫病，蠕虫病，利什曼病，泰累尔氏梨浆虫病，弓形体病，锥虫病，和毛滴虫病以及孢子虫(如，间日虐原虫，恶性疟原虫，三日疟原虫和卵形疟原虫)。这些寄生虫能引起一系列的疾病或症状，其中包括，但并不仅限于疱疮，恙螨病，眼睛感染，肠道感染(如，痢疾，梨形鞭毛虫病)，肝病，肺病，机会性感染(如，AIDS相关性)，疟疾，妊娠并发症和弓形体病。本发明中的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断任何一种这些症状或疾病。在特定的实施方案中，本发明中的多核苷酸，多肽，或其激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断疟疾。
优选地，应用本发明中的多肽或多核苷酸、和/或激动剂或拮抗剂的治疗或预防措施，可以是通过给患者施用有效量的多肽，或是通过从患者体内取出细胞，然后把本发明中的多核苷酸供给这些细胞，并把这些处理过的细胞再移入患者体内(离体疗法)。而且，本发明中的多肽或多核苷酸，可作为疫苗中的抗原来引发免疫反应以对抗感染性疾病。
神经性疾病。可以用本发明中CCR5的组合物(如，CCR5多肽、多核苷酸、和/或激动剂或拮抗剂)来治疗的神经系统疾病、功能紊乱和/或状况包括，但并不仅限于神经系统损伤，和这样的疾病、功能紊乱和/或状况，这些疾病、功能紊乱和/或状况或者引起轴突的断裂、神经原的萎缩或退变或脱髓鞘作用。可以根据本发明来治疗患者(包括人类和非人类哺乳动物患者)的神经系统损伤，其中包括，但并不仅限于以下中枢神经系统损伤(包括脊髓、脑)或外周神经系统损伤(1)缺血性损伤，即神经系统某一部分的缺血导致神经原的损伤或死亡，包括脑梗死或缺血，或脊髓梗死或缺血；(2)外伤性损害，包括物理性损伤所导致的损害或与手术有关的损害，例如，神经系统的某一部分断离性损伤，或压迫性损伤；(3)恶性损害，神经系统的某一部分遭到恶性组织的破坏或损伤，这些恶性组织或者是与恶性疾病有关的神经系统，或是源于非神经系统组织的恶性疾病；(4)感染性损伤，神经系统的一部分由于感染受到破坏或损伤，例如，由于脓肿或与人免疫缺陷病毒、带状疱疹、或单纯疱疹病毒、或莱姆病、结核、梅毒引起的感染有关；(5)退行性损害，神经系统的一部分由于退行性病变受到破坏或损伤，其中包括，但并不仅限于与帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、遗传性慢性舞蹈病、或肌萎缩性侧索硬化(ALS)有关的退行性病变；(6)与营养性疾病、失调和/或状况有关的损害，神经系统的一部分由于营养失调或代谢失调而受到破坏或损伤，其中包括，但并不仅限于维生素12缺乏症、叶酸缺乏症、急性出血性脑灰质炎、烟草-酒精中毒性弱视、马-比二氏病(原发性胼胝体变性)和酒精中毒性小脑变性；(7)与系统性疾病有关的神经损害，其中包括，但并不仅限于糖尿病(糖尿病神经病变，贝尔氏麻痹)、系统性红斑狼疮、肿瘤或肉样瘤病；(8)由毒性物质引起的损害，其中包括，但并不仅限于酒精、铅，或者，特别是神经毒素；和(9)脱髓鞘性损伤，神经系统的一部分由于脱髓鞘病而受到破坏或损伤，其中包括，但并不仅限于多发性硬化病、人类免疫缺陷病毒性脊髓病、横断性脊髓病或各种病因、进行性多发性脑白质病和中心性脑桥溶髓鞘性病变。
在一优选的实施方案中，本发明中CCR5的多肽、多核苷酸、或激动剂或拮抗剂，保护神经细胞免受脑缺氧性损伤。根据这一实施方案，本发明中的组合物可用来治疗、预防和/或诊断与脑缺氧有关的神经细胞损伤。在这一方案的一方面中，本发明中CCR5的多肽、多核苷酸、或激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断与脑缺血有关的神经细胞损伤。在这一方案的另一方面中，本发明中CCR5的多肽、多核苷酸、或激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断与脑梗塞有关的神经细胞损伤。
在这一方案的另一方面中，本发明中CCR5的多肽、多核苷酸、或激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断与中风有关的神经细胞损伤。在这一方案的另一方面中，本发明中CCR5的多肽、多核苷酸、或激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断与中风有关的脑神经细胞损伤。
在这一方案的更进一步方面中，本发明中CCR5的多肽、多核苷酸、或激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断与心脏病发作有关的神经细胞损伤。在这一方案的另一方面中，本发明中CCR5的多肽、多核苷酸、或激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断与心脏病发作有关的脑神经细胞损伤。
本发明中有助于治疗、预防和/或诊断神经系统功能紊乱的组合物，可以通过测试其在促进神经原存活或分化方面的生物活性而选择出来。例如，以非限制的方式，可诱发下列效应的本发明中CCR5的组合物可能有用(1)增加培养神经原的存活时间；(2)增加培养神经原或体内神经原的发芽(sprouting)；(3)增加培养中或体内神经原相关性分子的产生，如，与运动神经原有关的胆碱乙酰基转移酶或乙酰胆碱酯酶；或(4)减轻体内神经原机能不全引起的症状。这些效应可使用本领域中的任一方法来衡量。在优选的、无限制性的实施方案中，增强神经原活性这一效应常规地使用本文提出的或者是本领域已知的方法来衡量，如，Arakawa等提出的方法(J.Neurosci.103507-3515(1990))；增加神经原发芽活动这一效应，可用本领域已知的方法来检测，如，Pestronk等(Exp.Neurol.7065-82(1980))或Brown等(Ann.Rev.Neurosci.417-42(1981))提出的方法；增加神经原相关性分子的产生这一效应，可通过生物测定、酶分析、抗体结合、Northern blot分析等方法来衡量，这些方法皆使用了本领域的现有技术，同时也有赖于被衡量的分子；运动神经原机能不全可通过评估运动神经原失调的物理表现来衡量，如，无力、运动神经原的传输速度或功能性失能。
在具体的实施方案中，可以根据本发明来治疗的运动神经原病变、失调和/或相关状况包括，但并不仅限于下列疾病、失调和/或相关状况，如，梗死、感染、中毒、外伤、手术创伤、退行性病变或可能影响运动神经原和神经系统其它组成部分的恶性病变，以及选择性影响神经原的疾病、功能紊乱和/或相关状况，如肌萎缩性侧索硬化，以及包括，但并不仅限于进行性脊柱肌肉萎缩、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化、婴儿和青少年肌肉萎缩、儿童型进行性延髓麻痹(Fazio-londe综合征)，脊髓灰质炎和脊髓灰质炎后综合征，以及遗传性运动感受器神经病(沙-马-图病)。
另外，本发明中CCR5的多肽或多核苷酸可能在神经原的存活、突触的形成、传导、神经分化等过程中发挥着一定的作用。因此，本发明中的组合物(包括CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂)可用于诊断和/或治疗或预防与这些作用有关的疾病或功能紊乱，其中包括，但并不仅限于学习和/或认知功能紊乱。本发明中的组合物，也可用于治疗或预防神经退变性病变状态和/或行为紊乱。这些神经退变性病变状态和/或行为紊乱包括，但并不仅限于阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、图雷特氏综合征、精神分裂症、躁狂、痴呆、偏执狂、强迫症、恐慌症、学习障碍，肌萎缩性侧索硬化(ALS)、精神病、孤独癖和行为异常，其中包括饮食紊乱、睡眠规律紊乱、平衡紊乱和知觉紊乱。另外，本发明中组合物也可在治疗、预防和/或检测与发育的胚胎发育有关的发育性疾病或性别相关性疾病中发挥作用。
另外，本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，有助于保护神经细胞免受与脑血管病症有关的疾病、损害、失调或损伤，其中包括，但并不仅限于颈动脉疾病(如，颈动脉血栓形成、颈动脉狭窄或云雾病)，脑淀粉样血管病，脑动脉瘤，脑缺氧，脑动脉硬化，脑动静脉畸形，脑动脉病，脑栓塞和血栓形成(如，颈动脉血栓形成、静脉窦血栓形成或瓦伦伯格氏综合征)，脑出血(如，硬膜外或硬膜下血肿，或珠网膜下出血)，脑梗塞，脑缺血(如，短暂性脑缺血，锁骨下动脉盗血综合征，或椎基底动脉供血不足)，血管性痴呆(如多发性梗塞)，室周脑白质软化，和血管性头痛(如，丛集性头痛或偏头痛)。
本发明中更进一步的方面提供了利用CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来达到治疗目的的方法，例如，刺激神经细胞的增殖和/或分化。因此，本发明中的多核苷酸、多肽、激动剂和/或拮抗剂可用于治疗和/或检测神经性病变。而且，CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂能用作特定神经系统疾病或病症的标志物或检测物。
可用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来治疗或检测的神经性病变的例子包括脑的疾病，如代谢性脑疾病，其中包括苯丙酮尿症，如母体苯丙酮尿，丙酮酸羧化酶缺乏症，丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症，韦尼克氏脑病，脑水肿，脑肿瘤，如脑室瘤，卡纲范病，小脑病变，小脑共济失调，其中包括脊髓小脑变性，如毛细血管扩张性共济失调，小脑共济失调，弗里德赖希共济失调，神经系统亚速尔病，橄榄体脑桥小脑萎缩，小脑肿瘤，如幕下肿瘤，播散性脑硬化，如轴周性(periaxialis)脑炎，球样细胞性脑白质营养不良，异染性脑白质营养和亚急性硬化性全脑炎。
可用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来治疗或检测的其它神经性病变包括脑血管病(如颈动脉性疾病，其中包括颈动脉血栓形成、颈动脉狭窄和云雾病)，脑淀粉样血管病，脑动脉瘤，脑缺氧，脑动脉硬化，脑动静脉畸形，脑动脉病，脑栓塞和血栓形成，如颈动脉血栓形成，静脉窦血栓形成，和瓦伦伯格氏综合征，脑出血，如硬膜外血肿、硬膜下血肿和珠网膜下出血，脑梗塞，脑缺血，如短暂性脑缺血、锁骨下动脉盗血综合征和椎基底动脉供血不足，血管性痴呆，如多发性梗塞，室周脑白质软化，血管性头痛，如丛集性头痛和偏头痛。
可用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来治疗或检测的其它神经性病变包括痴呆，如AIDS痴呆综合征，早衰型痴呆，如阿耳茨海默氏病和克罗伊茨费尔特-雅各布综合征，老年性痴呆，如阿耳茨海默氏病和进行性核上麻痹症，血管性痴呆，如多发性梗死性痴呆，脑炎，其中包括轴周性(periaxialis)脑炎，病毒性脑炎，如流行性脑炎，日本型脑炎，St.路易斯氏脑炎，蜱传播性脑炎和西尼罗河热，急性散播性脑脊髓炎，脑膜脑炎，如眼色素脑膜脑炎综合征，脑炎后帕金森氏病和亚急性硬化性全脑炎，脑软化，如室周脑白质软化，癫痫，如全身性癫痫，其中包括婴儿期痉挛、癫痫发作型失神，肌阵挛性癫痫，其中包括肌强直癫痫和破碎红纤维性综合征，强直阵挛性癫痫，部分性癫痫，如复合性部分癫痫，额叶癫痫和颞叶癫痫，外伤后癫痫，癫痫状态，如部分性癫痫持续状态(Epilepsia Partialis Continua)，和哈-施综合征。
可用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来治疗或检测的其它神经性病变包括脑积水，如丹迪-沃克综合征和正常压力性脑积水，下丘脑性疾病，如下丘脑肿瘤，脑型疟疾，嗜眠症，包括猝倒，延髓型脊髓灰质炎，假性脑瘤，雷特综合征，Reye综合征，丘脑性疾病，脑弓形体病，颅内结核瘤和肝肾脑综合征，中枢神经系统感染，如AIDS痴呆综合征，脑脓肿，硬膜下积脓，脑脊髓炎，如马脑脊髓炎，委内瑞拉马脑脊髓炎，坏死出血性脑脊髓炎，绵羊脱髓鞘性脑白质炎，和脑型疟。
可用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来治疗或检测的其它神经性病变包括脑脊膜炎，如珠网膜炎，无菌性脑脊膜炎，如病毒性脑脊膜炎，其中包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎，细菌性脑脊膜炎，包括嗜血杆菌脑膜炎，李斯特菌脑膜炎，脑膜炎球菌性脑膜炎，如沃弗综合征，弗里德里希森综合征，肺炎球菌性脑膜炎和脑膜结核，真菌性脑膜炎，如隐球菌脑膜炎，硬膜下积液，脑膜脑炎，如眼色素层脑膜脑炎综合征，脊髓炎，如横断脊髓炎，神经梅毒，如运动性共济失调，脊髓灰质炎，其中包括延髓型脊髓灰质炎和脊髓灰质炎后遗症，朊病毒病(如克罗伊茨弗尔特-雅格布综合征，牛海绵状脑病，格-施综合征，库鲁病，痒病)，和脑弓形体病。
可用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来治疗或检测的其它神经性病变包括中枢神经系统肿瘤，如脑肿瘤，其中包括小脑肿瘤，如幕下肿瘤，脑室肿瘤，如脉络丛肿瘤，下丘脑肿瘤和幕上肿瘤，脑膜肿瘤，脊髓肿瘤，其中包括硬膜外肿瘤，脱髓鞘病，如卡纲范病，散播性脑sceloris，其中包括肾上腺脑白质营养不良，轴周性脑炎，球细胞性脑白质营养不良，散播性脑硬化症，如异染性脑白质营养不良，变态反应性脑脊髓炎，坏死出血性脑脊髓炎，进行性多发性脑白质病，多发性硬化病，中心性脑桥髓鞘破坏，横断性脊髓炎，视神经脊髓炎，痒病，凹背，慢性疲劳综合征，绵羊脱髓鞘性白质炎，高压力性神经综合征，假性脑膜炎，脊髓病变，如先天性肌弛缓，肌萎缩性侧索硬化，脊髓性肌萎缩，如韦-霍病，脊髓压迫症，脊髓肿瘤，如硬膜外肿瘤，脊髓空洞症，运动性共济失调，僵人综合征，精神发育迟缓，如安吉尔曼综合征，猫叫综合征，特朗热综合征，先天愚型，神经节苷脂沉积症(M1)，桑霍夫病，泰-萨病，哈特纳普病，高胱氨酸尿，劳伦斯-穆恩-比德尔综合征，莱-尼综合征，枫糖酸尿病，粘膜病，如岩藻糖苷病，神经原蜡样质-脂褐质沉积症，眼脑肾综合征，苯丙酮尿症，如母体苯丙酮尿，普-威综合征，雷特综合征，鲁-泰综合征，结节性硬化，WAGR综合征，神经系统异常，如前脑无裂畸形，神经管缺乏症，如无脑畸形，其中包括积水性无脑畸形，阿诺尔德-奇阿利变形，脑膨出，脑脊膜膨出，神经管闭合不全，如囊肿性脊柱裂和隐性脊柱裂。
可用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来治疗或检测的其它神经性病变包括遗传性运动和感觉神经病变，其中包括进行性神经病性肌萎缩，遗传性视神经萎缩，雷弗素姆病，遗传性强直性截瘫，韦-霍病，遗传性感觉和自主神经病，如先天性痛觉缺失和家族性自主神经功能异常，神经病表现(如认识不能，其中包括格斯特曼综合征、遗忘症，如逆行性遗忘症，精神性运用不能，神经遗传性膀胱，猝倒，交流障碍，如听力障碍，其中包括耳聋、部分听力丧失、响度重震和耳鸣，语言障碍，如失语症，其中包括书写不能、称名不能、语言遗忘和感觉性失语，诵读困难，如后天性诵读困难，语言发展障碍，发言障碍，如失语症，其中包括称名不能、语言遗忘和感觉性失语，发音障碍，交流性障碍，如发言障碍，其中包括构音障碍、模仿言语、哑症和口吃，声音障碍，如失声症和嘶哑，去脑状态，谵妄，肌纤维自发性收缩，幻觉，假性脑脊膜炎，移动障碍，如安吉尔曼综合征，共济失调，手足徐动症，舞蹈病，肌张力障碍，少动症，肌张力减退，肌阵挛，抽搐，斜颈和震颤，肌张力过高，如肌僵直，如人强直综合征，肌痉挛，麻痹，如面肌麻痹，其中包括耳部带状疱疹，胃轻瘫，偏瘫，眼肌麻痹，如复视，杜安综合征，霍纳综合征，慢性进行性眼外肌麻痹，如Kearns综合征，延髓麻痹症，截瘫，如不朗-塞尔卡综合征，四肢麻痹，呼吸性麻痹和声带麻痹，轻瘫，幻肢，味觉功能紊乱，如味觉丧失和味觉障碍，视觉功能紊乱，如弱视、眼盲、色觉低下、复视、偏盲、盲点和视力低下，睡眠失调，如嗜睡症，，其中包括克莱恩-莱文综合征，失眠症和梦游症，痉挛，如牙关紧闭，无意识，如昏迷，长期植物状态和晕厥以及眩晕，神经肌肉性病变，如先天性肌弛缓，脊髓侧索硬化症，兰-伊肌无力综合征，运动神经原病，肌萎缩，如脊柱肌萎缩，进行性神经病和韦-霍病，脊髓灰质炎后遗症，肌营养不良，重症肌无力，萎缩性肌强直，先天性肌强直，线粒体肌病，家族性周期性麻痹，复合性肌阵挛，热带痉挛性轻截瘫和僵人综合征，外周神经系统疾病，如肌痛症、淀粉样神经病，自主神经系统疾病，如艾迪综合征、巴-吕综合征、家族性自主神经功能异常、霍纳综合征、反射性交感神经营养不良和夏-德雷格综合征，颅内神经疾病，如听神经疾病，比如听神经瘤，其中包括2型神经纤维瘤病，面神经疾病，如面神经痛、麦-罗综合征，眼球运动功能紊乱，其中包括弱视、眼球震颤、动眼神经麻痹，眼球麻痹，如杜安综合征、霍纳综合征，慢性进行性眼外肌麻痹，其中包括Kearn’s综合征、斜视，如内斜视和外斜视，动眼神经麻痹，视神经疾病，如视神经萎缩，其中包括遗传性视神经萎缩、视神经乳头黄色变，视神经炎，如视神经脊髓炎，视神经乳头水肿，三叉神经痛，声带麻痹，脱髓鞘病，如视神经脊髓炎和凹背，以及糖尿病性神经病，如糖尿病足。
可用本发明中CCR5的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂来治疗或检测的其它神经性病变包括神经压迫综合征，如腕管综合征，跗骨管综合征，胸廓出口综合征，如颈肋综合征，尺神经压迫综合征，神经痛，如灼性神经痛、颈臂神经痛、面神经痛和三叉神经痛，神经炎，如实验性变态反应性神经炎、视神经炎、多发性神经炎，多神经根神经炎和脊神经根炎，如多神经根炎，遗传性运动和感觉神经病，如进行性神经病性肌萎缩、遗传性视神经萎缩、雷弗素姆病、遗传性震颤性截瘫和韦-霍病，遗传性感觉和自主神经病，其中包括，先天性痛觉缺失和家族性自主神经功能异常、POEMS综合征、坐骨神经痛、味觉性出汗(Gustatory Sweating)和手足搐溺。
过度增生性疾病。本发明中CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可用来治疗、预防和/或诊断过度增生性疾病、功能紊乱和/或相关状况，其中包括肿瘤。CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可通过直接或间接的相互作用来抑制这一病症的增生。或者，CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂可以促使能够抑制过度增生性病症的其它细胞进行增殖。
例如，通过增强过度增生性疾病的免疫反应，尤其是提高其抗原性，或者通过促进T细胞的增生、分化或迁移，来治疗、预防和/或诊断过度增生性疾病、功能紊乱和/或相关状况。增强这种免疫反应可以是通过增强已有的免疫反应，或是通过诱发一种新的免疫反应。或者，降低免疫反应也可以是一种治疗、预防和或诊断过度增生性疾病、功能紊乱和/或相关状况的方法，如作为一种化疗剂。
可以用CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂来治疗、预防和/或诊断的过度增生性疾病、功能紊乱和/或相关状况的例子包括，但并不仅限于位于以下部位的肿瘤结肠、腹部、骨、胸部、消化系统、肝、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头和脖子、神经的(中枢性和周围性的)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸廓和泌尿生殖器官。
相似地，其它过度增生性疾病、功能紊乱和/或相关状况也可以用CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂来治疗、预防和/或诊断。增生性疾病、功能紊乱和/或相关状况的例子包括，但并不仅限于高丙种球蛋白血症，淋巴增生性疾病、功能紊乱和/或相关状况，异常蛋白血症，紫癜，结节病，赛塞利综合征，瓦尔凳斯特伦巨球蛋白血症，戈谢病，组织细胞增多症和位于上述器官系统的肿瘤以外的其它过度增生性疾病。
一种优选的实施方案利用本发明的多核苷酸来抑制异常细胞分化，此方法应用了利用本发明和/或本发明的蛋白融合物或蛋白片段的基因疗法。
因此，本发明提供了一种治疗细胞增生性疾病、失调和/或相关状况的方法，这种方法是把本发明的多核苷酸插入异常增生细胞，在细胞中上述的多核苷酸抑制了上述的表达。
本发明的另一实施方案提供了一种治疗个体内细胞增生性疾病、失调和/或相关状况的方法，这种方法包括把本发明的一种或多种活性基因拷贝用于一个或多个异常增生性细胞。在一优选的实施方案中，本发明的多核苷酸是一种DNA构建体，其包含可以有效表达编码上述多核苷酸的DNA序列的重组表达载体。在本发明的另一优选的实施方案中，利用反转录病毒载体，或更为优选的是腺病毒载体，将编码本发明的多核苷酸的DNA构建体插入到被治疗的细胞中(参照G J.Nabel，et al.，PNAS 199996324-326，在此特以参考文献引入)。在一最优选的实施方案中，病毒载体是有缺陷的，并且不能转化非增生性细胞，而仅能转化增生性细胞。并且，在一优选的实施方案中，本发明中的多核苷酸可以单独地，或与其它多核苷酸结合、或者与其它多核苷酸融合后插入增生性细胞中，从而可以由外部刺激(比如，磁性的、特异小分子、化学制剂、或药物的给予等)来调控，这些外部刺激作用于上述多核苷酸的上游启动子，来诱导被编码蛋白产物的表达。比如本发明的这一有益的治疗效应可以由上述的外部刺激来明显地调控(如，增强、降低或抑制本发明的表达)。
本发明的多核苷酸可有助于抑制癌基因或抗原的表达。“抑制癌基因的表达”表示基因转录抑制，基因转录本(信使RNA的前体)的降解，拼接的抑制，信使RNA的破坏，翻译后蛋白修饰的抑制，蛋白的破坏，或蛋白正常功能的抑制。
对于异常增生细胞的局部用药，本发明多核苷酸可以通过本领域技术人员所了解的任一方法来给予，其中包括，但并不仅限于转染、电穿孔、细胞的微注射、或通过载体的方式，如脂质体、lipofectin，或作为裸露的多核苷酸，或本发明中所描述的其它任一方法。本发明的多核苷酸可以通过已知的基因递送系统来给于，比如，但并不仅限于反转录病毒载体(Glilboa，J.Virology 44845(1982)；Hocke，Nature320275(1986)；Wilson，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.853014)，痘病毒系统(Chakrabarty et al.，Mol.Cell Biol.53402(1985))或其它本领域中技术人员已知的有效的DNA递送系统(Yates et al.，Nature 313812(1985))。这些参考文献仅是举例，特此被收录为参考文献。为了专门地传输或转染那些异常增生细胞，并且不影响不分化细胞，优选利用本领域技术人员所了解的反转录病毒、或腺病毒(如本领域或本文其它地方所描述过的)传输系统。既然对于反转录病毒的整合来说，宿主DNA的复制是必需的，而且由于缺乏生命周期所必需的反转录基因，反转录病毒将不能自我复制。因此，利用这一反转录病毒传输系统来传输本发明的多核苷酸将定向上述的基因和构建体于异常增生细胞，而不影响不分化的正常细胞。
通过利用成象装置来指导注射针直接进入病变部位，本发明的多核苷酸可直接传输至内部器官、体腔和相似组织器官内细胞增生失调或病变部位。本发明的多核苷酸也可在手术过程中直接用于病变部位。
细胞增生性疾病是指任何影响一种或多种器官、体腔或身体部位的人类或动物的疾病或功能紊乱，这些疾病或功能紊乱以单一或多处细胞、细胞群体或组织的局部异常增殖为特征，无论这种增殖是良性的或恶性的。
无论多大量的本发明中的多核苷酸都可以应用，只要它对被治疗细胞的增生有生物学抑制效应。并且，一种以上的本发明的多核苷酸有可能同时应用于同一部位。
生物学抑制是指部分或全部的生长抑制，以及细胞增殖率或生长率的降低。通过评估本发明多核苷酸对组织培养中目标恶性或异常增生细胞的生长的抑制效应以及对动物和细胞培养中肿瘤生长的抑制效应，或通过本领域普通技术人员已知的任一其它方法，来确定生物抑制剂量。
本发明可进一步用于基于抗体基础上的治疗方法，其中包括抗多肽和抗多核苷酸抗体用药于哺乳动物患者，优选人类患者，来治疗一种或多种所描述过的疾病、功能紊乱和/或相关状况。生产抗多肽和抗多核苷酸的单克隆和多克隆抗体的方法在本文的其它地方有详细描述。这些抗体可以本领域已知的或本文所描述的药物组合物的方式来供给。
本发明中的抗体可以应用于治疗的方式包括在体内局部性或系统性地与本发明的多核苷酸或多肽结合，或通过抗体的直接细胞毒性，如补体介导(CDC)的或细胞效应因子介导(ADCC)的细胞毒性作用。某些方法将在下文详细描述。经过本文所提供的指导方法，本领域内普通技术人员将知道如何使用本发明的抗体来达到诊断、监控或治疗的目的，而无须过多的实验。
特别是，本发明的抗体、片段和衍生物有助于治疗患有本文所描述过的增生性和/或分化性疾病、失调和/或相关状况的患者。这种治疗方法包括给予单一剂量或多剂量的抗体或抗体的片段、衍生物或结合物。
本发明中的抗体可有利地与其它单克隆或嵌合性抗体、或淋巴因子或造血生长因子结合应用，例如，这些因子有助于增加可与抗体相互作用的效应细胞的数量或活性。
对于与本发明的多核苷酸或多肽以及它们的片段有关的疾病、功能紊乱和/或相关状况的免疫分析和治疗，较为优选的是利用本发明中多肽或多核苷酸的在体条件下具有高亲和性和/或高潜能性的抑制性和/或中和性抗体、以及它们的片段或区域。这些抗体、片段或区域对本发明中的多核苷酸或多肽，包括其片段，优选将具有亲和性。优选的结合亲和性包括离解常数或kd少于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M的那些抗体。更为优选的结合亲和性包括离解常数或kd少于5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M的那些。更加优选的结合亲和性包括离解常数或kd少于5×109M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，10-15M的那些。
并且，本发明的多肽单独地、作为蛋白融合物、或与其它多肽联合，象本文其它地方所描述的，直接或间接地有助于抑制增生细胞或组织的血管生成。在最为优选的方案中，上述抗血管生成效应可间接地取得，如，通过抑制造血的、肿瘤特异性细胞，如肿瘤相关性巨噬细胞(参照，Joseph IB，et al.J Natl Cancer Inst，90(21)1648-53(1998)，特此引为参考文献)。本发明的多肽或多核苷酸的抗体也可直接或间接地导致血管生成的抑制(参照，White L，et al.，Cancer Metastasis Rev.17(2)155-61(1998)，特此引为参考文献)。
本发明的多肽，包括G-蛋白融合物，或是其片段，通过诱导凋亡可有助于抑制增生细胞或组织。上述的多肽可直接或间接地诱导增生细胞或组织的凋亡，如激活死亡域受体，比如肿瘤坏死因子(TNF)受体-1，CD95(Fas/APO-1)，TNF受体相关性凋亡介导蛋白(TRMP)和TNF相关性凋亡诱导配体(TRAIL)受体1和2(参照，Schulze-Osthoff K，et al.，Eur J Biochem 254(3)439-59(1998)，特此引为参考文献)。并且，在本发明的另一优选的实施方案中，上述的多肽可通过其它机制来诱导凋亡，比如，单独地或与小分子药物或佐剂，如apoptonin、galetins、thioredoxins、抗炎蛋白，联合后激活其它可以激活凋亡的蛋白，或者刺激上述蛋白的表达(参照，如，Mutat Res 400(1-2)447-55(1998)，MedHypotheses.50(5)423-33(1998)，Chem Biol Interact.Apri24；111-11223-34(1998)，J Mol Med.76(6)402-12(1998)，Int JTissue React；20(1)3-15(1998)，特此全部引为参考文献)。
本发明的多肽，包括G-蛋白融合物，或其片段，有助于抑制增生细胞或组织的转移。抑制的发生可能是应用多肽或本文其它地方所描述的多肽的抗体的直接结果，或者是间接地，比如激活可抑制转移的蛋白的表达的结果，如α4整合素(参照，如，Curr Top Microbiol Immunol1998；231125-41，特此全部引为参考文献)。本发明的这种治疗效应可独立地、或是与其它小分子药物或佐剂联合后而取得。
在另一实施方案中，本发明提供了一种方法，此方法把包含本发明多肽的组合物(如，包含多肽或与异源多肽有关的抗体、异源核酸、毒素或药物前体)传输至表达本发明多肽的目标细胞中。本发明的多肽或多肽抗体可以通过疏水性、亲水性、离子的和/或共价的相互作用，与异种多肽、异种核酸、毒素或药物前体相结合。
本发明的多肽、多肽的蛋白融合物、或是其片段，可用于增强增生细胞或组织的免疫原性和/或抗原性，这可以采用直接的方式，例如，如果本发明的多肽引发针对增生性抗原和免疫原的免疫反应，那么此种增强效应就会产生；或者采用间接的方式，如，激活某些蛋白的表达，这些蛋白已知增强针对上述抗原和免疫原的免疫反应(如，趋化因子)。
心血管疾病。可以编码CCR5的CCR5多核苷酸或多肽、或者其激动剂或拮抗剂，有助于治疗、预防和/或诊断心血管疾病、功能紊乱和/或相关状况，其中包括外周动脉疾病，如肢体缺血。
心血管疾病、功能紊乱和/或相关状况包括心血管异常，如动脉-动脉瘘、动静脉瘘、脑动静脉畸形、先天性心脏缺陷、肺静脉闭锁和短弯刀综合征。先天性心脏缺陷包括主动脉缩窄、三房心、冠状血管异常、十字心、右位心、主动脉导管瘘、埃布斯坦异常、艾森门格尔复合征、左心发育不全综合征、左位心、法乐四联征、大血管错位、右心室双出口、三尖瓣闭锁、永存主动脉干，和心脏隔膜缺陷，如肺动脉隔缺损、新内膜垫缺损、鲁藤巴赫综合征、法乐三联征、心室间隔缺损。
心血管疾病、功能紊乱和/或相关状况也包括心脏病，如心率失常，心脏类癌病，高心输出量，低心输出量，充血性心衰，充血性心肌病，左心室肥大，右心室肥大，心脏梗塞后破裂，心室隔破裂，心脏瓣膜疾病，心肌病，心肌缺血，心包渗出，心包炎(包括狭窄性和结核性)，心包积气，心包切开术综合征，右心疾病，风湿性疾病，心室功能不全，冲血，妊娠心血管并发症，短弯刀综合征，心血管梅毒，和心血管结核。心率失常包括窦性心率失常，房颤，心房扑动，心动过缓，期外收缩，心原性脑缺氧，束支性传导阻滞，窦房阻滞，长OT间期综合征，平行收缩心，郎-甘-莱综合征，Mahaim型预激综合征，午非-帕金森-怀特综合征，病窦综合征，心动过速，和心室纤颤。心动过速包括阵发性心动过速，室上心动过速，心室自身节率加速，房室结折返性心动过速，心房异位性心动过速，异位房室接界性心动过速，窦房结折返性心动过速，窦性心动过速，尖端扭转型室性心动过速，和室心动过速。
心脏瓣膜疾病包括主动脉瓣膜缺损，主动脉瓣膜狭窄，心脏杂音，主动脉瓣膜脱垂，左房室瓣脱垂，三尖瓣脱垂，左房室瓣缺损，左房室瓣狭窄，肺静脉瓣膜闭锁不全，肺静脉瓣膜缺损，肺静脉瓣膜狭窄，右房室瓣闭锁不全，三尖瓣缺损，和三尖瓣狭窄。
心肌疾病包括酒精性心肌病，充血性心肌病，肥大性心肌病，主动脉瓣膜下狭窄，肺静脉瓣膜下狭窄，收缩性心肌病，恰加斯心肌病，心内膜纤维弹性组织增生，心内膜心肌纤维变性，Kearns综合征，心肌再灌注损伤，和心肌炎。
心肌缺血包括冠状疾病，如心绞痛，冠状动脉瘤，冠状动脉硬化，冠状血栓形成，冠状血管痉挛，心肌梗塞和心肌功能丧失。
心血管疾病也包括血管疾病，如动脉瘤，血管发育异常，多发性血管瘤，杆菌性血管瘤，希佩尔-林道病，克-特-韦综合征，斯特奇-韦伯综合征，血管神经性水肿，主动脉疾病，Takayasu’s动脉炎，外伤后骨质疏松，动脉阻塞性疾病，动脉炎，enarteritis，多发性动脉炎性结节病，心血管疾病、功能紊乱和/或相关状况，糖尿病性血管病，糖尿病性视网膜病，栓塞，血栓形成，红斑性肢痛病，痔，肝静脉阻塞性疾病，高血压，低血压，缺血，周围血管病，静脉炎，肺静脉阻塞性疾病，雷诺病，CREST综合征，视网膜静脉阻塞，短弯刀综合征，上静脉腔综合征，毛细血管扩张，运动失调性毛细血管扩张，遗传性出血性毛细血管扩张，精索静脉曲长，静脉曲长，静脉曲长性溃疡，脉管炎，和静脉闭锁不全。
动脉瘤包括壁间动脉瘤，假动脉瘤，感染性动脉瘤，破裂性动脉瘤，主动脉瘤，脑动脉瘤，冠状动脉瘤，心脏动脉瘤，和髂动脉瘤。
动脉阻塞性疾病包括动脉硬化，间歇性跛行，颈动脉狭窄，纤维肌发育不良，肠系膜血管阻塞，云雾病，肾动脉阻塞，视网膜动脉阻塞，和血栓闭塞性脉管炎。
脑血管疾病、功能紊乱和/或相关状况包括颈动脉疾病，脑淀粉样血管病，脑动脉瘤，脑缺氧，脑动脉硬化，脑动静脉畸形，脑动脉病，脑栓塞和血栓形成，颈动脉血栓形成，静脉窦血栓形成，瓦伦贝格综合征，脑出血，脑梗塞，脑缺血(包括短暂性)，锁骨下动脉盗血综合征，室周脑白质软化，血管性头痛，丛集性头痛，偏头痛，和基底动脉供血不足。
栓塞包括气体栓塞，羊水栓塞，胆固醇栓塞，蓝趾综合征，脂肪栓塞，肺栓塞，和血栓栓塞。血栓包括冠状血栓，肝静脉血栓，视网膜静脉阻塞，颈动脉血栓，静脉窦血栓，瓦伦贝格综合征，和血栓性静脉炎。
缺血包括脑缺血，性结肠炎，隔室综合征，动脉隔室综合征，心肌缺血，再灌注损伤，和肢体末端缺血。脉管炎包括主动脉炎，动脉炎，贝赫切特综合征，丘-施综合征，粘膜皮肤淋巴结节综合征，血栓闭塞性脉管炎，过敏性血管炎，舍恩莱因-亨诺赫紫癜，变态反应性皮肤脉管炎，和韦格纳肉芽肿病。
CCR5的多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，对急性肢体缺血和冠状疾病的治疗尤其有效。
CCR5的多肽可以用本领域中任一已知方法来给药，其中包括，但并不仅限于直接在传输部位的针刺注射，静脉内注射，局部用药，导管注入，生物轰击注射器，粒子加速器，可吸收明胶海绵储存库，其它商业可利用的储存材料，渗透泵，口服或固体栓剂性药物制剂，手术过程中注入或局部用药，气雾剂输入法。这些都是本领域中已知的方法。CCR5的多肽可作为治疗方案的一部分来应用，下文中将予以详述。CCR5的多核苷酸的输入方法在本文有较为详细的描述。
碳水化合物代谢失调的治疗。在具体的实施方案中，与这一基因相对应的多核苷酸和/或多肽，和/或这些多肽(包括抗体)的激动剂或拮抗剂以及多核苷酸、多肽、激动剂和拮抗剂的片段和变异体，可用来诊断、预后、治疗、预防或改善与糖代谢异常或细胞糖吸收异常有关的疾病或失调。
在一具体的实施方案中，与这一基因相对应的多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂和/或拮抗剂可用来诊断、预后、治疗、预防或改善I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病，IDDM)。
在另一实施方案中，相应于该基因的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂可用于诊断、预后、治疗、预防、和/或改善II型糖尿病(胰岛素抵抗性糖尿病)。
另外，在其它实施方案中，与这一基因相对应的多核苷酸和/或多肽，和/或其拮抗剂(尤其是中和性或拮抗性抗体)可用来诊断、预后、治疗、预防或改善与(I型或II型)糖尿病有关的状况，其中包括，但并不仅限于糖尿病性酮酸中毒，糖尿病性昏迷，非酮病性血糖过高性高渗透压性昏迷，癫痫发作，精神错乱，嗜睡，心血管疾病(如，心脏病，动脉粥样硬化，微血管疾病，高血压，中风，和其它在“心血管疾病”部分描述过的疾病或功能紊乱)，异常脂血症(dyslipidemia)，肾脏疾病(如，肾衰和肾病)，神经损害，神经病，视觉损害(如，糖尿病性视网膜病和眼盲)，溃疡和伤口经久不愈，感染(如，在“感染性疾病”部分所描述过的感染性疾病和功能紊乱，尤其是尿路和皮肤感染)，腕管综合征和杜普伊特伦孪缩。
在其它实施方案中，为了控制动物体重，将这一基因相对应的多核苷酸和/或多肽、和/或其激动剂或拮抗剂应用于动物，优选哺乳动物，而且最优选人类。在具体的实施方案中，通过调节胰岛素参与的生物化学途径，将这一基因相对应的多核苷酸和/或多肽、和/或其激动剂或拮抗剂应用于动物，优选哺乳动物，而且最优选人类来控制动物体重。在其它实施方案中，通过调节胰岛素样生长因子参与的生物化学途径，将这一基因相对应的多核苷酸和/或多肽、和/或其激动剂或拮抗剂应用于动物，优选哺乳动物，而且最优选人类来控制动物体重。
抗血管生成活性。内源性血管生成刺激剂和抑制剂之间存在的自然平衡中抑制效应占主导地位。Rastinejad等，Cell 56第345-355页(1989)。在正常生理状态下有新血管生成的那些罕见例子中，例如创伤愈合、器官再生、胚胎发育、和女性生殖过程，严格控制血管生成，而且在空间上和时间上受限。在病理性血管形成的情况下，例如特征性的实体瘤生长，这些调节控制将无效。无调节的血管生成将变为病理性的，并且维持肿瘤性和非肿瘤性疾病的进展。许多严重的疾病以不正常的新血管生成为主，包括实体瘤生长和转移，关节炎，一些眼病，功能紊乱，和/或相关情况，和银屑病。如，Moses等的评论，Biotech.9第630-634页(1991)；Folkman等，N.Engl.J.Med，333第1757-1763页(1995)；Auerbach等，J.Microvasc.Res.29第401-411页(1985)；Folkman，Advances in Cancer Research，eds。Klein和Weinhouse，AcademicPress，New York，第175-203页(1985)；Patz，Am.J.Opthalmol.94第715-743页(1982)；和Folkman等，Science 221第719-725页(1983)。在许多病理情况下，血管形成过程有助于疾病状态。例如，积累的重要数据显示实体瘤的生长依赖于血管生成。Folkman和Klagsbrun，Science235第442-447页(1987)。
本发明通过应用本发明的多核苷酸和/或多肽，以及其激动剂或拮抗剂，为血管生成有关的疾病，功能紊乱，和/或相关情况提供治疗方案。应用本发明的多核苷酸和多肽，或其激动剂或拮抗剂可治疗的恶性和转移性情况包括，但并不仅限于，恶性疾病，实体瘤，和本文描述的癌和本领域已知的其它疾病(关于这种紊乱的评论，见Fishman等，Medicine，2d Ed，J.B.Lippincott Co，Philadelphia(1985))。因此，本发明提供了一种治疗与血管生成有关疾病和/或功能紊乱的方法，包括给需要的个体应用有效治疗剂量的本发明的多核苷酸，多肽，拮抗剂和激动剂。例如，为了治疗或预防癌或肿瘤，在多种其它方法中也可应用多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂。用多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂可治疗的癌包括，但并不仅限于实体瘤，包括前列腺，肺，乳房，卵巢，胃，胰腺，喉部，食管，睾丸，肝，腮腺，胆道，结肠，直肠，宫颈，子宫，子宫内膜，肾，膀胱，甲状腺癌；原发肿瘤和转移性肿瘤；黑素瘤；成神经胶质细胞瘤；卡波西肉瘤；平滑肌肉瘤；非小细胞性肺癌；大肠直肠癌；发展的恶性疾病；和血源性肿瘤如白血病。例如，为了治疗或预防癌，如皮肤癌，头颈部肿瘤，乳腺肿瘤，和卡波西肉瘤，可局部使用多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂。
在其它方面，多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂可用来治疗、预防、和/或诊断表面型式膀胱癌，例如，通过膀胱内注射。通过注射或导管可将多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂直接注入肿瘤，或肿瘤附近的部位。当然，普通技术人员理解，依据被治疗的癌不同，合适的给药方式将有所变化。其它给药途径也在本文已讨论过。
多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂可用于治疗除癌以外的其它与血管生成有关的疾病，功能紊乱，和/或相关情况。这些疾病，功能紊乱，和/或情况包括，但不仅限于良性肿瘤，例如血管瘤，听神经瘤，纤维神经瘤，沙眼，和脓性肉芽肿；动脉粥样硬化斑块；眼血管生成性疾病，例如，糖尿病视网膜病变，儿童视网膜病，黄斑变性，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生症，虹膜潮红，视网膜母细胞瘤，眼睛的葡萄膜炎和翼状胬肉(异常血管生长)，类风湿性关节炎；银屑病；创伤延迟愈合；子宫内膜移位症；血管再生；肉芽；肥大性疤痕(瘢痕疙瘩)；骨不连合性骨折；硬皮病；沙眼；血管粘附；心肌血管生成；冠状旁支；脑旁支；动静脉畸形；缺血性肢体血管生成；Osler-Webber综合证；斑状新生血管；毛细血管扩张；血友病关节；血管纤维瘤；纤维肌性发育不良；创伤性斑块；局限性回肠炎；和脂肪沉淀性动脉硬化症。
例如，本发明的一个方面是为肥大性疤痕和瘢痕疙瘩提供治疗方法，包括将本发明的多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂施用给肥大性疤痕或瘢痕疙瘩的步骤。
在本发明的一种实施方案中，将多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂直接注射到肥大性疤痕或瘢痕疙瘩中，来阻止这些损伤的发展。这种治疗方法对预防性治疗已知导致形成由肥大性疤痕或瘢痕疙瘩的情况(例如，烧伤)具有特殊价值，优选在增生期发展(大约在最初损伤后14天)后启动，但在肥大性疤痕或瘢痕疙瘩发展之前。正如上文所说的，本发明也为眼睛的新血管生成性疾病提供治疗方法，其中包括，如，角膜新血管生成，新生血管性青光眼，增殖性糖尿病性视网膜病变，晶状体后纤维组织形成和黄斑变性。
而且，可用本发明中的多核苷酸和多肽(包括激动剂和/或拮抗剂)来治疗的与新血管生成有关的眼病，功能紊乱，和/或相关情况，包括，但并不仅限于新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，视网膜母细胞瘤，晶状体后纤维组织形成，葡萄膜炎，过早黄斑变性性视网膜病变，角膜移植性新血管生成，以及其它的眼睛炎性疾病，与脉络膜或虹膜相关的眼瘤和疾病。见，例如，Waltman等的评论，Am.J.Ophthal.85第704-710页(1978)和Gartner等的评论，Surv.Ophthal.22第291-312页(1978)。
因此，本发明的一方面是为治疗眼睛的新生血管性疾病提供治疗方法，例如角膜新血管生成(包括角膜移植性新血管生成)，包括将有效治疗剂量的化合物(上文所述)应用到患者的角膜以阻止血管生成的步骤。简言之，正常情况下角膜是无血管的一种组织。然而在某些病理情况下，冠檐角膜外周血管丛的毛细血管会延伸到角膜。当角膜有血管生成后，就会变暗，导致患者的视觉敏感性下降。如果角膜完全不透明，视觉就会完全丧失。各种各样的疾病，功能紊乱，和/或情况都有可能引起角膜新血管生成，其中包括，如，角膜感染(例如，沙眼，单纯疱疹性角膜炎，利什曼病和盘尾丝虫病)，免疫性病变(例如，移植排斥和史蒂文斯-约韩逊综合征)，碱烧伤，外伤，炎症(任何原因的)，中毒和营养缺乏性状态，以及戴隐性眼镜的并发症。
在本发明特别优选的实施方案中，以盐的制剂局部给药(与眼制剂常用的任何保存剂和抗菌剂结合)和眼药水的方式给药。溶液或悬浮液以纯的形式制备并一日多次给药。或者，用以上所描述的方法制备的抗血管生成组合物也可直接应用到角膜。在优选的实施方案中，抗血管生成组合物与可结合角膜的粘膜粘附聚合体一起制备。在进一步的实施方案中，抗血管生成因子或抗血管生成组合物可作为常规类固醇治疗的辅剂。局部治疗有助于预防高概率地诱发血管生成反应的角膜损伤(例如化学性烧伤)。在这些例子中，可能与类固醇联合应用的治疗方法，可立即实施以有助于阻止并发症。
在其它实施方案中，上述的化合物可在显微指导下由眼科医师直接注射到角膜基质。优选的注射部位随个体损伤部位的形态的不同而变化，但是注射的目标是将组合物放在脉管系统的最前方(即，血管与正常角膜之间的间隙)。在大多数病例中，这也包括边缘角膜注射以阻止角膜进一步的血管生成。这种方法也在角膜受刺激后立即使用，以预防性的阻止角膜新血管生成。在这种情况下，将组合物注射在损伤角膜和其不需要的潜在边缘血液供应区之间的边缘角膜间隙中。这种方法也可以相似的方式用来阻止移植角膜的毛细血管侵入。以持续释放的形式，每年仅仅需要注射2-3次。类固醇也可加入到注射液中以降低注射本身引起的炎症。
本发明的另一方面，为新生血管性青光眼提供治疗方法，包括给患者眼睛注入有效治疗剂量的多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂这一步骤，以阻止血管形成。在一种实施方案中，将化合物局部注入眼睛以治疗或阻止新生血管性青光眼的早期形式。在其它实施方案中，化合物可注射在前房角区域。在其它实施方案中，化合物可置放在任何部位，以便化合物可持续释放到房水中。本发明的另一方面，为增殖性糖尿病视网膜病变提供治疗方法，包括给患者眼睛注入有效治疗剂量的多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂这一步骤，以阻止血管形成。
在本发明的特别优选的实施方案中，为了提高多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂在视网膜中的局部浓度，组合物可注射到房水或玻璃体中来治疗增殖性糖尿病视网膜病变。优选地，这种治疗应在需要光凝固术的严重疾病形成之前开始使用。
本发明的另一方面，为晶状体后纤维增生症提供治疗方法，包括给患者眼睛注入有效治疗剂量的多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂这一步骤，以阻止血管形成。可以通过玻璃体内注射和/或眼内植入来局部给予化合物。
另外，能用多核苷酸，多肽，拮抗剂和/或激动剂治疗的疾病，功能紊乱，和/或病症包括，但并不仅限于，血管瘤，关节炎，银屑病，纤维血管瘤，动脉粥样硬化斑块，延迟性创伤愈合，肉芽，血友病性关节，肥大性疤痕，骨不连合性骨折，Osler-Webber综合征，脓性肉芽肿，硬皮病，沙眼，和血管粘附。
而且，能用多核苷酸，多肽，激动剂和/或拮抗剂治疗的疾病，功能紊乱，和/或病症和/或状态包括，但并不仅限于，实体瘤，血源性肿瘤如白血病，肿瘤转移，卡波斯肉瘤，良性肿瘤，例如血管瘤，听神经瘤，纤维神经瘤，沙眼，和脓性肉芽肿，类风湿性关节炎；银屑病，眼血管生成性疾病，例如糖尿病视网膜病变，早熟性视网膜病变，黄斑变性，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生症，潮红，视网膜母细胞瘤，和葡萄膜炎，延迟性创伤愈合，子宫内膜移位症，血管再生，肉芽，肥大性疤痕(瘢痕疙瘩)，骨不连合性骨折，硬皮病，沙眼，血管粘附，心肌血管生成，冠状旁支，脑旁支，动静脉畸形；缺血性肢体血管生成；Osler-Webber综合征，斑状新生血管，毛细血管扩张，血友病关节，血管纤维瘤，纤维肌性发育不良，创伤肉芽，局部回肠炎，和脂肪沉淀性动脉硬化症，通过阻止胚胎植入时所需的血管生成来控制月经的生育控制剂，病理原因引起的血管生成性疾病，例如猫抓病(Rochele minalia quintosa)，溃疡(幽门螺杆菌(Helicobacterpylori))，巴尔通氏体病和杆菌血管瘤病。
在这种生育控制方法的一方面中，可以在性交和受精发生之前或之后给予大量的足够阻断胚胎植入的组合物，从而为生育控制提供了一种有效的方法，这可能是一种“宿醉”方法。多核苷酸，多肽，激动剂和/或拮抗剂也可用来控制月经，或作为一种腹腔灌洗液或腹膜植入物用来治疗子宫内膜移位症。
本发明的多核苷酸，多肽，激动剂和/或拮抗剂可结合到外科缝线中以阻止针孔肉芽肿。
多核苷酸，多肽，激动剂和/或拮抗剂可应用到多种外科操作中。例如，在本发明的一方面中，在肿瘤去除之前，为了将周围正常组织与恶性组织分离，和/或阻止疾病扩散到周围组织，可以将组合物(例如，以喷雾或薄膜的形式)覆盖或喷在某个区域。在本发明的其它方面，通过内窥镜给予组合物(例如，以喷雾形式)，以便覆盖肿瘤，或抑制病变部位的血管生成。在本发明的再其它方面，用本发明抗-血管生成组合物覆盖的手术网丝，可用在任何可能应用手术网丝的操作中。例如，在本发明的一种实施方案中，为了给结构提供支持和释放大量的抗血管生成因子，载有抗-血管生成组合物的手术网丝可应用在腹部癌切除术中(例如，大肠切除术后)。
在本发明的其它方面，提供了治疗肿瘤切除部位的方法，包括在切除后将多核苷酸，多肽，激动剂和/或拮抗剂应用到肿瘤的切除边缘这一步骤，从而阻止癌的局部复发和此部位新血管的形成。在本发明的一种实施方案中，抗-血管生成组合物可以直接应用到肿瘤切除部位(例如，用抗-血管生成化合物拭抹，刷拭或覆盖肿瘤切除部位的边缘)。或者，在应用之前可将抗-血管生成化合物掺合到已知的手术糊中。在本发明特殊优选的实施方案中，抗-血管生成化合物可用于肝脏恶性肿瘤切除后，和神经外科手术后。
在本发明的一种方面，多核苷酸，多肽，激动剂和/或拮抗剂可应用在多种肿瘤切除后的边缘，其中包括，例如，乳腺，结肠，脑和肝脏的肿瘤。例如，在本发明的一种实施方案中，抗-血管生成组合物可应用到神经性肿瘤切除后的部位，从而阻止该部位的新血管生成。
本发明的多核苷酸，多肽，激动剂和/或拮抗剂也可与其它抗-血管生成因子一起给药。其它抗-血管生成因子的代表性实例包括抗-侵入性因子，视黄酸及其衍生物，紫杉醇，苏拉明，金属蛋白酶-1的组织抑制物，金属蛋白酶-2的组织抑制物，纤溶酶原激活物抑制剂-1，纤溶酶原激活物抑制剂-2，和多种形式的轻型“d族(dgroup)”过渡金属。
轻型“d族”过游戏金属包括，例如，钒，钼，钨，钛，铌，和钽类。这些过渡金属类可形成过渡金属复合体。以上提及的过渡金属类的适宜复合体包括氧络过渡金属复合体。
钒复合体的代表性实例包括氧络钒复合体，如钒酸盐和氧钒基复合体。合适的钒酸盐复合体包括偏钒酸盐和正钒酸盐复合体，如，偏钒酸铵，偏钒酸钠，和正钒酸钠。合适的氧钒基复合体包括，例如，乙酰丙酮氧钒和硫酸氧钒，包括硫酸氧钒水合物，如硫酸氧钒单和三水合物。
钨和钼复合物的代表性实例包括氧络复合体。合适的氧络钨复合体包括钨酸盐和氧化钨复合物。合适的钨酸盐复合体包括钨酸铵，钨酸钙，钨酸钠二水合物，和钨酸。合适的氧化钨包括四价和六价钨的氧化物。合适的氧络钼复合体包括钼酸盐，氧化钼，和氧钼基复合物。合适的钼酸盐复合物包括钼酸铵和它的水合物，钼酸钠和它的水化物，和钼酸钾和它的水合物。合适的氧化钼包括六价钼氧化物和钼酸。合适的氧钼基复合物包括，例如，氧钼基乙酰丙酮化物。其它合适的钼和钨复合物包括羟衍生物，例如从甘油，酒石酸，和糖衍生而来。
在本发明的上下文中，也可应用多种其它的抗血管生成因子。代表性的实例包括血小板因子-4；硫酸鱼精蛋白；硫酸几丁质衍生物(从雪花蟹壳制备而来)，(Murata等，Cancer Res.51第22-26页，1991)；硫酸多糖肽聚糖复合物(SP-PG)(类固醇如雌激素，和三苯氧胺柠檬酸盐可加强该化合物的功能)；星形孢菌素；基质代谢(matrix metabolism)的调节物，其中包括，例如，脯氨酸类似物，顺羟基脯氨酸，d，L-3，4-脱氢脯氨酸，噻脯氨酸(Thiaprdine)，α，α-二吡啶基，氨基丙腈反丁烯二酸盐；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-噁唑酮；氨甲蝶呤；米托蒽醌；肝素；干扰素；血清α2-巨球蛋白，ChIMP-3(Pavloff等，J.Bio.Chem.267第17321-17326页，1992)；抑糜蛋白酶素(Tomkinson等，Biochem J.286第475-480页，1992)；环糊精十四烷硫酸盐(tetradecasulfate)；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素(Ingber等，Nature 348；第555-557页，1990)；硫代苹果酸金钠(“GST”，Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.79第1440-1446页，1987)；血清抗胶原酶；α2-抗纤溶酶(Holmes等，J.Biol.Chem.262(4)第1659-1664页，1987)；比生群(National Cancer Institute)；氯苯扎利二钠(N-(2)-羧苯基-4-氯邻氨基苯甲酸二钠或“CCA”，Takeuchi等，Agents Actions 36第312-316页，1992)；反应停；Angostatic steroid；AGM-1470；carboxynaminolmidazole；和金属蛋白酶抑制剂如BB94。结合活性G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可用来筛选能与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的分子或G蛋白趋化因子受体(CCR5)与之结合的分子，G蛋白趋化因子受体(CCR5)与此分子的结合可以激活(激动剂)、增加、抑制(拮抗剂)或降低G蛋白趋化因子受体(CCR5)或其所结合分子的活性。这些分子包括例如抗体、寡核苷酸、蛋白质(如受体)或小分子。
优选的分子与G蛋白趋化因子受体(CCR5)的天然配基密切相关，例如配体的片段、天然底物、配体、结构或功能模拟物(见，Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)Chapter 5，(1991))。同样，这些分子可能和能与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的天然受体密切相关，或至少与能被G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的受体片段(活性位点)密切相关。在这些情况下，可用现有的技术合理地设计出这些分子。
优选地，筛选这些分子的过程包括制备合适的能表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞，G蛋白趋化因子受体(CCR5)作为分泌蛋白或位于细胞膜上。优选的细胞包括来源于哺乳动物、酵母、果蝇或大肠杆菌的细胞。然后优选将表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)(或含有表达多肽的细胞膜)的细胞与潜在包含这些分子的测试化合物接触以观察对G蛋白趋化因子受体(CCR5)或这些分子的结合、刺激或活性抑制。
鉴定实验可以方便地检测侯选化合物与G蛋白趋化因子受体(CCR5)的结合，其中结合可通过标记进行检测，或在涉及与标记竞争剂竞争的鉴定实验中进行检测。而且，鉴定可检测侯选化合物与G蛋白趋化因子受体(CCR5)的结合是否产生信号。
作为另一种选择，鉴定实验可以用无细胞制剂、附着在固体支持物上的多肽/分子、化学文库、或天然产物的混合物来进行。鉴定的简要过程包括将侯选化合物与含G蛋白趋化因子受体(CCR5)的溶液混合，测定G蛋白趋化因子受体/分子的活性或结合，并将其与标准G蛋白趋化因子受体/分子的活性或结合作比较。
优选地，酶连免疫吸附测定(ELISA)可用单克隆或多克隆抗体测定样本(如生物样本)中G蛋白趋化因子受体(CCR5)的水平或活性。抗体可通过直接或间接与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合或与G蛋白趋化因子受体(CCR5)竞争底物来测定G蛋白趋化因子受体(CCR5)的水平或活性。
另外，G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的配体可以用本领域技术人员已知的众多方法加以鉴定，例如配体淘选及FACS分拣(荧光激活细胞分类术)(Coligan等，Currect Protocols in Immun.，1(2)，Chapter5，(1991))。例如，可以利用表达克隆，其中聚腺苷酸化RNA是从对多肽敏感的细胞制备的，这类细胞例如已知包含FGF家族蛋白的多个受体的NIH3T3细胞以及SC-3细胞，将以此RNA制备的cDNA文库分池，并用以转染COS细胞或其它对多肽不敏感的细胞。转染细胞在载玻片上培养并与经过标记的本发明的多肽接触。多肽可通过多种方法标记，包括碘化作用或将位点特异性蛋白激酶的识别位点包括在内。
进行固定和孵育后，对载玻片进行放射自显影分析。鉴定出阳性池，经反复亚分池和亚筛选的过程制备亚池并重复转染，最终得到一个编码推测受体的单克隆。
作为鉴定受体的另一种方法是，标记多肽可与细胞膜或表达受体分子的提取液进行光亲和连接。交联物用PAGE分析法分离，并于X光片上曝光。含多肽受体的标记复合物可被切割、解离为肽片段，并进行蛋白质微量测序。用微量测序法获得的氨基酸序列设计一套简并寡核苷酸探针筛选cDNA文库以鉴定编码推定受体的基因。
此外，基因改组、基序改组、外显子改组、和/或密码子改组(统称为DNA改组)技术可用来调节G蛋白趋化因子受体(CCR5)的活性，从而有效的产生G蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂和拮抗剂。(一般见，U.S.Patent，Nos.5605793，5811238，5830721，5834252及5837458和Patent，P.A.，等Curr.Opinion Biotechnol.8724-33(1997)；Harayama，S.Trend Biotechnol.16(2)76-82(1998)；Hansson，L.O.，等J.Mol.Biol.287265-76，(1999)；及Lorenze，M.M.和Blasco，R.Biotechniques 24(2)308-13(1998)(每项专利和出版物均被收入参考文献)。在一个实施方案中，用DNA改组技术改造G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸及其相应多肽。DNA改组涉及用同源重组或位点特异性重组将两个或更多DNA片段组装到目标G蛋白趋化因子受体(CCR5)分子中。在另一实施方案中，通过易错PCR反应、随机核苷酸插入或其它已知的重组技术产生的随机诱变使G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸及其相应的多肽发生改变。在另一实施方案中，G蛋白趋化因子受体(CCR5)的一个或多个成分、基序、区域、部分、结构域、片段等可以和一个或多个异源分子的一个或多个成分、基序、区域、部分、结构域、片段等重组。在优选实施方案中，异源分子为G蛋白趋化因子受体(CCR5)家族成员。在更优选的实施方案中，异源分子是生长因子，例如，血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、转化生长因子α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、TGF-β、骨形态建成蛋白(BMP)-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、活化素A和B、decapentaplegic(dpp)、60A、OP-2、dorsalin、生长分化因子(GDFs)、nodal、MIS、干扰素α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5和神经胶质衍生神经营养因子(GDNF)。
其它优选片段是具有生物活性的G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段。生物活性片段是那些活性表现与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽相似但不一定一致的片段。片段的生物活性包括提高目标活性或降低非目标的活性。
另外，本发明还提供了筛选用以鉴定调节本发明多肽的作用的化合物的方法。这类鉴定例子是在成纤维细胞能正常增殖的细胞培养条件下，对哺乳动物成纤维细胞、本发明多肽、待筛选化合物及3H-胸苷进行混合。对照鉴定在不含筛选化合物条件下进行，通过测定两种情况下3[H]胸苷的吸收来比较化合物存在时成纤维细胞增殖数量，从而确定化合物是否刺激增殖。成纤维细胞增殖的数量可用液体闪烁层析法测量，这种层析方法测定的是3[H]胸苷的掺入。激动剂和拮抗剂化合物都可用这种方法鉴定。
在另一种方法中，将表达本发明多肽受体的哺乳动物细胞或细胞膜制剂与经标记的本发明多肽在含有化合物的条件下一起进行培养。这样可以测定化合物加强或阻碍这种互作的能力。或者，被筛选化合物与G蛋白趋化因子受体(CCR5)互作后，可对已知的第二信使系统的反应进行测定，就可测定化合物结合受体及诱发第二信使反应的能力，从而确定化合物是否是潜在的激活剂或拮抗剂。这样的第二信使系统包括但不仅限于cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道、磷酸肌醇水解作用。
所有以上分析试验都可用来作为诊断或预后标记。用这些分析试验发现的分子可用来治疗、防治和/或诊断疾病或通过激活或抑制多肽/分子给病人(如血管生长)带来特殊效果。而且，这些分析试验可还从适于操作的细胞或组织中发现能抑制或增进本发明多肽生产的制剂。因此，本发明包括鉴定与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的化合物的方法，其包括步骤(a)温育与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的侯选复合物，(b)检测是否发生结合。此外，本发明还包括鉴定激动剂/拮抗剂的方法，其步骤包括(a)与G蛋白趋化因子受体(CCR5)一起温育化合物，(b)鉴定生物活性并检测G蛋白趋化因子受体(CCR5)的生物活性是否发生改变。
也可以用图3和表1中列出的β-折叠区域鉴定结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的分子。因此，本发明的具体实施方案涉及编码多肽的多核苷酸，这种多肽含有或由图3/表1中列出的每个β-折叠区域的氨基酸序列组成。本发明另一实施方案是编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的多核苷酸，这种多肽包括或由图3和表1中列出的β-折叠区域任意组合或全部构成。本发明另外优选实施方案是多肽，此多肽包含或由图3/表1中所列出的每一个β-折叠区域的G蛋白趋化因子受体(CCR5)氨基酸序列组成。本发明另外优选实施方案是G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽，此多肽包括或由图3和表1中列出的β-折叠区域的任意组合或全部构成。定向递送在另一实施方案中，本发明提供了将组合物传送到表达本发明多肽受体的目标细胞或表达本发明细胞结合态多肽的细胞中的方法。
正如在此所讨论的，本发明的多肽或抗体通过疏水相互作用、亲水相互作用、离子相互作用、和/或共价相互作用与异源多肽、异源核酸、毒素或前体药物相连。在一实施方案中，本发明提供了通过施用本发明与异源多肽或核酸相连的多肽(包括受体)将本发明的组合物特异传送到细胞中的方法。在一个实施例中，本发明提供了将治疗蛋白传送到目标细胞中的方法。在另一个实施例中，本发明将单链核酸(例如，反义的或核酶)或双链核酸(例如，能整合到细胞基因组中或能进行游离复制的及能转录的DNA)传送到目的细胞中。
在另一实施方案中，本发明提供了通过施用本发明与毒素或细胞毒素前体药物相连的多肽(例如，本发明多肽或本发明抗体)而特异破坏细胞(如破坏肿瘤细胞)的方法。
“毒素”是指结合并激活内源细胞毒素效应系统的化合物、放射性同位素、全毒素、修饰毒素、毒素的催化亚基或任何在细胞内或细胞表面正常不存在，在一定的条件下会导致细胞死亡的分子或酶。根据本发明的方法，可用的毒素包括但不限于本领域已知的放射性同位素、化合物如结合天然或诱导产生的内源细胞毒素效应系统的抗体(或固定含有其蛋白的补体)、胸腺嘧啶核苷激酶、内切核酸酶、RNA酶、α-毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、皂草素、木鳖子皂苷、gelonin、美州商陆抗病毒蛋白、α-八叠球菌以及霍乱毒素。“细胞毒性前体药物”是指在细胞内正常存在的非毒性化合物，它们可由酶转化为细胞毒性化合物。据本发明的方法，可用的细胞毒性前体药物包括但不限于苯甲酸芥子烷化剂的谷氨酰衍生物、吡喃葡萄糖苷或丝裂霉素C的磷酸衍生物、胞嘧啶阿拉伯糖苷、逆诺红菌素、阿霉素的苯氧乙酰胺衍生物。药物筛选下一步设想是利用本发明多肽或编码这些多肽的多核苷酸来筛选改变本发明多肽活性的分子。这种方法包括将本发明多肽与可能具有激动剂或拮抗剂活性的选择化合物混合，然后检测结合后这些多肽的活性。
在众多的药物筛选技术中，本发明尤其适用于以本发明的多肽或其结合片段筛选治疗化合物。测试中所用到的多肽或片段可附着在固体支持物上、在细胞表面表达、游离在溶液中或位于细胞内。药物筛选的一种方法是利用真核生物或原核生物宿主细胞，这些细胞可稳定转化表达多肽或片段的重组核酸。在竞争性结合实验中对这些转化细胞进行药物筛选。可以测定，例如，被检测试剂与本发明多肽间复合物的组成。
因此，本发明提供了许多筛选药物或任何其它试剂的方法，这些试剂对受本发明多肽调节的活性产生影响。这些方法包括将这类试剂与本发明的多肽或其片段混合，然后利用本领域熟知的方法鉴定试剂与多肽或其片段之间复合物的存在。在这类竞争性结合鉴定实验中，典型地对待筛选的试剂作标记。进行培养后，将游离试剂从结合态分开，以游离或非复合标记的量作为衡量特殊试剂与本发明多肽结合能力的尺度。
另一种药物筛选技术提供了高通量筛选与本发明多肽有适宜结合亲和力的化合物的方法，在欧洲专利申请84/03564中对此进行了详细描述，此申于请1984年9月13日出版，在此收录于参考文献中。简要地说，大量不同小肽检测化合物是在诸如塑料物或其它表面之类的固体基质上合成的。肽检测化合物与本发明的多肽相互作用后被冲洗。用本领域熟知的方法检测已结合的多肽。纯化的多肽直接在平板上进行包覆以用于上述药物筛选技术中。此外，非中性抗体可以用来捕获肽并将其固定在固体支持物上。
本发明也考虑到竞争性药物筛选试验的应用，在这些试验中，能与本发明多肽结合的中和抗体与检测化合物在结合多肽或其片段方面产生特异竞争。通过这种方式，抗体被用来检测与任何本发明多肽共享一个或多个抗原表位的肽的存在。
因此，多肽可用于鉴别调节受体活性的化合物。受体蛋白、合适的变体及片段均可用于高通量筛选以鉴定能与受体结合的侯选化合物。对这些化合物可进一步进行功能受体筛选，以确定化合物对受体活性的影响。可鉴别到激活(激活剂)或抑制(拮抗剂)受体到既定程度的化合物。
术语“激活剂”和“拮抗剂”表示增强或减弱反应的化合物。作为激活剂的一种形式，这种化合物结合到内源化合物同一结合位点，并产生与内源试剂相等或更强的同类信号。另一类激活剂结合到与第一类激活剂不同的部位，自身并不产生信号，然而，当内源试剂也结合到其位点上时能产生增强的信号。这被称为变构作用。一类拮抗剂结合到内源试剂的结合位点上，削弱或阻碍内源试剂产生的信号。另一类拮抗剂与第二类激活剂相似，它结合到变构位点，但导致由内源试剂产生的信号减弱。第三类拮抗剂镶嵌在膜内或跨膜，并且在膜内或细胞内侧截断内源试剂产生的信号。因此，拮抗剂包含负激活剂或“反向激活剂”，它具有负向的内在活性，与无反向激活剂时检测到的信号活性相比，这种活性减弱了受体信号活性。这种拮抗剂与无内在活性并对受体的基础活性无影响的拮抗剂不同。因此，例如，反向激活剂能改变受体形态，从而减少或消除与配基的相互作用。(见，Milligan等，TIPS1610(1995)。
受体多肽可用于筛选能刺激或抑制受体蛋白与目标分子间相互作用的化合物，此化合物与受体蛋白存在正常相互作用。目标分子可以是配体或与受体蛋白正常互作的信号途径的成分(例如，G蛋白或其他互作因子，包括cAMP或者磷脂酰肌醇转换和/或腺苷酸环化酶，或磷脂酶C激活)。试验包括以下步骤在允许受体蛋白或其片段与目标分子互作的条件下，使受体蛋白与候选化合物结合，并检测蛋白与目标分子间复合体的形成或检测受体蛋白与目标分子互作产生的生化效应，例如，任何与信号转导有关的效应，如离子流、G蛋白磷酸化、环AMP或磷脂酰肌醇转换及腺苷酸环化酶或磷脂酶C激活。
当在细胞内过度表达时，受体多肽在细胞实验中非常有用。因而，这些过度表达受体的细胞可用于鉴别能调节或抵消这种过度表达的化合物。过度表达受体的细胞可源于天然途径或用常规重组方法得到。
当在细胞上被组成型激活时，受体多肽可用于在细胞试验中筛选化合物。这种表达组成型激活受体的细胞可用于筛选调节受体活性的化合物。这样的细胞可源于天然途径或用本领域熟知的重组途径得到。例如，见Scheer等，J.Receptor Signal Transduction Res.1757~73，(1997)；美国专利号5750353。
候选化合物包括，例如，(1)肽如可溶性肽，包括带Ig尾的融合肽和随机肽文库中的肽(见，例如Lam等，Nature 35482-84(1991)；Houghten等，Nature 35484-86(1991))以及由D-和/或L-型氨基酸组成的组合化学衍生分子文库；(2)磷酸肽(例如，随机和部分简并、定向的磷酸肽文库，见，例如，Songyang等，Cell 72767-778(1993))；(3)抗体(例如，多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合型，体内的及单链抗体，以及Fab、F(ab)2、Fab表达文库片段，及抗体表位结合片段)；(4)有机或无机小分子(例如，来源于重组或天然产物文库中的分子)。
一种候选化合物是竞争配基结合的可溶性全长受体或片段。其它候选化合物包括突变体受体或包含突变的合适片段，这种突变影响受体功能并因此而竞争配基。因此，本发明包含了例如以高亲合性竞争配体的片段，或结合但不释放配体的片段。
本发明提供了其它终点(end points)以鉴别调节(刺激或抑制)受体活性的化合物。试验主要包括对指示受体活性的信号转导事件进行分析。因此，可以鉴定响应受体蛋白依赖的信号级联而上调或下调的基因表达。在一个实施方案中，这种基因的调节区能可操作地连接一个易检测的标记，如萤光素酶。或者，也可检测受体蛋白的磷酸化或受体蛋白靶标分子。
可以理解，蛋白质水平异常或突变造成的紊乱可被用来作为终点的基础。因此，对化合物作用于受体起反应的发育中的特异偏差或紊乱过程可用作为终点。
任何由受体调节的生物或生化功能都可用做终点试验。这包括在此或本文为这些终点试验目标所引用的参考文献中所描述过的所有生化或生化/生物事件，及本领域普通技术人员所知的其它功能。
利用嵌合受体蛋白也可筛选结合和/或激活化合物，嵌合蛋白的N端胞外结构域或其部分、全部跨膜结构域或亚区，例如7个跨膜片段的任一个或任一细胞内环或胞外环、以及C端胞内结构域或其部分可由异源结构域或亚区代替。例如，可使用这样的G-蛋白结合区域，其与不被天然受体识别的不同G-蛋白互作。因此，可获得一套不同的信号转导组分作为活化的终点试验。或者，全部跨膜蛋白或亚区(例如，跨膜片段或胞内环或胞外环)可用寄主细胞特异的完整跨膜区域或亚区替换，这种寄主细胞不同于N端胞外结构域和/或G-蛋白结合域起源的寄主细胞。这就允许可以在特异寄主细胞外的其它受体起源的细胞内进行试验。或者，N端胞外域(和/或其它配基结合区域)可用结合不同配基的结构域(和/或其它配基结合区域)替换，因此提供了一个试验以检测与异源N端胞外结构域(或区域)互作但仍然产生信号转导的化合物。最后，可用一个包含易检测、并可操作与转录调节序列相连的编码区的报道基因来检测活化，此调节序列是天然信号转导途径的一部分。
受体多肽在设计方法来揭示与受体相互作用的化合物的竞争性结合试验上也是有用的。因此，在化合物可与多肽结合或互作的条件下，将化合物与受体蛋白混合。可溶性受体多肽也被加入到混合物中。如果检测的化合物与可溶性受体多肽产生互作，它就会减少所形成化合物的数量或降低受体目标分子的活性。这类试验在寻找与受体的特异区域互作的化合物时特别有用。因此，可设计与目标受体区域竞争的可溶性多肽以包含对应目标区域的肽序列。
为了进行无细胞药物筛选试验，需要固定受体蛋白或片段或其目标分子，从而简化从一种或两种蛋白的非复合态分离复合物，以及适应试验的自动化。
在基质上固定G-蛋白的技术可用于药物筛选试验。在一个实施方案中，可提供增加使蛋白质结合在胞基质上的结构域的融合蛋白。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/G-蛋白趋化因子受体(CCR5)融合蛋白可被吸附在谷胱甘肽琼脂糖球状颗粒上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化微量滴定板上，然后与溶胞产物(例如，35S-标记)及候选化合物结合，混合物在能有利于复合物形成的条件下(例如，在生理盐浓度及生理PH值条件下)温育。温育后，冲洗球状颗粒以除去未结合的标记，直接测定固定的基质和放射性标记，或在复合物解体后的上清液中测定。或者，复合物可从基质中解离下来，用SDS-PAGE分离，用标准电泳技术从凝胶定量出现在球状颗粒中的受体结合蛋白的水平。例如，利用本领域熟知的生物素和链霉抗生物素缀合可固定多肽或其目标分子。或者，与蛋白发生反应并不干涉蛋白与其目标分子的结合的抗体衍生化到板孔中，蛋白因与抗体连接而被捕获于孔中。结合受体的蛋白制剂和候选化合物在受体蛋白出现的加样孔中培养，加样孔中复合物的数量可以用测定。检测这些复合物的方法，除了以上描述的用于GST固定复合物的外，包括应用与受体蛋白目标分子反应或与受体蛋白反应且与目标分子竞争的抗体进行，复合物免疫检测，以及依靠检测与目标分子有关的酶活性的酶联测定。
根据以上药物筛选试验鉴定出的受体蛋白活性调节物，可用来治疗患有受体途径介导的疾病的对象。这种治疗通过处理表达受体蛋白的细胞。这些治疗方法包括对需要治疗的对象施用以上所述的药物组合物中蛋白活性的调节物。反义和核酶(拮抗剂)在具体实施方案中，本发明的拮抗剂是核酸，这些核酸与SEQ ID NO1或其互补链和/或保藏克隆97183中包含的核苷酸序列相对应。在一个实施方案中，反义序列由有机体在体内产生；在另一实施方案中，反义序列单独给予(见，例如，O’Conor，J.，Neurochem.56560(1991)。寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC Press，Boca Raton，FL，(1998)。反义技术可通过反义DNA、反义RNA或三链螺旋形成用来控制基因表达。基因表达反义技术在Okano，J.，Neurochem.56560(1991)；寡脱氧核苷酸作为反义抑制基因表达CRC Press，Boca Raton，FL，1998)；例如，三链螺旋形成描述在Lee等Nucleic Acids Research 63073，(1979)；Cooney等，Science 241456(1998)；和Dervan等，Science2511300(1991)。此方法的基础是多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。
例如，用c-cmc和c-cmb反义RNA结构来抑制无淋巴细胞性白血病细胞系HL-60和其它细胞系的生长前已述及(Wickstrom等，(1998)；Anfossi等，(1989))。这些试验通过体外与寡核糖核苷酸一起培养而完成。相似过程在体内的应用在WO91/15580中已有描述。简而言之，对某一给定的反义RNA，一对寡核苷酸由以下过程产生在与开放阅读框的前15个碱基互补的序列的5’端加E-coR1酶切位点，3’端加HindIII酶切位点。接下来，将寡核苷酸在90℃中加热1分钟，然后在2×的连接缓冲液(20mM TRIS HCl PH7.5，10mM MgC12，10MM二硫苏糖醇，DDT和0.2mM ATP)中退火，然后与逆转录病毒载体PMV7(WO91/15580)的EcoR1/HindIII的酶切位点连接。
例如，多核苷酸5’端编码部分可用来设计一个约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸，这种多核苷酸编码本发明的成熟多肽。将DNA寡核苷酸设计成与参与转录的基因区域互补的序列，从而阻止转录及受体的产生。反义RNA寡核苷酸与体内mRNA杂交，并阻止mRNA翻译成受体多肽。
在一实施方案中，本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)反义核酸由外源性基因在细胞内转录而来。例如，一个载体或其一部分被转录，产生本发明的反义核酸。这样的载体包含编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)反义核酸的序列。它既可以是游离型的也可整合在染色体上，只要能转录并产生反义RNA即可。这种载体可通过本领域标准的DNA重组技术构建，它可以是质粒、病毒或本领域的其它载体，可以复制并在脊椎动物细胞中表达。编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)的序列或其片段的表达可以通过本领域熟知的在脊椎动物，尤其是人体细胞中起作用的启动子来实现，这种启动子可以是诱导型或组成型的。这种启动子包括但不仅限于SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，Nature 29304-310，(1981))，劳斯肉瘤病毒3’长末端重复中包含的启动子(Yamamoto等Cell，22787-797，(1980)；疱疹胸腺嘧啶核苷启动子(Wagner等，Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.781441-1445，(1981))，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，Nature 29639-42，(1982))等。
本发明的反义核酸包括与G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的RNA转录物的至少部分互补序列，绝对互补是优选的，但并不是必须的。这里“与RNA至少部分互补”指的是具有足够的互补，能与RNA杂交并形成稳定的双螺旋的序列；在双链G蛋白趋化因子受体(CCR5)反义核酸的情况下，可检测到双螺旋的一条链或三链螺旋形成。杂交的能力依赖于互补程度和反义核酸的长度。一般地讲，杂交核酸越大，它包含的与G蛋白趋化因子受体(CCR5)RNA错配的碱基可能越多，但仍能形成一稳定的双螺旋(在某些情况下产生三链螺旋)。本领域的技术人员可通过标准过程确定杂交复合物的熔点来确定其可承受的错配程度。
与信使5’末端互补的寡核苷酸，例如，5’端未翻译序列直到并包括AUG起始密码子抑制翻译最为有效。然而，与mRNA的3’端非翻译区互补的序列在抑制翻译时也同样有效。通常见Wagner，R.，1994，Nature 372333-335。因此，与G蛋白趋化因子受体(CCR5)5’-或-3’非翻译区或非编码区(见图1A-B)或保藏克隆的编码区互补的寡核苷酸，都可以用在抑制内源G蛋白趋化因子受体(CCR5)的mRNA翻译的方法中。与mRNA 5’非翻译区互补的寡核苷酸应包含AUG起始密码子的互补区。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸抑制翻译的效率较低，但可在本发明中应用。无论设计来与G蛋白趋化因子受体(CCR5)mRNA 5’端、3’端或编码区还是保藏克隆的编码区杂交，反义核酸至少应该有6个核苷酸长，优选为6至约50个核苷酸长的寡核苷酸。在具体情况下寡核苷酸至少为10个、17、25或50个。
本发明的多核苷酸可以是DNA、RNA或其嵌合混合物或衍生物或其修饰物，它们可以是单链或双链的。例如，寡核苷酸的修饰可在碱基部分、糖部分、或磷酸骨架，从而提高分子和杂交物等的稳定性。寡核苷酸可以包含其它附加组分，例如，肽(例如，以寻找寄主细胞体内的受体)或者简化跨膜(见Letsinger等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.866553-6556；Lemaitre等1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84648-652；PCTPublication No.WO88/09810，published December 15，1988)或者血脑屏障运输的试剂(见，例如，PCT Publication No.WO89/10134 publishedApril 25，1988)，杂交引发的切割剂。(见Krol等1988，BioTechniques6958-976)或添加剂(见Zon，1988Pharm.Res.5539-549)。为此，寡核苷酸可以与另一分子相连接，如，肽、杂交引发的交联剂、运输剂、杂交引发切割剂等。
反义寡核苷酸可至少包含一个修饰碱基部分，这可以从以下组选出，包含但不仅限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、xantine，4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧基-甲氨基甲基尿嘧啶、双氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黄苷、N6-异戊基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5含氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-含氧乙酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3N-2-羧基-丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2，6-双氨基嘌呤。
反义寡核苷酸至少含有一个修饰糖部分，从以下组中选出，但不仅限于此，阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖以及己糖。
另一实施方案中，反义寡核苷酸至少含有一个修饰磷酸骨架，从以下组中选出，但不仅限于此，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酰胺、氨基磷酸酯、phosphordiamidate、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯、正缩醛或其类似物。
另一实施方案中，反义寡核苷酸是一个a-端基异构寡核苷酸。在a-端基异构体中寡核苷酸与互补RNA形成特殊的双链杂交体，它与通常的β单元相反，链间相互平行(Gautier等，1987，Nucl.AcidsRes.156625-6641)。寡核苷酸是一个2’-0-甲基核糖核酸(Inoue等，1987，Nucl.Acids Res.156131-6148)或是嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215327-330)。
本发明的多核苷酸可通过本领域熟知的标准方法合成。例如，利用DNA自动合成仪(可以从生物研究，或应用生物系统买到)。作为例子，硫代磷酸寡核苷酸可用Stein(1988，Nucl.Acids Res.163209)等的方法合成，甲基磷酸酯寡核苷酸用可控制的有孔高分子支持物制备(Sarin等1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857448-7451)等。
尽管可以应用与G蛋白趋化因子受体(CCR5)编码区互补的反义核酸，但是与转录的非编码区互补的反义核酸还是最优选的。
据本发明，潜在的拮抗剂也包括催化RNA或核酶(见，例如，PTCInternational Publication WO 90/11364，PUBLISHED October4，1990；Sarver等，Science 2471222-1225，(1990))。当核酶在位点特异区识别切割mRNA时，可用之来破坏G蛋白趋化因子受体(CCR5)mRNA，优先选用锤头状核酶。该酶在特异位点切割mRNA，通过两侧与能与目标mRNA分子互补的序列相连识别这些位点。最根本的要求是目标mRNA分子含有5’-UG-3’二碱基序列。锤头状核酶的构建与生产是本领域非常熟知的，而且在Haseloff和Gerlach，nature 334585-591(1988)，已作全面描述。G蛋白趋化因子受体(CCR5)的核酸序列中有许多潜在的锤头状核酶切割位点(图1A-B或保藏克隆序列)。优选实施方案中的核酶是经过加工的，以便使切割识别位点位于G蛋白趋化因子受体(CCR5)mRNA的5’端；也就是提高效率并使细胞内非功能mRNA转录体的积累最小化。
在反义方法中本发明的核酶可由修饰寡核苷酸组成(例如，提高稳定性、目标性等)并送到表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞内。编码核酶的DNA结构可引入细胞内，按照上述引入编码反义DNA的方式。优选的送递方式包括例如，在一个强组成型启动子(如polIII或polII启动子)的控制下，利用编码核酶的DNA结构，这样，转染细胞产生足够多的核酶以破坏内源G蛋白趋化因子受体(CCR5)信使并抑制其翻译。由于核酶不同于反义分子，是催化性的，低浓度就很有效。
拮抗剂/激动剂化合物可用来抑制本发明多肽对肿瘤细胞和组织的细胞生长与增殖效果，也就是刺激肿瘤血管发生，因此延迟或阻止细胞异常细胞的生长与增殖，如肿瘤形成与生长。
拮抗剂/激动剂也可用来防止多血管疾病，并能抑制囊外白内障手术后上皮晶状体细胞的增殖。本发明多肽能阻止有丝分裂活动，例如，对血管成型术后再狭窄很必要。
拮抗剂/激动剂用来在伤口治疗过程中能阻止伤疤组织的生长。
拮抗剂/激动剂也能治疗这里描述过的疾病。
因此，本发明提供了治疗或预防以下疾病、紊乱、和/或状态(但不仅限于此)的方法本申请中所列出的与本发明多核苷酸过度表达有关的疾病、紊乱、和/或状态，方式是通过给病人施用(a)本发明多核苷酸的反义分子和/或(b)本发明多核苷酸的核酶。利用跨膜片段作为拮抗剂/激动剂在具体实施方案中本发明与调节，尤其是抑制，G蛋白趋化因子受体(CCR5)的生物活性有关，这种调节作用是通过将G蛋白趋化因子受体(CCR5)暴露在干扰其受体正确组装的分子下。尤其是本发明与G蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜结构域的分离片段或肽有关，此肽抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的信号转导或与配基结合。某些实施方案中，在片段的一端加上带电残基，以促使片段在细胞膜里正确定位。
G蛋白偶联受体(GPCR)跨膜(TM)结构域片段在受体分子组装过程中，以一种特殊方式互作，这一点已被证明。这种互作并不导致刚性结构的形成，因为配基结合后，其构象改变需要一定的柔性，这允许分子将信号从细胞表面传递到胞内。以下这一点也早已说明对于几种GPCRs，跨膜结构域参与配基结合，因此，它含有允许配基侵入的空隙。有关缺失跨膜结构域的表达援救无活性截短V2加压素、β-肾上腺素和毒蝇碱的报道(Schoneberg等EMBO J.151283(1996)；Wong等J.Bio.Chem.2656219，1990；Monnot等J.Biol.Chem.2711507，1996；Gudermann等Annu.Rev.Neurosci.20399，1997，Osuga等J.Biol.Chem.27225006，(1997))表明来源于P2肾上腺素受体的第六个结构域能抑制受体活化和二聚体的形成(Hebert等，J.Biol.Chem.，271(27)16384-92，1996)。因此，GPCR功能可通过靶向膜内GPCRS的互作而得以拯救。
另外，可通过靶向膜内互作抑制GPCR的功能。例如，以前提及的G蛋白趋化因子受体(CCR5)的TM区域的相应片段的功能是HIV进入细胞的共同受体，它在对细胞无明显毒性的情况下，能有力抑制HIV的入侵，(见WO99/43711)。这一方法的应用可通过特异靶向CXCR4来证明，CXCR4的功能是HIV-1亲T细胞株进入细胞的共同受体。在低至0.2μmol的浓度时包含20至25个氨基酸残基的片段体外抑制受体产生信号和HIV-1传染(见WO99/43711)。
跨膜片段的疏水性和/或两亲性允许它们进入双分子层。而且，通过给暴露在细胞膜里面完整的受体加带电核残基来控制膜内定位。利用本领域的常规技术通过荧光显微镜检技术检测标记肽类似物插入细胞内，就象WO99/43711描述的一样。
在特殊实施方案中，本发明包含通过靶向G蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜结构域调节尤其是抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)生物特性和活性的跨膜片段。在进一步实施方案中，本发明包含利用这些拮抗物特异的扰乱G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能的方法。
利用化学或重组DNA技术获取G蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜片段。这种片段在保持与G蛋白趋化因子受体(CCR5)有足够高的亲和性或相关性的前提下应尽可能的小。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的非限制性例子包含10至50氨基酸片段，此肽至少与1至7个跨膜片段中的一个片段相对应。
在另外的实施方案中，本发明包括已分离的G蛋白趋化因子受体(CCR5)调节分子，该分子包含是部分G蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜片段的结构类似物的片段、肽或肽类似物，其中上述分子有胞内末端和胞外末端，并且上述胞外末端在生理状态下有一负电荷基团，在胞内端有中性电荷基团，上述分子按与它起源的跨膜结构域相同的方向自发地插入细胞膜内，并调节上述G蛋白趋化因子受体(CCR5)的生物特性或活性。
在一特殊的实施方案中，该分子包含一亲水的带负电荷的非肽头基团和一不带电荷的尾部，这样可以确保分子在膜内的正确定位。在另一实施方案中，负电荷头部基团是一个或多个酸性氨基酸。
由上述片段调节的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性包括抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的Ca2+释放和G蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的HIV病毒传染。由上述肽调节的G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性也包括G蛋白趋化因子受体(CCR5)配基的结合。另外，包括这里说明书和实施例中的所有活性。
在另一实施方案中，本发明含有通过将表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞和本发明的分子物质接触来调节其生物活性的方法。在一个方法中，调节的活性是抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的HIV的传染。在另一实施方案中，调节生物活性是抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的胞内Ca2+释放，其它调节活性包括其它地方描述过的调节活性。
另一实施方案是抑制HIV-1感染的方法，包括将表达结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞和包含属于部分上述G蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜结构域的结构类似物的多肽片段、肽或仿肽的分子接触，其中，胞和上述分子接触可抑制HIV-1的传染。肽或仿肽可以是部分G蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜结构域的类似物。
在一实施方案中，本发明的分子模拟G蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜片段，可能通过与自身TM片段竞争性抑制，来阻止受体的自我组装，因此，它们阻止或抑制受影响细胞中的信号传导。
本发明也包括具有有益特性，诸如增加半衰期、免疫原性缺乏和通过血脑屏障的能力的肽类似物或仿肽。
本发明的肽类似物调节荷尔蒙激动剂/拮抗剂或其它肽的化学和/或生物效果。这在药物设计、治疗、诊断技术上很有用。因此本发明提供了通过给哺乳动物使用有药效量的一种或多种本发明的肽类似物，在其体内产生预防或治疗反应的方法。在优选实施方案中，本发明提供了通过施加有效量的一种或多种本发明的肽类似物来调节G蛋白趋化因子受体(CCR5)活性，从而产生上述反应的方法。
在另一实施方案中，至少一种本发明肽的混合物混合起来使用来调节G蛋白趋化因子受体(CCR5)的活性。
术语“G蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜肽”可包括跨膜结构域的片段、跨膜片段、跨膜片段中的片段和/或其同源肽。优选片段包括至少4-50个氨基酸，优选至少4-30个氨基酸，最好是至少10-30个氨基酸长度或其中任何范围的片段。更优选的片段包括5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50个氨基酸长的那些，也包含有保守氨基酸替代的任何相应序列。
本发明的跨膜片段样本包括但不仅限于这里描述过的任何片段。本发明的优选跨膜片段当与含有生物活性G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞或膜结构(如，质体)接触时，可调节上述G蛋白趋化因子受体(CCR5)在体内、体外或原位的生物活性。在体内(如血浆或间隙液)或体外(如培养基中)接触细胞的溶液中片段浓度为1nmol至50μmol，优选在1nmol和1μmol之间，最优选小于5μmol。
“带负电荷”指在生理pH值条件下带负电的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸类似物、和带负电的化学部分。带负电荷氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。“酸性残基”是在生理条件下带负电荷的残基。
“带正电荷”指生理条件下带正电的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸类似物及化学部分。带正电荷氨基酸包括精氨酸和赖氨酸。“碱性残基”是生理pH值条件下带正电的残基。
“中性”指生理条件下既不带正电也不带负电的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸类似物及化学部分。
术语“调节生物性质或活性”的意思是，当待检测的跨膜片段存在时，可度量的生物学参数或事件与缺乏上述肽的对照相比有增加或减少。生物性质或活性的例子包括G蛋白趋化因子受体(CCR5)的构象、G蛋白趋化因子受体(CCR5)与其它分子的结合、信号传导、细胞内蛋白的胞外分泌、蛋白质构象变化、酶活性的改变、血管舒张的改变、心跳速率的调整、支气管舒张调整、内分泌调整和肠蠕动调整。注意G蛋白趋化因子受体(CCR5)生物活性并不需限定于由G蛋白趋化因子受体(CCR5)在体内充当的任何角色。这一术语也包括G蛋白趋化因子受体(CCR5)性质，例如病毒蛋白的结合，这并非G蛋白趋化因子受体(CCR5)在体内的生物角色。它还包括G蛋白趋化因子受体(CCR5)的仅在实验室中由试验操作揭示的固有特性，例如，G蛋白趋化因子受体(CCR5)在人造双层分子(如脂质体)与G蛋白趋化因子受体(CCR5)配基的互作能力。
“信号转导”是配基与受体结合产生生理改变的过程。一般而言，配基与受体结合会导致受体物理性质的改变，如构象改变、其定位或与其它配体的结合能力的改变。这种物理性质的改变直接或间接的导致离子流动的增加或减少，酶活性的加强或减弱，磷酸化作用的加强或减弱，受体或其他分子(如肌醇部分或G蛋白亚基)在细胞间隙间移动的加快与减慢。
“G蛋白趋化因子受体(CCR5)配基”指在体内、原位或体外与G蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的生物分子，可包括，荷尔蒙、神经传递物、病毒或其受体结合结构域、G蛋白、视蛋白、视紫红质，核苷、核苷酸、凝固级联因子、添味剂或信息素、毒素、集落刺激因子、血小板活化因子、神经激动肽、神经体液或任何其他生物活性化合物，如药物或人工或天然产生的化合物。
短语“抑制HIV传染”的意思是本发明的肽抑制HIV与G蛋白趋化因子受体(CCR5)的结合或抑制G蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的HIV病毒进入表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞并成功繁殖的生物活性。
本发明的CCR5多肽或其编码核苷酸包括有限套实质性相应序列作为替代肽或多核苷酸，这可根据这儿出现的教导与指南，通过本领域的常规技术而获得，而无需过多的试验。有关蛋白化学与结构的详细介绍，见Schulz等PRINCPLES OF PROTEIN STRUCTURE，Springer-Verlag，NewYork，1978和Creighton，T.E.，PROTEINSSTUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，1983，，这儿作为参考文献列出。有关核苷酸序列替代物例如密码子偏好的介绍，见Ausubel等同上，section A1.1-A.1.24，和Sambrook等同上，Appendices C andD。
CCR5多肽包括跨膜结构域片段和/或同源序列，尤其是至少含有CCR5的1-7个跨膜片段中的一个或其同系物。
然而，在本发明中，优选的是至少15至20个氨基酸的CCR5多肽，这样CCR5多肽能跨越脂双层。特别优选的是本发明的肽加以选择和修饰，这样在生理条件下，一端带电荷，另一端是中性的，这样肽就能自发地插入膜内。尤其重要的是肽按与它所起源的CCR5结构域同样的方向插入。
本发明的肽可来源于7个TM片段中的任一个。TM片段的氨基酸位置可用分子模拟确定，任选结合疏水性分析(见表1)和/或适于模式螺旋，作为无限制性的例子。这样的模拟可以根据已知的方法来完成。例如，ECEPP、INSIGHT、DISCOVER、CHEM-DRAW、FRODO和CHEM-X。这种算法是比较相关GPCRs之间的跨膜结构域和片段，确定可能的能量最小化结构，并确定可供选择的跨膜序列。
可用作拮抗剂的G蛋白偶联的趋化因子受体跨膜结构域片段包括或可供选择地由SEQ ID NO.2或保藏克隆编码的多肽的下列部分构成片段1SEQ ID NO.2或保藏克隆编码的多肽的氨基酸31-58，32-58，33-58，34-58，35-58，36-58，37-58，38-58，31-57，32-57，33-57，34-57，35-57，36-57，37-57，31-56，32-56，33-56，34-56，35-56，36-56，31-55，32-55，33-55，34-55，35-55，31-54，32-54，33-54，34-54，31-53，32-53，33-53，31-52，32-52，31-51或其任意组合，至少长15个氨基酸是优选的。
片段2SEQ ID NO.2或保藏克隆编码的多肽的氨基酸68-97，69-97，70-97，71-97，72-97，73-97，74-97，75-97，76-97，68-96，69-96，70-96，71-96，72-96，73-96，74-96，75-96，76-96，68-95，69-95，70-95，71-95，72-95，73-95，74-95，75-95，68-94，69-94，70-94，71-94，72-94，73-94，74-94，68-93，69-93，70-93，71-93，72-93，73-93，68-92，69-92，70-92，71-92，72-92，68-91，69-91，70-91，71-91，68-90，69-90，70-90，68-89，69-89，68-88或其任意组合，至少长15个氨基酸是优选的。
片段3SEQ ID NO.2或保藏克隆编码的多肽的氨基酸103-124，104-124，105-124，106-124，107-124，108-124，109-124，103-123，103-122，103-121，103-120，103-119，103-118或其任意组合，至少长15个氨基酸是优选的。
片段4SEQ ID NO.2或保藏克隆编码的多肽的氨基酸142-169，143-169，144-169，145-169，146-169，147-169，148-169，149-169，142-168，143-168，144-168，145-168，146-168，147-168，148-168，142-167，143-167，144-167，145-167，146-167，147-167，142-166，143-166，144-166，145-166，146-166，142-165，143-165，144-165，145-165，142-164，143-164，144-164，142-163，143-163，142-163或其任意组合，至少长15个氨基酸是优选的。
片段5SEQ ID NO.2或由保藏克隆编码的多肽的氨基酸196-223，197-223，198-223，199-223，200-223，199-223，201-223，202-223，203-223，196-222，197-222，198-222，199-222，200-222，201-222，202-222，196-221，197-221，198-221，199-221，200-221，201-221，196-220，197-220，198-220，199-220，200-220，196-219，197-219，198-219，199-219，196-218，197-218，198-218，196-217，197-217，196-216或其任意组合，至少长15个氨基酸是优选的。
片段6SEQ ID NO.2或由保藏克隆编码的多肽的氨基酸236-260，237-260，238-260，238-260，239-260，240-260，236-259，237-259，238-259，239-259，236-258，237-258，238-258，236-257，237-257，236-256或其任意组合，至少长15个氨基酸是优选的片段7SEQ ID NO.2或由保藏克隆编码的多肽的氨基酸275-305，276-305，277-305，278-305，279-305，280-305，281-305，282-305，283-305，284-305，285-305，275-304，276-304，277-304，278-304，279-304，280-304，281-304，282-304，283-304，284-304，275-303，276-303，277-303，278-303，279-303，280-303，281-303，282-303，283-303，275-302，276-302，277-302，278-302，279-302，280-302，281-301，282-302，275-301，276-301，277-301，278-301，279-301，280-301，281-301，275-300，276-300，277-300，277-300，278-300，279-300，280-300，275-299，276-299，277-299，278-299，279-299，275-298，276-298，277-298，278-298，275-297，276-297，277-297，275-296，276-296，275-295或其任意组合，至少长15个氨基酸是优选的。
WO99/43711中揭露的CCR5片段是从这个区域的实施方案中具体排除的。
带负电氨基酸，例如，天冬氨酸或谷氨酸可以替换或加在这个片段的胞外端。带负电氨基酸的数量典型地是1，2或3。中性氨基酸可以取代或加在片段的胞内端。见实施例57。其它活性本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂，作为刺激血管内皮细胞生长能力结果，可以用来治疗由于各种疾病状况如血栓、动脉硬化和其它心血管状况造成的局部缺血组织的再血管化。本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂也可以用来刺激血管发生和肢体再生，这在以前已讨论过。
本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂也可用来治疗、预防和/或诊断由于创伤、烧伤、手术后组织康复和溃疡等造成的伤口，因为它们促进各种不同来源细胞(如，成纤维细胞、骨骼肌细胞)的有丝分裂，因此促进被破坏或疾病组织的修复或取代。
本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂可用来刺激神经生长，并治疗或预防神经毁坏，这种毁坏是由于某种神经疾病、紊乱、和/或神经变性状态，如阿尔茨海默氏病、帕金斯氏疾病和AIDS相关复合物。多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂可能还有刺激软骨组织细胞生长的作用，因此它们可用来加强骨骼和牙周再生，并有助于组织移植或骨骼嫁接。
本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂可通过刺激角质细胞生长来阻止由于太阳灼伤造成的皮肤老化。
本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂可防止头发脱落，因为FGF家族成员激活形成毛发的细胞，并促进黑色素细胞生长。另外，多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂当和其它细胞因子结合使用时，可以刺激造血和骨髓细胞的生长和分化。
本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂用来保存器官移植前的器官或支持原始组织的细胞培养。本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂也可用来诱导起源于中胚层的组织在早期胚中的分化。
本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂也可用来增加或减少胚胎干细胞(造血细胞系以外的)的分化或增殖，象以前描述的那样。
本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂用来调节哺乳动物的性状，如，身高、体重、发色、眼色、皮肤、脂肪组织百分比、色素形成、大小和形状(如整形外科手术)。同样，本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂可用来调节哺乳动物的代谢机制，代谢机制影响合成代谢、分解代谢、能量的加工、利用和贮藏。
本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂可用来改变哺乳动物的精神状态或身体状态。这种调节通过影响生物节律、caricadic节律、抑郁(包括抑郁症、紊乱和/或状态)暴力倾向、忍受痛苦、生殖能力(活化素和抑制样激动剂)、激素或内分泌水平、食欲、性欲、记忆力、压力或其它认知能力。
本发明多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂用作食物添加剂或防腐剂。如增加或减少储藏能力、脂肪含量、油脂、蛋白、碳水化合物、维生素、矿物质、辅因子或其它营养成分。
上述应用可用在广泛的宿主上。宿主包括但不仅限于人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、田鼠、大鼠、仓鼠、猪、微型猪、鸡、奶牛、绵羊、狗、猫、非人灵长类和人。在具体方案中，宿主是哺乳动物，在大多数优选方案中宿主是人。
现在，已经对本发明进行了一般性说明，参考下面的实施例，更易理解本发明。所述实施例通过举例说明的方式提供，但并不是有意限制于此。
实施例实施例1HDGNR10的细菌表达与纯化使用对应于载体序列和经过加工的HDGNR10蛋白(去除信号肽序列)的5’端序列，以及位于HDGNR10基因3’端的载体序列的PCR寡核苷酸引物，起始扩增编码ATCC编号97183的HDGNR10的DNA序列。对应于HDGNR10的另外的核苷酸被分别加入到5’和3’序列中。5’寡核苷酸引物序列是5’CGGAATTCCTCCATGGATTATCAAGTGTCA 3’(SEQ ID NO3)，它含有一个EcoR I限制性酶切位点，其后是18个核苷酸的HDGNR10编码序列，起始于经过加工的蛋白密码子的推测的末端氨基酸。3’序列为5’CGGAAGCTTCGTCACAAGCCCACAGATAT 3’(SEQ ID NO.4)，它含有与HindIII位点互补的序列，其后是18个核苷酸的HDGNR10编码序列。限制性酶切位点与细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)上的限制性酶切位点相互对应。pQE-9编码对抗生素的抗性(AMPr)、细菌复制起点(ori)、受IPTG调节的启动子操纵基因(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6个组氨酸标签和限制性酶切位点。pQE-9继而被EcoR I和Hind III酶消化。扩增出来的序列与pQE-9连接，并被插入到与编码组氨酸标签和核糖体结合位点的序列相一致的编码框架中。该连接混合物被用来转化大肠杆菌M15/rep4株(Qiagen，Inc.)，操作程序见Sambrook，J.等著，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)。M15/rep4株含有pREP4质粒的多个拷贝，该质粒表达lacI阻遏蛋白并赋予对卡那霉素的抗性(Kanr)。转化株通过其在LB平皿上的生长能力而被识别，选择那些具有氨苄青霉素/卡那霉素抗性的菌落。分离质粒DNA并通过限制性内切酶分析加以确证。
含有所需要的结构的克隆在补充了氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)生长，过夜生长的培养物被用来按1∶100到1∶250的比率接种大量培养基。细胞要生长到600nm光密度值(O.D.600)达到0.4到0.6之间。然后加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1mM。IPTG通过使1acI阻遏蛋白失活，开放启动子操纵基因而诱导基因表达量增加。细胞再额外生长3到4个小时，然后通过离心方法收获。细胞沉淀溶解在离液剂6M盐酸胍中，澄清后，通过层析法在镍螯合柱上将溶解的HDGNR10从溶液中纯化出来，所用的条件是使该镍螯合柱可以被含有6个组氨酸标记的蛋白质牢固结合的条件，见Hochuli，E.等，J.Chromatography 477177-184(1984)。用6M pH5.0的盐酸胍从柱上洗脱HDGNR10，并为了复性的缘故，将溶液调整为3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷光甘肽(还原型)和2mM谷光甘肽(氧化型)。在该溶液中孵育12小时后，用10mM磷酸钠透析该蛋白质。实施例2在COS细胞中表达重组的HDGNR10表达质粒HDGNR10 HA起源于pcDNAI/Amp载体(Invitrogen)，该载体含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，随后是多接头区，SV40内含子和聚腺苷酸化位点。编码整个HDGNR10前体和融合在其框架的3’端的HA标签的DNA片段被克隆到载体的多接头区，因此重组蛋白的表达是在CMV启动子的直接控制之下。HA标签对应于如前所述(I.Wilson，等，Cell 37767(1984))的来自流感血凝素蛋白的一个抗原表位。将HA标签融合到目的蛋白上，将使得可以容易地用能够识别HA表位的抗体检测重组蛋白。
质粒的构建策略描述如下编码ATCC编号97183的HDGNR10的DNA序列是通过PCR方法，使用两个引物而构建的5’引物是5’GTCCAAGCTTGCCACCATGGATTATCAAGTGTCA3’(SEQ ID NO5)，它含有一个Hind III位点，随后是18个从起始密码子开始的HDGNR10编码序列核苷酸；3’引物是5’CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACAAGCCCACAG ATATTTC 3’(SEQ ID NO6)，它含有与Xho I位点互补的序列、翻译终止密码子、HA标签和HDGNR10编码序列(不包括终止密码子)的最后18个核苷酸。因此，该PCR产物含有一个Hind III位点、HDGNR10编码序列、随后是融合在该框架中的HA标签，HA标签后面是翻译末端终止密码子，以及一个Xho I位点。用Hind III和XhoI限制性内切酶消化经PCR扩增的DNA片段和pcDNAI/Amp载体，并将二者连接起来。连接混合物被转化进入大肠杆菌SURE株(可从Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，LaJolla，CA 92037获得)，转化后的培养物被铺在含氨苄青霉素的培养板上，挑选出抗性菌落。从转化体中分离出质粒DNA，通过限制性内切酶分析检测正确片段的存在。为了表达重组的HDGNR10，我们使用DEAE-DEXTRAN(二乙氨乙基葡聚糖)方法(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringLaboratory Press，(1989))，用表达质粒转染COS细胞。通过放射性标记和免疫沉淀方法(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))检测HDGNR 10HA蛋白的表达。转染后两天，用35S-半胱氨酸标记细胞8小时。然后收集培养液，用去污剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5).(Wilson，I.等，同上37767(1984))。细胞裂解物和培养液都用HA特异性单克隆抗体进行沉淀，沉淀下来的蛋白在15％SDS-PAGE胶上进行分析。实施例3使用杆状病毒表达系统克隆和表达HDGNR10编码ATCC编号97183的全长HDGNR10蛋白的DNA序列被使用PCR寡核苷酸引物进行扩增，引物对应于该基因的5’和3’序列5’引物序列为5’CGGGATCCCTCCATGGATTATCAAGTGTCA 3’(SEQ IDNO7)，它含有一个BamH I限制性酶切位点，随后是4个类似于真核细胞中的有效翻译起始信号的核苷酸(Kozak，M.，J.Mol.Biol.196947-950(1987))，它恰好位于HDGNR10基因的开始18个核苷酸(翻译起始密码子为ATG)的后面。
3’引物序列为5’CGGGATCCCGCTCACAAGCCCACAGATAT 3’(SEQ IDNO8)，它含有限制性核酸内切酶BamH I的裂解位点，以及与HDGNR10基因的3’非翻译序列互补的18个核苷酸。使用商用试剂盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，La Jolla，加拿大)从1％的琼脂糖凝胶中分离出扩增序列。然后按上述描述过的方法将该片段用核酸内切酶BamH I进行消化和纯化。该片段被命名为F2。
使用杆状病毒表达系统时，载体pRG1(经过修饰的pVL941载体，讨论见下文)被用于HDGNR10蛋白的表达(参见综述Summers，M.D.和Smith，G.E.1987，A manual of methods for baculovirus vectorsand insect cell culture procedures，Texas AgriculturalExperimental Station Bulletin No.1555)。该表达载体含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，随后是限制性核酸内切酶BamH I的识别位点。猿病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点被用来实现有效聚腺苷化。为了使重组病毒的选择更加简化，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因按与多角体蛋白启动子相同的方向被插入，在它后面是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧都被病毒序列所包围，以便与共转染的野生型病毒DNA进行细胞介导的同源重组。许多其它的杆状病毒都可以用来代替pRG1，例如pAc373，pVL941和pAcIMl(Luckow，V.A.和Summers，M.D.，Virology 77031-39).
按本领域所熟知的程序，用限制性核酸内切酶BamH I消化质粒，继而使用牛小肠磷酸酶将其去磷酸化，然后按上面描述过的方法从1％的琼脂糖凝胶中分离DNA，该载体DNA被命名为V2。
用T4 DNA连接酶连接片段F2和去磷酸化的质粒V2，然后转化大肠杆菌HB101，使用BamH I酶识别含有携带了HDGNR10基因的质粒(pBacHDGNR10)的细菌。克隆片段的序列通过DNA测序来证实。
使用脂转染法(Felgner等Proc.Natl Acad.Sci.USA847413-7417(1987))将5μg pBacHDGNR10质粒与1.0μg商品化线性杆状病毒(″BaculoGoldTMbaculovirus DNA″，Pharmingen，San Diego，CA.)进行共转染。
将1.0μg BaculoGoldTM病毒DNA与5μg pBacHDGNR10质粒在含有50μg无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的无菌微量滴定板孔中进行混合。然后加入10μl Lipofectin试剂和90μl Grace’s培养基，室温下混合并孵育15分钟。然后将转染混合物以滴加方式加在Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)上，该细胞种在含有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养板上。将培养板前后摇动以混合新加入的溶液。然后将该培养板在27℃孵育5小时。5小时后，从培养板中移出转染液，加入1ml补充了10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。将培养板放回孵箱，继续在27℃持续培养4天。
4天后收集上清，按与Summers和Smith(见上文)所描述过的类似方法进行蚀斑分析，我们对该方法所作的改进是使用带有“Blue Gal”(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)的琼脂糖凝胶，它可以使蓝染色的蚀斑容易分离。(“蚀斑分析”的详细描述也可在LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg所分发的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户手册的第9-10页上找到)。
系列稀释4天后，将病毒加在细胞上，用Eppendorf吸管的尖端挑出蓝染的蚀斑。然后将含有重组病毒的琼脂重悬在含有200μl Grace’s培养基的Eppendorf管中。经过简单离心移除琼脂，含有重组杆状病毒的上清液被用来感染种在35mm平皿上的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清并贮存于4℃。
Sf9细胞生长在补充了10％热失活的胎牛血清的Grace’s培养基中，用感染复数为2的重组杆状病毒V-HDGNR10感染细胞。6小时后移出该培养基，代以不含有甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培养基(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg)。42小时后，加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi的35S-半胱氨酸(Amersham)。细胞再孵育16小时，然后用离心方法收获，通过SDS-PAGE和放射自显影方法显现被标记的蛋白。实施例4经由基因治疗的表达通过皮肤活组织检查，从受试者身上获取成纤维细胞。将获得的组织放在组织培养基中并分散成小块。将这些组织小块放置于组织培养瓶的湿润表面上，每瓶大约放10块。将培养瓶颠倒，塞紧，置于室温下过夜。室温下24小时后，倒转培养瓶，组织块依然固定在瓶底，加入新鲜培养基(例如含10％胎牛血清、青霉素和链霉素的Ham’s F12培养基)。然后将其在37℃孵育大约一周。此时加入新鲜培养基，随后每隔几天改换一次新培养基。再经过另外两周的培养，就会出现单层的成纤维细胞。用胰蛋白酶消化该单层细胞并剥离到大的培养瓶中。
用EcoR I和Hind III酶消化其两侧连接有Molony鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7质粒(Kirschmeier，P.T.等DNA 7219-25(1988))，继而用牛小肠磷酸酶处理，在琼脂糖凝胶上分离该线性化载体并用玻璃珠纯化。
使用分别对应于序列的5’端和3’端的PCR引物，扩增编码本发明的多肽的cDNA。5’引物含有EcoR I位点，3’引物含有Hind III位点。在存在T4 DNA连接酶的情况下，将等量的Molony鼠肉瘤病毒线性主链和EcoR I-Hind III片段加在一起，将产生的混合物维持在适于两个片段进行连接的条件下。连接混合物被用来转化HB101细菌，将该转化菌置于含有卡那霉素的琼脂上，目的是证实载体含有被适当插入的目的基因。
在补充了10％的牛血清(CS)和青霉素、链霉素的Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)中，使兼嗜性pA317或GP+aml2包装细胞在组织培养中生长到汇合密度。然后将含有该基因的MSV载体加入到培养基中，用该载体转导包装细胞。现在包装细胞就可以制造含有该基因的感染性病毒颗粒(该包装细胞现在可以被看作是生产细胞)。
将新鲜的培养基加入到被转导的生产细胞中，随后，从生长着汇合的生产细胞的10cm平皿中收获培养基。使用过的培养基中含有感染性病毒颗粒，要通过微孔滤器将其过滤以去除脱落的生产细胞，然后该培养基被用来感染成纤维细胞。将培养基从即将汇聚的成纤维细胞平皿中移出，迅速用来自生产细胞的培养基取代之。移出该培养基，代以新鲜培养基。如果病毒滴度很高，那么事实上所有的成纤维细胞都会被感染，也就不需要进行选择。如果滴度很低，那么就必须使用带有如neo或his这样的选择性标记的逆转录病毒载体。
然后就可以将该工程化的成纤维细胞注射给宿主，不论是单独注射还是等到其在cytodex 3微载体珠上生长到汇聚状态后再注射都可以。现在该成纤维细胞就可以制造蛋白产物了。实施例5从保藏样品中分离G蛋白趋化因子受体(CCR5)DNA克隆将G蛋白趋化因子受体(CCR5)DNA插入到pQE-9质粒(Qiagen，Inc.)的多克隆位点，pQE-9含有氨苄青霉素抗性基因，并可以被转化进LifeTechnologies公司提供的大肠杆菌DH10B株(见例如，Gruber，C.E.等，Focus 1559-(1993))。
可以使用两种方法从保藏样品中分离G蛋白趋化因子受体(CCR5)。首先，用本领域技术人员所熟知的技术，例如那些由载体提供者所提供的或在相关出版物或专利中提供的技术，将保藏样品转化进合适的宿主(例如XL-1 Blue(Stratagene))。将转化体涂布在1.5％的琼脂平板上(其中含有合适的选择剂，例如氨苄青霉素)，密度是每个平板上有大约150个转化体(菌落)。然后使用本领域技术人员所周知的核酸分离技术(例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Edit.，(1989)；Cold Spring Harbor Laboratory Press.)，使用单个菌落制备DNA。
另外，也可以合成两个来自于SEQ ID NO1或SEQ ID NO21的两端(例如，该克隆的5’NT和3’NT限定的SEQ ID NO1或SEQ ID NO21的区域内)的17-20个核苷酸的引物，使用保藏的DNA质粒作为模板，用引物扩增G蛋白趋化因子受体(CCR5)DNA。聚合酶链式反应可以在通常的条件下完成，例如，在25μl反应混合物中含有0.5μg上述DNA模板。适宜的反应混合物是1.5-5mM MgCl2，0.01％(w/v)明胶，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各20μM，每种引物各25pmol，以及0.25单位的Taq聚合酶。用Perkin-Elmer Cetus自动热循环仪执行35个循环的PCR反应(94℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟)。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，切下具有所期望的分子量的DNA条带并将其纯化。通过亚克隆和DNA产物测序验证该PCR产物就是所要选择的序列。
有几种方法可以用来鉴定G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的5’和3’非编码区，该区可能在保藏克隆中并不存在。这些方法包括但并不限于在本领域广为人知的过滤探查，使用特殊探针进行的克隆富集，以及类似于或等同于5’和3’“RACE”实验方案的方案。例如，类似于5’“RACE”的方法可以用来产生所要得到的全长转录本的缺失的5’端(Fromont-Racine等，Nucleic Acids Res.21(7)1683-1684(1993))。
简而言之，将特异性RNA寡核苷酸连接到估计含有全长基因RNA转录本的一群RNA的5’端。用一对引物PCR扩增G蛋白趋化因子受体(CCR5)全长基因的5’部分，这对引物中包括对已经连接上的RNA寡核苷酸具有特异性的引物，以及对感兴趣的G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的已知序列具有特异性的引物。然后可以对该扩增产物进行测序并用来产生全长基因。
尽管也可以使用poly-A+RNA的方法，但上述的方法都是从总RNA开始的，总RNA是从期望的原始材料中分离出来的。如果有必要清除被降解或破坏的RNA上的、可能妨碍以后的RNA连接酶步骤的5’磷酸基团，那么可以用磷酸酶处理该RNA制备物。然后应该将磷酸酶失活，并将RNA用烟草酸性焦磷酸酶处理以去除存在于信使RNA 5’端的帽子结构。这个反应在帽子结构已经被裂解的RNA的5’端留下了一个5’磷酸基团，然后就可以使用T4 RNA连接酶将其与RNA寡核苷酸进行连接了。
以这个修饰过的RNA制品作为模板，使用基因特异性寡核苷酸，合成第一条cDNA链。第一链合成反应是为所要得到的5’端的PCR扩增提供模板的，PCR扩增所用的一个引物对连接上的RNA寡核苷酸有特异性，另一个对感兴趣的基因的已知序列具有特异性。随后对合成产物进行测序和分析，以证实其5’端序列属于G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因。实施例6G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因组克隆的分离按照在实施例5中描述过的方法(也参见Sambook的著作)，通过PCR方法筛选人类基因组P1文库(Genomic Systems，Inc.)，使用的是经过选择具有对应于SEQ ID NO1或SEQ ID NO21的DNA序列的引物。实施例7G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的组织分布使用Northern印迹实验分析方法，确定G蛋白趋化因子受体(CCR5)mRNA表达的组织分布情况，该方法尤其见Sambrook等人的描述。例如，按照实施例5所描述的方法制备的G蛋白趋化因子受体(CCR5)探针根据厂商的说明书，使用rediprimeTMDNA标记系统(Amersham LifeScience)而标记上P32。标记之后，按照厂商的PT1200-1号说明书，使用CHROMA SPIN-100TM柱(Clontech Laboratories，Inc.)纯化探针。用纯化后的标记探针检查各种不同人体组织的mRNA表达。
按照厂商PT1190-1号说明书，使用ExpressHybTM杂交液(Clontech)，用标记好的探针，检查含有各种不同的人体组织(H)或人体免疫系统组织(IM)的多组织Northern(MTN)印迹(Clontech)。经过杂交和洗涤之后，将这些印迹放好，于-70℃对胶片作过夜曝光，按照标准程序将胶片显影。实施例8G蛋白趋化因子受体的染色体图根据SEQ ID NO1或SEQ ID NO21的5’端的序列，设计了一套寡核苷酸引物。该引物优选跨度为大约100个核苷酸。该套引物用于聚合酶链式反应，反应条件如下95℃30秒钟，56℃1分钟，70℃1分钟。重复此循环32次，再留置在70℃5分钟。除了含有个体的染色体或染色体片段的体细胞杂种组(Bios，Inc)以外，也用人、鼠、仓鼠DNA作为模板。在8％的聚丙烯酰胺凝胶或3.5％的琼脂糖凝胶上分析这些反应。根据在特殊的体细胞杂种中是否存在大约100bp的PCR片段来确定染色体图。实施例9G蛋白趋化因子受体的细菌表达正如实施例5中所简述的那样，使用对应于DNA序列的5’端和3’的PCR寡核苷酸引物，扩增编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸，以便合成插入片段。用来扩增cDNA插入片段的引物应该优选在其5’端含有限制性酶切位点，例如BamH I和Xba I，以便将扩增产物克隆到表达载体中。例如，BamH I和Xba I对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性酶切位点。该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG调节的启动子/操纵基因(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6个组氨酸标签(6-His)，以及限制性酶克隆位点。
用BamH I和Xba I消化pQE-9载体，将扩增出来的片段连接到pQE-9载体中，保持读码框架起始于细菌的核糖体结合位点(RBS)。然后将连接混合物转化大肠杆菌M15/rep4株(Qiagen，Inc.)，该菌株含有pREP4质粒的多个拷贝，该质粒表达lacI阻遏蛋白并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。通过其在LB平板上的生长能力来识别转化体，选择抗氨苄青霉素/卡那霉素的菌落。分离质粒DNA并用限制性酶切分析加以确认。
含有所需要的结构的克隆在补充了氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)生长，过夜生长的培养物被用来按1∶100到1∶250的比率接种大量培养基。细胞要生长到600nm光密度值(O.D.600)达到0.4到0.6之间。然后加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1mM。IPTG通过使lacI抑制子失活，开启启动子/操纵子而诱导基因表达量增加。
细胞再额外生长3到4个小时，然后通过离心方法(6000×g，20分钟)收获。细胞沉淀溶解在离液剂6M盐酸胍中，于4℃搅拌3-4小时。通过离心去除细胞碎屑，将含有多肽的上清液上样到次氮基三乙酸镍(“Ni-NTA”)亲和树脂柱(由QIAGEN，Inc提供，见上文)。带有6个组氨酸标签的蛋白质能以高亲和力结合在Ni-NTA树脂上，并可以经简单的一步操作纯化(详情可参见The QIAexpressionist(1995)QIAGEN，Inc.，见上文)。
简而言之，用6M pH 8的盐酸胍将上清液上样到树脂柱上，首先用10倍体积的6M pH 8的盐酸胍洗涤该柱，接着用10倍体积的6M pH 6的盐酸胍洗涤，最后用6M pH 5的盐酸胍将多肽洗脱下来。
随后，通过使用磷酸盐缓冲液(PBS)或pH 6的50mM乙酸钠缓冲液加200mM氯化钠，对纯化过的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白进行透析而使之复性。另外，当G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白被固定在Ni-NTA柱上的时候，也可以使之成功地进行再折叠。推荐使用的条件如下使用线性递减的6M到1M尿素梯度进行复性，尿素溶解在500mM氯化钠、20％甘油、20mM Tris/盐酸，pH7.4，并含有蛋白酶抑制剂的溶液中。复性时间应该超过1个半小时或更多。复性后，加入250mM咪唑将蛋白质洗脱下来。最后经过透析步骤清除咪唑，透析所使用的是磷酸盐缓冲液(PBS)或pH6的50mM乙酸钠缓冲液加200mM氯化钠。纯化后的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白贮存于4℃或冻存在-80℃。
除了上述的表达载体以外，本发明还包括一种被称为pHE4a的表达载体(ATCC登记号209645，于1998年2月25日保藏)，该载体所含有的噬菌体操纵子和启动子元件可操作地连接到G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸上。该载体含有1)作为选择标记的新霉素磷酸转移酶基因。2)大肠杆菌复制起点。3)T5噬菌体启动子序列。4)两个lac操纵基因序列。5)Shine-Delgarno序列，和6)乳糖操纵子阻遏蛋白基因(lacIq)。复制起点(oriC)来自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。启动子序列和操纵基因序列是合成的。
通过用Nde I和Xba I、BamH I、Xho I或Asp718对载体进行限制性酶切反应，将酶切产物在凝胶上电泳，并分离较大片段(填充片段应为大约310bp)，就可以将DNA插入到pHE4a中。根据实施例5中描述的PCR实验方法制备DNA插入物，所使用的PCR引物具有Nde I(5’引物)和Xba I、BamH I、Xho I或Asp718(3’引物)限制性酶切位点。PCR插入物经过凝胶纯化以及适宜的酶进行限制性酶切反应后，根据标准实验方法将其与载体相互连接。
为了在细菌系统中表达蛋白质，在上述实验方法中可以很容易地替代所用的工程化载体。实施例10从包含体中纯化G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽下面介绍的可供选择的方法可以用来纯化以包含体形式在大肠杆菌中表达的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽。除非特别指出以外，下列所有步骤都是在4-10℃条件下操作。
在完成了大肠杆菌发酵的生产阶段以后，紧接着将细胞培养物冷却到4-10℃，通过15,000转/分(Heraeus Sepatech)连续离心，收获细胞。根据每单位重量的细胞糊状物中的预计蛋白产量和希望获得的纯化蛋白的量，根据重量计算，将合适量的细胞糊状物重悬于含有100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4的缓冲溶液中。用高剪切力搅拌器将细胞分散成均匀的悬浊液。
在4000-6000psi(磅/平方英寸)的压力下，使该溶液流经微量流化器(Microfuidics，Corp.或APV Gaulin，Inc.)两次裂解细胞。然后把该匀浆物与NaCl溶液混合，NaCl的终浓度为0.5M。随后以7000×g离心力离心15分钟。所得到的沉淀再用0.5M NaCl，100mM Tris，50mMEDTA，pH7.4的溶液洗涤。
用1.5M盐酸胍(GuHCl)溶解洗涤后的包含体2-4小时。以7000×g离心力离心15分钟后，弃去沉淀，将含有多肽的上清液在4℃继续孵育过夜，以利于盐酸胍的进一步提取。
用高速离心(30,000×g)除去不可溶的颗粒之后，将盐酸胍提取物与20倍体积的、含有50mM钠，pH4.5，150mM NaCl，2mM EDTA的缓冲液经强力搅拌而迅速混合，以便使盐酸胍中溶解的蛋白发生再折叠。再折叠后的稀释蛋白溶液保持在4℃12小时，并不再进行混合，直到进行进一步的纯化步骤。
为了使再折叠的多肽溶液澄清，要使用事先准备好的切线过滤装置，它装备了具有合适表面积的0.16μM滤膜(如Filtron)，并用40mM乙酸钠(pH6.0)进行平衡。将过滤后的样品上载到阳离子交换树脂柱(如PorosHS-50，Perseptive Biosystems)上。用40mM乙酸钠，pH6.0溶液洗柱，用在同样缓冲液中的250mM、500mM、1000mM和1500mM NaCl，以梯度方式进行洗脱。连续监测流出物在280nm的吸光度。收集各个部分并进一步通过SDS-PAGE进行分析。
然后将含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的部分混合在一起，加入4倍体积的水。将稀释后的样品上载到事先准备好的一套串联起来的强阴离子(Poros HQ-50，Perseptive Biosystems)和弱阴离子(PorosCM-20，Perseptive Biosystems)交换树脂柱。用40mM乙酸钠，pH6.0溶液平衡这些离子交换柱。两种离子交换柱都用40mM乙酸钠，pH6.0，200mM NaCl溶液进行洗涤。然后用10倍体积的线性梯度的洗脱液洗脱CM-20柱，洗脱液的线性梯度范围是从0.2M NaCl，50mM乙酸钠，pH6.0到1.0M NaCl，50mM乙酸钠，pH6.5。在对流出物进行连续的280nm吸光度(A280)监测的情况下收集各个洗脱部分。然后将含有该多肽的部分(通过例如16％的SDS-PAGE来确定)混合在一起。
经过上述的再折叠和纯化步骤，最终获得的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的纯度应该大于95％。当上载5μg纯化蛋白时，在考马斯蓝染色的16％SDS-PAGE凝胶上不应该观察到主要污染物条带。纯化的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽也可以接受内毒素/LPS污染检测，根据LAL试验，脂多糖的含量典型地少于0.1ng/ml。实施例11在杆状病毒表达式系统中克隆和表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)在本实施例中，我们使用质粒穿梭载体A2，将G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸插入到杆状病毒中，表达G蛋白趋化因子受体。该表达载体含有苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的多角体蛋白强启动子，接着是合适的限制性酶切位点，例如BamHI，Xba I和Asp718。猿病毒(SV40)的聚腺苷酸化位点被用来实现有效的聚腺苷酸化。为了容易筛选重组病毒，质粒中含有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，该基因位于同方向的弱的果蝇启动子的控制之下，然后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。插入的基因的两侧均被病毒序列所包围，以便与野生型病毒DNA进行细胞介导的同源重组，产生能够存活的病毒，该病毒表达已经被克隆的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸。
许多其他的杆状病毒载体都可以用来替代上述的载体，例如pAc373，pVL941和pAcIMl，正像本领域的熟练技术人员很容易理解的那样，只要该结构提供了转录、翻译、分泌以及类似的适当定位信号，包括必需的信号肽和框架内的AUG就行。这样的载体已经被描述过了，例如，见Luckow等，Virology 170，31-39(1989)。
特别地，使用在实施例5中描述过的PCR方法，扩增包含在保臧克隆中的，包括AUG起始密码子和任何天然关联的前导序列的G蛋白趋化因子受体(CCR5)cDNA。如果天然信号序列被用来产生分泌蛋白，那么pA2载体就不需要第二个信号肽。另外，可以使用Summers等，″AManual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell CultureProcedures，″Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987)所描述的标准方法，对载体进行修饰(pA2 GP)，以包含杆状病毒前导序列。
使用商品试剂盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)，从1％琼脂糖凝胶中分离扩增出来的片段。用合适的限制性内切酶消化该片段，然后用1％琼脂糖凝胶再次纯化。
使用本领域已知的常规操作方法，用相应的限制性内切酶消化质粒，并任选地使用牛小肠磷酸酶去磷酸化。然后使用商品试剂盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)，从1％琼脂糖凝胶中分离DNA。
用T4 DNA连接酶连接该片段和去磷酸化的质粒。将连接混合物转化大肠杆菌HB101或其他合适的大肠杆菌宿主细胞，例如XL-1Blue(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，并将细胞涂布到培养板上。消化来自单个菌落的DNA并通过凝胶电泳分析消化产物，识别含有质粒的细菌。克隆片段的序列通过DNA测序来证实。
使用由Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417(1987)描述的脂转染方法，将5μg含有该多核苷酸的质粒与1.0μg商品化的线性杆状病毒DNA(″BaculoGoldTMbaculovirus DNA″，Pharmingen，San Diego，CA)共转染。1μg BaculoGoldTM病毒DNA与5μg质粒在含有50μl无血清Grace’s培养基(Life TechnologiesInc.，Gaitliersburg，MD)的无菌微量滴定板孔中混合。然后，加入10μl Lipofectin和90μl Grace’s培养基，室温下混合并孵育15分钟。然后将转染混合物滴加到种在35mm组织培养板上的Sf9昆虫细胞(ATCCCRL 1711)上，培养板中含有1ml无血清Grace’s培养基。然后将培养板在27℃孵育5小时。从培养板中移出转染液，加入1ml补充了10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。然后在27℃继续培养4天。
4天后收集上清，按照Summers和Smith前述的方法进行噬斑实验。使用含有“蓝胶”(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)的琼脂糖凝胶以便容易地识别和分离表达半乳糖苷酶的克隆，该克隆可以产生蓝染的噬斑。(这种类型的“噬斑实验”的详细描述可以在LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg分发的昆虫细胞培养和杆状病毒使用手册第9-10页中找到)。经过适当的孵育以后，用微量加样器(例如，Eppendorf)的尖端挑出蓝染噬斑。然后将含有重组病毒的琼脂重悬于含有200μl Grace’s培养基的微量离心管中，含有重组杆状病毒的该悬浊液被用来感染种在35mm平皿上的Sf9细胞。4天后收获这些培养平皿中的上清液并贮存在4℃。
为了证实该多肽的表达，Sf9细胞生长在补充了10％热失活的胎牛血清的Grace’s培养基中。用含有该核苷酸的重组杆状病毒感染Sf9细胞，感染复数(“MOI”)大约为2。如果希望得到放射标记的蛋白，就在6小时后移走培养基，替代以不含有甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II(由Life Technologies Inc.，Rockville，MD提供)培养基。42小时后，加入5μCi35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(Amersham公司提供)。继续孵育细胞16小时，离心收获。用SDS-PAGE方法分析上清中的蛋白和细胞内的蛋白，然后进行放射自显影(如果进行了放射标记的话)。
可以对纯化的蛋白的氨基末端的氨基酸序列进行微量测序，以确定所产生的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的氨基端序列。实施例12G蛋白趋化因子受体(CCR5)在哺乳动物细胞中的表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽可以在哺乳动物细胞中表达。典型的哺乳动物细胞表达载体含有一个启动子元件，它介导mRNA的起始转录；一段蛋白编码序列；以及转录终止和转录本的聚腺苷酸化所需要的信号。另外的元件包括增强子，Kozak序列以及间插序列，在间插序列两侧连接着供RNA剪切的供体和受体位点。利用来自SV40病毒的早期和晚期启动子、逆转录病毒例如RSV，HTLVI，HIVI的长末端重复(LTRs)、以及巨细胞病毒(CMV)的早期启动子，可以获得高效转录。然而，也可以使用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。
在进行本发明的工作中使用的合适的表达载体包括例如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，pRSVcat(ATCC 37152)，pSV2DHFR(ATCC 37146)，pBC12MI(ATCC 67109)，pCMVSport 2.0，和pCMVSport3.0载体。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人的Hela、293、H9和Jurkat细胞，鼠的NIH3T3和C127细胞，Cos1、Cos7和CV1细胞，鹌鹑QC1-3细胞，鼠的L细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
另外，G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽也可以在含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的稳定的细胞系中表达，而G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸是整合到细胞的染色体上的。与选择性标记，例如DHFR，gpt，新霉素，潮霉素共转染，使得可以识别和分离被转染的细胞。
被转染的G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因也可以被扩增，从而大量表达其编码的蛋白。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记在建立可携带几百个甚至几千个拷贝的目的基因的细胞系的工作中很有用途。(见，例如Alt，F.W.，等，J.Biol.Chem.2531357-1370(1978)；Hamlin，J.L.和Ma，C.，Biochem.et Biophys.Acta，1097107-143(1990)；Page，M.J.和Sydenham，M.A.，Biotechnology 964-68(1991).)另一个有用的选择性标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，Biochem J.227277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology 10169-175(1992))。使用这些标记时，哺乳动物细胞生长在选择性培养基中，选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有已整合到染色体中的扩增的基因。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和NSO细胞经常被用来生产蛋白。
pSV2-DHFR质粒(ATCC登记号.37146)的衍生物，表达载体pC4(ATCC登记号209646)和pC6(ATCC登记号209647)含有劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，Molecular and Cellular Biology，438-447(1985年3月))加上CMV增强子的一个片段(Boshart等，Cell41521-530(1985).)。多克隆位点，例如BamHI，Xbal和Asp718的限制性酶切位点，可以使G蛋白趋化因子受体的克隆更加简化。这些载体还含有3’内含子，大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化和终止信号，处于SV40早期启动子控制之下的小鼠DHFR基因。
特别地，通过本领域已知的操作，用限制性内切酶消化质粒pC6或pC4，在其多克隆位点内切开，然后用牛小肠磷酸酶进行去磷酸化。再用1％琼脂糖凝胶分离该载体。
可以对载体进行修饰，使其包括一段异源性信号序列，以便使蛋白能够从细胞中分泌出来。(见，例如WO 96/34891)用限制性内切酶消化扩增出来的片段，产生与被消化的载体互补的末端，用商品化试剂盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)在1％琼脂糖凝胶上纯化该片段。然后用T4 DNA连接酶连接分离出来的片段和去磷酸化的载体。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞，再用例如限制性酶切分析的方法，识别含有插入pC6或pC4质粒的片段的细菌。
缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞可被用来做转染。5μg pC6或pC4表达质粒与0.5μg pSV2neo质粒用Lipofectin(Felgner等，见前述)进行共转染。pSV2neo质粒含有一个显性选择标记，neo基因来自Tn5，它编码一种酶，该酶可赋予针对包括G418在内的一组抗生素的抗性。细胞被种在补充了1mg/ml G418的α-MEM培养基中。2天后，用胰蛋白酶消化细胞，将其种在杂交瘤克隆板上(Greiner，德国)，板中有补充了10、25、50ng/ml氨甲喋呤加1mg/ml G418的α-MEM培养基。10-14天后，用胰蛋白酶消化单克隆，种在6孔培养皿或10ml烧瓶中，其中使用不同浓度的氨甲喋呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。将能够生长在最高浓度的氨甲喋呤中的克隆转移到含有甚至更高浓度的氨甲喋呤(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)的新的6孔培养皿中。重复同样的操作，直到获得可以在100-200μM的氨甲喋呤中生长的克隆。采用例如SDS-PAGE和Western印迹或反相HPLC分析方法分析G蛋白趋化因子受体(CCR5)的表达。实施例13N端和/或C端缺失突变体的构建下列普通的研究方法可以用来克隆N端和/或C端缺失的G蛋白趋化因子受体(CCR5)缺失突变体。一般来说，两个约15-25个核苷酸的寡核苷酸引物来自SEQ ID NO1或保藏克隆(SEQ ID NO21)的一段多核苷酸的所期望的5’和3’位置。引物的5’和3’位置是根据所期望的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸片段来确定的。如果有必要的话，可以在5’和3’引物上分别添加一个起始和终止密码子，以便表达由这段G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸片段所编码的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽片段。优选的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸片段是那些编码在本说明书的“多核苷酸和多肽片段”部分所述的N端和C端缺失突变体的片段。
含有限制性酶切位点的另外的核苷酸也可以附加在5’和3’引物序列上，它们可以使把G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸片段克隆到目的载体上的工作变得更加容易。使用在此讨论的或本领域已知的合适的PCR寡核苷酸引物和条件，将G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸片段从基因组DNA或保藏的cDNA中扩增出来。由本发明的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸片段编码的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽片段可以用对待全长多肽的同样的普通方法表达和纯化出来，然而常规的修饰可能是必须的，因为在全长的多肽和其特别的片段之间存在着理化性质的差异。
下面的例子仅作为例证而不是限制本发明，编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的Y-37到Q-280片段的多核苷酸被扩增出来并按下列步骤克隆制备一个5’引物，它包含一个限制性酶切位点，后面是一个起始密码子，该密码子位于编码起始于Y-37的多肽片段的N端部分的多核苷酸序列的框架内；制备一个互补的3’引物，它包含一个限制性酶切位点，后面是一个终止密码子，该密码子位于编码终止于Q-280的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽片段的C端部分的多核苷酸序列的框架内。
扩增出来的多核苷酸片段和表达载体都用能够识别引物上的这些位点的限制性内切酶消化，将消化过的多核苷酸连接在-起。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸片段就被插入到限制性表达载体中，优选将G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸片段编码区置于启动子的下游。按照此处实施例中描述的方法，使用标准操作方法，将连接混合物转化进感受态大肠杆菌细胞。从抗性菌落中分离质粒DNA，用限制性酶切分析、PCR和DNA测序方法，确认克隆出来的DNA的身份。实施例14G蛋白趋化因子受体的蛋白融合物G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽优选与其他蛋白融合。这些融合蛋白可以有各种各样的应用。例如，将G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽与His-标签，HA-，蛋白A，IgG域，麦芽糖结合蛋白融合，可以使纯化更加容易。(见实施例9，也可参见EP A 394,827；Traunecker等，Nature 33184-86(1988))。类似地，与IgG-1、IgG-3、白蛋白融合，可以增加其在体内的半衰期。将核定位信号与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽融合，可以将蛋白导向特殊的亚细胞定位，而共价异二聚体或同型二聚体可以增强或减弱融合蛋白的活性。融合蛋白还可以产生具有不止一种功能的嵌合分子。最后，与非融合蛋白相比，融合蛋白还可以增加被融合蛋白的溶解度和/或稳定性。前面描述过的所有类型的融合蛋白都可以通过修改下文的方法或者实施例9中的方法而制备出来，下文的方法简述了多肽与IgG分子的融合。
简而言之，可以使用跨过下面描述的序列的5’和3’端的引物，用PCR方法扩增人IgG分子的Fc部分。这些引物也应当具有合适的限制性酶切位点，它可以使将片段克隆到表达载体的工作更加容易，表达载体首选哺乳动物表达载体。
例如，如果使用pC4(登记号209646)，人Fc部分可以连接到BamHI位点。注意3’端的BamH I位点应该被破坏掉。下一步，含有人Fc部分的载体用BamH I再次酶切，使载体线性化，再把按照实施例5所描述的PCR方法分离出来的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸连接到BamHI位点。注意多核苷酸在克隆时不要带有终止密码子，否则将不会产生融合蛋白。
如果用天然的信号序列制备分泌蛋白，pC4就不需要第二个信号肽。另外，如果没有使用天然的信号序列，可以对载体进行修饰，以便包括一个异源的信号序列。(见，例如WO 96/34891)人IgG Fc区GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT (SEQ ID NO10)实施例15抗体的制备杂交瘤技术本发明的抗体可以通过多种方法制备(见Current Protocols，第2章)。作为这些方法中的一个例子，可以将表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞施用于动物体，诱导产生含有多克隆抗体的血清。在优选的方法中，制备的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白要充分去除其天然污染物。然后将经过这样制备的蛋白导入动物体，以便制备具有更高特异性的多克隆抗血清。
使用杂交瘤技术制备针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的特异性单克隆抗体。(Kohler等，Nature 256495(1975)；Kohler等.，Eur.J.Immunol.6511(1976)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6292(1976)；Hammerling等，在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，pp.563-681(1981))。一般来说，用G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽免疫动物(首选小鼠)，或者更优选用分泌型的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的表达细胞进行免疫。这种多肽表达细胞可以培养在任何合适的组织培养基中，优选补充了10％的胎牛血清(在大约56℃失活)的Earle’s改良Eagle’s培养基，其中还补充了大约10g/L非必需氨基酸，大约1,000U/ml青霉素和大约100μg/ml链霉素。
取出这种免疫后的小鼠的脾细胞，使其与合适的骨髓瘤细胞系融合。根据本发明，任何合适的骨髓瘤细胞系都可以使用；然而，首选使用可从ATCC获得的亲本骨髓瘤细胞系(SP20)。融合后，获得的杂交瘤细胞被选择性地维持在HAT培养基中，随后用Wands等人描述的有限稀释法(Gastroenterology 80225-232(1981))进行克隆。然后对通过这种选择方法获得的杂交瘤细胞进行检测，确定分泌能与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合的抗体的克隆。
另外，使用抗独特型抗体，进行两步操作，可以制备出能够与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽结合的另外的抗体。这种方法利用的是这样的事实即抗体本身也是抗原，因此，获得一种可以结合到第二种抗体上的抗体是可能的。根据本方法，用蛋白特异性抗体免疫动物，首选小鼠。用该动物的脾细胞制备杂交瘤细胞，然后筛选杂交瘤细胞，确认能够制备如下抗体的克隆，这种抗体能够与G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽特异性抗体结合，而它的这种能力又可以被G蛋白趋化因子受体(CCR5)所封闭。这样的抗体中含有针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白特异性抗体的抗独特型抗体，可以用它来免疫动物，诱导形成更进一步的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白特异性抗体。
在人体内使用的抗体是“人源化”的抗体，这样的抗体可以通过使用来源于杂交瘤细胞的遗传结构来制备，该杂交瘤细胞是用来制备上述的单克隆抗体的。制备嵌合抗体和人源化抗体的方法在本领域是众所周知的，并在此讨论。(见，综述Morrison，Science 2291202(1985)；Oi等，BioTechniques 4214(1986)；Cabilly等.，美国专利4,816,567；Taniguchi等，EP 171496；Morrison等.，EP 173494；Neuberger等，WO 8601533；Robinson等，WO 8702671；Boulianne等，Nature312643(1984)；Neuberger等，Nature 314268(1985).)从scFvs的文库中分离直接针对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体片段从人PBL(外周血淋巴细胞)中分离出来的天然的V基因被构建成一个抗体片段文库，其中的抗体片段包含对G蛋白趋化因子受体(CCR5)的反应性，该供体可能已经暴露或可能没有暴露于此受体。(见，例如U.S.专利5,885,793，在此全部并入作为参考文献)文库的拯救。
如PCT出版物WO 92/01047所述，scFv文库是从人PBL的RNA构建的。为了拯救展示抗体片段的噬菌体，大约109个包含噬菌粒的大肠杆菌菌种被接种到50ml 2×YT培养基中，培养基中还含有1％的葡萄糖和100μg/ml的氨苄青霉素(2×TY-AMP-GLU)，震荡培养细菌，使其生长到O.D值为0.8。取5ml这样的培养物，接种到50ml 2×TY-AMP-GLU中，加入2×108TU(转导单位)的δ基因III辅助噬菌体(M13δ基因III，见PCT出版物WO 92/01047)，在37℃培养45分钟，不进行震荡，然后在37℃震荡培养45分钟。将培养物以4000转/分的速度离心10分钟，将沉淀重悬于2升2×YT培养基中，培养基中含有100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素，生长过夜。按照PCT出版物WO 92/01047所述方法制备噬菌体。
M13δ基因III的制备方法如下M13δ基因III辅助噬菌体不编码基因III的蛋白，因此，展示抗体片段的噬菌体(粒)具有更高的结合抗原的亲和力。感染性的M13δ基因III颗粒是通过让辅助噬菌体在包含了pUC19衍生物的细胞中生长而制备出来的，pUC19衍生物在噬菌体形态发生期提供野生型的基因III蛋白。将培养物在37℃孵育1小时，无需震荡，然后在37℃震荡培养再1小时。离心沉淀细胞(lEC-Centra8,400转/分，共10分钟)，用300ml含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的2×YT培养基(2×TY-AMP-KAN)重悬细胞，37℃震荡生长过夜。通过两次PEG沉淀，将噬菌体颗粒从培养基中纯化和浓缩出来(Sambrook等，1990)，将其重悬于2ml PBS中，通过0.45μm滤器(Minisart NML；Sartorius)过滤，最终浓度大约为1013转导单位/ml(氨苄青霉素抗性克隆)。
文库的淘选。
用4ml 100μg/ml或10μg/ml本发明的多肽在PBS溶液中过夜包被免疫试管(Nunc)，在37℃用290 Marvel-PBS溶液封闭试管2小时，然后用PBS溶液洗涤3次。加入大约1013转导单位的噬菌体，室温下在垂直转动的转盘上翻转孵育30分钟，然后再静置1.5小时。用含1％的Tween-20的PBS洗涤试管10次，再用PBS洗涤10次。在试管中加入1ml100mM的三乙胺，并在垂直转动的转盘上旋转15分钟，洗脱噬菌体，然后，立即用0.5ml 1.0M Tris-HCl，pH7.4中和溶液。然后用这些噬菌体感染10ml对数生长中期的TG1大肠杆菌，方法是把洗脱下来的噬菌体与细菌在37℃孵育30分钟。随后将大肠杆菌涂布在含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE平板上。然后按前述方法，用δ基因III辅助噬菌体拯救所得到细菌文库，制备出噬菌体用于下一轮的选择。该过程总共要重复4轮亲和纯化，在第三轮和第四轮，用含0.1％Tween-20的PBS所进行的试管洗涤增加到20次，用PBS所进行的试管洗涤也增加到20次。
结合物的特性描述。
从第3轮和第4轮选择中洗脱下来的噬菌体被用来感染大肠杆菌HB2151，从单菌落中制备可溶性scFv(Marks等，1991)用于实验检测。在微量滴定板上进行ELISA实验，微量滴定板用10pg/ml本发明的多肽包被，该多肽溶解在pH9.6的50mM碳酸氢盐溶液中。在ELISA反应中呈阳性的克隆进一步被PCR指纹技术(见，例如PCT出版物WO92/01047)以及随后的测序所表征。还可以通过本领域已知的技术，如表位作图、结合亲合性、受体信号转导、阻断或竞争抑制抗体/抗原结合的能力、和竞争性激动剂或拮抗剂活性，进一步表征这些ELISA阳性克隆。实施例16用来进行高通量筛选试验的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白或配体的制备下列方法可制备含有可溶性G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽或G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体的上清液以供测试。G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体包括MIP(巨噬细胞炎症蛋白)-1α，MIP-1β，MCP(甲基受体趋化性蛋白)-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)，RANTES和HIV。该上清液可以用于在实施例18-25中描述的筛选实验。
首先，按1∶20的比例在PBS溶液(有或没有钙或镁17-516FBiowhittaker)中将聚-D-赖氨酸(644 587 Boelirrnger-Mannheim)贮存液(1mg/ml在PBS中)稀释到工作浓度(50μg/ml)。在24孔板每个孔中加入200μl该溶液，室温下孵育20分钟。注意要让溶液覆盖整个孔(注可以使用12道加样器，每隔一道更换吸头)。吸出聚-D-赖氨酸溶液，用1ml PBS(磷酸盐缓冲液)清洗每个板孔。应将PBS溶液留在孔中直到临放入细胞前，而聚-赖氨酸包被培养板可以在此前不超过2周进行。
将293T细胞加入含0.5ml DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)(其中含有4.5g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺(12-604F Biowhittaker)，10％热失活的胎牛血清(14-503F Biowhittaker)/1×Penstrep(青链霉素)(17-602E Biowhittaker))的板孔中，浓度为2×105细胞/孔。让细胞生长过夜。
第二天，在无菌溶液槽中混合下列物质300μl Lipofectamine(18324-012 Gibco/BRL)和5ml Optimem I(31985070 Gibco/BRL)/96孔板。用小体积的多道加样器，把大约2μg根据实施例8-10中描述过的方法制备出来的、含有插入的多核苷酸的表达载体等分试样，加入经过适当标记的96孔圆底培养板中。用多道加样器，在每个孔中加入50μlLipofectamine/Optimem I混合物。轻柔地进行吸取/排出的操作以使之混合，室温下孵育15-45分钟。大约20分钟后，使用多道加样器在每个孔中加入150μl Optimem I。在另外一个培养板中加入没有插入多核苷酸的载体DNA，同样也按照转染的每道程序进行操作以作为对照。
转染工作首选采用两人一组的方式完成下列任务，通过采用两人一组的方式，所用时间就会减少一半，细胞也就不会在PBS溶液中停留太长时间。首先，操作者A从4个培养着细胞的24孔培养板中吸弃培养基，随后操作者B用0.5-1ml PBS清洗每个板孔。操作者A再吸弃PBS清洗液，操作者B用每隔一道更换吸头的12道加样器首先给24孔培养板上每一排的每个奇数孔加200μl DNA/Lipofectamine/Optimem I复合物，然后再加偶数孔。将培养板放在37℃孵育6小时。
当进行细胞孵育时，要准备合适的培养基，合适的培养基或者是含有1％牛血清白蛋白和1×penstrep(青链霉素)的DMEM，或者是含有2mM谷酰胺和1×penstrep(青链霉素)的HGS CHO-5培养基(116.6mg/L CaCl2(无水)；0.00130mg/L CuSO4-5H2O；0.050mg/LFe(NO3)3-9H2O；0.417mg/L FeSO4-7H2O；311.80mg/L KCl；28.64mg/L MgCl2；48.84mg/L MgSO4；6995.50mg/L NaCl；2400.0mg/LNaHCO3；62.50mg/L NaH2PO4-H2O；71.02mg/L Na2HPO4；0.4320mg/LZnSO4-7H2O；0.002mg/L花生四烯酸；1.022mg/L胆固醇；0.070mg/LDL-α-醋酸维生素E；0.0520mg/L亚油酸；0.010mg/L亚麻酸；0.010mg/L肉豆蔻酸；0.010mg/L油酸；0.010mg/L Palmitricacid；0.010mg/L棕榈酸；100mg/L Pluronic F-68；0.010mg/L硬脂酸；2.20mg/LTween80；4551mg/L D-葡萄糖；130.85mg/ml L-丙氨酸；147.50mg/ml L-精氨酸-HCL；7.50mg/ml L-天冬酰胺-H2O；6.65mg/ml L-天(门)冬氨酸；29.56mg/ml L-胱氨酸-2HCL-H2O；31.29mg/ml L-胱氨酸-2HCL；7.35mg/ml L-谷氨酸；365.0mg/ml L-谷氨酰胺；18.75mg/ml甘氨酸；52.48mg/ml L-组氨酸-HCL-H2O；106.97mg/ml L-异亮氨酸；111.45mg/ml L-亮氨酸；163.75mg/ml L-赖氨酸HCL；32.34mg/mlL-甲硫氨酸；68.48mg/ml L-苯丙氨酸；40.0mg/ml L-脯氨酸；26.25mg/ml L-丝氨酸；101.05mg/ml L-苏氨酸；19.22mg/ml L-色氨酸；91.79mg/ml L-酪氨酸-2Na-2H2O；和99.65mg/ml L-缬氨酸；0.0035mg/L生物素；3.24mg/L D-Ca泛酸盐；11.78mg/L氯化胆碱；4.65mg/L叶酸；15.60mg/Li-环己六醇；3.02mg/L烟酰胺；3.00mg/L吡哆醛HCL；0.031mg/L吡哆醇HCL；0.319mg/L核黄素；3.17mg/L硫胺素HCL；0.365mg/L胸苷；0.680mg/L维生素B12；25mM HEPES缓冲液；2.39mg/L次黄嘌呤钠；0.105mg/L硫辛酸；0.081mg/L腐胺钠-2HCL；55.0mg/L丙酮酸钠；0.0067mg/L亚硒酸钠；20uM乙醇胺；0.122mg/L柠檬酸铁；41.70mg/L甲基-β-环糊精与亚油酸复合物；33.33mg/L甲基-β-环糊精与油酸的复合物；10mg/L甲基-β-环糊精与乙酸视黄醛复合物，调节渗透摩尔浓度到327mOsm)(BSA(81-068-3Bayer)100g溶于1L DMEM溶液中作为10％BSA贮存液)。过滤培养基，收集50μl培养基，在15ml聚苯乙烯锥形管中检测内毒素。
在孵育结束阶段，首选采用两人一组的方式终止转染反应。操作者A吸弃转染培养基，而操作者B给每个孔加入1.5ml合适的培养基。根据所使用的培养基的不同，在37℃孵育45小时或72小时，含1％牛血清白蛋白的培养基孵育45小时，CHO-5培养基孵育72小时。
在第四天，使用300μl多道加样器，在一个1ml深孔培养板中每孔加入600μl等分试样上清液，剩余的上清液加到一个2ml深孔培养板中。然后每孔中的上清液就可以在实施例18-25所描述的实验中使用了。
特别需要明确指出的是，当使用上清液在任何下述实验中测得活性时，该活性不是直接来自G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽(例如，作为分泌的、可溶的或膜相关的蛋白)，就是直接来自G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体，或是通过G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体诱导其他蛋白的表达、这些蛋白随即分泌到上清液中而产生的。因此，本发明进一步提供识别通过在具体实验中的活性表征的上清液中的蛋白的方法。实施例17GAS报道结构的构建一种涉及细胞的分化和增殖的信号转导途径被称作Jaks-STATs途径。在Jaks-STATs途径中，被激活的蛋白结合到γ活化位点“GAS”元件或干扰素敏感反应元件(“ISRE”)上，这些元件定位于许多基因的启动子中。蛋白与这些元件的结合改变了相关基因的表达。
GAS和ISRE元件被一类转录因子所识别，它们被称作信号转导物和转录激活物，或“STATs”。STATs家族有六个成员。Stat1和Stat3在许多细胞类型中都存在，Stat2也同它们一样(因为对α干扰素的反应是普遍性的)，Stat4有较严格的限制性，虽然已经在I类T辅助细胞和用IL-12(白细胞介素12)处理过的细胞中发现了它的存在，但在许多细胞类型中都不存在Stat4。Stat5原来被称作乳腺生长因子，但现已发现它在其他细胞，包括骨髓来源的细胞中的浓度更高。在组织培养细胞中，它可以被许多细胞因子所激活。
这些STATs可以被一组被称作Janus激酶(“Jaks”)家族的激酶所激活，通过酪氨酸磷酸化作用，从细胞浆移位到细胞核。Jaks代表一个独特的可溶性酪氨酸激酶家族。包括Tyk2，Jak1，Jak2和Jak3。这些激酶表现出明显的序列相似性，并且通常在静止细胞中没有催化活性。
Jaks可以被很宽范围的受体所激活，这些受体在下面的表3中概述(改编自Schidler和Darnell的综述，Ann.Rev.Biochem.64621-51(1995).)。能够激活Jaks的细胞因子受体家族被分成两组(a)一类包括IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15，Epo，PRL，GH，G-CSF，GM-CSF，LIF，CNTF和血小板生成素的受体；和(b)二类包括IFN-α，IFN-g，和IL-10受体。一类受体都含有一个保守的半胱氨酸基序(一组4个保守的半胱氨酸和一个色氨酸)和一个WSXWS基序(一个编码Trp-Ser-Xxx-Trp-Ser(SEQ ID NO11)的近膜区)。
因此，当配体结合到受体上的时候，Jaks被激活，它随即激活STATs，然后STATs发生移位，结合到GAS元件上。整个过程都包括在Jaks-STATs信号转导途径中。
所以，通过GAS或ISRE元件的结合所反映出来的Jaks-STATs途径的激活，可以用来指示与细胞的分化和增殖有关的蛋白。例如，已知生长因子和细胞因子可以激活Jaks-STATs途径(见下面的表3)，所以，通过使用与受体分子连结的GAS元件，可以辨识出Jaks-STATs途径的激活物。表3JAKsSTATSGAS(元件)或ISRE配体tyk2Jak1Jak2Jak3IFN家族IFN-a/B + + - - 1，2，3 ISREIFN-g+ + - 1 GAS(IRF1＞Lys6＞IFP)Il-10+ ？ ？ - 1，3gp130家族IL-6(多效的) + + + ？1，3GAS(IRF1＞Lys6＞IFP)Il-11(多效的)？ + ？ ？1，3OnM(多效的) ？ + + ？1，3LIF(多效的) ？ + + ？1，3CNTF(多效的)-/+ + + ？1，3G-CSF(多效的)？ + ？ ？1，3IL-12(多效的)+ - + + 1，3g-C家族IL-2(淋巴细胞) - + - + 1，3，5 GASIL-4(淋巴/骨髓) - + - + 6 GAS(IRF1＝IFP＞＞Ly6)(IgH)IL-7(淋巴细胞) - + - + 5 GASIL-9(淋巴细胞) - + - + 5 GASIL-13(淋巴细胞) - + ？ ？6 GASIL-15？ + ？ + 5 GASgp140家族IL-3(骨髓) - - - - - GAS(IRF1＞IFP＞＞Ly6)IL-5(骨髓) - - + - 5 GASGM-CSF(骨髓) - - + - 5 GAS生长激素家族GH ？ - + - 5PRL ？ +/- + - 1，3，5EPO ？ - + - 5 GAS(B-CAS＞IRF1＝IFP＞＞Ly6)受体酪氨酸激酶EGF ？ + + - 1，3GAS(IRF1)PDGF ？ + + - 1，3CSF-1？ + + - 1，3GAS(notIRF1)
为了构建用于实施例18-19所描述的生物学检测实验的、含有启动子元件的合成的GAS，我们使用了基于PCR的策略以生成GAS-SV40启动子序列。5’引物含有4个GAS结合位点的串联拷贝，该位点是在IRF1启动子中被发现的，并经过事先确证在许多细胞因子的诱导下可以结合STAT。(Rothman等，Immunity 1457-468(1994).)。然而其他的GAS或ISRE元件也可以用来替换它。5’引物还含有与SV40早期启动子序列互补的18bp序列，一侧带有Xho I位点。5’引物的序列是5’GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG3’(SEQ ID NO12)下游引物与SV40的启动子序列互补，该引物的一侧带有Hind III位点5’GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC3’(SEQ ID NO13)。
使用SV40启动子模板进行PCR扩增，该模板存在于从Clontech公司获得的β-半乳糖苷酶启动子质粒中。用Xho I/Hind III消化所得到的PCR片段，将其亚克隆到BLSK2-(Stratagene.)质粒中。用正向和反向引物测序，证明插入片段含有下面的序列5’CTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT3’(SEQ ID NO14)随着该GAS元件被连接到SV40启动子上，下一步就是要构建GASSEAP2报道结构。在此，报道分子是分泌性的碱性磷酸酶，或“SEAP”。然而很明显的是，在本实施例或其他的实施例中，都可以用任何其他的报道分子替代SEAP。可以用来代替SEAP的众所周知的报道分子包括氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)，或任何可被抗体所检测的蛋白。
上面的序列证明通过使用Xho I和Hind III酶，合成的GAS-SV40启动子元件被亚克隆到来自Clontech公司的pSEAP-启动子载体中，用GASSV40启动子元件有效取代了SV40启动子，创造出GAS-SEAP载体。然而，该载体不合有新霉素抗性基因，因此并不优选用于哺乳动物表达系统。
因此，为了建立能够表达GAS-SEAP报道分子的稳定的哺乳动物细胞系，使用Sal I和Not I酶，将GAS-SEAP表达盒从GAS-SEAP载体中切下来，利用多克隆位点中的限制性酶切位点，将其插入到含有新霉素抗性基因的载体骨架，例如pGFP-1(Clontech)中，创建GAS-SEAP/Neo载体。正如实施例18-19所描述的那样，一旦这种载体被转染进哺乳动物细胞，这种载体就随即被用来作为指示GAS结合的报道分子。
通过采用上述描述的方法，并用不同的启动子序列取代GAS也可以构建其他的结构。例如，在实施例20和21中描述了含有NFκ-B和ECG启动子序列的报道分子的结构。然而，使用在这些实施例中描述的方法，许多其他的启动子也可以被取代。例如，SRE、IL-2、NFAT或骨钙素启动子就可以被单独或联合取代(例如GAS/NF-K B/EGR，GAS/NF-K B，II-2/NFAT，或NF-KB/GAS)。与此相类似，其他的细胞系也可以被用来检测报道结构的活性，这些细胞系有例如HELA(上皮细胞)，HUVEC(内皮细胞)，Reh(B细胞)，Saos-2(成骨细胞)，HUVAC(主动脉细胞)或心肌细胞。实施例18T细胞活性的高效筛选实验下面的方法是用于评估T细胞的活性的，就是通过识别某些因子，以及确定含有本发明的多肽或其配体的上清液是否使T细胞增生和/或分化，来评估T细胞的活性。使用在实施例17中构建的GAS/SEAP/Neo构建体对T细胞活性进行评估。因此，那些增强SEAP活性的因子显示出能够激活Jaks-STATs信号转导途径的能力。在本实验中使用的T细胞是Jurkat T细胞(ATCC保藏号TIB-152)，虽然也可以使用Molt-3细胞(ATCC保藏号CRL-1552)和Molt-4细胞(ATCC保藏号CRL-1582)。
Jurkat T细胞是淋巴母细胞性CD4+Th1类辅助细胞。为了产生稳定的细胞系，使用DMRIE-C(Life Technologies)，将GAS-SEAP/neo载体转染给大约2百万个Jurkat细胞。(转染步骤见下面的描述)。被转染的细胞按每孔大约20,000个细胞的密度接种到细胞培养板上，筛选可以抵抗1mg/ml庆大霉素的转染物。扩增抗性克隆并随后测验其对γ-干扰素浓度不断提高的反应。证明所选择的克隆的剂量反应。
具体的，下面的方法可以产生足够的细胞量，可满足75孔、每孔200μl细胞的需求。因此，可以扩大该方法的培养规模，或是进行多次操作，以便产生足够的细胞，满足多个96孔培养板对细胞的需求。用含有10％牛血清、1％青链霉素(Pen-Strep)的RPMI培养基维持培养Jurkat细胞。将2.5ml OPTI-MEM(Life Technologies)和10μg质粒DNA在T25烧瓶中混合。加入2.5ml含有50μl DMRIE-C的OPTI-MEM，在室温下培养15-45分钟。
在孵育期间，计数细胞浓度，离心收获所需数目的细胞(每次转染需要107个细胞)，将细胞重悬于OPTI-MEM中，终浓度为107个细胞/ml。然后将1ml在OPTI-MEM中的1×107的细胞加入到T25烧瓶内，37℃孵育6小时。孵育结束后，加入10ml含15％血清的RPMI。
JurkatGAS-SEAP稳定的报道细胞系维持生长于含有10％血清、1mg/ml硫酸庆大霉素和1％青链霉素的RPMI。用含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的上清液处理这些细胞，或用含有按实施例16所描述的方法制备出来的、由G蛋白趋化因子受体(CCR5)诱导的多肽的上清液处理这些细胞。
用上清液处理细胞的当天，应该洗涤细胞，并将其重悬于含10％血清的新鲜RPMI培养基中，密度为每毫升500,000个细胞。所需细胞的准确数目将根据所要进行筛选的上清液的数目来决定。对于一个96孔培养板来说，需要大约10,000,000个细胞(10块培养板就需要100,000,000个细胞)。
将细胞转移到一个三角形的船型容器中，以便能使用12道加样器将细胞加到96孔培养板中。使用12道加样器给每个孔加入200μl细胞(就是每孔加入100,000个细胞)。
当全部的培养板都接种了细胞之后，使用12道加样器直接从含有上清液的96孔细胞培养板中每孔吸取50μl上清液，加到检测培养板的每个孔中。另外，将不同剂量的外源γ-干扰素(0.1，1.0，10ng)加到H9、H10、H11孔作为该实验的附加阳性对照。
将含有被上清液处理过的Jurkat细胞的96孔培养板被放置在孵箱中48小时(注该时间在48-72小时之间可变)。使用12道加样器从每个孔中吸出35μl样品，转移到一个不透明的96孔培养板中。这个不透明培养板需要加上盖子(使用sellophene盖子)，并贮存在-20℃，直到根据实施例18进行SEAP实验。含有剩余的经过处理的细胞的培养板放在4℃，作为材料来源，以便在需要的时候在特定孔重复该实验。
已知100单位/ml的γ-干扰素可以激活Jurkat细胞，故可用作阳性对照。在阳性对照孔，可以典型性地观察到30倍的诱导。
上述的方法可用来产生被暂时性以及稳定性转染的细胞，这对于本领域的熟练的技术人员来说是很显然的。实施例19鉴定髓样活性的高效筛选实验下面的方法是用于评估G蛋白趋化因子受体(CCR5)的髓样活性的，通过确定G蛋白趋化因子受体(CCR5)或G蛋白趋化因子受体(CCR5)的配体是否能使髓样细胞增生和/或分化来评估G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的髓样活性。使用在实施例17中构建的GAS/SEAP/Neo结构对髓样细胞活性进行评估。因此，那些能提高SEAP活性的因子显示出能够激活Jaks-STATs信号转导途径的能力。在本实验中使用的髓样细胞是U937，它是一种前单核细胞系，然而也可以选择TF-1，HL60，或KG1细胞。
为了用在实施例17中制备的GAS/SEAP/Neo结构短暂转染U937细胞，使用DEAE-Dextran方法(Kharbanda等，1994，Cell Growth&Differentiation，5259-265)。首先，收获2×10e7U937细胞并用PBS洗涤。U937细胞通常生长在含有10％热失活胎牛血清(FBS)并补充了100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI1640培养基中。
下一步，用1ml含有0.5mg/ml DEAE-Dextran，8μg GAS-SEAP2质粒DNA，140mM NaCl，5mM KCl，375μM Na2HPO4.7H2O，1mM MgCl2，和675uMCaCl2的20mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液重悬细胞，于37℃孵育45分钟。
用含有10％FBS的RPMI1640培养基洗涤细胞，然后将其重悬于完全培养基中，于37℃孵育36小时。
通过让细胞在400μg/ml G418中生长，可以获得GAS-SEAP/U937稳定细胞。
用不含G418的培养基进行常规培养，但每一到两个月，就应当让细胞在400μg/ml G418中再培养几代。
收获1×108细胞(这足以进行10块96孔板实验)，用PBS洗涤，对这些细胞进行实验检测。用200ml上述的生长培养基重悬细胞，细胞终密度为5×105细胞/ml。在96孔板的每个孔中加入200μl细胞(或1×105细胞/孔)。
每孔加入50μl根据实施例16所描述的方法制备的上清液。在37℃孵育48到72小时。已知可以激活U937细胞的100单位/ml的γ-干扰素可作为对照。在阳性对照孔中可以典型性地观察到30倍的诱导。根据实施例22中描述的方法SEAP检测上清液。实施例20鉴定神经元活性的高效筛选实验当细胞经历分化和增殖，一组基因通过许多不同信号转导途径而激活。这些基因当中的一种，即EGR1(早期生长反应基因1)，在激活的情况下，在多种组织和细胞类型中诱导产生。EGR1的启动子是这种诱导的原因。使用连接有指示分子的EGR1启动子，能够评估G-蛋白趋化因子受体(CCR5)或者它的配体对细胞激活作用。
具体的，接下来的实验流程被用来评估PC12细胞系中的神经元活性。已知PC12细胞(大鼠phenochromocytoma细胞)在许多有丝分裂原激活下可发生增殖和/或分化，这些有丝分裂原有例如TPA(十四烷佛波醇醋酸盐)，NGF(神经生长因子)，和EGF(表皮生长因子)。在经历这种处理的时候，EGR1基因的表达被激活。因此，用含有与SEAP指示分子连接的EGR启动子的构建体，稳定转染PC12细胞系，就能够评估G-蛋白趋化因子受体(CCR5)或者它的配体对PC12细胞系的激活作用。
EGR/SEAP指示分子结构可通过如下方案组装。EGR-1启动子序列(-633到+1)(Sakamoto K等，Oncogene 6867-871(1991))可以从人基因组DNA中用如下PCR引物扩增出来。
5’GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3’(SEQ ID NO15)5’GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3’(SEQIDNO16)我们使用了在实施例17中制备的GASSEAP/Neo载体，将EGR1扩增产物插入这个载体中。用限制性内切酶XhoI/HindIII使GASSEAP/Neo载体线性化，移除GAS/SV40填充片断。用相同的限制性酶消化EGR1扩增产物。连接载体和EGR1启动子。
准备96孔板进行细胞培养，将2ml在30％的乙醇(滤器除菌)中的包被液(1∶30稀释的胶原蛋白I型(Upstate BiotechInc.Cat.No.08-115)加入每个10cm的培养板或者对96孔板每孔加50ml，空气中干燥2小时。
在预包被的10cm组织培养皿中，用含有补充了10％马血清(JRHBIOSCIENCES，Cat.No.12449-78P)，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，5％加热灭活的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640(Bio Whittaker)常规培养PC12细胞系。每3-4天作1传4的传代。细胞从表面皿上被刮下，并用吸量管吹打15次以上。
用如例16所述的Lipofectamine方法，将EGR/SEAP/Neo结构转染到PC 12细胞中。通过在300μg/ml G418中培养而获得EGR-SEAP/PC12稳定细胞系。无G418的培养基用作常规生长。但每隔1-2个月，细胞应该重新在300μg/ml G418生长几代。
为检验神经元活性，通过移除旧的培养基，将细胞汇聚度约70％到80％的10cm培养板筛选出来。用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤细胞。然后在低血清培养基(包含1％马血清和0.5％含抗生素的胎牛血清的RPMI-1640)中过夜饥饿培养细胞。
第二天早上，除去培养基并用PBS洗涤细胞。从板上刮下细胞，在2ml低血清培养基中重悬细胞。计数细胞并加入低浓度血清培养基，使细胞终密度达到5×105细胞/ml。
在96孔板的每孔中加入200μl细胞悬液(等同于1×105细胞/孔)。加入50μl在实施例12中制备的上清液，37℃孵育48-72小时。使用已知能通过EGR激活PC12细胞的生长因子作为阳性对照，例如50ng/μl的神经生长因子(NGF)。在阳性对照孔，可以典型性地观察到对SEAP的超过50倍的诱导。依照实施例22的方法SEAP检测上清。实施例21T细胞活性高效筛选实验NF-κB(核因子κB)是能被广泛种类的作用物激活的转录因子，这些作用物包括炎症细胞因子IL-1和TNF、CD30和CD40、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β，或者通过暴露于LPS或凝血酶、暴露于某种病毒基因产物而被激活。作为一种转录因子，NF-κB调节基因的表达，这些基因涉及免疫细胞活化，凋亡控制(NF-κB似乎保护细胞免于凋亡)，B细胞和T细胞的发育，抗病毒和抗微生物反应和多种应激反应。
在无刺激环境中，NF-κB和I-κB(κB抑制剂)保留在胞质中。然而在受到刺激时，I-κB发生磷酸化并被降解，导致NF-κB穿入细胞核，从而激活靶基因的转录。被NF-κB激活的靶基因包括IL-2，IL-6，GM-CSF，ICAM-1和1类MHC分子的基因。
由于它所处的中心角色和对一系列刺激原具有反应能力，所以可用利用NF-κB启动子元件的报导分子构建物，筛选在实施例16中制备的上清液。NF-κB的活化剂或抑制剂可以用在疾病的治疗、预防和/或诊断。例如，NF-κB抑制剂能用于治疗那些与NF-κB的急性或慢性活化相关的疾病，例如风湿性关节炎。
为构建一个包含NF-κB启动子元件的载体，我们采用了基于PCR的策略。上游引物包含四个NF-κB结合位点(GGGGACTTTCCC)(SEQ ID NO17)的串联拷贝，18bp的序列与SV40早期启动子序列的5’末端互补，它的侧翼有一个Xhol位点5’GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG3’(SEQ ID NO18)。
下游引物与SV40启动子的3’末端互补，并在侧翼有一个HindIII位点5’GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC3’(SEQ DDNO19)。
用存在于获自Clontech公司的pB-gal启动子质粒中的SV40启动子模板进行PCR扩增。得到的PCR片段用Xhol和HindIII酶消化并亚克隆到BLSK2-(Stratagene)。用T7和T3引物测序，确定插入片段中包括如下序列5’CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT3’(SEQ ID NO20)下一步，使用Xhol和Hind III酶，用NF-κB/SV40片段置换pSEAP2启动子质粒(Clontech)中的SV40最小启动子元件。然而，这个载体不含有新霉素抗性基因，因此，对于哺乳动物表达系统并非优选。
为产生稳定的哺乳动物细胞系，用限制性内切酶Sal I和Not I从上面的NF-κB/SEAP载体中切下NF-κB/SV40/SEAP盒，并将其插入到一个包含新霉素抗性基因的载体中。具体是用Sal I和Not I酶切pGFP-1之后，将NF-κB/SV40/SEAP盒插入pGFP-1(Clontech)，置换GFP基因。
一旦构建成NF-KB/SV40/SEAP/Neo载体，就可依照实施例18描述的方案，构建和维持稳定的Jurkat T细胞系。相似地，在实施例18中描述了用这些稳定的Jurkat T细胞系来检测上清的方法。将作为阳性对照的外源TNF-α(0.1，1，10ng)加入H9，H10和H11孔，将会典型性地观察到5-10倍的激活。实施例22SEAP活性检测作为实施例18-21中描述的用于检测的指示分子，SEAP的活性用Tropix Phospho-light试剂盒(Cat.BP-400)，依照下列通用程序来检测。Tropix Phospho-light试剂盒提供下面将要用到的稀释、检验和反应用缓冲液。
首先在分样器中注入2.5x稀释缓冲液，并将15μl的2.5x稀释缓冲液分散到含有35μl上清的光学培养板(Optiplates)中。用塑料密封带封闭该板并在65℃孵育30分钟。分开放置光学培养板以防止不均匀加热。
将样品冷却到室温15分钟。倒空分样器并注入检测缓冲液。加入50ml检测缓冲液并在室温孵育5分钟。倒空分样器并注入反应缓冲液(见下表)。加入50μl反应缓冲液并在室温孵育20分钟。因为化学发光信号的强度是时间依赖的，并且在发光计上读5块平板要花约10分钟，所以每一次应该处理5块平板并且在10分钟后才开始第二批实验。
在发光计上读取相对光单位。设H12为空白，打印结果。化学发光的增长表明指示分子的活性。反应缓冲液简述板号 Rxn缓冲液稀释(ml) CSPD(ml)10 60 311 65 3.2512 70 3.513 75 3.7514 80 415 85 4.2516 90 4.517 954.7518 100 519 105 5.2520 110 5.521 115 5.7522 120 623 125 6.2524 130 6.525 135 6.7526 140 727 145 7.2528 150 7.529 155 7.7530 160 831 165 8.2532 170 8.533 175 8.7534 180 935 185 9.2536 190 9.537 195 9.7538 200 1039 205 10.2540 210 10.541 215 10.7542 220 1143 225 11.2544 230 11.545 235 11.7546 240 1247 245 12.2548 250 12.549 255 12.7550 260 13实施例23鉴定小分子浓度和膜渗透性的变化的高效筛选实验已知，配体结合到受体能改变细胞内小分子水平，例如钙，钾，钠，和pH，也可以改变膜电位。可以在鉴定结合特定细胞受体的上清的实验中测量这些改变。虽然下面的方案仅描述了一个钙检测实验，但这个方案能够很容易地被修改，用来检测钾、钠、Ph、膜电位或者任何其他一些能够被荧光探针检测到的小分子。
下面的实验用荧光成像板阅读器(″FLIPR″)检测结合小分子的荧光分子(分子探针)的变化。很清楚，可使用能够检测小分子的任何荧光分子，代替在此使用的钙荧光分子，fluo-4(Molecular Probes，Inc.；catalog no.F-14202)。
对于贴壁细胞，以10,000-20,000细胞/孔在底部透明的Co-star黑色96孔板上接种细胞。此板在CO2孵箱中培养20个小时。贴壁细胞于Biotek洗涤器中用200μl HBSS(Hank平衡盐溶液)洗两遍，最后一次洗涤后留100μl缓冲液。
1mg/ml的fluo-4储存液是在10％普卢兰尼克酸DMSO中配成。为了将fluo-4结合到细胞上，在每个孔加入50μl的12μg/ml fluo-4。将培养板在二氧化碳孵箱中37℃孵育60分钟。在Biotek洗涤器中用HBSS洗涤四遍，并留下100μl的缓冲液。
对于非贴壁细胞，从培养基中离心沉降细胞。在50ml圆锥管中，用HBSS将细胞重悬为2-5×106细胞/ml的细胞悬液。每毫升细胞悬液中加入4μl以1mg/ml溶于10％普卢兰尼克酸DMSO的fluo-4。然后将圆锥管置于37℃水浴中孵育30-60分钟。细胞用HBSS洗涤两次，重悬至1×106细胞/ml，分装到微板中，100μl/孔。将该板以1000转/分离心5分钟。然后用200μl在Denley CellWash洗涤该板一次，经过一步吸液操作到终体积为100μl。
对于无细胞试验，每孔都包含某种荧光分子，例如fluo-4。将上清加入孔中，检测荧光的变化。
为了检测细胞内钙的荧光，FLIPR被设置成如下参数(1)系统增益是300-800mW；(2)曝光时间为0.4秒；(3)照相机F/光圈是F/2；(4)激发光是488nm；(5)发射光是530nm；并且(6)样品加样量是50μl。在530nm发射光的强度的增加表明，它是由某些分子所导致的细胞外信号事件，例如由G-蛋白趋化因子受体(CCR5)或者它的配体，或者G-蛋白趋化因子受体(CCR5)所诱导的分子，这些分子能够导致细胞内钙离子浓度的增加。实施例24鉴定酪氨酸激酶活性的高效筛选试验蛋白酪氨酸激酶(PTK)代表一个多样化的跨膜和胞质激酶家族。受体蛋白酪氨酸激酶(RPTK)家族是一系列，包括PDGF，FGF，EGF，NGF，HGF和胰岛素受体亚家族的有丝分裂和代谢的生长因子的受体。并且还有其相应的配体依然未知的庞大的RPTKs家族。RPTKs的配体主要包括分泌型小蛋白，但也包括膜结合的和细胞外基质蛋白。
配体激活RPTK包括配体介导的受体二聚化作用，导致受体亚单位发生转磷酸作用和胞质酪氨酸激酶的激活。细胞质酪氨酸激酶包括与受体相关的src家族(例如，src，yes，lck，lyn，fyn)的酪氨酸激酶，以及非受体连锁的和胞质中的蛋白酪氨酸激酶，后者例如Jak家族，它的成员介导由细胞因子受体超家族(例如，白介素，干扰素，GM-CSF，和Leptin)激发的信号转导。
因为广泛的已知因子能够激活酪氨酸激酶活性，因此鉴定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)、它的配体、G-蛋白趋化因子受体(CCR5)诱导的分子是否能够激活酪氨酸激酶信号转导途径是令人感兴趣的。因此，我们设计了下面的方法以鉴别能够激活酪氨酸激酶信号转导途径的这类分子。
在购自Nalge Nunc公司(Naperville，IL)的96孔Loprodyne SilenScveen板上，以每孔约25,000细胞的密度接种靶细胞(例如，初级角质细胞)。该板用100％乙醇漂洗两次，每次30分钟，清水漂洗，过夜干燥来灭菌。一些平板用100ml的细胞培养级的I型胶原(50mg/ml)、明胶(2％)或者多聚赖氨酸(50mg/ml)包被两小时，以上试剂均可购自Sigma Chemicals公司(St.Louis，MO，)，或者也可用购自BectonDickinson公司(Bedford，MA)的10％Matrigel(基质胶)，或者牛血清包被两小时，然后用PBS漂洗并于4℃保存。通过在生长培养基中接种5000个细胞/孔，48小时后，依照Alamar Biosciences，Inc公司(Sacramento，CA)操作手册所描述的方法，使用alamarBlue间接计数细胞数来检测这些平板上的细胞的生长情况。用Becton Dickinson公司(Bedford，MA)的Falcon#3071平板盖于覆盖Loprodyne Silent Screen平板。Falcon Microtest III细胞培养板也能用于某些增殖试验。
为了制备提取物，接种A431细胞到Loprodyne平板(20,000/200ml/孔)的尼龙膜上并且在完全培养基上培养过夜.细胞于无血清基础培养基中静置孵育24小时。用EGF(60ng/ml)或者50μl实施例16生产的上清处理5-20分钟，除去培养基并把100ml的提取缓冲液(20mM HEPESpH7.5，0.15M NaCl，1％Triton X-100，0.1％SDS，2mM Na3VO4，2mMNa4P2O7和来自Boeheringer Mannheim(Indianapolis，IN)的鸡尾酒式蛋白酶抑制剂(#1836170))加入每个孔中，并把平板在旋转混合器上4℃震荡5分钟。然后，将平板放置在真空转移装置上，使用房间里的真空装置，使提取物过滤通过每个孔底部的0.45mm滤膜。将抽提物收集在位于真空装置底部的96孔捕捉/分析板上，并立即置于冰上。为了通过离心获得澄清的提取物，每个孔的内容物在用去污剂溶解五分钟后被移出，并在4℃用16,000xg离心力离心15分钟。
检验经过过滤的提取物的酪氨酸激酶活性水平。虽然已知有很多种检测酪氨酸激酶活性的方法，但是这里只描述一种方法。
一般来说，上清中的酪氨酸激酶活性是通过测定它对特定底物(生物素化肽)上的酪氨酸残基的磷酸化的能力来评价的。能够用于这种目的的生物素化多肽包括PSK1(对应于细胞分裂激酶cdc2-p34的6-20位氨基酸)和PSK2(对应于胃泌激素的1-17位氨基酸)。这两个多肽都是一系列酪氨酸激酶的底物，并可以从Boehringer Mannheim公司获得。
依次加入下列组分来建立酪氨酸激酶反应。首先，加入10μl5uM的生物素化肽，然后是10μl ATP/Mg2+(5mM ATP/50mM MgCl2)，然后是10μl5x试验缓冲液(40mM咪唑盐酸，pH7.3，40mM β-甘油磷酸，1mMEGTA，100mM MgCl2，5mM MnCl2，0.5mg/ml BSA)，然后是5μl的钒酸钠(1mM)，然后是5μl的水。轻柔的混合各个组分并在30℃将反应混合物预孵育两分钟。加入10μl的对照酶或者过滤所得上清来启动反应。
然后加入10μl 120mmEDTA并将反应物置于冰上来终止酪氨酸激酶分析反应。
酪氨酸激酶活性通过将每份50μl反应混合液转移到微量滴定平板(MTP)组件中，并在37℃孵育20分钟来确定。这种做法使得链霉亲和素包被的96孔板与生物素化多肽结合。用300μl/孔的PBS冲洗MTP组件四次。然后在每个孔中加入75μl缀合有辣根过氧化物酶(anti-P-Tyr-POD(0.5u/ml))抗磷酸化酪氨酸的抗体，并在37℃孵育一小时，用上述方法洗涤平板。
然后加入100μl的过氧化物酶的底物溶液(Boehringer Mannheim)并在室温下孵育至少5分钟(可达30分钟)。用ELISA阅读仪测量样品在405nm下的吸光度。使用ELISA阅读器对所结合的过氧化物酶的活性水平进行定量，以反映酪氨酸激酶的活性水平。实施例25鉴定磷酸化活性的高效筛选试验作为实施例24中所描述的蛋白酪氨酸激酶活性试验的一个潜在的替代和/或补充，也可以采用检测主要细胞外信号转导中间体的活化(磷酸化)作用的实验。例如，如下面所描述的，一个特定的实验可以检测Erk-1和Erk-2激酶酪氨酸的磷酸化。然而，其他分子例如Raf，JNK，p38MAP，Map激酶的激酶(MEK)，MEK激酶，Src，肌肉特异性激酶(MuSK)，IRAK，Tec，和Janus，以及任何其他的磷酸丝氨酸，磷酸酪氨酸，磷酸苏氨酸分子等的磷酸化作用，都可以通过用这些分子取代Erk-1或者Erk-2分子而在下述的实验中被检测。
具体的，用0.1ml的蛋白G(1μg/ml)在室温(RT)将96孔ELISA板包被两小时制成试验平板。然后用PBS漂洗平板并用3％BSA/PBS在室温封闭一小时。蛋白G平板然后用2个针对Erk-1和Erk-2(室温一小时)(Santa Cruz Biotechnology)的商业化单克隆抗体(100ng/孔)来处理。(为检测其他分子，可以轻松地对本步骤进行修改，将原来的抗体替换成检测上述的任意一种分子的单克隆抗体)。用PBS漂洗3-5次后，平板在4℃保存备用。
A431细胞按20,000/孔接种到96孔Loprodyne滤器平板中，并在生长培养基中过夜培养。然后在基础培养基(DMEM)中使细胞饥饿48小时，而后用EGF(6ng/孔)或50μl的实施例16中获得的上清处理5-20分钟。然后溶解细胞并将提取物直接过滤到检验平板中。
提取物在室温孵育一小时后，再次漂洗板孔。在A431提取物的平板中，使用商品化的MAP激酶(10ng/well)制剂作为阳性对照。然后用商品化多克隆(兔)抗体(1μg/ml)处理该板，它们能特异性地识别Erk-1和Erk-2激酶的磷酸化表位(室温一个小时)。按标准程序对该抗体进行生物素化。在Wallac DELFIA装置(时间-解析荧光)中，通过将结合的多克隆抗体与铕-链霉亲和素和铕荧光增强试剂连续孵育而被定量。高于背景的增强的荧光信号表明由G蛋白趋化因子受体(CCR5)或者它的配体或者G蛋白趋化因子受体诱导的分子的所引起的磷酸化作用。实施例26确定G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因改变的方法从呈现目的表型(例如疾病)的整个家族或者个别病人中分离出RNA，然后采用本领域中已知的方案从这些RNA样品中产生cDNA(见Sambrook)。而后用该cDNA作PCR模板，采用包围SEQ ID NO1中目的区段的序列作为引物。建议使用的PCR条件包括95℃30秒；52-58℃60-120秒；70℃60-120秒，共35个循环，采用Sidransky，D等(Science252706(1991)描述的缓冲液。
然后，使用SequiTherm聚合酶(Epicentre Technologies)和5’末端标记T4多核苷激酶的引物，对PCR产物进行测序。经过选择的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)外显子的内含子-外显子边界被确定下来，并且通过分析基因组PCR产物来确定该结果。而后对疑有G-蛋白趋化因子受体(CCR5)突变的PCR产物进行克隆和测序，证实直接测序的结果。
按照Holton，T.A和Graham，M.W.(Nucleic Acids Research，191156(1991))中所描述的方法，将G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的PCR产物克隆到带有T尾的载体上，然后用T7聚合酶(United StatesBiochemical)测序。利用在未受影响的个体中不存在的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的突变，鉴定出受影响的个体。
作为确定在相应于G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的基因所发生改变的方法，基因组重排也可以被观察到。依照实施例6而分离出来的基因组克隆用洋地黄毒甙脱氧尿苷5’-三磷酸(Boehringer Manheim)进行缺口翻译，并按Johnson，Cg等(Methods Cell Biol。3573-99(1991))所描述的方法进行荧光原位杂交(FISH)分析。用大大过量的人cot-1 DNA进行与标记探针杂交，该DNA是能够与G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的基因组位点发生特异性杂交的。
染色体用4，6-二氨基-2-phenylidole和碘化丙啶复染，同时产生C-带和R-带。使用联有冷电偶合装置照相机(cooled charge-coupleddevice camera)(Photometries，Tucson，AZ)和可变激发波长滤波器的三带滤波器(Johnson，Cv。等，Genet。Anal。 Tech。AppL，875(1991))，获得用于精确绘制的线性图像。图象的采集、分析和染色体片段长度测量是应用ISee图像程序系统完成的。(Inovision Corporation，Durham，NC。)G-蛋白趋化因子受体(CCR5)(与探针杂交)基因组区域的染色体的改变被鉴定为插入、删除、和易位。这些G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的改变可用作相关疾病的诊断标记。实施例27检测生物样品中G-蛋白趋化因子受体(CCR5)水平异常的方法在生物样品中能够被检测到G-蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽，并且如果检测到G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的水平的升高或者降低，这种多肽就是特定表型的标志。检测的方法有许多中，因此，可以理解的是一名本领域熟练的技术人员能够改进下面的实验来适应他们特殊的需要。
例如，抗体-三明治ELISAs实验用于检测样品中的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)，优选用于生物样品。用以终浓度为0.2到10μg/ml的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)特异的抗体包被微量滴定板孔。抗体或者是单克隆抗体，或者是多克隆抗体，并都是按照实施例15中描述的方法制备的。封闭板孔，以减少G-蛋白趋化因子受体(CCR5)与板孔的非特异性结合。
然后在室温下将包被孔与包含G-蛋白趋化因子受体的样品孵育超过两个小时。优选将样品进行系列稀释来验证结果。平板用去离子水或者蒸馏水冲洗三次以除去未结合的G-蛋白趋化因子受体。
下一步，加入50μl的特异抗体-碱性磷酸酶缀合物，浓度是25-400ng，并在室温下孵育两小时。平板再次用去离子水或者蒸馏水冲洗三次以除去未结合的复合物。
每孔加入75μl的4-磷酸羟甲香豆素(MUP)或者p-磷酸硝基苯(NPP)底物溶液，并在室温下孵育1小时。用微滴定板阅读器测量反应。用系列稀释的对照样品描绘一条标准曲线，并以G-蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽浓度为X轴(log数值)，以荧光或者吸光度为Y轴(线性数值)。用标准曲线推测样品中G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的浓度。实施例28制剂本发明也提供了治疗和/或预防疾病、紊乱和/或由于对受治疗者给予有效量的治疗剂所引发的状态(例如，任何一种或者更多种在此揭示的疾病、失调、和/或状态)的方法。治疗剂是指与药学上可以接受的载体类型(例如，无菌载体)结合的本发明的多核苷酸或多肽(包括片断和衍生物)、它的激动剂或拮抗剂、和/或其抗体。
治疗剂应该用与良好的医学实践相一致的方式加以配制和给定剂量，需考虑个别病人的临床情况(尤其是单独使用该治疗剂时的副作用)、发放地点、服用方法、服用时间表、以及其他一些对医师来说已知的因素。基于这些考虑决定用于治疗目的的“有效剂量”。
作为一般建议，采用肠胃外途径给药时，根据患者的体重，每剂药物的总的药学有效剂量约在每天1μg/kg到每天10mg/kg的范围内，虽然上面已经陈述过了，有效剂量的确定要从属于治疗上的考虑。剂量更优选至少达到每天0.01mg/kg，对于该激素来说，给人使用的剂量最优选在每天0.01到1mg/kg之间。如果持续给药，该药典型的给药剂量约为每小时1μg/kg到50μg/kg，或者每天注射1-4次，或者用例如微型真空泵进行持续皮下输液。也可采用静脉囊方法。需要观察变化的治疗长短和治疗后发生反应的时间间隔依据想得到的效应而变化。
治疗剂可以经口服、经直肠、经胃肠外途径、intracistemally，阴道内、腹膜内、局部(如粉末、药膏、凝胶、滴剂、经皮的胶布)、口腔内给药，或者作为口腔或鼻腔喷剂给药。“药学上可接受的载体”指非毒性固体、半固体或液体填料，稀释剂、胶囊材料或任何形式的辅助成分。此处用的术语“胃肠外途径的”指的是包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射或灌输的给药方式。
本发明的治疗剂也适用于通过缓释系统给药。缓释治疗剂的合适的例子是经口服、经直肠、经胃肠外途径、intracistemally，阴道内、腹膜内、局部(如粉末，药膏，凝胶，滴剂，通过皮肤的胶布)、口腔内给药或者作为口腔或鼻腔喷剂。“药学上可以接受的载体”指非毒性固体、半固体或液体填料、稀释剂，胶囊材料或任何形式的辅助成分。此处用的术语“胃肠外途径的”指的是包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射或灌输的给药方式。
本发明的治疗剂也适用于通过缓释系统给药。缓释治疗剂合适的例子包括合适的聚合材料(例如，以有形物品如薄膜，或微胶囊形式的半渗透性聚合基质)、合适的疏水性材料(例如在可接受性的油中的乳状液)或者离子交换树脂，以及微溶性衍生物(如，微溶性盐)。
缓释基质包括聚交酯(U.S.Pat.No.3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸(Sidman等，Biopolymers 22547-556(1983))的共聚物，聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)，和Langer，Chem.Tech.1298-105(1982))，乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，Id。)或者聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133，988)。
缓释治疗剂也包括本发明的脂质体包埋治疗剂(一般见，Langer，Science 2491527-1533(1990)；Treat等，in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(eds。)，Liss，New York，pp。317-327 and 353-365(1989))。包含治疗剂的脂质体通过已知的方法制备见DE 3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)823688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)774030-4034(1980)；EP 52,322；EP36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；Japanese Pat.Appl.83-118008；U.S.Pat.Nos.4,485,045和4,544,545；和EP102,324。通常，脂质体呈小(约200-800埃)单片薄层状，其中脂质成分是大约大于30摩尔百分比的胆固醇，这个选择出来的比例经过调整以适合最佳的治疗剂。
在另一个实施例中，本发明的治疗剂通过泵来传输(见Langer，上文；Sefton，CRC Crit Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，Surgery 88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。
Langer在综述中讨论了另外一些可控释放系统(Science2491527-1533(1990))。
对于胃肠外途径给药，在一个实施例中，治疗剂通常是在单位剂量可注射形式(液体，悬液，或乳状液)中，达到将有效治疗成分与药学上可接受载体混合以所需纯度而制成的剂型的。药学上可接受载体就是在所采用剂量和浓度下，对接受者来说是无毒的，并且与组成剂型的其他成分相互兼容的成分。举例来说，制剂中优选不包括氧化制剂和其他已知对治疗剂有害的化合物。
一般来说，制剂是通过将治疗剂均一地和终极化地与液体载体或者粉碎良好的固体载体或与这两种成分一起接触而制备出来的。然后，如果需要的话，该产品可被塑型成为所期望的制剂。载体首选胃肠外用药的载体，更优选的是与接受者的血液等张的液体。这样的载体工具包括水、生理盐水、Ringer氏液和葡萄糖溶液。在此也可使用非水载体，例如非挥发油和油酸乙酯，以及脂质体。
载体适合地包含少量的添加剂，例如能提高等渗性和化学稳定性的物质。这样的物质在所采用的剂量和浓度条件下对接受者都无毒的，其包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、醋酸和其他有机酸或者它们的盐的缓冲液；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(小于大约10个残基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合体，如多聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如氨基乙酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸；单糖，二糖，和其他的糖类，包括纤维素或者它们的衍生物，葡萄糖，甘露糖或者糊精；螯合的药剂如EDTA；糖醇如甘露醇或者山梨糖醇；反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯、聚羟亚烃、或PEG。
治疗剂通常在这样的载体中被制成制剂，浓度大约0.1mg/ml到100mg/ml，首选在1-10mg/ml之间，pH值大约在3-8。不难理解的是使用前述的赋形剂、载体或稳定剂会导致多肽盐的生成。
用于治疗剂给药的所有的药物都要经过无菌化处理。无菌化过程可以很容易地通过使用无菌滤膜过滤来完成(例如，0.2微米膜)。治疗剂通常被放入一个有无菌开口的容器，例如，带有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉输液包或小瓶。
治疗剂通常在单位容器或多剂量容器中储存，例如，密封安瓿或药瓶，以水溶液或以便于恢复的冻干制剂形式储存。以冻干制剂形式为例，10-ml药瓶可装入5ml 1％(w/v)的无菌过滤的治疗剂的水溶液，混合物随即被冻干，使用抑制细菌生长的注射用水重新溶解冻干的治疗液，制备注射用溶液。
此发明也提供药学包装或试剂盒，里面包括一种或多种容器，容器中装着一种或多种本发明的治疗剂组分。与此容器相关的是一个通告，该通告是由控制医药产品或生物制品的生产、使用和销售的官方机构制定的，这个布告表明这种产品是得到生产、使用和销售机构许可的，可以用于人体。另外，本治疗剂可能和其他的治疗性化合物一起用于联合治疗。
本发明的治疗剂可以被单独给药，或与佐剂联合给药。能够与本发明的治疗剂联合使用的佐剂包括，但并不局限于明矾、明矾加脱氧胆酸(免疫抗原)、MTP-PE(Biocine公司)、QS21(Genentech公司)、BCG和MPL。在具体的实施例中，本发明的治疗剂与明矾联合给药。在另一具体实施例中，本发明的治疗剂与QS-21联合给药。能够与本发明的治疗剂联合给药的更多的佐剂包括，但不局限于单磷酰脂免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐、MF-59和病毒体细胞(Virosomal)佐剂技术。能与本发明的治疗剂共同给药的疫苗包括，但不仅限于直接提供保护的抗MMR(麻疹、腮腺炎、风疹)疫苗，抗脊髓灰质炎、水痘、破伤风/白喉、甲型肝炎、乙型肝炎、B型流感嗜血菌、百日咳、肺炎、流感、莱姆关节病、轮状病毒、霍乱、黄热病、乙型脑炎、脊髓灰质炎、狂犬病、伤寒、百日咳的疫苗。联合给药可以是相伴随的，例如，作为一种混合物；或者是单独的但却是同时的或并行的，或者按顺序的。这包括联合药物作为一种治疗剂混合物一起给药的形式，也包括联合药物分别但又同时给药的方式，例如，通过分开的静脉导管进入同一个体。“联合”给药进一步包括分别先给或化合物或制剂中的一种成分，再给第二种成分。
本发明的治疗剂可以单独给药或与其他的治疗性制剂联合使用。可以与本发明的治疗剂联合用药的治疗性制剂包括，但不仅限于TNF家族的其他成员、化疗药物、抗生素、甾体的和非甾体的消炎药、传统的免疫治疗剂、细胞因子和/或生长因子。联合给药可以是相伴随的，例如，作为一种混合物；或者是单独的但却是同时的或并行的，或者按顺序的。这包括结合药物是作为一种治疗剂混合物一起给药的，也包括结合药物是分别给药但却是同时给药的，例如，通过分离的静脉通路进入同一个体。联合用药的给药方式还包括先给其中一种成分，再给第二种成分。
在一个实施例中，本发明的治疗剂与TNF家族成员联合使用。TNF、TNF相关的或TNF样分子，都可以与本发明的治疗剂一同用药，它们包括但不仅限于，TNF-α的溶液形式、淋巴毒素-α、(LT-α，也叫β-TNF)、LT-β(存在复合物异质三联体LT-α2-β)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国际公开号WO96/14328)、AIM-I(国际公开号WO97/33899)、endokine-α(国际公开号WO98/07880)、TR6(国际公开号WO98/30694)、OPG、和neutrokine-α(国际公开号WO98/18921)、OX40、和神经生长因子(NGF)、和可溶性的Fas、CD30、CD27、CD40和4-IBB、TR2(国际公开号WO96/34095)、DR3(国际公开号WO97/33904)、DR4(国际公开号WO98/32856)、TR5(国际公开号WO98/30693)、TR6(国际公开号WO98/30694)、TR7(国际公开号WO98/41629)、TRANK、TR9(国际公开号WO98/56892)、TR10(国际公开号WO98/54202)、312C2(国际公开号WO98/06842)、和TR12，和溶液形式的CD154、CD70和CD153。
在某些实施例中，本发明的治疗剂与抗反转录病毒药剂、核苷/核苷酸反转录抑制剂(NRTIs)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)和/或蛋白酶抑制剂(Pis)联合使用。其中NRTIs可与本发明的治疗剂联合使用，它包括但不仅限于RETROVIRTM(齐多夫定/AZT)，VIDEXTM(地丹诺辛/ddI)、HIVIDTM(扎西他宾/ddC)、ZERITTM(斯塔夫定/d4T)、EPIVIRTM(拉米夫定/3TC)和COMBIVIRTM(齐多夫定/拉米夫定)，NNRTIs可与本发明的治疗剂联合使用，它包括但不仅限于VIRAMUNETM(奈韦拉平)，RESCRIPTORTM(delaviridine)，and SUSTIVATM(efavirenz)。蛋白酶抑制剂可与本发明的治疗剂联合使用，它包括但不仅限于CRIXIVANTM(印地那韦)、NORVIRTM(利托那韦)、INVIRASETM(沙奎那韦)和VIRACEPTTM(那非那韦)。在一个特殊实施例中，抗反转录病毒药剂、核苷反转录抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂可以与本发明的治疗剂联合用于治疗艾滋病和/或预防或治疗HIV感染。
其他的NRTIs包括LODENOSINE(F-ddA；酸稳定性腺苷酸NRTI；Triangle/Abbott；COVIRACILTM(emtricitabine/FTC；结构上与拉米夫定相关(3TC)但是在体外有3到10倍活性；Triangle/Abbott)；dOTC(BCH-10652，也是结构上与拉米夫定相关但对于对拉米夫定有抗性的隔离群有效；Biochem Pharma)；Adefovir(在用于抗HIV治疗方面未获FDA许可；Gilead Sciences)；PREVEON(Adefovir Dipivoxil，adefovir的活性前体药物；其活性形式是PMEA-pp)；TENOFOVIR(bis-POC PMPA，PMPA的活性前体药物；Gilead)；DAPD/DXG(DAPD的活性代谢物；Triangle/Abbott)；D-D4FC(3TC相关，对抗AZT/3TC的病毒有效)；GW420867X(Glaxo Wellcome)；ZIAGENTM(abacavir/159U89；Glaxo WellcomeInc)；CS-87(3’叠氮基2’，3’-双脱氧尿苷；WO 99/66936)；和β-L-FD4C和β-L-FddC的载有S-酰基-2-硫醚基(SATE)的前体药物形式(WO 98/17281)。
其他NNRTIs包括COACTINONTM(Emivirine/MKC-442，HEPT类中有效的NNRTI；Triangle/Abbott)；CAPRAVIRINETM(AG-1549/S-1153，下一代有抗K103N突变病毒的活性的NNRTI；Agouration)；PNU-142721(活性高于上一代拉米夫定20到50倍并且有抗K103N突变活性；Pharmacia&Upjohn)；DPC-961和DPC-963(efavirenz的第二代衍生物，设计有抗K103N突变病毒的活性；DuPont)；GW-420867X(比HBY097活性高25倍，抗K103N突变活性；Glaxo Wellcome)；CALANOLIDE A(来源于乳胶树的天然药剂；具有抗含有Y181C和K103N突变之一或全部的病毒的活性)；和Propolis(WO99/49830)。
其他蛋白酶抑制剂包括LOPINAVIRTM(ABT378/r；Abbott实验室)；BMS-232632(azapeptide；Bristol-Myres Squibb)；TIPRANAVIR(PNU-140690，非消化性的避蚊酮；Pharmacia$Upjohn)；PD-178390(非消化性的避蚊酮；Parke-Davis)；BMS 232632(azapeptide；Bristol-Myers Squibb)；L-756,423(印地那韦类似物；Merck)；DMP-450(环脲复合物；avid&DuPont)；AG-1776(peptidomimetic有体外抑制抗蛋白酶抑制剂活性病毒的效果；Agouron)；VX-175/GW-433908(安泼那韦的磷酸盐前体药物Vertex&Glaxo Welcome)；CGP61755(Ciba)；和AGENERASETM(安泼那韦；Glaxo Wellcome Inc)。
其他抗反转录病毒因子包括融合抑制剂/gp41粘合剂。融合抑制剂/gp41粘合剂包括T-20(结合到gp41上维持其静止状态并且防止其变换为成融合态的HIV gp41跨膜蛋白外功能区的第643-678个残基构成的肽；Trimeris)和T-1249(第二代融合抑制剂；Trimeris)。
其他抗反转录病毒因子包括融合抑制剂/趋化因子受体对抗药。融合抑制剂/趋化因子受体对抗药包括CXCR4对抗药例如AMD 3100(bicyclam)，SDF-1和其类似物，和ALX40-4C(阳离子肽)，T22(18氨基酸肽；Trimeris)和T22类似物T134和T140；CCR5对抗药例如RANTES(9-68)，AOP-RANTES，NNY-RANTES和TAK-779；和CCR5/CXCR4对抗药例如NSC 651016(司替霉素类似物)。也包括CCR2B，CCR3，和CCR6对抗药。趋化因子受体激动剂例如RANTES，SDF-1，MIP-1α，MIP-1β，等，可能也抑制融合。
其他抗反转录病毒制剂包括整合酶抑制剂。整合酶抑制剂包括二咖啡因基奎尼(DFQA)酸；L-菊苣酸(二咖啡因基酒石(DCTA)酸)；醌茜素(QLC)和相关蒽醌；ZINTEVIRTM(AR 177，可能作用于细胞表面而不是真的整合酶抑制剂的寡核苷酸；Arondex)；和例如发表在WO98/50347的萘酚。
其他抗反转录病毒制剂包括羟基脲样化合物，例如BCX-34(嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；Biocryst)；核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如DIDOX(Molecules for Health)；肌苷一磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂，例如VX-497(Vertex)；和霉酚酸例如CellCept(mycophenolate mofetil；Roche)。
其他的抗反转录病毒剂包括病毒整和酶抑制剂，病毒基因组核易位抑制剂，例如芳撑二(甲基酮)化合物；HIV穿入抑制剂，例如AOP-RANTES、NNY-RANTES、RANTES-IgG融合蛋白、RANTES及葡糖胺聚糖(GAG)的可溶性复合物和AMD-3100；核壳体锌指抑制剂，例如二噻烷化合物；HIVTat和Rev的靶标；和药物增强剂，例如ABT-378。
其他的抗反转录病毒治疗和辅助治疗包括细胞因子和淋巴因子，例如M1P-1α、MIP-1β、SDF-1α、IL-2、PROLEUKINTM(aldesleukin/L2-7001；Chiron)、IL-4、IL-10、IL-12和IL-13；干扰素，例如IFN-α2a；TNFs、NFκB、GM-CSF、M-CSF和IL-10的拮抗剂；调节免疫系统活性的药物，如环孢菌素和强的松；疫苗如RemuneTM(HIV免疫原)，APL 400-003(Apollon)，重组的gp120及其片段，双价(B/E)重组包膜糖蛋白，rgp120CM235，MNrgp120，SF-2rgp120，gp120/可溶性CD4复合物，ΔJR-FL蛋白，来自不连续的gp120 C3/C4结构域的分支合成肽，具有融合功能的免疫原以及Gag、Pol、Nef和Tat疫苗；基于基因的治疗如基因抑制成分(GSEs；WO 98/54366)和intrakines(基因工程修饰的以ER为靶标的CC趋化因子以阻断新合成CCR5的表面表达(Yang et al，PNAS9411567-12(1997)；Chen et al，Not Wed31110-16(1997))；抗体(例如，抗-CXCR4抗体，如抗-CXCR4抗体12G5，抗CCR5抗体如抗CCR5抗体2D7，5C7，PA8，PA9，PA10，PA11，PA12和PA14，抗CD4抗体如抗CD4抗体Q4120和RPA-T4，抗CCR3抗体如抗CCR3抗体7B11，抗gp120抗体如抗gp120抗体17b，48d，447-52D，257-D，268-D和50.1，抗Tat抗体，抗TNF-α抗体和单克隆抗体33A)；芳基烃(AH)受体激动剂和拮抗剂如TCDD，3，3’，4，4’，5-五氯联苯，3，3’，4，4’-四氯联苯和α-萘黄酮(WO 98/30213)；和抗氧化剂如γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸乙酯(γ-GCE；WO 99/56764)。
在存在前述药物或者不存在前述制剂下，可以和本发明的治疗剂共同使用的其他制剂包括抗淋巴细胞增殖药物，如全反式视黄酸(全-反-RA)、IFN-γ、EPOCH和Cidofovir；血管生成抑制药物，如沙利度胺；抑制细胞增殖的化学治疗药物，如羟基脲；抗感染药物，如利福布丁，异烟肼和利福平；抗衰老药物如LU 02-584(CPI-1189；CentuarPharmaceuticals Inc.)。
这些不同类型制剂的剂量在本领域是已知的，并且可在类似医师临床参考和科学文献中查找到。
由于反转录酶(RT)易于出错，病毒突变非常快，因此可以对多种治疗药物产生抗性。采用使用联合疗法，瞄准病毒生存途径的多个点(RT，蛋白酶，病毒进入和病毒中和)，可以有效的抵消高突变率。因此，本发明的治疗剂可以和抗病毒药物联合使用，包括2种药、3种药、4种药、5种药、6种药、7种药、8种药、9种药或更多种药的组合。抗病毒制剂的这种组合在文献中称作主动抗病毒治疗(ART)、高主动抗病毒治疗(HAART)、连续HAART、间断HAART、“mega”HAART(大于4、5、6、7或8，最好大于9种药物)，强剂量多药物治疗、早期治疗加强(ETI)、最大限度辅助治疗(MAT)、自我用药治疗(同一用药治疗)(SAT)，低CD4+数量HIV感染病人的皮下重组人IL-2主动抗反转录病毒治疗(SILCAAT)和维持治疗。本发明的治疗剂首选能够和高主动抗病毒治疗联用。本发明的治疗剂可以和辅助药物联合使用，如前述药物和其他在此公开的及在科研本领域中广为人知的药物，或单独使用或和抗病毒药物联用。
当本发明的治疗剂和上述制剂或制剂的组合的任意一种联用时，要根据需要调整剂量。联合使用时，NRTIs通常不需要调整剂量，但是NNRTIs和PI可以影响彼此的水平和效力。通常这种剂量调整的开始、持续、管理、变更和抗病毒治疗的维持的指导为职业医师所熟知，并且很容易在诸如Guidelines for the Use of Antiretroviral AgentsIn HIV-Infected Adults and Adolescents，Panel on ClinicalPractices for Treatment of HIV Infection，Dept.Health and HumanServices and Henry J.Kaiser Foundation，Jan.28，2000，和<<http//www.hivatis.org>>及其他科学文献中获得。
在其他实例中，本发明的治疗剂可以和抗机会感染药物联合使用。可以和本发明的治疗剂联合服用的抗机会感染药物包括，但是不仅限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM(三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲异噁唑)，DAPSONETM(氨苯砜)，PENTAMIDINETM(双戊烷)，ATOVAQUONETM(阿托喹酮)，ISONIAZIDTM(异烟肼)，RIFAMPINTM(利福平)，PYRAZINAMIDETM(吡嗪酰胺)，ETHAMBUTOLTM(乙胺丁醇)，RIFABUTINTM(利福布丁)，CLARITHROMYCINTM(克拉(红)霉素)，AZITHROMYCINTM(阿齐红霉素)，GANCICLOVIRTM(9-1；3-二羟-2-丙氧甲基鸟嘌呤)，FOSCARNETTM(膦甲酸)，CIDOFOVIRTM，FLUCONAZOLETM(氟康唑)，ITRACONAZOLETM(伊曲康唑)，KETOCONAZOLETM(酮康唑)，ACYCLOVIRTM(阿昔洛韦)，FAMCICOLVIRTM，PYRIMETHAMTNETM，LEUCOVORTNTM，NEUPOGENTM(filgrastim(非格司亭)/G-CSF)和LEUKINETM(重组GM-CSF)(sargramostim(沙莫司亭/GM-CSF)。在特定的实施例中，本发明的治疗剂和TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM(三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲异噁唑)，DAPSONETM(氨苯砜)，PENTAMIDINETM(双戊烷)和/或ATOVAQUONETM(阿托喹酮)任意组合，联合用于预防性治疗或者防止肺部机会性的卡氏肺囊虫感染。在其他特定实施例中，本发明的治疗剂和ISONIAZIDTM(异烟肼)，RIFAMPINTM(利福平)，PYRAZINAMIDETM(吡嗪酰胺)和/或ETHAMBUTOLTM(乙胺丁醇)中的任一种联合使用进行预防治疗或者防止机会性的鸟分支杆菌复合感染。在另一个实施例中，本发明的治疗剂和RIFABUTINTM(利福布丁)，CLARITHROMYCINTM(克拉(红)霉素)和/或AZITHROMYCINTM(阿齐红霉素)任意组合，联合用于预防性治疗或者防止机会性的结核分支杆菌感染。在其他特定实施例中，本发明的治疗剂和GANCICLOVIRTM(9-1；3-二羟-2-丙氧甲基鸟嘌呤)，FOSCARNETTM(膦甲酸)和/或CIDOFOVIRTM任意组合，联合用于预防性治疗或者防止机会性的巨细胞病毒感染。在其他特定实施例中，本发明的治疗剂和FLUCONAZOLETM(氟康唑)，ITRACONAZOLETM(伊曲康唑)和/或KETOCONAZOLETM(酮康唑)任意组合，联合用于预防性治疗或者防止机会性的真菌感染。在其他特定实施例中，本发明的治疗剂和ACYCLOVIRTM(阿昔洛韦)和/或FAMCICOLVIRTM任意组合，联合用于预防性治疗或者防止机会性的I型和II型单纯疱疹病毒感染。在其他特定实施例中，本发明的治疗剂和PYRIMETHAMTNETM和/或LEUCOVORTNTM任意组合，联合用于预防性治疗或者防止机会性的鼠弓形虫感染。在其他特定实施例中，本发明的治疗剂和LEUCOVORTNTM和/或NEUPOGENTM任意组合，联合用于预防性治疗或者防止机会性的细菌感染。
在进一步的实施例中，本发明的治疗剂和抗病毒药物联用。可以与本发明的治疗剂联用的抗病毒药物包括但不仅限于阿昔洛韦、病毒唑，金刚烷胺和remantidine(洛米替丁)。
在进一步的实施例中，本发明的治疗剂和抗生素制剂联用。可以与本发明的治疗剂联用的抗生素制剂包括但不仅限于阿莫西林，β-内酰胺酶，氨基糖甙，β-内酰胺(糖肽)，β-内酰胺酶，克林霉素，氯霉素，先锋霉素，环丙沙星，环丙沙星，红霉素，氟喹诺酮、大环内酯类抗生素，甲硝唑，青霉素，喹诺酮、利福平，链霉素，磺胺，四环素族，甲氧苄啶，三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲异噁唑和万古霉素。
可以与本发明的治疗剂联用的常规非特异免疫抑制药物包括，但不仅限于类固醇、环孢霉素，环孢霉素类似物、环磷酰胺甲基强的松、强的松、硫唑嘌呤、FK-506、15-去氧精胍素，以及其他通过抑制反应性T细胞的功能来发挥作用的免疫抑制药物。
在特定的实施例中，本发明的治疗剂和免疫抑制剂联用，可以与本发明的治疗剂联用的免疫抑制剂包括但不仅限于ORTHOCLONETM(OKT3)，SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(环孢菌素)，PROGRAFTM(tacrolimus)，CELLCEPTTM(mycophenolate)，硫唑嘌呤，糖皮质类固醇和RAPAMUNETM(sirolimus)。在特定实施例中，免疫抑制剂可以用于防止器官或骨髓移植中的排异反应。
在另外的实施例中，本发明的治疗剂可以单独给药，或者与一种或多种静脉内免疫球蛋白制剂联用，可以与本发明的治疗剂联用的免疫球蛋白制剂包括，但不仅限于GAMMARTM，IVEEGAMTM，SANDOGLOBULINTM，GAMMAGARD S/DTM和GAMIMUNETM。在特定实施例中，本发明的治疗剂可以和静脉内免疫球蛋白制剂联合用于移植治疗(例如骨髓移植)。
在另外的实例中，本发明的治疗剂可以单独给药或者与消炎药物联用。可以与本发明的治疗剂联用的消炎药物包括，但不仅限于糖皮质激素和非甾体消炎药物、氨基芳基羧酸诱导剂、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑酮、水杨酸衍生物、噻嗪咪唑羧酰胺，e-乙醚氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、地他唑、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗杀唑和替尼达帕。
在特定的实施例中，本发明的药物可以和化学治疗制剂联用，可以与本发明的治疗剂联用的化学治疗制剂包括，但不仅限于抗生素衍生物(如阿霉素，博来霉素，柔红霉素和放线菌素)；抗雌激素药物(如他莫昔芬)；抗代谢药物(如氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，氨甲蝶呤，氟尿苷，干扰素α-2b，谷氨酸，普卡霉素，巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤)；细胞毒药物(如卡莫司汀，1，3双氯乙基亚硝基脲，洛莫司汀，罗氮芥，阿糖胞苷，环磷酰胺，雌莫司汀，羟基脲，丙卡巴肼，丝裂霉素，二甲磺酸丁酯，顺铂和硫酸长春新碱)；激素(如甲羟孕酮，雌莫司汀磷酸盐，乙炔基雌二醇，雌二醇，醋酸甲地孕酮，甲睾酮，二磷酸己烯雌酚，氯烯雌醚和睾酮)；氮芥衍生物(如，mephalen，chorambucil，双氯乙基甲胺(氮芥)和噻替哌)；类固醇和其化合物(如，倍他米松磷酸钠)及其他药物(如，dicarbazine，天冬酰胺酶，米托坦，硫酸长春新碱，硫酸长春碱和依托泊甙)。
在特定的实施例中，本发明的药物可以和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)联合使用，或者和CHOP中任意药物联用。在另一实施例中，本发明的治疗剂可以和Rituximab联用。在进一步的实例中，本发明的治疗剂可以和Rituximab和CHOP联用，或者与Rituximab及CHOP的任一组分联用。
在另外一个实施例中，本发明的治疗剂可以和细胞因子联用。可以与本发明的治疗剂联用的细胞因子包括，但不仅限于IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗CD40，CD40L，IFN-γ和TNF-α。在另外的实例中，本发明的治疗剂可以和任意白介素联用，这些白介素包括，但不仅限于IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-S，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20和IL-21.
在另外一个实施例中，本发明的治疗剂可以和血管生成素蛋白联用，可以与本发明的治疗剂联用的血管生成素蛋白包括，但不仅限于胶质瘤衍生生长因子(GDGF)，由欧洲专利号EP-399816公开；血小板衍生生长因子A(PDGF-A)，由欧洲专利号EP-682110公开；血小板衍生生长因子B(PDGF-B)，由欧洲专利号EP-282317公开；胎盘生长因子(P1GF)，由国际公开号WO 92/06194公开；胎盘生长因子2(P1GF-2)，由Hauser等公开(Gorwth Factors，4259-268(1993))；血管内皮生长因子(VEGF)，由国际公开号WO 90/13649公开；血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，由欧洲专利号EP-506477公开；血管内皮生长因子-2(VEGF-2)，由国际公开号WO 96/39515公开；血管内皮生长因子B(VEGF-3)；血管内皮生长因子B-186(VEGF-B186)，由国际公开号WO96/26736公开；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，由国际公开号WO98/02543公开；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，由国际公开号WO98/07832公开和血管内皮生长因子-E(VEGF-E)，由公开德国专利号DE19639601公开.上述所提及的文献在此都被列为参考文献。
在另外一个实施例中，本发明的治疗剂可以和造血生长因子联用。可以与本发明的治疗剂联用的造血生长因子包括，但不仅限于LEUKINETM(沙莫司亭)和NEUPOGENTM(FELGRASTIMTM)。
在另外一个实例中，本发明的治疗剂可以和成纤维细胞生长因子联用。可以与本发明的治疗剂联用的成纤维细胞生长因子包括，但不仅限于FGF-1，FGF-2，FGFr3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-11，FGF-12，FGF-13，FGF-14和FGF-15。
在另外的实例中，本发明的治疗剂可以和猪或人胰岛素或其混合物；胰岛素类似物；重组人胰岛素如HUMULINTM和NOVOLINTM；口服降糖药物如ORAMIDETM和ORINASETM(甲苯磺丁脲)，DIABINESETM(氯磺丙脲)，TOLAMIDETM和TOLINASETM(妥拉磺脲)，DYMELORTM(醋磺环己脲)(醋磺己脲)，格列苯脲，MICRONASETM，DIBETATM和GLYNASETM(格列本脲)，GLUCOTROLTM(格列吡嗪)和DIAMICRONTM(甲磺吡脲)(格列齐特)，GLUCOPHAGETM(盐酸二甲双胍)(二甲双胍)，PRECOSETM(阿卡波糖)(阿卡波糖)，AMARYLTM(格列美脲)和环格列酮；thiazolidinediones(TZDs)如rosiglitazone(松香格列酮)，AVANDIATM(rosiglitazone马来酸松香格列酮)，ACTOSTM(piogliatazone)和曲格列酮；α-葡糖苷酶抑制剂；牛或猪高血糖素；生长素释放抑制素如SANDOSTATINTM(奥曲肽)(生长抑素八肽)和二氮嗪如PROGLYCEMTM(二氮嗪)联用。仍是在其他实施例中，本发明的治疗剂可以和下述一种或者几种制剂联用双缩胍抗糖尿病药，glitazone抗糖尿病药，和磺酰脲抗糖尿病药。
在另外的实例中，本发明的治疗剂可以和其他的治疗性或者预防性疗法联用，例如放射治疗。实施例29G-蛋白趋化因子受体水平降低的治疗方法本发明涉及一种方法，可以用来对体内需要提高本发明的多肽水平的个体进行治疗，其中包括给这样的个体摄入含有有效治疗量的本发明的激动剂(包括本发明的多肽)。此外，值得称赞的疗法是对一个个体中由G-蛋白趋化因子受体(CCR5)低于标准或者正常的表达水平所导致的状况，通过施用G-蛋白趋化因子受体(CCR5)激动剂进行治疗，首选分泌形式的激动剂。这样，本发明也提供一种方法来治疗需要增加G-蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽水平的个体，通过给这样的个体施用其中包含一定量的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)激动剂的治疗剂，来增加这个个体的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的活性水平。
例如，一个G-蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽水平降低的病人可以服用日剂量在0.1-100μg/kg的激动剂，连续6天。基于服药方式和形式的剂量方案的确切细节在实施例28中提供。实施例30G-蛋白趋化因子受体水平增高的治疗方法本发明也涉及一种方法，可以用来治疗体内需要降低本发明的多肽水平的个体，其中包括给这样的个体施用含有有效治疗量的本发明拮抗剂(包括本发明的多肽和抗体)。
在一个实施例中，采用反义技术来抑制G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的产生。这个技术只是一个方法的实例，这个方法可以用于降低G-蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的水平，优选可溶性形式的多肽的水平。这种多肽水平是由各种不同的病因所引起的，例如癌症。
例如，一个被诊断为G-蛋白趋化因子受体(CCR5)水平异常增加的病人，可以给他静脉输入日剂量为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mg/kg的反义多核苷酸，连续21天。如果他可以耐受这样治疗，在停药7天后，重复上述治疗。反义多核苷酸的制剂在实施例28中提供。
降低G-蛋白趋化因子受体(CCR5)水平或者抑制其活性的其他方法在此描述(如实施例57)。实施例31使用基因治疗的体外治疗方法基因治疗的一个方法是将能表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的成纤维细胞移植到病人体内。通常的，从皮肤的活检中获得成纤维细胞。把得到的组织放置到组织培养液中并分成小块。把小块组织放置到组织培养瓶湿润的表面，大约每个瓶放10小块。将培养瓶倒转、塞紧，在室温中放置过夜。在室温放置24小时后，将培养瓶翻转过来，小块组织仍然固定在培养瓶的底部，然后加入新鲜培养液(例如，含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的Ham’s F12培养液)。培养瓶在37℃培养大约1个星期。
这时加入新鲜的培养基，每隔几天换一次培养基。继续培养2个星期后出现单层的成纤维细胞。用胰蛋白酶消化单层细胞并转移到更大的培养瓶中大规模培养。
pMV-7(Kirschmeier，P.T等，DNA，7219-25(1998))的侧翼带有Moloney鼠肉瘤病毒的长末端重复序列，用EcoRI和HindIII消化pMV-7，然后用牛小肠磷酸酶处理。用琼脂糖凝胶分离线性载体，并用玻璃珠纯化载体。
用PCR方法扩增编码G蛋白趋化因子受体的DNA，所用的引物分别对应于实施例5所描述序列的5’和3’端。优选在5’引物中含有EcoRI酶切位点，而3’引物含有HinDIII酶切位点。在存在T4 DNA连接酶的情况下，将等量的鼠肉瘤病毒线性骨架和扩增出来的EcoRI-Hind III片段加在一起。将混合物放置在适合这两个片段连接的条件下。将连接混合物转化HB101细菌，然后把细菌涂到含卡那霉素的平板上，以确保载体含有正确插入的G蛋白趋化因子受体。
兼嗜性pA317或GP+am12包装细胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s改良Eagles培养基(DEME)中培养至汇聚浓度。然后把含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的MSV载体加入到培养液中，并转导这些包装细胞。这样这些包装细胞就产生含有G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的感染性病毒颗粒(这样的包装细胞被称为生产细胞)。
将新鲜的培养液加入到被转导的生产细胞中，然后从10cm含有汇聚的生产细胞的平板中收获培养液。这些用过的培养液中含有感染性病毒颗粒，用微孔滤器过滤培养液，以除去脱落的生产细胞，然后用该培养液感染成纤维细胞。从亚汇聚状态的成纤维细胞平板中移出培养液，并迅速的换成从生产细胞来源的培养液。弃去这些培养液换成新鲜的培养液。如果病毒的滴度高，那么实际上所有的成纤维细胞被感染，不需要进行选择。如果病毒滴度非常低，有必要用带有选择标记，比如neo或his的逆转录病毒载体。一旦成纤维细胞被有效地感染了，就分析该细胞，并确定其是否产生G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白。
然后把工程化的成纤维细胞移植给宿主，可以单独移植，也可以等其在cytodex3微载体珠上生长到汇聚状态后移植。实施例32用内源G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因进行基因治疗根据本发明，另一种基因治疗的方法涉及通过同源重组的方法，将内源性G蛋白趋化因子受体(CCR5)序列和启动子操作性连接。所用的方法在U.S.Patent No.5,641,670，June 24，1997发表；国际公布No.WO 96/29411，September 26，1996出版；国际出版物No.WO 94/12650，8月4日，1994出版；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342435-438(1989)中有描述。这个方法包括靶细胞中基因的激活，这个基因在该细胞中不表达，或只有少于期望值的表达。
构建包括一个启动子和靶向序列的多核苷酸，该序列和内源性G蛋白趋化因子受体(CCR5)的5’末端非编码序列同源，位于启动子两翼。靶序列要和G蛋白趋化因子受体(CCR5)的5’端靠得足够近，这样启动子可以通过同源重组而可操作性地连接到内源序列上。可以用PCR扩增启动子和靶序列。优选，PCR扩增出来的启动子的5’末端和3’末端含有不同的限制性内切酶的位点。优选，第一个靶序列的3’端含有与扩增出来的启动子5’端一致的限制性内切酶位点，而第二个靶序列的5’端含有和扩增出来的启动子3’端一致的限制性内切酶位点。
用合适的限制性内切酶消化扩增得到的启动子和靶向序列，然后用牛小肠碱性磷酸酶处理。在存在T4 DNA连接酶的情况下，把消化后的启动子和靶序列放置在一起，将得到的混合物维持在适合两个片段连接的条件下。用琼脂糖凝胶按大小分离连接产物，并用酚提取和乙醇沉淀的方法进行纯化。
在本实施例中，通过电穿孔方法，将多核苷酸结构以裸露的多核苷酸的形式导入到细胞中。然而，也可以使用转染促进剂，如脂质体、病毒序列、病毒颗粒及沉淀剂等，将多核苷酸结构导入细胞。这些转运方法都是在本领域中被大家所熟知的。
一旦细胞被转染，就会发生同源重组，导致启动子被可操作性地连接到内源性G蛋白趋化因子受体(CCR5)序列上。从而使得G蛋白趋化因子受体(CCR5)得以在细胞中表达。可以用免疫染色或其他在本领域大家所熟知的方法检测表达。
从皮肤的活检中获得成纤维细胞。将获得的组织放置到含10％胎牛血清的DMEM中。用胰蛋白酶消化指数生长或早期固定阶段的成纤维细胞，然后用营养培养液从塑料表面冲洗下细胞。取出一份细胞悬浮液用于记数，其余的细胞用于离心。吸出上清后，将沉淀重悬到5ml的电穿孔缓冲液(20mM HEPES pH7.3，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖)中。再次离心，吸出上清后将细胞重悬到含有1mg/ml的乙酰化的牛血清白蛋白的电穿孔缓冲液中。最终的细胞悬浮液中含有大约3×106细胞/ml。细胞重悬后立即进行电穿孔。
用标准的技术准备质粒DNA。比如，为了构建以G蛋白趋化因子受体(CCR5)位点为目标的质粒，用Hind III消化pUC18质粒(MBI Fermentas，Amherst，NY)，用PCR的方法扩增CMV启动子，使其的5’末端带有XbaI酶切位点而在其3’末端有BamHI酶切位点。通过PCR方法扩增两个G蛋白趋化因子受体(CCR5)非编码序列一个G蛋白趋化因子受体(CCR5)非编码序列(G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段1)的5’末端带有HindIII位点，3’末端带有Xba I位点。另一个G蛋白趋化因子受体(CCR5)非编码序列(G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段2)的5’末端带有BamH I位点，而在3’末端带有HindIII位点。用合适的酶(CMV启动子-XbaI和BamHI；G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段1-XbaI；G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段2-BamHI)消化CMV启动子和G蛋白趋化因子受体(CCR5)片段(1和2)，然后连接在一起。获得的连接产物用Hind III消化后连接到用HindIII消化的pUC18质粒上。
质粒加入到无菌的带有0.4cm电极间隙的比色杯中(Bio-Rad)。通常，最终DNA浓度至少是120μg/ml。然后，把0.5ml的细胞悬浮液(大约含有1.5×106细胞)加入到比色杯中，轻轻的混合细胞悬浮液和DNA溶液。用Gene-Pulser仪器(Bio-Rad)进行电穿孔。电容和电压分别设置为960μF和250-300V。当电压增加时，细胞存活减少，但是存活细胞中，其基因组中稳定整合了导入的DNA的细胞的百分含量急剧增加。根据那些参数，应该观察到14-20毫秒的脉冲时间。
电穿孔后的细胞在室温放置5分钟，用无菌的移液管把比色杯中液体轻轻吸出。细胞直接加入到10cm含有预热营养培养液的(含有15％小牛血清的DMEM)培养皿中，在37℃培养。第二天，吸出培养液，替换成10ml新鲜的培养液，然后再培养16-24小时。
然后把工程化的成纤维细胞注射到宿主体内，可以单独使用也可以在cytodex 3微载体珠中生长汇聚后使用。现在该成纤维细胞可以产生蛋白产物。然后可以按上述的方法将该纤维母细胞导入患者体内。实施例33体内基因治疗的方法本发明的另一方面是用体内基因治疗的方法治疗失调、疾病及各种病情。基因治疗的方法是将裸露的核酸(DNA，RAN，反义DNA或RNA)G蛋白趋化因子受体(CCR5)序列导入动物体内，以增加或减少G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的表达。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽能够被可操作性地连接到一个启动子或其他基因元件上，该元件是靶组织表达G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽所必须的。这样的基因治疗和输送技术和方法在本领域是为大家所熟悉的。参考，例如WO90/11092，WO98/11779；U.S.Patent NO.5693622，5705151，5580859；Tabata H等(1997)Cardiovasc.Res.35(3)470-479，Chao J等(1997)Pharmacol.Res.35(6)517-522，Wolf J.A.(1997)Neuromuscul.Disord.7(5)314-318，Schwartz B.等(1996)Gene Ther.3(5)405-411，Tsurumi Y.等，(1996)Circulation 94(12)3281-3290(在此作为参考文献)。
可以用任何将可注射物质递送到动物细胞的方法递送G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸结构，如，注射到组织(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝、小肠等类似组织)间隙中。G蛋白趋化因子受体(CCR5)多聚核苷酸结构可以用药学上可接受的液体或水样载体进行输送。
术语“裸露”的多核苷酸，DNA或RNA，指的是不带有任何运输载体的序列，这些载体的作用是帮助、促进、或有利于进入细胞，其包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂转染试剂或沉淀剂以及类似物。然而G蛋白趋化因子受体(CCR5)多聚核苷酸可以通过脂质体制剂递送。(如Felgner P.L.等(1995)Ann.NY Acad.Sci.772126-139及AbdallahB等(1995)Biol.Cell 85(1)1-7)中所述的)，可以用本领域熟练技术人员所熟知的方法制备脂质体制剂。
用于基因治疗的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多聚核苷酸载体最好是既不和宿主的基因组整和也不含有允许进行复制的序列。本领域熟练的技术人员所熟知的任何强启动子都可以用来促进DNA的表达。和其他的基因治疗技术不同，将裸露的核酸序列导入靶细胞的一个主要的优势是多核苷酸在细胞中合成的瞬时性。研究表明，非复制DNA序列导入细胞后，可以在直到6个月的期间内生产所期望的多肽。
G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建物可以被导入到动物的组织间隙中，这些组织包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝脏、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴结、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、小肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺体及结缔组织。组织间隙包括细胞间液，器官组织网状纤维中的粘多糖基质、脉管壁或腔室壁的弹性纤维、纤维组织的胶原纤维、包在肌肉细胞外或在骨腔隙中的结缔组织中的那些相同的基质。它很类似于被循环中血浆和淋巴管中淋巴液所占的空间。优选递送到肌肉组织的间隙中的原因在下面讨论。通过注射方法可以把它们很方便地递送到含有这些细胞的组织中。虽然也可以将它们递送到不分化或不完全分化的细胞中，比如，血液中的干细胞或皮肤纤维母细胞，并在这些细胞中表达，但首选将他们递送到分化的，持续的，不分裂的细胞中进行表达。体内的肌肉细胞的摄取和表达多核苷酸的能力特别强。
在注射裸露的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸时，有效DNA或RNA剂量范围在约0.05g/Kg体重到约50mg/Kg体重。优选的剂量在约0.005g/Kg到约20mg/Kg之间，更优选剂量大约是约0.05mg/Kg到约5mg/Kg。当然，如本领域技术人员将会理解的，根据不同的注射组织部位改变使用剂量。合适及有效的核苷酸注射剂量可以根据本领域常用的技术进行确定，并依赖于治疗条件和给药途径。优选的给药途径是经肠胃外途径注射到组织间隙。但是也可以使用其他肠胃外途径，如，吸入气溶胶的方法就特别适合将药物递送到肺、支气管组织、喉和鼻粘膜。另外，裸露的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸构建物还可以在血管成形术中通过在该项操作中所使用的导管而输入到动脉。
通过下述的方法可以测定体内肌肉注射的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的剂量反应效果。根据标准的重组DNA方法，制备合适的G蛋白趋化因子受体(CCR5)模板DNA，用来制备编码G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的mRNA。这些模板DNA，无论是环状的或是线性的，都可以作为裸露的DNA或和脂质体形成复合物而使用。然后用不同剂量的模板DNA注射小鼠的四头肌。
腹腔注射0.3ml 2.5％的三溴乙醇，麻醉5到6周雌性及雄性的Balb/C小鼠。在大腿前侧做一个1.5cm的切口，能直接看到四头肌。用1毫升注射器，通过27号针头，注射包含在0.1ml的载体中的G蛋白趋化因子受体(CCR5)模板DNA，注射时间超过1分钟。从注射部位的远端大约0.5cm外向膝盖方向进针，深度为0.2cm，注射部位缝合以备以后的定位，并用无菌的钢夹闭合皮肤。
在合适的培养时间后(如，7天)，切除完整的四头肌，制备肌肉提取物。各四头肌的每5个15um的横切面进行组织化学染色以测定G蛋白趋化因子受体(CCR5)的蛋白表达。用类似的方式记录G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白表达的经时反应进程，只是那些四头肌来自不同小鼠且是不同的时间获得的。从接受注射小鼠和对照小鼠中制备细胞DNA和HIRT上清，用Southern印迹的方法分析G蛋白趋化因子受体(CCR5)DNA在注射后的肌肉中的保留时间。上面在小鼠实验中的结果可以用于推测G蛋白趋化因子受体(CCR5)裸露DNA用于人体或其他动物中所需要的合适剂量和其他治疗参数。实施例34G蛋白趋化因子受体(CCR5)转基因动物G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽也可以在转基因动物中表达。任何种类的动物，包括但不仅限于小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪、山羊、绵羊、牛及非人灵长类，比如，狒狒、猿猴及猩猩，它们都可以用于产生转基因动物。在一个具体的实施例中，这里所描述的技术及其他本领域已知的方法，作为基因治疗方法的一部分，可用于在人体中表达该发明的多肽。
本领域已知的任何技术都可以用于将待转基因(比如本发明的多核苷酸)导入动物以产生转基因动物的原代系。这些技术包括但不仅限于前核显微注射(Paterson等，Appl.Microbiol.Biotechnol.40691-698(1994)；Carver等，Biotechnology(NY)111263-1270(1993)；Wright等，Biotechnology(NY)9830-834(1991)；和Hoppe等，U.S.Pat.No.4873，191，(1989))；逆转录病毒介导的生殖系(Vander Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152(1985))，囊胚或胚胎基因转移；在胚胎干细胞基因打靶(Thompson等，Cell56313-321(1989))；细胞或胚胎的电穿孔(Lo，1983，Mol Cell.Biol.31083-1814(1983))；用基因枪导入本发明的多核苷酸技术(参考，Ulmer等，Science 2591745(1993)；把核酸构建物导入胚胎多能干细胞，然后把该干细胞转移回囊胚；及精子介导的基因转移(Lavitrano等，Cell 57717-723(1989)；等。这些技术的综述请参考Gordon，”Transgenic Animals，”Intl.Rev.Cytol，115171-229(1989)，该文章的全部在此作为参考文献。
任何在本领域熟知的技术都可以用于产生含有本发明的多核苷酸的转基因克隆，比如，将核转移到从培养的胚胎、胎儿及成人细胞(这些细胞是被诱导到静止期的)中获得的去核卵母细胞中的技术。(Campell等，Nature 38064-66(1996)；Wilmut等，Nature 385810-813(1997))。
本发明提供了所有细胞中都含有转基因的转基因动物，同时还提供了部分细胞而不是全部细胞含有转基因的转基因动物。比如嵌合体动物。这些转基因可以作为单个转基因进行整合；或以多个拷贝，如多联体的形式进行整合，比如，头对头的串联或头对尾串联形式。转基因还可以通过下列方法，比如Lasko等所述的方法(Lasko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896232-6236(1992))，被选择性导入特定的细胞类型并在其中被激活。这些细胞类型特异性的激活作用所要求的调节序列依赖于所感兴趣的特定细胞类型，这对于本领域有经验的技术人员来说是很明显的。当期望多核苷酸转基因被整合到内源性基因的染色体位点上的时候，优选基因打靶。
简而言之，利用这些技术，设计含有一些与内源性基因同源的核苷酸序列，目的是通过与染色体进行同源重组，将其整合到内源性基因上，并破坏该内源基因核苷酸序列的功能。转基因还可以选择性地被导入特定细胞类型，并因此通过下列方式，比如Gu等所述的方法(Gu等，Science 265103-106(1994))，使该内源基因仅在这种特定的细胞中失活。这些细胞类型特异性失活作用所要求的调节序列依赖于所感兴趣的特定细胞类型，这对于本领域有经验的技术人员来说是很明显的。在这一段中所引用的每篇文章的内容在这里都全部作为参考文献。
除了以普适的或组织特异性方式在转基因动物中表达本发明的多肽外，对本领域熟练的技术人员来说，通过许多其他的方式(比如，发育的或化学的调节表达)构建调节多肽表达的构建物，只是常规性的工作。一旦产生了转基因动物，可以用标准的方法检测重组基因的表达。最初筛选可以用Southern印迹分析或PCR技术分析动物组织以证实转基因已经整合。可以用一些技术评估转基因动物组织中转基因的mRNA的表达水平。这些技术包括但不仅限于从动物中获得的组织样品的Nothern印迹分析，原位杂交分析，反转录酶PCR(rt-PCR)。还可以用转基因产物的特异性抗体，对表达转基因的组织样品进行免疫细胞化学和免疫组织化学方面的评估。
一旦产生原代系动物，就可以通过近交繁殖、远交繁殖或杂交繁殖以产生特定动物的克隆系。这样的繁殖策略包括但不仅限于在带有不止一个整合位点的原代系小鼠之间进行远交繁殖以产生隔离系；隔离系内进行近交繁殖以产生复合转基因动物，由于每个转基因添加的表达效应，使得转基因在这样的动物中有更高的表达；在杂合转基因动物之间进行杂交，产生给定整合位点为纯合体的动物，以便提高表达，并且不必再用DNA分析来筛选动物；隔离的纯合体系列之间进行杂交，以产生复合杂合体或纯合体系；以及通过繁殖，把转基因放置到适合感兴趣的实验模型的独特背景中。
本发明的转基因动物的用途包括但不仅限于，作为动物模型，用于详细研究G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的生物学功能，研究与G蛋白趋化因子受体(CCR5)异常表达相关的疾病、失调和/或状态，及筛选能有效改善这些疾病，失调和/或状态的化合物。实施例35G蛋白趋化因子受体(CCR5)基因敲除动物可以通过靶向同源重组的方法灭活或“敲除”G蛋白趋化因子受体基因和/或它的启动子，从而降低内源性G蛋白趋化因子受体的基因表达(见，例如Smithes等，Nature 317230-234(1985)；Thomas&Capecchi，Cell 51503-512(1987)；Thompson等.Cell 5313-321(1989)；在此每篇文献的全文都作为参考文献)。比如，可以用一个本发明中突变的、无功能的多核苷酸(或一个完全不相关的DNA序列)转染体内表达本发明多肽的细胞。这个多核苷酸的侧翼有与内源性多聚核苷酸同源的DNA(基因的编码区或调节区)，含有或不含有选择标记和/或负性选择标记。在另一个实施例中，用本领域常用的技术在含有但不表达感兴趣的基因的细胞中进行基因敲除。再通过靶向同源重组插入DNA构建物，导致目的基因的灭活。这种方法特别适合用于研究和农业领域，通过对胚胎干细胞的修饰，可以产生含有失活的靶基因的子代动物。(例如，参考，Thomas&Capecchi 1987及Thompson 1989，见上文)。如果用合适的病毒载体，可以使重组DNA直接给药于或导向于所需要的体内位点，那么这些方法就可以常规的用于人体。这对本领域技术人员来说是很显而易见的。
在本发明的进一步的实施例中，用经过基因工程改造的、能表达本发明多肽的细胞，或者经基因工程改造后能不表达本发明多肽的细胞(如敲除)，对患者给药。这样的细胞可以从患者(例如动物，包括人类)或MHC相容的供体中获得，这样的细胞包括但不仅限于纤维母细胞、骨髓细胞、血细胞(如淋巴细胞)、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞等。这些细胞在体外经过基因工程改造，利用重组DNA技术，将编码本发明的多肽的序列导入细胞；或者破坏编码序列和/或与本发明多肽相关的内源调节序列，比如通过转导(用病毒载体，优选那些能把转基因整合到细胞基因组中的载体)或转染操作，包括但不仅限于使用质粒、粘粒、酵母人工染色体、裸露DNA、电穿孔、脂质体等。本发明多肽的编码序列可以放置到一个强的组成性的或可诱导的启动子或启动子/增强子下面，以获得G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的表达，优选分泌。这些能够表达本发明的多肽，并在一个实施例中，优选能分泌本发明的多肽的经过改造过的细胞，可以被系统性地比如在循环中或经腹膜内地导入到病人中。
另外，这些细胞可以被整合到基质中，然后移植到体内，比如，基因工程改造过的成纤维细胞可以作为皮肤移植片的一部分进行移植；基因改造过的内皮细胞可以作为淋巴管或血管移植片的一部分进行移植。(见，例如，Anderson等.U.S. Patent No.5,399,349；及Mulligan&Wilson，U.S.Patent No.5,460,959.每篇文献的全文在此都作为参考文献)。
当被输入的细胞是非自体同源的或非MHC相容的细胞，可以用众所周知的技术，防止宿主发生针对导入的细胞的免疫反应。比如，细胞可以以胶囊的形式导入，在允许与相邻的细胞外环境交换成分的同时使得导入的细胞不被宿主免疫系统所识别。
本发明中的基因敲除动物的用途包括但不仅限于作为动物模型，用于详细研究G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的生物学功能，研究与G蛋白趋化因子受体(CCR5)异常表达相关的疾病、失调和/或状态，及筛选能有效改善这些疾病，失调和/或状态的化合物。实施例36检测B细胞增殖和分化的刺激或抑制的实验功能性体液免疫反应的产生，需要在B谱系细胞和它们的微环境之间有兼具可溶性和同源性的信号传递。信号可以给予积极的刺激，允许激B细胞系继续程序化发育；或消极刺激，指导细胞阻止目前的发育途径。到目前为止，已经发现了许多影响B细胞反应的刺激和抑制信号，包括IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-13，IL-14，IL-15。有趣的是，这些信号本身的作用很弱，但是和其他许多共刺激蛋白一起时能诱导B细胞群的激活，增殖，分化，归巢，耐受和死亡。
被研究得最详尽的B细胞共刺激蛋白之一是TNF超家族。已经发现这个家族中的CD40、CD27和CD30以及它们相应的配体CD154、CD70及CD153一起能调节很多的免疫反应。检测和/或观察B细胞群和它们前体细胞的增殖和分化的实验是有价值的工具，可以用它测定各种蛋白所具有的、在增殖和分化方面对这些B细胞群的作用。下面叙述了的两个实验，它们被设计用于检测B细胞群和它们前体细胞的分化，增殖或抑制。
体外实验评估纯化的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白、或其截短的形式、或纯化的G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体在诱导B细胞和它们前体细胞活化，增殖，分化或抑制和/或死亡方面的能力。用标准的B淋巴细胞共刺激实验评价G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白对纯化的人类扁桃体B细胞的活性，被定性检测的剂量范围为0.1到10,000ng/ml。在该实验中，纯化的扁桃体B细胞和作为引发试剂的由福尔马林固定的金黄色葡萄球菌Cown I(SAC)或固定的抗人IgM抗体共同培养。如氚标记胸苷掺入而测量的，第二信号，如IL-2和IL-15协同SAC及IgM诱发B细胞的增殖。使用这个实验可以很容易地鉴定出新的协同因子。这个实验包括用磁珠除去CD3阳性的细胞分离人扁桃体B细胞(MACS)。通过分析CD45R(B220)表达，说明所得到的细胞95％以上是B细胞。
不同稀释度的每个样品放置到96孔板的每个孔中，在培养液中(RPMI1640，含有10％胎牛血清，5×10-5M 2ME，100U/ml青霉素，10μg/ml链霉素及10-5稀释的SAC)加入105悬浮于培养基的后细胞，总体积是150μl。在待测因子加入后72小时开始，以3H-胸苷(6.7Ci/Mm)的20小时脉冲(1uCi/well)定量细胞增殖或抑制。阳性对照和阴性对照分别是IL-12和培养基。
体内实验用单独的缓冲液或2mg/Kg的G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白或其截短形式、或G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体，注射BALB/C小鼠(腹腔注射)每天两次。连续4天这样处理小鼠，然后处死小鼠，取各种组织和血清进行分析。通过将正常的和G蛋白趋化因子(CCR5)蛋白处理过的小鼠的脾的苏木素/伊红染色部分进行比较，以确定G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白对脾细胞活性的影响，比如动脉周围淋巴鞘的扩散，和/或红髓区有核细胞的明显增加，它表明B细胞分化和增殖的激活作用。通过使用B细胞标记物，抗CD45R(B220)，用免疫组化研究来测定脾细胞的任何生理变化，比如脾组织的破坏，是否是由于松散界定的B细胞区中B细胞的增多，以至侵入已建立的T细胞区而引起的。
流式细胞记数分析来自G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白处理的小鼠的脾，来说明G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白能否特异的增加ThB+，CD45R(B220)弱表达B细胞的构成比例，使其超过对照组。
同样的，体内成熟B细胞的增加的预期结果是血清抗体滴度的相应增高。因此，将G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白处理小鼠和缓冲液处理小鼠的血清IgM和IgA水平进行比较。
在该实施例中描述的研究检测了G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的活性。然而，本领域有经验的技术人员可以很容易地对范例中的研究进行修改，来检测G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸(如，基因治疗)，激动剂(包括配体)，和/或G蛋白趋化因子受体的拮抗剂的活性。实施例37T细胞增殖检测实验对外周血单个核细胞(PBMC)进行CD3诱导的增殖实验，并通过其对3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的摄取进行测量。该实验按照下面所描述的方法进行。用100μl/孔的抗CD3单克隆抗体(HIT3a，Pharmingen)或同型配对的对照单克隆抗体(B33.1)在4℃过夜包被96孔板(1μg/ml在0.05M重碳酸盐缓冲液中，pH 9.5)，然后用PBS洗3遍。用F/H梯度离心从人外周血中分离PBMC，并一式四份加到用单克隆抗体包被的反应板中(5×104/孔)，培养液是含有10％胎牛血清和青链霉素及不同浓度G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的RPMI培养基(总体积是200μl)。相关的蛋白缓冲液和单独的培养液作为对照。在37℃培养48小时后，平板以1000rpm离心2分钟，取出100μl的上清，保存在-20℃，如果观察到增殖的活性就检测上清中的IL-2(或其他的细胞因子)。孔中补充100μl含0.5μCi3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基，并在37℃中培养18-24小时。收获每个孔中样品，掺入的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷作为增殖的测量标准。单独的抗CD3作为增殖的阳性对照。IL-2(100U/ml)能增强增殖，也作为对照。不能诱导T细胞增殖的对照抗体作为G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白作用的阴性对照。
该实施例中的研究检测了G蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的活性。然而在本领域有经验的技术人员可以对范例中的研究进行修改，来检测G蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸(如，基因治疗)，激动剂(包括配体)，和/或G蛋白趋化因子受体的拮抗剂的活性。实施例38G蛋白趋化因子受体(CCR5)对MHC II类分子、共刺激分子、粘附分子的表达和单核细胞及单核细胞来源的人树突状细胞分化的作用树突状细胞是由外周血中发现的增殖的前体细胞的扩增所产生的将黏附的PBMC或淘选的单核细胞部分与GM-CSF(50ng/ml)及IL-4(zong/ml)一起培养7-10天。这些树突状细胞具有不成熟细胞的特征性表型(表达CD1、CD80、CD40和MHC II类抗原)。用例如TNF-a等激活因子处理，引起表面表型的快速变化(MHC I类和II类分子，共刺激和粘附分子的表达增加，FCγRII下调，CD83上调)。这些变化和增加的抗原呈递能力及树突状细胞功能性成熟相关。
用荧光激活细胞分类术(FACS)对表面抗原进行分析，步骤如下用浓度不断增加的G蛋白趋化因子受体(CCR5)或配体或LPS(阳性对照)处理细胞1-3天，用含有1％BSA和0.02mM叠氮化钠的PBS洗涤，然后按1∶20稀释度和合适FITC-或PE标记的单克隆抗体在4℃共同培养30分钟。再一次洗涤后，在FACScan(Becton Dickinson)上用流式细胞术分析标记的细胞。
对细胞因子产量的影响。树突状细胞所产生的细胞因子，特别是IL-12，对于T细胞依赖的免疫反应的初始化起到很大的作用。IL-12强烈地影响着Th1类辅助T细胞免疫反应的发展，并且诱导细胞毒性T细胞和NK细胞的功能。用ELISA方法测量IL-12的释放，步骤如下用浓度不断增加的G蛋白趋化因子受体(CCR5)处理树突状细胞(106/ml)24小时。LPS(100ng/ml)加入到细胞培养板中作为阳性对照。收集细胞培养的上清，用商用ELISA试剂盒(如R&D Systems(Minneapolis，MN))分析IL-12的含量。采用试剂盒提供的标准程序进行操作。
对MHC II类分子、共刺激和粘附分子表达的效应。单核细胞上可以鉴别出三种主要的细胞表面抗原家族粘附分子、参与抗原呈递的分子和Fc受体。MHC II类抗原和其它的共刺激分子——如B7和ICAM-1——表达的调节，可以导致单核细胞抗原呈递能力和诱导T细胞活化能力的变化。Fc受体表达的增强与单核细胞的细胞毒作用、细胞因子的释放和吞噬作用的增强相关。
检测表面抗原的FACS分析方法如下。用浓度递增的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)或者LPS(阳性对照)处理单核细胞1-5天，用含1％BSA和0.02mM叠氮钠的PBS洗一次。而后与1∶20稀释的FITC或者PE标记的合适的单克隆抗体在4℃孵育30分钟，再洗一次，被标记的细胞用FACScan(Becton Dickinson)进行流式细胞分析。
单核细胞激活和/或存活力的提高 分析激活(或者失活)单核细胞和/或增加单核细胞的存活(或者降低单核细胞的存活)的分子的方法在本领域是众所周知的，可常规性用于确定本发明的分子功能是可以作为单核细胞的激活剂还是抑制剂。G-蛋白趋化因子受体(CCR5)、激动剂或者拮抗剂的筛选可以用下述三种实验。每个实验都需要分离外周血单个核细胞(PBMC)，从来自单一供体的leukopacks(American Red Cross，Baltimore，MD)中通过Histopaque梯度(Sigma)离心获得外周血单个核细胞。单核细胞通过逆流离心淘洗从PBMC中分离。
单核细胞存活分析在无血清和其他刺激物存在的条件培养，人单核细胞逐步失去生存能力。它们的死亡是由于内在的调节过程(凋亡)。另外加入激活因子进行培养，如TNF-α，可显著提高细胞的存活率，防止DNA的断裂。碘化丙锭(PI)染色可用于检测调亡，程序如下在聚丙烯管中，分别用无血清培养基(阳性对照)、存在100ng/ml TNF-α(阴性对照)和存在不同浓度的待测成分的条件下培养单核细胞48小时。细胞用含终浓度为5μg/ml PI的PBS重悬，浓度为2×106/ml，室温下孵育5分钟，进行FACScan分析。在这个实验范例中，PI的摄入量被证明与DNA的断裂有关。
对细胞因子释放的效应 单核细胞/巨噬细胞的一个重要的功能是它们在刺激后释放细胞因子，对免疫系统其他细胞类群具有调节活性。用于测定细胞因子释放的ELISA程序如下浓度为5×105细胞/ml的人单核细胞与浓度递增的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)以及在不存在G-蛋白趋化因子受体的同等条件下共培养。对于IL-12的产生，在存在G-蛋白趋化因子受体时，用IFN(100U/ml)致敏细胞，而后加入LPS(10ng/ml)。24小时后收集条件培养基，冻存备用。用商业上可以获得的ELISA试剂盒(如R&D Systems(Minneapolis，MN))采用试剂盒提供的标准程序，测量TNF-α和IL-10、MCP-1和IL-8。
氧化爆发 纯化的单核细胞以2-1×105细胞/孔的浓度培养于96孔板中，各孔加入浓度递增的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)，培养基(RPMI1640+10％FCS，谷氨酰胺和抗生素)总体积为0.2ml。培养3天后，离心该培养板，从孔中移去培养基。对于单层巨噬细胞，每孔加入0.2ml酚红溶液(140mM NaCl，10mM磷酸钾缓冲液pH7.0，5.5mM葡萄糖，0.56mM酚红和19U/ml of HRPO)，同时加入刺激物(100nM PMA)。培养板于37℃孵育2小时，每孔加入20μl 1N NaOH终止反应。在610nm读取吸光度值。计算巨噬细胞产生的H2O2量，对每次实验都要做已知摩尔浓度的H2O2溶液的标准曲线。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改该范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例39G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的生物学效应星形胶质细胞和神经元分析在大肠杆菌中表达，并根据前述方法纯化的重组G-蛋白趋化因子受体(CCR5)可以用于测定促进皮质神经元细胞的存活、轴突延伸和表型分化，诱导神经胶质原纤维酸性蛋白免疫阳性的细胞，即星型胶质细胞的增殖的活性。选择皮质细胞进行生物学分析是基于在皮质结构中普遍表达FGF-1和FGF-2，以及先前报道的FGF-2处理可以增强皮质神经元的存活。例如，胸腺嘧啶核苷掺入分析可以用于阐明G-蛋白趋化因子受体(CCR5)对这些细胞的活性。
此外，先前的报道描述了FGF-2(碱性FGF)对皮质或者海马神经元体外生物学效应，已经证明它既能增加神经元存活又能促进轴突延伸。(Walicke，P.等，″Fibroblast growth factor promotes survivalof dissociated hippocampal neurons and enhances neuriteextension.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 833012-3016.(1986)，在此将该实验全文作为参考文献)。然而，对PC-12细胞的实验报道提示这两种反应不必然同时发生，可能不仅依赖于被测试的FGF，而且依赖于靶细胞表达的受体。采用原代皮质神经元培养实例，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)诱导轴突延伸的能力可以利用例如胸腺嘧啶核苷掺入实验来与FGF-2诱生的反应进行比较。成纤维细胞和内皮细胞测定人肺成纤维细胞获自Clonetics公司(San Diego，CA)，并用Clonetics的生长培养基培养。皮肤微血管内皮细胞获自CellApplications公司(San Diego，CA)。在增殖实验中，人肺成纤维细胞和皮肤微血管内皮细胞按5000细胞/孔培养在96-孔板中，在生长培养基中培养1天。然后将该细胞在含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的基础培养基中培养1天。更换新鲜的含0.1％BSA的培养基，细胞与待测蛋白共培养3天。每孔加入终浓度为10％的Alamar Blue(Alamar Biosciences，Sacramento，CA)。细胞培养4小时。通过CytoFluor荧光光度计测定细胞的存活率。对于PGE2测定实验，将人肺成纤维细胞按5000细胞/孔在96孔板中培养1天。在培养基更换为含0.1％BSA的基础培养基后，细胞与FGE-2或者G-蛋白趋化因子受体(CCR5)在存在或不存在IL-1α的条件下培养24小时，收集上清，用EIA试剂盒(Cayman，Ann Arbor，MI)分析PGE2。对于IL-6测定实验，人肺成纤维细胞按5000细胞/孔在96孔板中培养1天。在培养基更换为0.1％BSA基础培养基后，细胞与FGF-2或者G-蛋白趋化因子受体(CCR5)在存在及不存在IL-1α的条件下培养24小时，收集上清，用ELISA试剂盒(Endogen，Cambridge，MA)分析IL-6。
在加入Alamar Blue，评价对成纤维细胞增殖影响的效应前，人肺成纤维细胞在存在FGF-2或者G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的条件下，于基础培养基中培养3天，在10-2500ng/ml的范围内，FGF-2具有的刺激效应可以用于与G-蛋白趋化因子受体的刺激效应进行比较。帕金森模型在帕金森氏病中，运动功能的丧失是由于黑质纹状体的多巴胺能投射神经元退化导致的纹状体(striatal)多巴胺缺乏。具有帕金森氏病广泛特征的动物模型涉及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)的系统性给药。在中枢神经系统(CNS)，MPTP被星型胶质细胞摄入，经B型单胺氧化酶代谢为1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)后释放。随后，多巴胺能神经元通过高亲和的多巴胺重摄取输送载体主动聚集MPP+。而后MPP+在线粒体中通过电化学梯度浓缩，并且选择性的抑制烟酰胺腺嘌呤二磷酸泛醌氧化还原酶(复合体I)，由此干扰电子传递，最终产生氧自由基。
已经证明在组织培养实验范例中，FGF-2(碱性FGF)对黑质多巴胺能神经元具有营养作用(Ferrari等，Dev.Biol.1989)。最近，Unsicker博士的研究组已经证明在纹状体的凝胶泡沫移植物中添加FGF-2，可以近乎完全地保护黑质多巴胺能神经元，使其不受与MPTP暴露相关的毒性的影响(Otto和Unsickeiy J.Neuroscience，1990)。
基于对FGF-2的研究数据，可以对G-蛋白趋化因子受体(CCR5)进行评估，确定它是否具有类似FGF-2那样的体外增强多巴胺能神经元的存活的作用，以及在体内检测它能否保护纹状体内的多巴胺能神经元免受MPTP处理所导致的相关损伤。G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的潜在效应首先在体外培养的多巴胺能神经元细胞实验中进行检测。从妊娠14天的Wistar大鼠胚胎中切除中脑底板，制备培养物。用胰蛋白酶消化该组织，而后以200000细胞/cm2的密度接种在polyorthinine-层粘连蛋白包被的玻璃盖片上。细胞用含有激素添加剂(Nl)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基和F12培养基培养。8天后，培养物用多聚甲醛体外固定，进行酪氨酸羟化酶免疫组化染色，它是多巴胺能神经元细胞的一种特异的标记。分离的细胞培养物从胚胎鼠中制备。每3天更换一次培养基，同时补加各种因子。
由于多巴胺能神经元细胞是从妊娠14天的动物中分离出来的，这个发育阶段超过了多巴胺能前体细胞增殖的阶段，所以酪氨酸羟化酶免疫阳性细胞的数目的增多，就代表了体外存活的多巴胺能神经元细胞数目的增多。因此如果G-蛋白趋化因子受体(CCR5)能够起到延长多巴胺能神经元细胞存活的作用，就提示G-蛋白趋化因子受体(CCR5)与帕金森氏疾病有关。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例40G-蛋白趋化因子受体(CCR5)对于血管内皮细胞生长的效应在第1天，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以2-5×104的密度接种于M199培养基的35mm碟子中，M199培养基含有4％胎牛血清(FBS)，16单位/ml肝素和50单位/ml内皮细胞生长添加剂(EGGS，Biotechnique，Inc.)。第2天，培养基用含10％FBS，8单位/ml肝素的M199代替。按不同的浓度加入SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.22的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白和阳性对照，如VEGF和碱性FGF(bFGF)。在第4天和第6天，更换培养基，在第8天，用Coulter计数器确定细胞数。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞数的增加表明G-蛋白趋化因子受体(CCR5)可以促进血管内皮细胞的增殖。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例41G-蛋白趋化因子受体(CCR5)对于血管内皮细胞增殖的刺激效应为评价生长因子的促有丝分裂活性，用电子偶联试剂PMS(吩嗪硫酸二甲酯)(CellTiter 96 AQ，Promega)进行比色测量MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基氧苯基)-2-(4-硫苯基)2氢-四唑)实验。0.1ml细胞接种于96孔板中(5000细胞/孔)，培养基中补加血清，过夜培养使细胞贴壁。用0.5％FBS使其血清饥饿12小时后，在存在或者不存在肝素(8单位/ml)的情况下，将受试物(0.5％FBS中的bFGF，VEGF165或者G-蛋白趋化因子受体(CCR5))加入每个孔，培养48小时。每孔加入20mg MTS/PMS混合物(1∶0.05)，在37℃培养1小时，而后在ELISA读板仪上测量490nm吸光度值。减去对照孔(一些培养基，没有细胞)的背景吸光度值，每个受试物平行测试7个孔。(见Leak等.In VitroCell.Dev.Biol 30A512-518(1994))。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例42刺激内皮细胞的迁移本实施例用于探索G-蛋白趋化因子受体(CCR5)刺激淋巴内皮细胞迁移的可能性。
采用48孔微量趋化性分析槽检测内皮细胞的迁移(Neuroprobe Inc.，Cabin John，MD；Falk，W等，J.Immunological Methods1980；33239-247)。孔径为8μM的无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜(Nucleopore Corp.Cambridge，MA)用0.1％明胶室温包被，至少6小时，在无菌空气中干燥。待测物质用含有0.25％牛血清白蛋白(BSA)的M199培养基稀释至合适浓度，25μl最终稀释液加入到改良Boyden装置的下层小室中。洗涤亚汇聚状态的、早期传代的(2-6)HUVEC或者BMEC培养物，按细胞解离所需要的最短时间，用胰蛋白酶消化。将滤膜放置在下层和上层小室之间之后，把悬于50μl含1％FBS的M199中的2.5×105细胞接种在上层小室中。然后将该装置放在37℃含5％CO2的湿润温箱中孵育1小时，使细胞发生迁移。培养结束后，移去滤膜，用橡皮淀帚刮擦带有未迁移细胞的滤膜的上面。用甲醇固定滤膜，并用Giemsa溶液染色(Diff-Quick，Baxter，McGraw Park，IL)。计数每个孔中3个随机高放大倍数区(40×)的细胞来进行迁移的定量，所有的组重复4次。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例43血管生成中G-蛋白趋化因子受体(CCR5)对于索状组织形成的作用在血管生成中，另一步骤是索状组织的形成，标志是内皮细胞的分化。这项生物测定测量的是当进行体外培养时，微血管内皮细胞形成毛细血管样结构(中空结构)的能力。
作为增殖细胞(第2代)的CADMEC(微血管内皮细胞)购自CellApplications，Inc。采用Cell Applications公司的CADMEC生长培养基培养细胞，使用第5代细胞。对于体外血管生成实验，48孔细胞培养板的每个孔用Cell Applications公司的粘附因子培养基(200ml/孔)37℃包被30分钟。CADMEC按照7500细胞/孔的密度接种在包被孔中，在生长培养基中过夜培养。而后用含有对照缓冲液或者G-蛋白趋化因子受体(CCR5)(0.1到100ng/ml)的300mg Cell Applications公司的索形成培养基替代生长培养基。细胞继续培养48小时。毛细管状条索的数目和长度用Boeckeler VIA-170视频图象分析仪定量。所有的实验重复3次。
商品化的(R&D)血管内皮生长因子(VEGF)(50ng/ml)用作阳性对照。b-esteradiol(1ng/ml)用作阴性对照，合适的缓冲液(不含蛋白)也用作对照。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例44对鸡尿囊绒膜的血管生成效应鸡尿囊绒膜(CAM)是已建立的检测血管生成的良好系统。在CAM上的血管形成容易观察和定量。可以在CAM中检测G-蛋白趋化因子受体(CCR5)或其配体是否具有刺激血管生成的能力。
白色来亨鸡(原鸡)和日本鹌鹑(鹌鹑)的受精卵在37.8℃，80％湿度下孵化。16日龄鸡和13日龄鹌鹑胚胎的分化的CAM可以用下述的方法研究。
在发育的第4天，在蛋壳上开一个窗户。检查胚胎是否正常发育，而后用胶带(cellotape)封好小口。进一步培养至第13天。将Thermanox盖片(Nunc，Naperville，IL)切割成直径约5mm的小圆片。无菌和无盐的生长因子溶于蒸馏水中，用吸管在圆片上加入约3.3mg/5ml。空气干燥后，反转圆片放在CAM上。3天后，样品用3％戊二醛和2％甲醛固定，并用0.12M二甲胂酸钠缓冲液漂洗。用立体显微镜[Wild M8]照相，并按照前述方法包埋，用于半薄或超薄切片。对照只用载体圆片。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例45在鼠中采用基质胶(Matrigel)植入物进行血管生成实验体内G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的血管生成实验检测的是现有的毛细血管网络在植入的鼠细胞外基质(基质胶)囊中形成新生血管的能力。蛋白和液体基质胶在4℃混合，而后将混合物皮下注射给小鼠，并固化。7天后，移去基质胶固化“塞子”，检查是否存在新生的血管。基质胶购自Becton Dickinson Labware/Collaborative BiornedicalProducts。
在4℃融化的基质胶材料是液体。基质胶与150ng/ml的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)在4℃混合，而后抽进冷的3ml注射器。约8周龄的雌性C57B1/6鼠用基质胶和实验蛋白的混合物在腹侧中部两点(0.5ml/点)注射。7天后，颈脱位法将鼠处死，取出基质胶塞子，并清洗(如移去所有的粘附膜和纤维组织)。两份整个塞子在10％中性甲醛缓冲液中固定，石蜡包埋，用于制备切片，用Masson’s Trichrome染色后进行组织学检查。每个塞子在3个不同的区作横向切片。选择的切片染色用于证明vWF的存在。本分析的阳性对照是牛碱性纤维母细胞生长因子(FGF)(150ng/ml)。基质胶单独用于确定血管新生的基础水平。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例46在兔下肢模型中挽救局部缺血为研究G-蛋白趋化因子受体(CCR5)对局部缺血的体内效应，根据先前的描述(Takeshita，S.等，Am J.Pathol 1471649-1660(1995))，采用外科手术移去一根股动脉，建立兔后肢缺血模型。股动脉的切除导致血栓的逆向发展和髂外动脉阻塞。最终，向缺血的肢体流动的血流依赖于来自髂内动脉的侧副血管(Takeshita，S.等Am J.Pathol7471649-1660(1995))。10天的间隔允许兔子进行术后恢复和发展内生性侧副血管。在术后10天(0天)，基线血管造影后，通过动脉基因转染技术，使用参考文献所述水凝胶包被的气囊导管(Riessen，R.等HumGene Their.4149-758(1993)；Leclerc，G.等J.Clin.Invest.90936-944(1992))，将500mg裸露的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)表达质粒转染缺血后肢的髂内动脉。当在治疗中应用G-蛋白趋化因子受体(CCR5)时，在1分钟的时间内，通过灌输导管，将约500mg的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白单一药丸(bolus)或者对照药丸发送到缺血肢体的髂内动脉中。在第30天，测量这些兔子的各种参数a)BP比-缺血肢体和正常肢体的心脏收缩压的血压比；b)血流量和流量储备-静止血流量在未扩张条件下的血流量，最大血流量完全扩张条件下的血流量(也是血管总量的间接测量)，而最大流量和静止期流量的比值反映了血流量储备；c)血管造影得分-通过计数侧副血管的血管造影片而得出。得分由在交叠网格中横跨不透明动脉的循环数除以兔大腿上的循环总数的百分率而确定；d)毛细血管密度-侧副毛细血管的数目由取自后肢的的光学显微镜切片确定。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例47外周动脉疾病模型使用G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的血管生成疗法是一个新的治疗策略，可以在外周动脉疾病中重建缺血部位的血流。实验的程序如下a)结扎股动脉的一侧以产生后肢的缺血性肌肉，另一侧后肢作为对照。
b)G-蛋白趋化因子受体(CCR5)按20mg-500mg的剂量范围，静脉内或者肌肉内每周给药3次(或更多)，持续2-3周。
c)结扎股动脉后的第1，2，3周后，收集缺血的肌肉组织用于分析G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的表达和组织学情况。同时在对侧后肢正常肌肉的另一侧进行组织活检。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例48局部缺血性心脏病模型G-蛋白趋化因子受体(CCR5)被评估为潜在的有丝分裂原，能够刺激侧副血管的发育，并在冠状动脉闭塞后重建新的血管。已经在原位研究过G-蛋白趋化因子受体(CCR5)表达的变化。实验的程序包括a)对大鼠行左侧胸廓切开术暴露心脏，立即用细手术线(6-0)将左冠状动脉缝合，而后封闭胸廓。
b)静脉内和/或肌肉内注射G-蛋白趋化因子受体(CCR5)，剂量范围为20mg-500mg，每周3次(也许更多)，持续2-4周。
c)手术后30天，摘除心脏，作横向切片，进行形态学分析和原位分析。
本实施例所描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例49G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抑制TNFα诱导的粘附分子表达淋巴细胞聚集到炎症发生和血管生成的区域涉及淋巴细胞表面粘附分子(CAMs)和血管内皮细胞之间特定的受体-配体相互作用。在正常和病理状态下，粘附过程是多步的级联过程，涉及胞内粘附分子(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和内皮细胞白细胞粘附分子(E-选择素)在内皮细胞(EC)上的表达。这些分子及其他血管内皮上分子的表达决定了在炎症反应发展过程中，淋巴细胞粘附到局部血管的效率和从血管中渗出进入局部组织的效率。细胞因子和生长因子的局部浓度参与这些CAMs表达的调控。
肿瘤坏死因子(TNFα)是一种有效的促炎症细胞因子，是内皮细胞上所有3种CAMs的刺激物，并且参与广泛的炎症反应，通常导致病理结果。
可以检查G-蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的抑制TNFα诱导的CAM表达的潜能。采用改进的ELISA实验进行检查，该实验用内皮细胞(ECs)作为固相吸附剂，当TNFα与FGF蛋白家族的一个成员共刺激时，测定TNFα处理的ECs上的CAM的表达量。
为进行此实验，从收集保存的脐带中获得人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养物，在补加10％FCS、1％青霉素/链霉素的生长培养基中(EGM-2；Clonetics，San Diego，CA)中，于37℃，含5％CO2的湿润孵箱中维持生长。以1×104细胞/孔的浓度将HUVEC接种96孔板，在EGM培养基中37℃培养18-24小时或至成片。随后用补加100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的无血清的RPMI-1640溶液漂洗单层细胞3次，于37℃用给定的细胞因子和/或生长因子处理24小时。培养后，评价细胞的CAM的表达。
在标准96孔板中培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)至成片。从细胞孔中移去生长培养基，用90μl 199培养基(10％FBS)代替。用于测试的样品和阳性及阴性对照均一式三份加入孔板中(10μl体积)。孔板在37℃培养5小时(选择素或者整合素表达)或者24小时(只表达整合素)。吸出孔板中的培养基并在每孔中加入100μl 0.1％多聚甲醛-PBS(含Ca++和Mg++)。置于4℃30分钟。
从孔中移去固定液，用含0.5％BSA的1×PBS(含Ca++和Mg++)洗孔1次，排净液体，但不能使孔变干。在测试孔和对照孔中加入10μl稀释的一抗，抗-ICAM-1-生物素，抗-VCAM-1-生物素和抗-E-选择素-生物素的使用浓度为10μg/ml(1∶10稀释0.1mg/ml的抗体储存液)。细胞在37℃湿润环境下孵育30分钟。用含0.5％BSA的PBS(含Ca++和Mg++)洗孔3次。
而后每孔加入20μl稀释的ExtrAvidin-碱性磷酸酶(1∶5000稀释)，37℃孵育30分钟。用含0.5％BSA的PBS(含Ca++和Mg++)洗孔3次。将1片对-硝基苯酚磷酸(p-NPP)溶于5ml甘氨酸缓冲液中(pH10.4)。每个测试孔加入100μl含p-NPP底物的甘氨酸缓冲液。用溶于甘氨酸缓冲液中的ExtrAvidin-碱性磷酸酶工作稀释液，按照1∶5000(100)＞10-0.5＞10-1＞10-1.5，制备3份标准孔。3份孔中每种稀释液每孔加入5μl，，每孔中最终的碱性磷酸酶(AP)含量为5.5ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng。随后将100μl pNNP试剂加入每个标准孔中。孔板必须在37℃孵育4小时。所有孔中加入50μl 3M NaOH，结果用酶标仪以405nm波长定量。背景减影选项仅用于只加入甘氨酸缓冲液空白孔。设定模板指明每个标准孔中AP-缀合物的浓度(5.5ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng)。结果表示每个样品中结合AP-缀合物的量。
本实施例所描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例50采用跨膜片段抑制G-蛋白偶联受体活性的方法WO 94/05695和美国专利5,508,384号提出74个GPCR的跨膜区序列。WO 94/05695专利出版物描述和要求的多肽相应于GPCRs序列的片段或者同源区，它们可以结合GPCR配体或者调节配体的结合。两份文献都揭示了多巴胺D2受体第3个TM结构域的跨膜片段以简单的、小的单层囊泡模式特异性地结合完整的受体的配体。所采用的片段末端一端为赖氨酸(生理pH值下带正电荷)，另一端为天冬氨酸(生理pH值下带负电荷)。这个多肽预计不容易插入生物膜中。
相反，本实施例涉及将G-蛋白趋化因子受体(CCR5)暴露在可干扰其受体正确组装的分子上，从而调节、特别是抑制G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的生物学活性。特别是G-蛋白趋化因子受体(CCR5)跨膜区的合成、分离和/或重组多肽，片段和/或共有序列多肽，可以抑制G-蛋白趋化因子受体(CCR5)介导的信号转导。带电的残基可以加入到一端以促进多肽在膜中的正确定向。尤其，加入两个负电荷的残基——如天冬氨酸——在片段的胞外端可以增强拮抗活性。
跨膜结构域的片段可以在432A应用生物系统多肽合成仪上利用Fmoc氨基酸衍生物，采用流穿固相多肽合成方法合成。为克服在多肽合成过程中可能产生的聚集问题和因此导致的多肽链延长的终止，引入了丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的FmocHmb衍生物。将带电的残基加入多肽的末端以确保多肽在穿透进入细胞膜过程中的正确定向，并提高疏水肽的可溶性。多肽的纯度用反相HPLC评价，其结构用基质辅助的激光解吸时间飞行质谱仪(MALDI-TOF)证实(Tarasova等，Ad，Exp，Med.BioL，Plenum Press，NY，pp.201-206(1998).)
片段的拮抗效应采用稳定表达G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的人肾癌细胞(HEK)测定。RANTES用作激动剂。生长在Nunc公司盖玻片室载玻片上的细胞与1μMFura-2/AM在CO2孵箱中培养20分钟，用PBS漂洗，而后置于Zeiss Axiovert倒置显微镜上的载物台上，用Attofluor数字影象系统(Atto Instruments)测量Ca2+浓度，荧光用增强型CCD相机，外加505截断滤镜监测。采用含1μM Fura的Ca2+标准试剂校正Ca2+浓度。根据WO 99/43711实施例1-4所述的方法进一步优化片段的拮抗活性。
片段的拮抗活性也可以通过其抑制G-蛋白趋化因子受体-HIV细胞融合的能力来测定，以及通过抑制G-蛋白趋化因子受体(CCR5)同标记的配体结合的能力来测定，所用的方法是本领域众所周知的并在WO99/43711中描述过测定CXCR4的方法。实施例51可以表达G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的疱疹病毒永生化T细胞构建表达G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的疱疹病毒永生化T细胞系的方法如Vella等所述(J.Virol.Methods 7P51-63(1999))。在于此处公开的方法中，这个细胞系或者类似的细胞系被用于检测激动剂和拮抗剂。实施例52CCR5配体和抗CCR5抗体的分离按其天然状态溶解CCR5的通用方法如Mirzabekov等所述(J.Biol.Chem.27428745-50(1999))。该CCR5可用于配体或者抗体筛选实验。从人抗体的噬菌体展示文库中筛选CCR5抗体的方法已由Osbourn等提出(Nat.Biotechnol.16778-81(1998))。Lee等揭示出CCR5-特异性抗体2D7所识别的表位是可以抑制HIV进入的抗体的首选目标(Lee等J.Biol.Chem.2749611-26(1999))。其他筛选配体和抗体的方法在本领域广为人知，并在此描述。实施例53抗体中和实验Trkola等公开了一种以细胞系为基础的测量抗体对HIV-1的中和作用的方法(J.Virol 738966-74(1999))。HIV中和抗体检测和筛选可以在任一阶段抑制HIV结合或者进入的分子的实验已由Boritz等公开(J.Virol.736937-45(1999))。用于分析共同受体抑制作用的方法由Klasse等提出(J.Virol 737453-66(1999))。其他用于分析中和HIV-1进入、融合、复制的方法在本领域广为人知，并在此描述。实施例54采用XenomouseTM生产抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的抗体基因工程鼠中的XenomouseTM品系小鼠可以表达人全部IgG2/κ抗体，可以从Abgenix公司(Fremont，CA)获得。小鼠分组后，根据下列程序免疫免疫程序1(XF3融合)首先在XenomouseTM鼠(n＝5)尾基部注射100μg溶于PBS中的、编码全长G-蛋白趋化因子受体(CCR5)基因的DNA质粒表达载体(CCR5pcDNA3T)。随后在皮下注射3次，每次间隔两周，每次注射1×107用CCR5表达载体转化的CHO细胞(以下称为CCR5 CHO细胞)，该细胞是被包含在不完全弗氏佐剂中注射的。动物休息12周后，而后再给予两次以上的皮下注射，间隔2周，每次注射1×107用CCR5表达载体转化的NSO细胞(以下称为CCR5 NSO细胞)，该细胞是被包含在不完全弗氏佐剂中注射的。最后一次注射后3天。处死小鼠，收集脾和/或淋巴结细胞，用于产生杂交瘤。这次融合中产生的杂交瘤细胞称为“XF3.----”(表4)免疫程序2(XF6融合)首先在XenomouseTM鼠(n＝5)腹腔内注射7×106CCR5 CHO细胞，该细胞是被包含在弗氏完全佐剂中注射的。随后腹腔内注射6次，每次间隔2周，每次注射1×107的CCR5 CHO细胞。动物休息5周后，给予两次以上的腹腔内注射，间隔2周，每次注射1×107CCR5 NSO细胞，该细胞是被包含在不完全弗氏佐剂中注射的。最后一次注射后3天。处死小鼠，收集脾和/或淋巴结细胞用于产生杂交瘤。从这次融合中产生的杂交瘤细胞称为“XF6.---”(表4)。免疫程序3(XF7融合)首先在XenomouseTM鼠(n＝5)尾基部注射7×106CCR5 CHO细胞，该细胞是被包含在弗氏完全佐剂中注射的。随后在尾基注射6次，每次间隔两周，每次注射1×107CCR5 CHO细胞。动物休息5周后，再给予两次的尾基注射，间隔2周，动物休息5周后，给予两次以上的尾基注射，间隔2周，每次注射1×107CCR5 NSO细胞，该细胞是被包含在不完全弗氏佐剂中注射的。最后一次注射后3天。处死小鼠，收集脾和/或淋巴结细胞用于产生杂交瘤。从这次融合中产生的杂交瘤细胞称为“XF7.---”(表4)免疫程序4(XF11融合)首先通过XenomouseTM鼠(n＝5)脚垫注射免疫，间隔2周。每次免疫含1×107CCR5 NSO细胞的RIBI佐剂。这样的注射总共进行8次。最后一次注射后3天，处死小鼠，收集脾和/或淋巴结细胞用于产生杂交瘤。从这次融合中产生的杂交瘤细胞称为“XF11.---”(表4)免疫程序5(XF12融合)首先用含1×107CCR5 NSO细胞的弗氏完全佐剂，通过腹腔和皮下联合途径免疫XenomouseTM鼠(n＝5)。随后注射6次，每次间隔两周，每次注射1×107CCR5 CHO细胞，该细胞是被包含在不完全弗氏佐剂中注射的，同样采取的是腹腔和皮下联合途径免疫。第三次用包含在不完全弗氏佐剂中的细胞加强免疫后3天，处死一只动物用于融合。最后一次注射后3天，处死其余的鼠，收集脾和或/淋巴结细胞用于产生杂交瘤。这次融合产生的杂交瘤称为“XF12.---”(表4)
根据本领域众所周知的的程序产生杂交瘤。用于产生这些杂交瘤的融合伴侣细胞是P3X63-AG8.653，购自ATCC，批号F11545。
通过ELISA和FACS筛选，根据其结合CCR5的能力而筛选这些杂交瘤产生的抗体。抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的特异抗体的膜ELISA筛选实验质膜的制备。从CCR5 CHO细胞和转染了对照载体的CHO细胞中制备质膜。简而言之，108到109CCR5 CHO细胞或者CHO细胞重悬在40-50ml含有12mM Tris，pH7.5，250mM蔗糖的冷的溶液中，用可变速电子匀浆器在冰上裂解细胞。通过显微镜证实细胞裂解。4℃将匀浆液以270×g离心10分钟，收集上清(包含质膜)，弃沉淀(包含核的部分)。随后，在4℃将上清以8000×g离心10分钟，再次收集上清(包含质膜)，弃沉淀(包含线粒体和溶酶体组分)。而后在4℃以100,000xg超速离心60分钟，收集从上清中离心分离出的质膜成分。弃上清。沉淀的质膜重悬于约1ml PBS中，重悬后，质膜的体积用PBS补充到5-10ml。将质膜溶液保持在冰浴中并进行超声(冰浴)，直至得到均一的溶液。注意不要在超声时使溶液过热。采用Pierce化学公司(Rockford Illinois)的BCA蛋白测定试剂盒确定质膜蛋白的浓度。质膜于-70℃保存备用。
膜ELISA。Immulon 4板(Dynex)用50μl CCR5 CHO细胞或者载体对照转染的CHO细胞质膜(膜溶液浓度为20mg/ml)4℃包被过夜。第二天早晨，用PBST(PBST为含0.1％Tween20的PBS)洗板3次，而后每孔用200μl 3％BSA/PBS室温封闭1小时。吸去封闭液，每孔中加入50μl样品(杂交瘤上清)和对照，室温孵育2小时，或者4℃过夜。每个样品/对照都用于测定与CCR5 CHO膜和载体对照转染的CHO膜的结合。随后，用PBST洗板3次。洗完后，加入50μl二抗/孔(用0.1％BSA/PBST和1％羊血清稀释的载体羊抗人IgG(H+L)，浓度为0.25μg/ml)，室温孵育1小时。在孵育该板时，制备ABC试剂(Vector Laboratories)。而后用PBST洗板3次。随后，加入50μl/孔稀释的ABC试剂，室温孵育30分钟。而后用PBST洗板6次。每孔加入100μl TMB试剂(Sigma ChemicalCompany，St.Louis，MO)，室温孵育10分钟。每孔加入25μl的2MH2SO4终止反应。在405nm测量。
结果。238个杂交瘤可以结合CCR5 CHO细胞的膜，其中约一半结合CCR5 CHO细胞膜的能力比结合载体对照转染的细胞膜的能力增加。将217个杂交瘤(表4)扩大培养，重复膜ELISA实验。第二次筛选的结果证明这次筛选的程序是可重复的。表4分泌可结合CCR5CHO细胞膜的抗体的杂交瘤
FACS筛选抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的特异抗体收集G-蛋白趋化因子受体(CCR5)转染或者载体对照转染的CHO细胞，用FACS缓冲液(含0.1％NaN3和0.1％BSA的PBS)洗一次。1×106细胞悬于100μl FACS管中(Falcon 2052)。每管加入10μl杂交瘤上清，4℃孵育20分钟。每一上清都用于分析与CCR5 CHO细胞和载体对照转染的CHO细胞的结合。将细胞漂洗后重悬于100μl FACS缓冲液中，而后加入10μl 1μg/ml生物素标记的山羊抗人IgG(H+L)(Vector)，4℃孵育20分钟。将细胞漂洗后重悬于100μl FACS缓冲液中，而后加入5μl链霉亲和素PE(DAKO)，4℃孵育10分钟。将细胞漂洗后重悬于200μl含0.5μg/ml的碘化丙锭的FACS缓冲液中，而后用FACScan分析(Becton Dickinson)。
结果。通过FACS分析，筛选了217个杂交瘤上清，XF11.1D8、XF11.4D10、XF11.4C4、XF11.5H1、XF11.1G8对CCR5 CHO细胞的结合能力显著高于与载体对照转染的CHO细胞的结合能力。实施例55VH和VL结构域的鉴别和克隆从表达特定抗体的细胞系中鉴别和克隆VH和VL结构域的一个方法是，用VH和VL特异的引物，用PCR从抗体表达细胞系的cDNA中克隆。简而言之，从细胞系中分离RNA，作为RT-PCR的模板，用于从表达抗体的EBV细胞系中扩增抗体的VH和VL结构域。细胞用TRIzol_试剂(LifeTechnologies，Rockville.MD)裂解，而后用1/5体积的氯仿抽提。加入氯仿后，溶液在室温孵育10分钟，而后用台式离心机以14000rpm 4℃离心15分钟，收集上清，而后加入等体积异丙醇沉淀RNA，用台式离心机以14000rpm 4℃离心15分钟将沉淀的RNA集中到管底，离心后，弃上清，用75％乙醇洗沉淀，洗后，以800rpm 4℃离心RNA 5分钟，弃上清，将沉淀空气干燥。RNA溶于DEPC水中，60℃温浴10分钟，用光密度测量法对RNA定量。
依照本领域众所周知的方法，采用逆转录酶和随机六聚体引物，可以从1.5-2.5μg RNA中合成cDNA。而后cDNA可以用作扩增VH和VL结构域的PCR模板。用于扩增VH和VL基因的引物见表5。典型的PCR反应采用一个5’引物和一个3’引物。有时，当获得的RNA模板量有限，或者为提高扩增的效率，可以采用成组的5’引物和/或3’引物。例如有时，一次PCR反应采用所有的5个VH5’引物和所有的JH3’引物。PCR反应在50μl的反应体系中完成，该体系包括1×PCR缓冲液、每种浓度为2mM的dNTP、0.7单位的高保真Taq聚合酶、5’引物混合物、3’引物混合物和7.5μl cDNA。VH和VL的5’和3’引物的混合物可以通过混合分别为28pmol和22pmol的每种单独引物获得。PCR条件为96℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，1分钟，25个循环；而后72℃延伸10分钟。反应完成后，样品管储存在4℃。表5用于扩增VH和VL域的引物序列。引物名称 SEQ ID NO引物序列(5’-3’)VH引物Hu VH1-5’ 23 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGHu VH2-5’ 24 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGGHu VH3-5’ 25 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGHu VH4-5’ 26 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGHu VH5-5’ 27 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGCHu VH6-5’ 28 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGHu JH1，2-5’ 29 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCHu JH3-5’ 30 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCCHu JH4，5-5’ 31 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCHu JH6-5’ 32 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCVL引物Hu Vkappa1-5’ 33 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCHu Vkappa2a-5’ 34 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCHu Vkappa2b-5’ 35 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCHu Vkappa3-5’ 36 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCHu Vkappa4-5’ 37 GACATCGTGATGACCCAGTCTCCHu Vkappa5-5’ 38 GAAACGACACTCACGCAGTCTCCHu Vkappa6-5’ 39 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCHu Vlambda1-5’ 40 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCHu Vlambda2-5’ 41 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCHu Vlambda3-5’ 42 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCHu Vlambda3b-5’ 43 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCHu Vlambda4-5’ 44 CACGTTATACTGACTCAACCGCCHu Vlambda5-5’ 45 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCHu Vlambda6-5’ 46 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCAHu Jkappa1-3’ 47 ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCHu Jkappa2-3’ 48 ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCHu Jkappa3-3’ 49 ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCHu Jkappa4-3’ 50 ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCHu Jkappa5-3’ 51 ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCHu Jlambda1-3’ 52 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCHu Jlambda2-3’ 53 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCHu Jlambda3-3’ 54 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCHu Jlambda3b-3’ 55 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCHu Jlambda4-3’ 56 CACGTTATACTGACTCAACCGCCHu Jlambda5-3’ 57 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCHu Jlambda6-3’ 58 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
然后将PCR样品于1.3％琼脂糖凝胶上电泳。从胶上切下预期大小的DNA带(VH结构域约为506个碱基对，VL结构域约为344个碱基对)，用本领域众所周知的方法纯化。纯化的PCR产物可以连接到PCR克隆载体上(来自Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA的TA载体)。转化大肠杆菌和蓝/白斑筛选后可以获得单独的PCR克隆产物。克隆的PCR产物可以用本领域中通常使用的方法测序。
包含有VH结构域和VL结构域的PCR带也可以用于构建全长Ig表达载体。VH和VL结构域可以克隆到含有重链(如人IgG1或者IgG4)或者轻链(人κ或者λ)恒定区核苷酸序列的载体上，这样，在转染合适的宿主细胞的时候，完整重链或者轻链分子就可以从这些载体表达。进一步，当克隆的重链和轻链在一个细胞系中都表达(从一个或者两个载体)时，它们可以组装成完整的有功能的抗体分子，并分泌到细胞培养基中。用编码抗体VH和VL结构域的多核苷酸构建编码完整抗体分子的表达载体的方法在本领域是广为人知的。实施例56免疫荧光实验可以采用下面的免疫荧光程序，来证实G-蛋白趋化因子受体(CCR5)在细胞上的表达，或者用于检查与表达在细胞表面的G-蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的一种或者几种抗体的存在。简而言之，将Lab-Tek II小室载片用溶于含钙镁的DPBS(DPBS++)中的10μg/ml的2型牛胶原于4℃包被过夜。载片用冷的DPBS++洗两次，而后接种8000个CHO-CCR5细胞或者pC4转染的CHO细胞，总体积125μl，在37℃，95％氧气/5％二氧化碳的条件下培养。轻柔地吸出培养基，室温下用DPBS++洗两次粘附在载片上的细胞。而后将该载片用含有0.2％BSA的DPBS++在0-4℃封闭1小时。轻柔地吸出封闭液，加入125μl含抗体的溶液(含抗体的溶液可以是通常未稀释使用的杂交瘤培养上清，或者通常约1∶100稀释的血清/血浆)。载片在0-4℃孵育一小时，然后轻柔地吸出抗体溶液，用400μl冰冷的封闭液洗细胞5次。随后，在细胞上加入125μl含有1μg/ml罗丹明标记二抗(如抗人IgG)的封闭液。再次，载片在0-4℃孵育一小时，然后温和的吸出二抗溶液，用400μl冰冷的封闭液洗细胞3次，用冷的DPBS++洗5次，而后细胞用125μl含有3.7％甲醛的DPBS++室温固定15分钟，室温下细胞用400μl DPBS++洗5次，最后将细胞放置于50％含水甘油中，而后采用罗丹明滤镜在荧光显微镜下观察。实施例57Western印迹检测G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的结合G-蛋白趋化因子受体(CCR5)是一种嵌入膜的蛋白。为进行G-蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白的Western印迹，首先必须将细胞膜溶解。下列的程序是由Mirzabekov等提出的(J.Biol.Chem.27428745(1999))，在此将其全文列为参考文献。G-蛋白趋化因子受体(CCR5)-CHO细胞或者pC4-CHO(载体转化的对照CHO)细胞的单细胞悬液沉淀下来，而后重悬在溶解缓冲液中，缓冲液含100mM(NH4)2SO4，20mMTris-HCl(pH7.5)、1％(W/V)CymalTM-5(Anatrace Inc.，Maumee，OH)，和蛋白酶抑制剂混合物(一片CompleteTM(Roche MolecularBiochemicals)溶于25ml溶液中)。在摇床上4℃孵育30分钟，样品于14000g离心30分钟，以除去细胞碎片。用例如Wu等描述的抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)单克隆抗体2D7偶联的琼脂糖小珠(J.Exp.Med.1861373(1997))，采用免疫沉淀的方法将G-蛋白趋化因子受体(CCR5)从可溶性的膜中沉淀出来。免疫沉淀后，用溶解缓冲液剧烈清洗小珠，将样品重悬于2×SDS样品缓冲液中。样品在SDS样品缓冲液中55℃孵育1小时，然后进行11％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。而后根据本领域已知的标准程序进行G-蛋白趋化因子受体(CCR5)样品的Western印迹实验。实施例58Western印迹，免疫沉淀和G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的纯化溶解膜的程序或上述实施例57中由Mirzabekov等描述的的程序也可以用于制备包含G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的样品，以进行Western印迹，免疫沉淀和纯化。实施例59BIAcore分析G-蛋白趋化因子受体(CCR5)结合多肽的亲和力抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体与G-蛋白趋化因子受体(CCR5)结合可以用BIAcore分析实验来分析。G-蛋白趋化因子受体(CCR5)(或者其他希望了解与抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体的亲和力的抗原)或者抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体可以经由氨基基团，利用N-乙基-N′-(二甲基氨基丙基)-碳酰亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，将其共价固定在BIAcore传感芯片上(CM5芯片)。不同稀释度的抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体或者G-蛋白趋化因子受体(CCR5)(或者其他希望了解与抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体亲和力的抗原)，分别流经流动池中的衍生CM5芯片表面，流速每分钟15μl，总体积50μl。用HBS缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性剂p20)来洗脱流动池时，确定结合的蛋白量。感兴趣蛋白的结合特异性可以通过感兴趣的蛋白和可溶性竞争物的竞争来确定。
可以将结合蛋白洗脱而使流动池的表面再生，再生用20μl 10mM甘氨酸-HCl，pH2.3。为了进行动力学分析，在不同的流速和CM5芯片上的多肽密度不同的情况下，检测流动池。可以用BIAevaluation 3软件的动力学评价程序确定结合和解离速率。实施例60病毒中和分析采用病毒中和分析，例如Zolla-Pazner和Share所描述的方法(AIDSRes.Hum.Retrovir.111449(1995))，(在此将其全文列为参考文献)，可以测定本发明的抗体抑制或者降低HIV-1感染(CCR5表达的)细胞的能力。简要的说，2×105静止的PBMC与合适稀释度的本发明的抗体孵育1小时后，在将细胞暴露给病毒2小时，漂洗细胞并重悬于含PHA和IL2的培养基中。在感染后的不同时间点，例如感染后第7天或者9天，用ELISA方法测定培养上清中HIV p24抗原的量。计算相对于对照实验的中和百分率，对照实验中HIV感染细胞时不存在本发明所提出的抗体，或者可供替代地(或者此外)，存在一种(如必须时，同种型匹配)具有不相关特异性的对照抗体。
本测定法的一个变例是采用活化而不是静止的PBMC进行实验。进行病毒中和实验前，在存在PHA和IL2的条件下培养PBMC 2天，就可以获得活化的细胞。实施例61MIP-1β结合分析本发明的抗体可以用于测定其阻止CCR5的天然配体-如MIP-1β-结合CCR5受体的能力。
下述的125I-MIP-1β结合实验是这种实验的一个例子，这个实验可以用来确定本发明的抗体防止CCR5的天然配体，即MIP-1β，与CCR5受体结合的能力。
25μCi的125I-MIP-1β(Amersham Pharmacia Biotech，Cat#IM310，25microCuries，2000Ci/mmol)溶于1毫升蒸馏水中，制备12.5nM的贮存液。如果培养的细胞，如CCR5 CHO细胞被用于此实验，需要用胰酶消化，漂洗并用结合缓冲液(1mM CaCl2，5mM MgCl2，50mM Hepes，0.5％BSA，0.1％NaN3，pH7.5)重悬为10×106细胞/ml。如果用外周血单个核细胞(PBMC)来进行该实验，要将其从健康的供体中分离出来，用结合缓冲液重悬为2×106细胞/ml。
在实验中，为了确定何种MIP-1β浓度或含量可以饱和细胞，配制一系列125I-MIP-1β溶液，浓度为所需要的终浓度的4倍。(例如，终浓度为3nM，需要配制12nM的溶液)。典型条件下，所需要的125I-MIP-1β终浓度范围可以从3nM低到0.05nM。此外，还要配制所需要的终浓度4倍的冷(非放射性)MIP-1β溶液。典型的冷MIP-1β的所需浓度为200nM，因此配制800nM的溶液。
为测定细胞结合125I-MIP-1β的总量，25μl结合缓冲液，25μl热125I-MIP-1β和50μl细胞悬液加入U-型底96孔微量反应板中(Costa，Cat#3799)，细胞总是在最后加入。如果与125I-MIP-1β的结合是非特异的，它将不会被冷MIP-1β有效的竞争下来。因此，为了评价结合的特异性，将25μl冷MIP-1β(800 nM)，25μl热125I-MIP-1β(不同的稀释度)和50μl细胞悬液加入U-型底96孔微量反应板中。细胞又总是在最后加入。然后将混合物在摇床上室温下孵育1小时。孵育后，每个样品转移到含有200μl油混合物(2∶1邻苯二甲酸二丁酯∶邻苯二甲酸二辛酯)的离心管的上部。离心管在微量离心机上12000rpm离心20秒，管的底部含有细胞沉淀，将其切下，在γ计数器中计数。如果MIP-1β的结合是特异的，竞争实验中，γ计数器将会测量到较低的放射性。作为保证MIP-1β与G-蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的对照，实验者可以选择在合适的CCR5不表达的细胞中，如载体转染的CHO细胞中进行这个实验。
为进行竞争实验以确定趋化因子或抗体是否能够与MIP-1β竞争结合相同的G-蛋白偶联的受体，配制4倍于所需浓度的系列稀释的冷趋化因子或者抗体溶液。此外，制备4倍于所需浓度的125I-MIP-1β溶液。对于这种类型的竞争实验，需配制2nM125I-MIP-1β溶液，使最终浓度为0.5nM。
为测定细胞结合的125I-MIP-1β总量，25μl结合缓冲液，25μl热125I-MIP-1β(2nM)和50μl细胞悬液加入U-型底的96孔微量反应板中，细胞总是在最后加入。如果其他物质(例如，抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体，或者其他的趋化因子)结合MIP-1β的受体(G-蛋白趋化因子受体(CCR5))，数量不断增加的冷(非放射性)物质(例如，抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体，或者其他的趋化因子)的存在将会与之竞争与MIP-1β受体(如G-蛋白趋化因子受体(CCR5))的结合。因此，为了确定一种物质是否结合MIP-1β受体(G-蛋白趋化因子受体(CCR5))，抑制(放射性标记的)MIP-1β与其受体(即G-蛋白趋化因子受体(CCR5))的结合，将25μl冷物质(如不同稀释度的抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体)，25μl热125I-MIP-1β(2nM)和50μl细胞悬液加入U-型底96孔微量反应板中。细胞又总是在最后加入。然后混合物在摇床上室温孵育1小时。孵育后，每个样品转移到含有200μl油混合物(2∶1邻苯二甲酸二丁酯∶邻苯二甲酸二辛酯)的离心管的上部。离心管在微量离心机上12000rpm离心20秒，管的底部含有细胞沉淀，将其切下，在γ计数器中计数。如果MIP-1β的结合是特异的，竞争分析中，γ计数器将会测量到较低的放射性。作为保证MIP-1β与G-蛋白趋化因子受体(CCR5)结合的对照，实验者可以选择在合适的CCR5不表达的细胞中，如载体转染的CHO细胞中进行这个实验。
另一种作为替代但却类似的实验可以确定本发明的抗体具有防止天然的CCR5配体，即MIP-1β结合CCR5受体的能力，该方法由Lopalco等(J.Immunol.，1643426(2000))和Trkola等描述(Nature，384184(1996))，在此将其全文列为参考文献。简而言之，106表达CCR5的细胞(如CD4+T细胞，CCR5转染的CHO细胞)与合适稀释度的本发明的抗体在冰上孵育。45分钟后，加入0.2μCi放射性标记的MIP-1β(例如125I-MIP-1β(DuPont-NEN，Boston，MA))使其终浓度为0.1nM，在冰上孵育两个小时后，按照Grassi等描述的方法(J Exp Med.17453(1991)，采用两步梯度法移去未结合的放射性物质，在此将该文全文列为参考文献。下层由含10％蔗糖的胎牛血清，上层含80％硅酮((Sigma Aldrich))和20％矿物油(Sigma Aldrich)。细胞沉淀中结合的放射性用γ计数器测量。实施例62趋化作用分析可以测定本发明的多肽以及它的激动剂或拮抗剂增强、抑制或者不显著改变表达G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞对MIP-1β的趋化作用的能力。表达G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞可以是纯化的表达G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的细胞的同质群体，或者异质群体(如外周血单个核细胞，PBMC)。
下述测量MIP-1β诱导的CCR5表达细胞趋化反应的实验，涉及用(荧光)示踪分子标记细胞，诱导趋化作用在含有细胞可以通过的滤膜的96孔板中的孔中进行，通过荧光发射，测量迁移细胞的数量。为了进行该实验，需要下列材料HBSS，无钙镁(Biofluids Cat#p325-000)牛血清白蛋白组分V干粉，无IgG(Sigma Cat#A-2058)ChemoTx#105-2(用于T细胞，PBMC，NK细胞)，108-l(用于嗜酸性细胞，PMN)(Neuro Probe，Inc)钙黄绿素(Calcein)，AM(1mg/ml溶于纯DMSO中)(Molecular ProbesCat#C-3099)PBS，1X，pH7.4，无钙镁(Biofluids Cat#p312-00)简而言之，细胞(例如PBMC)用HBSS(Biofluids Cat#p325-000)/0.1％BSA洗两次，重悬于缓冲液中，浓度为10×106/ml。将5μl钙黄绿素AM(1mg/ml贮存液)加到1ml细胞悬液中，细胞在37℃孵箱中松盖培养30分钟。孵育结束后，用HBSS/0.1％BSA洗细胞两次，重悬于HBSS/0.1％BSA缓冲液中，浓度为10×106/ml。29μl待测试的趋化因子或者对照缓冲液加入趋化作用微量板的底部小室中，将滤膜迅速放置在96-孔板的各个位置上，确保在滤膜和溶液间没有气泡。随后，在滤膜的上部加入20μl细胞，盖上盖防止蒸发。对于T细胞、PBMC、PMN、NK细胞，反应板在37℃培养2小时，嗜酸性细胞则为3小时。孵育结束后，用PBS缓冲液仔细的冲洗滤膜上表面，而后使用橡皮刷温和的搽去滤膜上表面没有迁移的细胞。采用CytoFluor荧光仪在激发波长485nm/发射波长530nm读取荧光强度。结果以趋化指数表示，它代表与对照培养基中的自发迁移相比，趋化因子所导致的迁移细胞数目增加的倍数。
本程序可以很容易地被修改，用于测定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)激动剂或者拮抗剂(如抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体)是否能增强、抑制或者不明显地改变MIP-1β在CCR5表达细胞中诱导趋化作用的能力。为进行这种测量，在将细胞放置在膜上以前，实验者可将细胞与抗G-蛋白趋化因子受体(CCR5)抗体(可能在不同的浓度以获得剂量-反应曲线)预先孵育。
用来测量本发明的多肽及其激动剂和拮抗剂增强、抑制或者不明显的改变CCR5表达细胞应答MIP-1β的趋化作用的能力的替代分析方法可以在transwell室中进行，而不是在96孔微量反应板中进行。进行该分析需要下列材料RPMI-1640(GIBCO-BRL Cat#21870-084)牛血清白蛋白组分V干粉，无IgG((Sigma Cat#A-2058)Transwell反应板(Costar Cat#3421)，直径6.5mm，孔径5.0μmMIP-1β(R&D Systems Cat#271-BME)淋巴细胞分离介质(ICN Biochemical Cat#50494)简而言之，从新鲜的人外周血中利用淋巴细胞分离介质分离PBMC，并在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养两天。培养的PBMC重悬于RPMI-1640/0.5％BSA中，浓度为20×106细胞/ml。MIP-1β稀释于RPMI-1640/0.5％BSA中至终浓度为10,100和1000ng/ml。600μl MIP-1β溶液或者单独的RPMI-1640/0.5％BSA加入tranwell底部小室中，100μl细胞悬液加入滤器的上部，细胞在37℃孵箱中培养4小时。孵育结束后，收集迁移到小室底部的细胞，而后进行FACS分析。例如确定迁移细胞种群数目和类型。结果以趋化指数表示，它代表和对照培养基中的自发迁移相比，趋化因子所导致的迁移细胞数目增加的倍数。
确定本发明的抗体具有能够防止CCR5的天然配体，即MIP-1β诱导MIP-1β表达细胞系的趋化能力的另一种方法由Lopalco等描述(J.Immunol.，1643426(2000).)。简而言之，在存在本发明的抗体的条件下，活化PBMC(如用植物凝集素和IL-2)3天，而后将50μl含3×105活化的PBMC的、含有3％人血清白蛋白的1640 RPMI培养基，置于空的滤器transwell的上部小室中，滤膜孔径为5μm(CoStar)。1.5μg MIP-1β置于下部小室中。当transwell小室在37℃孵育时，趋化作用可以在1个半小时内发生。从上部迁移到下部小室中的细胞用FACS分析进行定量。结果表示为迁移指数，即迁移到含MIP-1β的下层小室中的细胞的数目/迁移到只含有对照培养基的下层小室中的细胞的数目。实施例63激活G-蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白后，钙的动员当G-蛋白趋化因子受体(CCR5)蛋白激活后，来自胞内贮存的钙和胞外空间的钙被动员起来。钙动员可以用荧光钙指示剂来监视。可被紫外光激发的钙指示剂，如Fura-2AM可以从Molecular Probes，Eugene，OR(Cat#F-1221))获得。使用Fura-2AM来监视钙动员的方法描述如下。
简而言之，用钙缓冲液(20mM Hepes缓冲液，125mM NaCl，5mMKCl，0.5mM葡萄糖，1mM CaCl2，1mM MgCl2，0.025％BSA，pH7.4)将细胞(如纯化的PBMC或者CCR转染的细胞，如CCR5 CHO细胞)重悬为5×106/ml。Fura-2，AM(50μg/瓶)溶于25μl DMSO中。细胞用染料标记，即2ml细胞悬液中，加入1μl Fura-2AM，黑暗中、室温下孵育30分钟，孵育后用钙缓冲液洗两次，再用钙缓冲液重悬为1×106/ml，2ml细胞悬液置于37℃连续搅拌池中。[Ca++]浓度利用Hitach分光光度计测量，使用340nm和380nm双激发波长，510nm发射波长。在加入待测试的趋化因子或者抗G-蛋白偶联受体(CCR5)抗体前，建立持续60秒的基线。然后加入20μl待测的趋化因子(100倍于终浓度)于测量杯中，用分光光度计检测细胞内钙浓度的变化。此分析也可以用于研究抗G-蛋白偶联受体(CCR5)抗体是激动剂(诱导钙动员)或者拮抗剂(未能诱导钙动员)。实施例64糖尿病鼠和糖皮质激素损害的创伤愈合模型糖尿病db+/db+鼠模型为证明G-蛋白趋化因子受体(CCR5)可以促进创伤愈合，采用基因工程糖尿病鼠的创伤愈合模型。在db+/db+鼠中建立的深度创伤愈合模型是特点清楚的伤口治愈不良的可重复和临床相关的模型。糖尿病创伤的愈合是依赖于肉芽组织的形成和上皮再形成，而不是萎缩(Gartner，M.H.等，J.Surg.Res.52389(1992)；Greenhalgh，D.G.等Am.J.Pathol.1361235(1990))。
糖尿病鼠具有许多II型糖尿病中可以观察到的典型特征。和同窝出生的正常杂合(db+/+m)仔畜相比，纯合(db+/db+)鼠比较肥胖。突变的糖尿病(db+/db+)鼠在第四条染色体上具有单点常染色体隐性突变(db+)(Coleman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77283-293(1982))。动物表现为多食、多饮和多尿。突变的糖尿病鼠(db+/db+)血糖升高、胰岛素水平升高或者正常、抑制细胞介导的免疫(Mandel等，J.Immunol.7201375(1978)；Debray-Sachs，M.等，Clin.Exp.Immunol.51(1)1-7(1983)；Leiter等，Am.J.of Pathol.11446-55(1985))。在这些动物中，已经发现存在外周神经病、心肌综合征、微血管损伤、基底膜增生和肾小球滤过异常等症状(Norido，F.等，Exp.Neural.83(2)221-232(1984)；Robertson等，Diabetes 29(1)60-61(1980)；Giacomelli等，Lab Invest.40(4)460-473(1979)；Coleman，D.L.，Diabetes 31(Suppl)1-6(1982))。这些纯合糖尿病鼠所发展的高血糖症可以抗胰岛素，类似人II型糖尿病(Mandel等，J.Immunol1201375-1377(1978))。
这些动物中观察到的特征表明这个模型中的愈合类似在人类糖尿病患者中观察到的愈合(Greenhalgh，等，Am.J.of Pathol.1361235-1246(1990))。
本实验采用基因工程糖尿病雌性C57BL/KsJ(db+/db+)鼠及同窝出生的非糖尿病杂合(db+/+m)鼠(Jackson Laboratories)。动物购于6周龄，实验开始时为8周龄。动物单笼饲养，任意饮水、取食。所有的操作均为无菌操作。实验根据人类基因组科学公司科研单位动物护理和使用委员会的规定和指导原则，按照实验动物护理与使用指南进行。
创伤形成程序根据先前报导的方法进行(Tsuboi，R.和Rifkin，D.B.，J.Exp.Med 172245-251(1990))。简而言之，创伤当日，用溶于去离子水的阿弗丁(0.01mg/ml)，2，2，2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇对动物进行腹腔麻醉。剃光动物的背毛，用70％乙醇溶液和碘酒擦拭皮肤。创伤前，手术区用无菌纱布擦干，而后用Keyes组织钻制造8mm的重度损伤。创伤后，立即将周围的皮肤轻轻的拉伸，以消除伤口膨胀。在实验过程中，伤口一直呈开放状态。局部处理从创伤开始日起连续进行5天治疗。在治疗前，伤口用无菌盐水和无菌纱布温和清理。
手术当天和随后每两天目测观察创口，并在固定距离照相，根据第1-5天和第8天的每日测量结果，确定伤口的愈合。创口采用校正的Jameson卡钳进行水平和垂直测量。如果不再见到肉芽组织，创口被连续的表皮覆盖，即认为创伤治愈。
G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的给药剂量是不同的，每天每个创口的给药剂量范围从4mg到500mg，药物包含在载体中，持续8天给药。载体对照组每天接受50ml载体溶液。
第8天，以腹腔注射戊巴比妥钠(300mg/kg)的方式处死动物。收集创口和周围的皮肤用于组织学和免疫组织化学检测，组织样品放于组织活检海绵间，置于10％中性福尔马林中的组织盒中，待进一步处理。
评价3组动物，每组10只(5只糖尿病，5只无糖尿病的对照)。分组如下1)载体安慰剂对照，2)未处理组；3)治疗组。
通过在垂直和水平轴测量创伤区面积和获取整个创伤区域来分析创伤愈合。通过比较初始创伤面积(0天)和治疗后面积(8天)的不同来评价收缩情况。创伤区第一天的面积为64mm2，相当于皮肤钻的大小。计算采用下列的公式[第8天的开放区]-[第1天的开放区]/[第1天的开放区]将样品用10％福尔马林缓冲液固定，石蜡包埋，包埋块按与创口表面(5mm)垂直方向截断，用Reichert-Jung切片机进行切片。对伤口剖面的横切片进行常规苏木精-伊红(HE)染色，创口的组织学检查用于评价修复的皮肤的愈合过程和形态学外观是否由于G-蛋白趋化因子受体的处理而发生改变。这种评价包括证实有细胞聚集的存在，有炎症细胞、毛细血管、成纤维细胞，上皮再形成和表皮成熟的存在(Greenhalgh，D.G.et al，Am.J.Pathol.1361235(1990))。采用校正的光学测微尺单盲测定。
采用ABC Elite检测系统，用兔抗人角蛋白多克隆抗体，对组织切片进行免疫组化染色。人皮肤作为阳性组织对照，而未免疫的IgG作为阴性对照，采用校正的光学测微尺，通过评价伤口的表皮再形成的程度来确定角质细胞的生长采用ABC Elite检测系统，用抗PCNA的抗体(1∶50)，确定皮肤样品中增殖性细胞核抗原/周期素(PCNA)的表达。人结肠癌作为阳性组织对照，人脑组织作为阴性组织对照，每一样品包括省略一抗和用未免疫的鼠IgG替代的对照。这些切片的级别根据增生程度分为0-8个等级。等级较低反映增生较弱，较高则反映增生较强。
采用非配对的T-检验分析实验数据，P值小于0.05，被认为具有显著性。类固醇损伤的鼠模型类固醇引起的创伤愈合抑制已经在不同的体内和体外系统中得到了证实(Wahl，S.M.Glucocorticoids and Wound healing.InAnti-Inflammatory Steroid ActionBasic and Clinical Aspects.280-302(1989)；Wahl，SM.等，J.Immunol 115476-481(1975)；Werb，Z.等，J.Exp.Med.1471684-1694(1978))。糖皮质激素延缓创伤愈合，通过抑制血管生成，降低血管的通透性(Ebert，R.H.等，An.Intern.Med.37701-705(1952))，成纤维细胞增殖和胶原合成(Beck，L.S.等，Growth Factors.5295-304(1991)；Haynes，B.F.等，J.Clin.Invest.61703-797(1978))发挥作用，并且可以暂时的减少循环的单核细胞(Haynes，B.F.等，J.Clin.Invest.61703.-797(1978)；Wahl，S.M.，″Glucocorticoids and wound healing″，InAntiinflammatory Steroid ActionBasic and Clinical Aspects，Academic Press，New York，pp.280-302(1989))。在鼠中，系统地服用类固醇激素延缓创伤愈合是一个非常明确的现象(Beck，L.S.等，Growth Factors.5295-304(1991)；Haynes，B.F.，等，J.Clin.Invest.61703-797(1978)；Wahl，S.M.，″Glucocorticoids andwound healing″，InAntiinflammatory Steroid ActionBasic andClinical Aspects，Academic Press，New York，pp.280-302(1989)；Pierce，G.F.et al，Proc.Natl Acad.Sci.USA 862229-2233(1989))。
为证明G-蛋白趋化因子受体(CCR5)可以促进创伤愈合，在由于系统摄入甲基强的松龙导致愈合延缓的全厚度皮肤切除创伤鼠中，对G-蛋白趋化因子受体(CCR5)多次局部应用的效应进行了评估。
本实施例采用年轻的成熟雄性Sprague Dawley大鼠，体重约250-300g(Charles River Laboratories)。动物购于6周龄，实验开始时为8周龄。在进行创伤时，系统性摄入甲基强的松龙(17mg/kg/鼠，肌注)导致大鼠愈合功能受损。动物单笼饲养，任意饮水、取食。所有的操作均为无菌操作。实验根据人类基因组科学公司科研单位动物护理和使用委员会的规定和指导原则，按照实验动物护理与使用指南进行。
创伤程序根据上述A部分进行，在创伤的当日，给动物肌肉注射氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)麻醉。剃光背毛，用70％酒精和碘溶液清洗，创伤前，手术区用无菌纱布擦干，用Keyes组织钻制造8mm的全厚度损伤。在实验过程中，伤口一直呈开放状态。待试药物对创口的局部处理从创伤开始日起，每日一次，连续治疗7天，随后摄入甲基强的松龙。在治疗前，伤口用无菌盐水和无菌纱布温和的清理。
手术当天和治疗结束时目测检查创口，并在固定距离照相，根据第1-5天每日测量和第8天的测量，确定伤口的愈合。创口采用校正的Jameson卡钳进行水平和垂直测量。如果看不见肉芽组织，创口被连续的表皮覆盖，即认为创伤愈合。
G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的给药剂量是不同的，每天每个创口的给药剂量范围从4mg到500mg，药物包含在载体中，持续8天给药。载体对照组每天接受50ml载体溶液。
第8天，以腹腔注射戊巴比妥钠(300mg/kg)的方式处死动物。收集创口和周围的皮肤用于组织学和免疫组织化学检测，组织样品放于组织活检海绵间，置于10％中性福尔马林中的组织盒中，待进一步处理。
评价4组动物，每组10只(5只注射甲基强的松龙，5只没有激素)。分组如下1)未处理组，2)载体安慰剂对照；3)G-蛋白趋化因子(CCR5)治疗组。
通过在垂直和水平轴测量创伤区面积和获取整个创伤区域来分析创伤愈合。通过比较初始创伤面积(0天)和治疗后面积(8天)的不同来评价愈合情况。创伤区第一天的面积为64mm2，相当于皮肤钻的大小。计算采用下列的公式[第8天的开放区]-[第1天的开放区]/[第1天的开放区]将样品用10％福尔马林缓冲液固定，石蜡包埋，包埋块按与创口表面(5mm)垂直方向截断，用Reichert-Jung切片机进行切片。对伤口剖面的横切片进行常规苏木精-伊红(HE)染色，创口的组织学检查允许评价修复的皮肤的愈合过程和形态学外观是否由于G-蛋白趋化因子受体的处理而改善。采用校正的光学测微尺单盲观测，确定创口的深度。
采用非配对的T-检验分析实验数据，P值小于0.05，即认为具有显著性。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定编码G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例65糖尿病鼠模型中G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的评价实施例64所采用的糖尿病鼠模型也可以用于确定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)是否在预防、治疗和/或在实质上缓解糖尿病症状中有效。在db+/db+鼠发生糖尿病前或者后的不同时段内，对该鼠通过肠胃外途径给予G-蛋白趋化因子受体(CCR5)，测量血糖和/或胰岛素水平，或者使用本领域已知的其他用于测量疾病严重程度的方法，来确定给药是否可以防止、延缓或者减轻糖尿病的发生和症状的严重程度。
本实施例描述的研究测定G-蛋白趋化因子受体蛋白(CCR5)的活性，然而，本领域熟练的技术人员能够很容易的修改本范例研究，来测定编码G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的多核苷酸的活性(如基因治疗)，G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂(包括配体)和/或拮抗剂的活性。实施例66在炎症肠道疾病和结肠炎模型中评估G-蛋白趋化因子受体(CCR5)本研究目的是确定G-蛋白趋化因子受体(CCR5)在鼠的结肠炎模型中是否有效。这个模型是通过给鼠任意饮用含有葡聚糖硫酸钠的水而诱导出来的。
本实验采用6到8周的雌性Swiss Webster鼠(20-25g，Charles River，Raleigh，NC)。让其任意饮用一周含4％硫酸钠的(DSS，36,000-44,000MW，American International Chemistry，Natick，MA)溶液，诱发炎症性肠道疾病模型。G-蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂、拮抗剂和本发明的合适的抗体，每天通过肠胃外途径给药(n＝10)。采用3个指标来确定其效果1)基于粪便评价的临床得分；2)基于结肠评价的组织学得分；3)体重变化。临床得分由两部分组成，总计四个分值中的最大值。粪便的稠度分级为0＝坚硬；1＝松散；2＝腹泻。粪便中的血液也分为0-2级0＝无血；1＝血丝；2＝肉眼可见的直肠出血。组的平均得分大于3表明可能是致死性的，疾病已发展到超出可治疗的范围。临床的得分在第0、4、5、6、7天评价。为取得组织学得分，以盲式模式，根据炎症得分(0-3)和隐窝得分来评价(0-4)升、横和降结肠的切片。每日测量体重。数据用平均值±SEM表示。采用非配对的T-检验比较和疾病对照的显著性差异(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)。
本研究的结果证明G-蛋白趋化因子受体(CCR5)在IBD、结肠炎，包括溃疡性结肠炎中的作用。因此，激动剂、拮抗剂，包括本发明的抗体，和G-蛋白趋化因子受体(CCR5)片段都可以用于治疗、预防、和缓解病人的IBD、结肠炎和/或溃疡性结肠炎以及其他肠道炎症。
很清楚，本发明的实际应用不仅限于上述说明或者实施例具体描述过的。根据上述的教导，对本发明进行无数的修改和变化都是可能的，因此也是在附加的权利要求范围之内，在发明背景、发明详述和实施例中所引用每一篇文献(包括专利、专利申请、期刊文章、摘要、实验手册、书及其他公开出版物)的完整公开，在此都被列为参考文献。U.S申请09/195,662，于1998年11月18日提出，在此被列为参考文献。U.S.临时申请60/181,258，于2000年1月9日提出，60/187,999，于2000年3月9日提出和60/234,336，于2000年9月22日提出，在此被列为参考文献。国际公开物WO 98/54317在此被列为参考文献。此外，美国专利5,707,815的序列表在此被列为参考文献。
序列表序列表<110>Human Genome Sciences，Inc.
Rosen，Craig A.
Roschke，ViktorLi，YiRuben，Steven，M.<120>人G蛋白趋化因子受体(CCR5)HDGNR10<130>1488.115PCOD<150>US 60/181,258<151>2000-02-09<150>US 60/187,999<151>2000-03-09<150>US 60/234,336<151>2000-09-22<160>58<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1414<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(259)..(1314)<400>1gtgagatggt gctttcatga attcccccaa caagagccaa gctctccatc tagtggacag60ggaagctagc agcaaacctt cccttcacta cgaaacttca ttgcttggcc caaaagagag 120ttaattcaat gtagacatct atgtaggcaa ttaaaaacct attgatgtat aaaacagttt 180gcattcatgg agggcaacta aatacattct aggactttat aaaagatcac tttttattta 240tgcacagggt ggaacaag atg gat tat caa gtg tca agt cca atc tat gac 291Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp1 5 10atc aat tat tat aca tcg gag ccc tgc cca aaa atc aat gtg aag caa 339Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser Glu Pro Cys Pro Lys Ile Asn Val Lys Gln15 20 25atc gca gcc cgc ctc ctg cct ccg ctc tac tca ctg gtg ttc atc ttt 387Ile Ala Ala Arg Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe30 35 40ggt ttt gtg ggc aac atg ctg gtc atc ctc atc ctg ata aac 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Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys160 165 170gaa ggt ctt cat tac acc tgc agc tct cat ttt cca tac agt cag tat 819Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr175 180 185caa ttc tgg aag aat ttc cag aca tta aag ata gtc atc ttg ggg ctg 867Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu190 195 200gtc ctg ccg ctg ctt gtc atg gtc atc tgc tac tcg gga atc cta aaa 915Val Leu Pro Leu Leu Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys205 210 215act ctg ctt cgg tgt cga aat gag aag aag agg cac agg gct gtg agg 963Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg220 225 230 235ctt atc ttc acc atc atg att gtt tat ttt ctc ttc tgg gct ccc tac 1011Leu Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr240 245 250aac att gtc ctt ctc ctg aac acc ttc cag gaa ttc ttt ggc ctg aat 1059Asn Ile Val Leu Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn255 260 265aat tgc agt agc tct aac agg ttg gac caa gct atg cag gtg aca gag 1107Asn Cys 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acccccatcg360agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc420catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct480atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga540ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg600acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc660acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc720gactctagag gat 733<210>11<211>5<212>PRT<213>膜近侧区基序<220><221>UNSURE<222>(3)..(3)<223>可以是任何氨基酸<400>11Trp Ser Xaa Trp Ser1 5<210>12<211>86<212>DNA<213>寡核苷酸<400>12gcgcctcgag atttccccga aatctagatt tccccgaaat gatttccccg aaatgatttc60cccgaaatat ctgccatctc aattag 86<210>13<211>27<212>DNA<213>寡核苷酸<400>13gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc27<210>14<211>271<212>DNA<213>人<400>14ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg60aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc120gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat180ttatgcagag 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23<210>58<211>23<212>DNA<213>引物<400>58aattttatgc tgactcagcc cca23PCT/RO/134表关于保藏的微生物的说明(PCT实施细则第13条之二) PCT/RO/134表关于保藏的微生物的说明(PCT实施细则第13条之二) PCT/RO/134表关于保藏的微生物的说明(PCT实施细则第13条之二) PCT/RO/134表关于保藏的微生物的说明(PCT实施细则第13条之二) PCT/RO/134表关于保藏的微生物的说明(PCT实施细则第13条之二) PCT/RO/134表关于保藏的微生物的说明(PCT实施细则第13条之二) PCT/RO/134表
权利要求
1.编码第一抗体的分离的多核苷酸，所述第一抗体与含有选自下组的氨基酸序列的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(b)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(c)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(d)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(e)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(f)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(g)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(h)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(i)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(j)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(k)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(l)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(m)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(n)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(o)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(p)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(q)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(r)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(s)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(t)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(u)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(v)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(w)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(x)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(y)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(z)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VL域的至少三个CDR区；(aa)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VL域的至少三个CDR区；(ab)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VL域的至少三个CDR区；(ac)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VL域的至少三个CDR区；和(ad)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VL域的至少三个CDR区。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VH域的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VL域的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
4.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VH域和恒定区的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
5.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VL域和恒定区的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
6.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VH域和VL域的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
7.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VH域和恒定区及VL域和恒定区的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
8.权利要求4的分离的多核苷酸，其中所述恒定区是IgG恒定区或IgA恒定区。
9.权利要求5的分离的多核苷酸，其中所述恒定区是κ恒定区或λ恒定区。
10.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、Fv、单链Fv、或二硫键连接的Fv。
11.权利要求1至10之任一项的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体是单克隆抗体。
12.权利要求1至11之任一项的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体免疫特异性地结合选自下组的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽胞外部分(a)N端胞外区；(b)胞外环1；(c)胞外环2；和(d)胞外环3。
13.权利要求1至12之任一项的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体是人抗体。
14.权利要求1至12之任一项的分离的多核苷酸，其中所述第一抗体是人源化抗体。
15.权利要求1至14之任一项的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸与异源多核苷酸融合。
16.包含权利要求1至15之任一项的分离的多核苷酸的载体。
17.包含权利要求16的载体的宿主细胞。
18.包含权利要求1至15之任一项的分离的多核苷酸的宿主细胞。
19.制备抗体的方法，包括(a)表达权利要求1至15之任一项的分离的多核苷酸编码的抗体；和(b)回收所述抗体。
20.通过权利要求19的方法制备的抗体。
21.分离的第一抗体，其与含有选自下组的氨基酸序列的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(b)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(c)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(d)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(e)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VH域的至少一个CDR区；(f)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(g)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(h)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(i)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(j)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VH域的至少两个CDR区；(k)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(l)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(m)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(n)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(o)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VH域的至少三个CDR区；(p)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(q)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(r)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(s)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(t)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VL域的至少一个CDR区；(u)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(v)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(w)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(x)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(y)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VL域的至少两个CDR区；(z)杂交瘤细胞系XF11.1D8表达的抗体的VL域的至少三个CDR区；(aa)杂交瘤细胞系XF11.4D10表达的抗体的VL域的至少三个CDR区；(ab)杂交瘤细胞系XF11.4C4表达的抗体的VL域的至少三个CDR区；(ac)杂交瘤细胞系XF11.5H1表达的抗体的VL域的至少三个CDR区；和(ad)杂交瘤细胞系XF11.1G8表达的抗体的VL域的至少三个CDR区。
22.权利要求21的分离的第一抗体，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VH域的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
23.权利要求21的分离的第一抗体，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VL域的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
24.权利要求21的分离的第一抗体，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VH域和恒定区的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
25.权利要求21的分离的第一抗体，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VL域和恒定区的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
26.权利要求21的分离的第一抗体，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VH域和VL域的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
27.权利要求21的分离的第一抗体，其中所述第一抗体与包含选自下组的杂交瘤细胞系表达的抗体VH域和恒定区及VL域和恒定区的第二抗体至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致、至少99％一致、或至少100％一致(a)XF11.1D8；(b)XF11.4D10；(c)XF11.4C4；(d)XF11.5H1；和(e)XF11.1G8。
28.权利要求24的分离的第一抗体，其中所述恒定区是IgG恒定区或IgA恒定区。
29.权利要求25的分离的第一抗体，其中所述恒定区是κ恒定区或λ恒定区。
30.权利要求20至29之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体免疫特异性地结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽。
31.权利要求20至30之任一项的分离的第一抗体，其中所述第一抗体免疫特异性地结合选自下组的G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽胞外部分(a)N端胞外区；(b)胞外环1；(c)胞外环2；和(d)胞外环3。
32.权利要求20至31之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体是单克隆抗体。
33.权利要求20至32之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、Fv、单链Fv、或二硫键连接的Fv。
34.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-7M的解离常数(KD)。
35.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-8M的解离常数(KD)。
36.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-9M的解离常数(KD)。
37.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-10M的解离常数(KD)。
38.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-11M的解离常数(KD)。
39.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-12M的解离常数(KD)。
40.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-3/秒的关闭速率。
41.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-4/秒的关闭速率。
42.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-5/秒的关闭速率。
43.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-6/秒的关闭速率。
44.权利要求20至33之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体具有至少10-7/秒的关闭速率。
45.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体是G蛋白趋化因子受体(CCR5)的激动剂。
46.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体是G蛋白趋化因子受体(CCR5)的拮抗剂。
47.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体中和G蛋白趋化因子受体(CCR5)。
48.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制HIV病毒结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的能力。
49.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制HIV病毒感染G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的能力。
50.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制RANTES与G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的结合。
51.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制RANTES诱导的G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的趋化性。
52.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MCP-1与G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的结合。
53.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MCP-1诱导的G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的趋化性。
54.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MCP-2与G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的结合。
55.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MCP-2诱导的G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的趋化性。
56.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MCP-3与G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的结合。
57.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MCP-3诱导的G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的趋化性。
58.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制Eotaxin与G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的结合。
59.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制Eotaxin诱导的G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的趋化性。
60.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MIP-1α与G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的结合。
61.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MIP-1α诱导的G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的趋化性。
62.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MIP-1β与G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的结合。
63.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体抑制MIP-1β诱导的G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达细胞的趋化性。
64.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体下调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的表达。
65.权利要求20至44之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体上调G蛋白趋化因子受体(CCR5)的表达。
66.权利要求20至65之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体与可检测标记偶联或缀合。
67.权利要求66的分离的第一抗体，其中所述可检测标记是酶、荧光标记、发光标记、或生物发光标记。
68.权利要求20至65之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体与放射性标记偶联或缀合。
69.权利要求20至65之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体与治疗剂缀合。
70.权利要求69的分离的第一抗体，其中所述治疗剂是抗代谢物、烷基化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、或抗血管生成剂。
71.权利要求69的分离的第一抗体，其中所述治疗剂是抗有丝分裂剂、蒽环类药、毒素、或细胞凋亡剂。
72.权利要求20至65之任一项的分离的第一抗体，其中所述分离的第一抗体与细胞毒性剂缀合。
73.与权利要求20至65之任一项的分离第一抗体结合G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽上的相同表位的抗体。
74.权利要求20至65之任一项的分离的第一抗体，其在可药用载体中。
75.经改造表达权利要求20至65之任一项的分离的第一抗体的细胞系。
76.从权利要求75的细胞系表达的分离的第一抗体。
77.治疗、预防、或改善疾病或紊乱的方法，包括给动物施用权利要求20至74或76之任一项的分离的第一抗体。
78.权利要求77的方法，其中所述动物是人。
79.权利要求77的方法，其中所述疾病或紊乱与炎症有关。
80.权利要求77的方法，其中所述疾病或紊乱与免疫细胞的缺陷或异常趋化性有关。
81.权利要求77的方法，其中所述疾病或紊乱与缺陷或异常的T细胞-抗原呈递细胞相互作用有关。
82.权利要求77的方法，其中所述疾病或紊乱是感染性疾病。
83.权利要求77的方法，其中所述疾病或紊乱是自身免疫病。
84.权利要求83的方法，其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎。
85.权利要求77的方法，其中所述疾病或紊乱是神经变性病。
86.权利要求77的方法，其中所述疾病或紊乱是病毒感染。
87.权利要求86的方法，其中所述病毒感染是HIV感染。
88.权利要求87的方法，其中所述HIV感染为早期HIV感染。
89.权利要求87的方法，其中病毒感染是巨细胞病毒感染。
90.权利要求87的方法，其中病毒感染是痘病毒感染。
91.权利要求77的方法，其中所述疾病或紊乱是与HIV感染有关的病症。
92.权利要求91的方法，其中所述与HIV感染有关的病症是肺孢子虫病。
93.权利要求91的方法，其中所述与HIV感染有关的病症是卡波西肉瘤。
94.权利要求77的方法，其中所述分离的第一抗体联合化疗剂一起施用。
95.权利要求77的方法，其中所述分离的第一抗体的施用与抗逆转录病毒治疗联合进行。
96.权利要求77的方法，其中预防性地给动物施用所述分离的第一抗体。
97.权利要求77的方法，其中该疾病或紊乱与异常G蛋白趋化因子受体(CCR5)表达、G蛋白趋化因子受体(CCR5)功能缺乏、异常G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体表达、或G蛋白趋化因子受体(CCR5)配体功能缺乏有关。
98.检测G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽表达的方法，其包括(a)使用权利要求20至74或76之任一项的分离的第一抗体，分析来自个体的生物样品中G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的表达；和(b)比较此G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的水平和G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的标准水平(例如正常生物样品中的水平)。
99.检测、诊断、预后或监测癌症和其它过度增殖性疾病的方法，其包括(a)使用权利要求20至74或76之任一项的分离的第一抗体，分析来自个体的生物样品中G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的表达；和(b)比较此G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的水平和G蛋白趋化因子受体(CCR5)多肽的标准水平。
100.包含权利要求20至74或76之任一项的分离的第一抗体的试剂盒。
101.包含对照抗体的权利要求100的试剂盒。
102.分离的核酸分子，其包含具有与选自下组的序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸(a)SEQ ID NO1的多核苷酸片段或ATCC保藏物97183所包括的cDNA序列的多核苷酸片段；(b)编码SEQ ID NO2或ATCC保藏物97183所包括的cDNA序列的多肽片段的多核苷酸；(c)编码SEQ ID NO2或ATCC保藏物97183所包括的cDNA序列的多肽域的多核苷酸；(d)编码SEQ ID NO2或ATCC保藏物97183所包括的cDNA序列的多肽表位的多核苷酸；(e)编码具有生物学活性的SEQ ID NO2或ATCC保藏物97183所包括的cDNA序列的多肽的多核苷酸；(f)为SEQ ID NO1的变体的多核苷酸；(g)为SEQ ID NO1的等位基因变体的多核苷酸；(h)编码SEQ ID NO2的物种同系物的多核苷酸；(i)能在严紧条件下与(a)-(h)定义的任何一个多核苷酸杂交的多核苷酸，其中所述多核苷酸在严紧条件下不与具有仅有A残基或仅有T残基的核苷酸序列的核酸分子杂交。
全文摘要
本发明涉及称作人G蛋白趋化因子受体(CCR5)HDGNR10的新人类蛋白质，以及编码该蛋白的分离多核苷酸。本发明还指向与G蛋白质趋化因子受体(CCR5)HDGNR10结合的人类抗体以及编码这些抗体的多核苷酸。本发明还提供载体、宿主细胞、抗体、和用于制备人G蛋白趋化因子受体(CCR5)HDGNR10和抗人G蛋白趋化因子受体(CCR5)HDGNR10的人类抗体的重组方法。本发明还涉及用于诊断和治疗涉及此新人类蛋白质和这些新人类抗体的疾病、紊乱和/或病症的诊断和治疗方法。
文档编号C07K14/715GK1454216SQ01807504
公开日2003年11月5日 申请日期2001年2月9日 优先权日2000年2月9日
发明者C·A·罗森, V·罗施克, 李毅, S·M·鲁宾 申请人:人类基因组科学公司