多价靶结合蛋白的制作方法

专利名称：：多价靶结合蛋白的制作方法
背景技术：
：提高靶结合蛋白的价数是必要的。提高了的价数可提高所述靶结合蛋白对其所结合的靶的亲合力，进而可以提高治疗的特异性和安全性。价数提高了的靶结合蛋白还可用于将不同的细胞毒性物质递送到单一的靶物质，或将某种细胞毒性物质递送到不同的靶物质。多价靶结合蛋白可进一步用于将不同的免疫反应性细胞募集到单一的靶细胞，由此引发针对所述靶细胞的加强免疫反应。已经有人试图生产至少针对三个不同靶结合位点的多价靶结合蛋白。例如，通过将几个Fab-样片段通过化学接头交联起来以制造多价靶结合蛋白。参见USPatentNo.5,262,524。也可参见USPatentNo.5,091,542和Landsdorp，等，″CyclicTetramolecularComplexesOfMonoclonalAntibodiesANewTypeOfCross-linkingAgent，″Euro.J.Immunol.，16679-83(1986)。此外通过将几种单链Fv分子(scFv)共价连接起来形成单一的多肽来构建多价靶结合蛋白。参见USPatentNo.5,892,020。在USPatentNos.6,025,165和5,837,242.A中描述了基本上由scFv分子聚集而成的多价靶结合蛋白。在Krott等，″Single-chainFvFragmentofAnti-NeuraminidaseAntibodyNC10ContainingFive-andTen-ResidueLinkersFormDimersandZero-ResidueLinkerATrimer″ProteinEngineering，10(4)423-433(1997)中描述了包含三个scFv分子的三价靶结合蛋白。但是上述的方法或是缺乏再现性、或是缺乏产生不同的，预定的靶结合特异性的能力。本发明提供了一种新形式的，具有不同的预定结合特异性多价靶结合蛋白，及其可再现的制造方法。本发明的多价靶结合蛋白包含两条多肽，其相互联合形成至少三个靶结合位点。本发明还提供制造多价靶结合蛋白的新途径。本发明的另一个目的是利用本发明的多价结合蛋白治疗和检测肿瘤或感染性损伤的方法。为达到这些目的，依照本发明的一个方面，提供了包含三个靶结合位点的的靶结合蛋白，其中所述的包括与第一免疫球蛋白样结构域共价连接的第一单链Fv分子，和与第二免疫球蛋白样结构域共价连接的第二单链Fv分子，其中所述的第一单链Fv分子形成第一靶结合位点，所述的第二单链Fv分子形成第二靶结合位点，并且所述的第一免疫球蛋白样结构域与第二免疫球蛋白样结构域联合形成第三靶结合位点。另外，第一和第二单链Fv分子可联合在一起形成两个结合位点，第一和第二免疫球蛋白样结构域联合起来形成第三结合位点。依照本发明的另一方面，所述的第一Fv分子和第一免疫球蛋白样结构域通过第一外加氨基酸序列共价连接，第二单链Fv分子和第二免疫球蛋白样结构域通过第二外加氨基酸序列共价连接。所述的第一外加氨基酸序列与所述的第二外加氨基酸序列优选的通过共价相互作用，更优选至少通过一个二硫键联合起来。在本发明的另一方面中，所述的第一免疫球蛋白样结构域包含免疫球蛋白轻链可变区结构域或其衍生物，其通过免疫球蛋白轻链恒定区结构域或其衍生物与所述第一scFv分子共价相连，所述的第二免疫球蛋白样结构域包含免疫球蛋白重链可变区结构域或其衍生物，其通过免疫球蛋白重链恒定区结构域或其衍生物与所述第二scFv分子共价相连。本发明的又一方面中，所述的第一单链Fv分子和免疫球蛋白轻链恒定区结构域通过第一肽接头共价连接，所述的第一肽接头优选地包含氨基酸序列EPKSADKTHTCPPCPGGGS，所述的第二单链Fv分子和免疫球蛋白重链恒定区结构域通过第二肽接头共价连接，所述的第二肽接头优选地包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPGGGS。依照本发明的再一方面，三个靶结合位点中的两个具有不同的靶结合特异性。在本发明的又一方面中，三个靶结合位点中的两个具有相同的靶结合特异性。依照本发明的又一方面提供了第一或第二多肽在其N-或C-末端与附加的氨基酸残基共价连接。所述的附加氨基酸残基优选包括肽标签，信号肽，酶，细胞因子，毒素，药物，细胞毒性蛋白或其他功能性蛋白。在本发明的又一方面中，糖链通过工程化连接到所述第一或第二多肽链上的N-糖基化识别序列与第一或第二多肽共价连接。所述的糖链优选地进一步与药物，放射性化合物，螯合物，酶，毒素，细胞因子，细胞毒性蛋白，或其他功能性试剂相连接。依照本发明的再一方面，药物，放射性化合物，螯合物，酶，毒素，细胞因子，细胞毒性蛋白，或其他功能性试剂与本发明的多价结合蛋白通过所述多价结合蛋白的氨基酸残基侧链共轭连接。依照本发明的又一方面，所述多价结合蛋白的一个靶结合位点与毒素，药物，细胞因子，螯合物，酶，放射性化合物，细胞毒性蛋白或其他功能性试剂相结合，其他两个靶结合位点与肿瘤抗原相结合。依照本发明的又一方面还提供一种多价靶结合蛋白，其中，所述多价蛋白的一个靶结合位点与肿瘤抗原相结合，另外两个靶结合位点与T细胞或其他效应细胞表面蛋白相结合。依照本发明的又一发明还提供一种核酸分子，其包含编码本发明的多价结合蛋白的第一多肽的第一多核苷酸和编码本发明的多价结合蛋白的第二多肽的第二多核苷酸。本发明的再一方面提供两个核酸分子，一个编码本发明的多价结合蛋白的第一多肽，另一个编码编码本发明的多价结合蛋白的第二多肽。另外，本发明还提供包含上述核酸的载体，以及依次包含所述载体的宿主细胞。本发明的又一方面还提供了制造本发明的多价结合蛋白的方法。本发明的再一方面提供了引发针对肿瘤的增强免疫应答的方法，该方法包括向患有所述肿瘤的病人施用有效量的本发明的多价靶结合蛋白，其中该蛋白的一个靶结合位点与肿瘤结合，另两个靶结合位点与T细胞或其他效应细胞的表面蛋白相结合。本发明的再一方面提供了治疗或检测肿瘤的方法，该方法包括向患有所述肿瘤的病人施用有效量的本发明的多价靶结合蛋白，其中该蛋白的一个靶结合位点与一个靶结合位点与毒素，药物，细胞因子，螯合物，酶，放射性化合物，细胞毒性蛋白或其他功能性试剂相结合，其他两个靶结合位点与肿瘤抗原相结合。本发明的又一方面提供了一种治疗或检测肿瘤的方法，，该方法包括向患有所述肿瘤的病人施用有效量的本发明的多价靶结合蛋白，其中所述蛋白的至少一个靶结合位点，优选三个靶结合位点与肿瘤抗原相结合，同时毒素，药物，细胞因子，螯合物，酶，放射性化合物，细胞毒性蛋白或其他功能性试剂与所述蛋白共轭相连。本发明的又一方面提供利用本发明的靶结合蛋白治疗肿瘤的方法。图1是包含两条多肽的多价靶结合蛋白的图解说明。第一多肽包含与第一免疫球蛋白样结构域(1stIg-样结构域)共价相连的第一单链Fv分子(1stscFv)。第二多肽包含与第二免疫球蛋白样结构域(2ndIg-样结构域)共价相连的第二单链Fv分子(2ndscFv)。图2是包含两条多肽的多价靶结合蛋白的图解说明。第一多肽包含与包含恒定区CL和可变区VL的免疫球蛋白轻链片段共价相连的第一单链Fv分子(1stscFv)。第二多肽包含与包含恒定区CH1和可变区VH的免疫球蛋白重链片段共价相连的第二单链Fv分子(2ndscFv)。具体实施例方式本发明提供了包含至少三个靶结合位点的多价靶结合蛋白。所述的三个靶结合位点可针对相同或不同的靶物质。本发明的多价结合蛋白包含第一和第二多肽。所述的第一多肽包含与第一免疫球蛋白样结构域共价相连的第一单链Fv分子，所述的第一免疫球蛋白样结构域优选地是免疫球蛋白轻链可变区结构域。所述的第二多肽包含与第二免疫球蛋白样结构域共价相连的第二单链Fv分子，所述的第二免疫球蛋白样结构域优选地是免疫球蛋白重链可变区结构域。所述的第一和第二单链Fv分子形成两个靶结合位点，所述的第一和第二免疫球蛋白样结构域联合形成第三靶结合位点。另外，第一和第二单链Fv还可以联合在一起形成两个结合位点，第一和第二免疫球蛋白样结构域联合形成第三靶结合位点。优选地，所述的第一Fv分子和第一免疫球蛋白样结构域通过第一外加氨基酸序列共价连接，其中第一外加氨基酸序列优选地包含免疫球蛋白轻链恒定区结构域，第二单链Fv分子和第二免疫球蛋白样结构域通过第二外加氨基酸序列共价连接，其中，其中第二外加氨基酸序列优选地包含免疫球蛋白重链恒定区结构域。更优选地，所述的第一外加氨基酸序列与所述的第二外加氨基酸序列相互联合，优选地通过共价相互作用，如二硫键联合起来，以便于稳定第一和第二多肽之间的联合。此处所用的术语“抗体”可与“免疫球蛋白”互换使用。所用的术语“结构域”或“片段”是指蛋白氨基酸序列的一部分。抗体结构至少存在五类人抗体，每一类都具有相同的基本结构。所述的抗体基本结构是四聚体，或其多聚体形式，其包括两个相同的异源二聚体，每个异源二聚体包含分子量大约为25kDa的轻链和分子量约为50-77kDa的重链。例如，免疫球蛋白G(IgG)由两个相同的异源二聚体，而免疫球蛋白M(IgM)具有五个相同的异源二聚体。IgG分子的两个异源二聚体通过二硫键共价连接。每个异源二聚体的重链和轻链也至少通过一个二硫键共价相连。每条重链和轻链都折叠成几个区域。每个区域均由约110个氨基酸残基组成，并具有保守的三维构象。所述的轻链包含一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)。所述的重链包含一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1，CH2和CH3)。所述的重链的CH1和CH2区域通过铰链区相连。所述的VL和VH区域相联合形成抗原结合位点。这种联合主要包括共价相互作用。″Fv″表示由VL和VH联合所形成的结构。在抗体上与所述抗原结合位点相互作用的区域称为表位。所述的表位与所述抗体的抗原结合位点的构象结构象适合，以使所述抗原抗体相结合。所述抗原和抗原结合位点之间的相互作用决定了抗体的特异性。抗体的CL和CH1区域通过非共价相互作用联合起来。所述的CL区域还通过二硫键与重链的铰链区相连。例如κ型轻链的Cys214(Kabat的编号)可与重链铰链区的Cys233(Kabat编号)形成二硫键。有关Kabat编号，参见KabatEA，WuTT，PerryHM，GottesmanKSandFoellerC.(1991)，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(5thedition，USDept.HealthandHumanServices，USGovernmentPrintingOffice)，该文献引入此处作为参考。所述的CL和CH1区域之间的联合，以及CL和铰链区之间的二硫键与抗体三维结构的稳定性有关。所述的可变区(VL和VH)在不同免疫球蛋白之间表现出结构上和氨基酸组成上相当的可变性。所述的恒定区(CL，CH1，CH2和CH3)几乎不表现可变性。本说明书中所用的术语“可变”是指抗体重链和轻链可变区的多变性质。在可变区域内还发现有，在不同抗体间表现出高度可变的氨基酸序列。所述重链和轻链每个可变区发现有三个这种所谓的“高变”或“互补决定区”(CDR)。每个CDR的两侧是相对保守的框架区(FR)。上述的FR被认为是用于保持可变区的完整性，轻链的CDRs和相应重链的CDRs形成抗原结合位点。CDRs的所谓“超变区”可用于解释抗体特异性的多样性。用木瓜蛋白酶切割天然存在的抗体分子产生保留有抗原结合位点的片段。这些片段，通常为Fab片段，其包括抗体的轻链(VL和CL)和重链(VH，CH1和部分铰链区)的片段。上述轻链和重链片段通过至少一个二硫键共价连接。抗体是免疫球蛋白超家族成员。这一超家族的成员还包括，但不限于T细胞受体，CD2，CD4，CD8，和某些类型的细胞间黏附分子。参见MolecularBiologyofTheCell(2ndedition，BruceAlberts等，GarlandPublishing，Inc.，1989)，pp1053-1054。该免疫球蛋白超家族成员中的基础构筑块称作“免疫球蛋白样结构域”。一种“免疫球蛋白样结构域”由约100个氨基酸组成，折叠成由两个反向平行的β折叠组成的特征性的夹心样结构，参见同上。每个天然存在的“免疫球蛋白样结构域”通常由不同的外显子编码，参见同上。一种典型的免疫球蛋白样结构域包括抗体的可变的和恒定的区域。单链Fv分子单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。所述的VL和VH结构域联合形成靶结合位点。这两个结构域通过肽接头(L)进一步共价连接。若VL结构域是scFv分子N-末端的一部分则scFv分子表示为VL-L-VH，若VH结构域是scFv分子N-末端的一部分，则其表示为VH-L-VL。制备scFv分子的方法和设计适当的肽接头在USPatentNo.4,704,692，USPatentNo.4,946,778，R.RaagandM.Whitlow，″SingleChainFvs.″FASEBVol973-80(1995)和R.E.BirdandB.W.Walker，″SingleChainAntibody可变区，″TIBTECH，Vol9132-137(1991)中有详细的描述。这些文献引入此处作为参考。具有VL-L-VH构象的单链Fv分子可与所述的具有VH-L-VL构象的Fv分子联合以形成二价的二聚体。在这种情况下，第一scFv分子的VL结构域和第二scFv分子的VH结构域相联合形成一个靶结合位点，同时第一scFv分子的VH结构域与第二scFv分子的VL结构域联合形成另一个靶结合位点。多价靶结合蛋白在一个实施方案中，通过第一和第二肽的联合构建多价靶结合蛋白。参见图1。所述的第一多肽包含与第一免疫球蛋白样结构域共价连接的第一单链Fv分子，所述的免疫球蛋白样结构域优选地是免疫球蛋白轻链可变区结构域。所述的第二多肽包含与第二免疫球蛋白样结构域共价连接的第二单链Fv分子，所述的免疫球蛋白样结构域优选地是免疫球蛋白重链可变区结构域。每一个第一和第二单链Fv分子形成一种靶结合位点，第一和第二免疫球蛋白样结构域联合形成第三靶结合位点。在优选的实施方案中，所述的第一免疫球蛋白样结构域包含抗体轻链可变区结构域(VL结构域)或其衍生物，第二免疫球蛋白样结构域包含抗体重链可变区结构域(VH结构域)或其衍生物。所述的VL和VH结构域可以是利用如WO93/11236中所描述的技术在体外构建的合成结构域。所述的VL结构域或其衍生物与VH结构域或其衍生物联合形成功能性的靶结合位点。如果两结构域之间的氨基酸序列同一性高于50％，优选高于70％，更优选高于90％，则上述的一个结构域是由另一结构域衍生而来。所谓“氨基酸序列同一性”具有本领域所公认的意义，并可通过已公开的技术计算出来。参见COMPUTATIONALMOLECULARBIOLOGY，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversityPress，NewYork.1988；BIOCOMPUTINGINFORMATICSANDGENOMEPROJECTS，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，NewYork，1993；COMPUTERANALYSISOFSEQUENCEDATA，PARTI，Griffin，A.M.，andGriffin，H.G.，eds.，HumanaPress，NewJersey，1994；SEQUENCEANALYSISINMOLECULARBIOLOGY，VonHeinje，G.，AcademicPress，1987；andSEQUENCEANALYSISPRIMER，Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.，MStocktonPress，NewYork，1991。这些文献引入此处作为参考。由于存在许多的方法测定两氨基酸序列之间的同一性，因此术语“同一性”是本领域技术人员所公知的。参见Carillo，H，andLipton，D.，SIAMJAppliedMath(1988)481073，该文献引入此处作为参考。通常用于确定两氨基酸之间的同一性或相似性的方法包括，但不限于那些在如GuidetoHuge.Computers，MartinJ.Bishop，ed.，AcademicPress，SanDiego，1994，andCarillo，H.，andLipton，D.，SIAMJAppliedMath(1988)481073中所描述的方法。确定同一性和相似性的方法已编写成计算机程序。优选地确定两氨基酸之间的同一性或相似性的计算机程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等，NucleicAcidsResearch(1984)12(1)387)，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.等，J.Mol.Biol.(1990)215403)，和FASTDB(Brutlag等，Comp.App.Biosci.(1990)6237-245)。更优选的确定待查询序列(querysequence)(例如，本发明的序列)和被比较序列(subjectsequence)之间的最佳总体匹配，也称作全序列对比的方法，可以是基于Brutlag等(Comp.App.Biosci.(1990)6237-245)算法的FASTDB程序。在序列对比中待查询序列(querysequence)和被比较序列(subjectsequence)可均为氨基酸序列，也可以均为核苷酸序列。所述的全序列对比结果以百分同一性的形式表示。在FASTDB氨基酸对比中优选使用的参数是Matrix＝PAM0，k-tuple＝2，MismatchPenalty＝1，JoiningPenalty＝20，RandomizationGroupLength＝zero，CutoffScore＝1，WindowSize＝sequencelength，GapPenalty＝5，GapSizePenalty＝0.05，WindowSize＝500或被比较氨基酸序列的长度，其中较短的一个。如果由于N-或C-末端缺失，而不是由于内部的缺失造成被比较序列(subjectsequence)比被比较序列(subjectsequence)短，则需要进行人工校正以获得所述结果。这是由于FASTDB程序在计算全序列百分同一性时不解释被比较序列(subjectsequence)N-和C-末端截短。相对于待查询序列(querysequence)，在N-和C-末端截短的被比较序列(subjectsequence)所述百分同一性的校正是通过下述方式进行的，计算被比较序列(subjectsequence)N-和C-末端的残基，即不与相应的被比较残基相匹配/对比的残基的数量，作为占待查询序列(querysequence)总碱基数的百分数。一个残基是否匹配/对比是通过FASTDB序列对比结果确定的。然后利用特定的参数通过上述FASTDB程序的计算将这一百分比从上述百分同一性中扣除，从而获得最终的百分同一性值。这一最终百分同一性值就是用于本发明目的中的。对于人工调整百分同一性值，仅需要考虑被比较序列(subjectsequence)N-和C-末端的残基不与被比较序列(subjectsequence)匹配/对比。这就是说，仅需考虑超出被比较序列(subjectsequence)最远端的N-和C末端残基位置的待查询残基位置。例如，90个氨基酸残基的被比较序列(subjectsequence)与100个残基的待查询序列(querysequence)相比确定百分同一性。缺失出现在被比较序列(subjectsequence)的N-末端，因此FASTDB对比不表示出在其N-末端前10个残基的匹配/对比性。所述的10个非配对残基代表所述序列的10％(在N-和C-末端不匹配的残基数/待查询序列的残基总数)。因此从由FASTDB程序计算出的百分同一性值中扣除10％。如果剩余的90个残基完全匹配，则最终的百分同一性值为90％。另一个例子是，90个氨基酸残基的被比较序列(subjectsequence)与100个残基的待查询序列(querysequence)相比。这一次是内部缺失，所以在被比较序列(subjectsequence)的N-或C末端没有与待查询序列(querysequence)不匹配/对比的残基。在这种情况下由FASTDB计算出的百分同一性不经人工校正。再一次说明，只有在FASTDB对比中显示出不与待查询序列(querysequence)相匹配/对比的，在被比较序列(subjectsequence)的N-或C末端外的残基序列才进行人工校正。VL结构域或其衍生物是否能与VH结构域或其衍生物联合形成功能性的靶结合位点可以利用M13噬菌体显示进行检测。例如，编码VL结构域或其衍生物的cDNA可与编码VH结构域或其衍生物的DNA相连接形成scFv序列。由此形成的所述的scFv可亚克隆到M13噬菌体显示载体中。所表达的scFv分子对所需靶物质的亲和性可通过常规的噬菌体显示技术确定。有关噬菌体显示技术参见PhagedisplayofpeptidesandproteinsAlaboratoryManual(1996)(Eds.Kay，B.，等，AcademicPress，SanDiego)；DunnIS，Curr.Opin.Biotechnol.，7547-553(1996)；SmithGDandScottJK，MethodsEnzymol.217228-257(1993)；O＇NeilKTandHoessRH，Curr.Opin.Struct.Biol.5443-449(1995)。这些文献和本说明书中所引述的任何其他文献均可引入此处作为参考。所述的VL结构域或其衍生物或VH结构域或其衍生物是否能形成功能性的靶结合位点，可通过本领域所公知的标准试验评估，例如竞争试验，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射性免疫试验(RIA)。类似的，由两免疫球蛋白样结构域联合形成的靶结合位点的活性也可以用上述方法进行确定。如此处所用到的，如果所述的结合位点与有用的靶物质以至少103M-1，优选104M-1，更优选105M-1，最优选106M-1的亲和力相结合，则所述的结合位点是功能性的。在另一个优选的实施方案中，第一单链Fv分子和第一免疫球蛋白样结构域通过第一外部氨基酸序列共价相连，第二单链Fv分子和第二免疫球蛋白样结构域通过第二外部氨基酸序列共价相连。优选的，第一和第二外部氨基酸序列相互连接，以稳定多价靶结合蛋白中第一和第二多肽之间的联合。例如，第一和第二氨基酸序列之间可以富含亮氨酸，以形成亮氨酸拉练结构的方式。更优选地，所述的第一和第二外来氨基酸序列之间共价相连。例如，所述第一和第二外来氨基酸序列可富含半胱氨酸残基，由此，在它们之间形成二硫键。在一个优选的实施方案中，所述的第一外来氨基酸序列包含轻链恒定区结构域(CL结构域)或其衍生物，所述的第二外来氨基酸序列包含重链恒定区结构域(CH结构域)或其衍生物。优选地，所述CL结构域或其衍生物和CH结构域或其衍生物彼此联合，以稳定多价靶结合蛋白中的第一和第二多肽之间的联合。所述的CL结构域或其衍生物可与CH结构域或其衍生物可通过非共价相互作用的方式，如疏水相互作用相联合。在优选的实施方案中，第一外来氨基酸序列包含κ型轻链CL结构域，其具有相应于依照Kabat编号中的Cys214的半胱氨酸残基，第二外来氨基酸序列包含重链铰链区或其衍生物，其具有相应于依照Kabat编号中的Cys233的半胱氨酸残基。所述的第一和第二外来氨基酸序列可以通过上述两个半胱氨酸之间形成的二硫键共价连接。在又一优选的实施方案中，多价靶结合蛋白中的第一多肽包含与包含可变区VL和恒定区CL的免疫球蛋白轻链片段共价相连的第一scFv分子，多价靶结合蛋白中的第二多肽包含与包含可变区VH和恒定区CH1的免疫球蛋白重链片段共价相连的第二scFv分子共价相连，参见图2。所述的VL区域和VH区域相连接以形成靶结合位点。所述的CL区域和CH1区域彼此联合以稳定多价靶结合蛋白。优选地，第一scFv分子和CL区域通过第一肽接头共价相连，所述的第一肽接头优选地由约4到15个氨基酸残基组成。所述的第二scFv分子和CH1区域也优选地通过第二肽接头共价相连，所述的第二肽接头优选地由约4到15个氨基酸残基组成。优选地，所述的第一肽接头可包含氨基酸序列GGGS或EPKSADKTHTCPPCPGGGS，第二肽接头具有氨基酸序列EPKSCGGGS或EPKSCDKTHTCPPCPGGGS。更优选地，第二肽接头中的半胱氨酸残基可与CL区域以抗体轻链和重链之间形成的二硫键相似的方式形成二硫键。本实施方式中的多价靶结合蛋白的分子量可约为100kDa。在一个实施方案中，所述的第一和第二免疫球蛋白样结构域可以包含人源化的可变区结构域。例如，可将鼠抗体的互补决定区移植到人抗体的框架结构区域。参见Sahagen等，J.Immunol.，1371066-1074(1986)；Sun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82214-218(1987)；Nishimura等，CancerRes.，47999-1005(1987)；Lie等，ProcNatl.Acad.Sci.USA，843439-3443(1987)；andUSPatentNo.5,874,540。这些文献在此引入作为参考。另外，也可以使用人抗体可变区。分离人抗体的方法是本领域所公知的，例如通过经遗传修饰产生人抗体的转基因动物，或通过人抗体噬菌体显示文库。参见USPatentNos6,075,181and5,969,108，该文献在此引入作为参考。人可变区结构域是否能与另一可变区结构域相联合以形成功能性的靶结合位点，可以利用M13噬菌体显示或其他标准的试验，如例如竞争试验，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射性免疫试验(RIA)进行测定。第一和第二scFv分子的可变区结构域也可进行类似的人源化。人抗体恒定区结构域也可用于将多价靶结合蛋白的第一和第二scFv分子分别与第一和第二免疫球蛋白样结构域共价相连。在一个实施方案中，多价结合蛋白的三个靶结合位点中至少两个具有不同的靶结合特异性。例如，所述的第一和第二scFv分子可具有不同的氨基酸序列，从而具有不同的结合特异性。三个靶结合位点中的每一个均可具有与其他结合位点不同的结合特异性。如此处所述，两结合位点具有不同的靶结合特异性，条件是它们不具有相同的靶结合特异性。两结合位点具有“相同的”靶结合特异性，条件是它们可以相同的亲和力与相同的靶物质结合。两靶结合位点具有相同的结合亲和力，条件是它们对给定的抗原或靶物质的亲和常数在约0.2到约5之间。若两结合位点对相同的靶物质具有相同的结合特异性则它们是同一的。在另一个实施方案中，多价结合蛋白中的三个靶结合位点中的至少两个具有相同的靶结合特异性。例如，所述的第一和第二scFv分子可具有相同的氨基酸序列从而具有相同的结合特异性。所述的三个靶结合位点可以具有相同的结合特异性。这可以通过当第一免疫球蛋白样结构域，第一scFv分子的VL结构域和第二scFv分子的VL结构域具有相同的氨基酸序列，所述的第二免疫球蛋白样结构域，第一scFv分子的VH结构域和第二scFv分子的VH结构域具有相同的氨基酸序列时才能实现。具有至少两个相同结合位点的靶结合蛋白对其靶物质可表现出增强的亲和力。在又一实施方案中，所述的多价结合蛋白包含至少两个异源二聚体，每个异源二聚体包含第一和第二多肽。第一多肽包含第一单链Fv分子和通过第一外来氨基酸序列共价相连的第一免疫球蛋白样结构域。所述的第二多肽包含第二单链Fv分子和通过第二外来氨基酸序列共价相连的第二免疫球蛋白样结构域。第一异源二聚体的第一和第二外来氨基酸序列可与第二异源二聚体的第一和第二外来氨基酸序列共价相连，优选地通过共价相互作用，例如二硫键。此处所用到的，一种分子与另一中分子相联合，条件是所述的两分子具有结合在一起的倾向。两分子间的联合可包括共价相互作用或非共价相互作用，或者共价相互作用及非共价相互作用。若两分子彼此联合，则它们之间相互连接或共轭配合。此处所用的术语“连接”和“共轭配合”可相互替换。多价靶结合蛋白的肽接头用于多价靶结合蛋白scFv分子的肽接头优选地主要由Gly和Ser残基组成。优选的肽接头是[GGGGS]3。也可以包括Glu和Lys残基。用于scFv分子的合适的肽接头可依照USPatentNo.4,946,778中描述的方法进行设计，该文献在此引入作为参考。用于多价靶结合蛋白scFv分子的肽接头优选地包含至少12个氨基酸残基。更优选地，所述肽接头具有至少15个氨基酸残基。最优选地，所述肽接头具有约15到约30个氨基酸残基。少于12个氨基酸的肽接头可能会降低scFv分子VL和VH结构域之间的灵活性。本发明的多价结合蛋白的第一和第二scFv分子可以是VL-L-VH构象，也可以是VH-L-VL构象。同一多价结合蛋白中的两个scFv分子可以是相同或相反的构象。在一个实施方案中，本发明的多价结合蛋白的两个scFv分子的肽接头包含至少12个氨基酸残基，且两scFv分子具有相反的构象。例如，第一scFv分子具有VL-L-VH构象，而第二scFv分子具有VH-L-VL构象。所述的两个scFv分子相联合形成两个靶结合位点。在上述的实施例中，一个靶结合位点通过第一scFv分子的VL结构域和第二scFv分子的VH结构域之间相结合形成，另一靶结合位点通过第一scFv分子的VH结构域和第二scFv分子的VL结构域之间联合形成。如此形成的两结合位点的结合亲和特异性可通过本领域已知的标准试验，例如竞争试验，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射性免疫试验(RIA)进行评估。在另一实施方案中，多价靶结合蛋白中的第一多肽包含通过第一多肽接头与免疫球蛋白轻链片段共价相连的第一scFv分子，所述多价靶结合蛋白中的第二多肽包含通过第二多肽接头与免疫球蛋白重链共价相连的第二scFv分子。所述的第一和第二肽接头可以提高scFv分子相对于所述多价结合蛋白其他部分的灵活性。这种灵活性在由于，例如靶物质大而导致的一个靶结合事件阻碍另一个靶结合事件时显得突出。在优选的实施方案中，由于免疫球蛋白轻链片段包含VL和CL区域，所述的免疫球蛋白重链片段包含VH和CH1区域。所述的第一和第二肽接头优选地包含至少4个氨基酸残基，更优选地包含至少10个氨基酸残基，最优选地包含至少15个氨基酸残基。优选地，所述第二肽接头包含半胱氨酸残基，其能与免疫球蛋白轻链片段CL区域的Cys214(Kabat＇snumbering)形成二硫键。例如，所述的第二肽接头具有EPKSCGGGS序列，所述的第一肽接头具有GGGS氨基酸序列。在另一个实施例中，所述的第二肽接头可具有氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPGGGS，第一肽接头可具有氨基酸序列EPKSADKTHTCPPCPGGGS。多价靶结合蛋白与某种试剂的共轭连接附加的氨基酸残基可以添加到第一或第二多肽的N-或C-末端。所述的附加氨基酸残基可以包含肽标签，信号肽，细胞因子，酶(例如，原药激活酶)，肽毒素，如假单胞菌外毒素，肽药物，细胞毒素蛋白或其他功能性蛋白。此处所用的功能性蛋白是指具有生物活性的蛋白。优选的功能性蛋白是细胞毒性蛋白。在蛋白的N-或C-末端附加额外氨基酸残基是本领域已知的。例如，其可通过将编码所述附加氨基酸的DNA序列框内连接到编码第一或第二多肽的DNA序列中。连接位点可在编码第一或第二多肽的DNA序列的5＇或3＇端。附加的氨基酸序列优选地并不显著地影响所述多价结合蛋白的结合和亲和特异性。如果经修饰的蛋白以小于103M-1的亲和力与命中的靶物质结合，则靶结合蛋白的结合特异性受到显著地影响。如果经修饰的蛋白比未经修饰的蛋白的结合亲和性第10倍以上，则靶结合蛋白的结合亲和性受到显著地影响。在一个实施方案中，药物，毒素，放射性化合物，酶，细胞毒性蛋白，螯合物，细胞因子，或其他功能性试剂与所述多价靶结合蛋白共轭连接，优选地共价连接到多价靶结合蛋白的氨基酸侧链，例如，胺，羧基，苯基，硫醇或羟基基团。多种常规的接头均可用于这一目的，例如，二异氰酸盐，二异硫氰酸盐，bis(羟基琥珀酰亚胺)酯，碳化二亚胺，马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯，戊二醛等等。用于多价蛋白的共轭试剂优选地不显著影响所述蛋白对其靶物质的结合和亲和特异性。此处所用到的功能性试剂是具有生物活性的试剂。优选的功能性试剂是细胞毒性试剂。在另一实施方案中，细胞毒性试剂可与多聚体载体共轭相连，且所述的多聚体载体接下来可与多价靶结合蛋白共轭相连。有关这一方法参见Ryser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，753867-3870，1978，USPatentNo.4,699,784和USPatentNo.4,046,722，这些文献引入此处作为参考。共轭连接优选地不显著地影响多价结合蛋白的结合和亲和特异性。已知许多药物和毒素对肿瘤细胞或微生物具有细胞毒性作用。这些药物和毒素可在药物和毒素简述，如Merck索引等中查到。在一个实施方案中，至少一个将一个N-糖基化序列引入到多价靶结合蛋白的第一或第二多肽中。参见Hansen等，U.S.PatentNo.5,443,953，和Leung等，U.S.ProvisionalPatentApplication60/013,709，其中，N-糖基化序列引入到抗体的VL(HCN1位点)或CH1(HCN5位点)区域。这些文献在此引入作为参考。优选地，将所述糖基化序列插入到远离靶结合位点的位点，以便所述序列的糖基化不显著地影响所述多价靶结合蛋白的结合特异性和亲和性。而且，优选地将所述糖基化序列插入到距靶结合位点至少4.1！处。最优选地，将所述的N-糖基化位点引入到第一和第二免疫球蛋白样结构域和第一和第二scFv分子外。在一个优选的实施方案中，使N-糖基化位点引入到第一和第二外来氨基酸序列中，如分别将第一与第二免疫球蛋白样结构域与第一或第二scFv分子共价相连的免疫球蛋白恒定区结构域。应用计算机模型可以辅助将N-糖基化位点引入到合适的位点。利用定点突变可将N-糖基化识别序列引入第一或第二多肽。在任何可能的情况下，所述的突变在自然条件下是保守的，以便于保持所述蛋白的最终的四级结构。保守的突变一般包括用相似大小，临床性质相似的氨基酸之间的取代。例如，优选的N-糖基化识别序列是NXT或NXS，其中的N代表精氨酸，T代表苏氨酸，S代表丝氨酸，X代表任意氨基酸。用精氨酸(N)残基替代谷氨酰氨(Q)被认为是保守取代。可以通过小心地选择在其中仅有一个氨基酸发生取代并足以提供潜在的糖基化位点的序列而使对最终四级结构的干扰最小化。所述N-糖基化序列的插入，仅作为一个例子。其所包含的原理也适用于O-糖基化。已知O-糖基化可出现在苏氨酸或丝氨酸处。O-联结糖基化受体的序列没有很好的定义，参见Wilson等，Biochem.J.，275526(1991)。在这些区域偏向于富含脯氨酸，丝氨酸和苏氨酸，但仅通过可及性，而非确切的一级结构确定是否某个特定的丝氨酸或苏氨酸残基可成为O-糖基化位点。但潜在的O-糖基化序列，如在其他已知具有O-糖基化位点的抗体中鉴定出的那些，可作为标准序列移植到有用靶结合蛋白的不同位点。参见Chandrashekarkan等，J.Biol.Chem.，2591549(1981)，SmythandUtsumi，Nature，216322(1967)，Kim等，J.Biol.Chem.，26912345(1994)。糖基化识别序列的插入，被引入序列的糖基化，或任何其他的修饰优选地不显著影响所述多价靶结合蛋白的结合特异性和亲和特异性。在另一实施方案中，糖链可与工程化的糖基化序列共价相连。可将包含所述糖基化识别序列的多价结合蛋白在真核细胞中表达已实现共价附着。优选地，将单一的肽序列引入多价结合蛋白的第一或第二多肽的N-末端。在真核细胞中表达时，带有信号肽序列的第一或第二多肽可从胞液质易位到内质网(ER)，在那里所述的多肽可被工程化的糖基化识别序列糖基化。在另一个实施方案中，可将酶，毒素，细胞因子，药物，螯合物，细胞毒性蛋白，放射性化合物或其他毒性试剂通过工程化的糖基化识别序列整合到多价结合蛋白中。为将某种试剂与糖链共轭相连，所述糖链中的半羧醛环可通过化学氧化以产生反应性的醛基。这样形成的醛基可与蛋白或试剂中的氨基通过西弗氏碱共价键合。有关将蛋白或试剂附着于糖链的一般方法，参见Hansen等，U.S.PatentNo.5,443,953，和Leung等，U.S.ProvisionalPatentApplication60/013,709，上述的全部内容引入此处作为参考。多价靶结合蛋白表达载体的构建可通过下述方法获得所述多价靶结合蛋白第一或第二多肽的表达载体可利用本领域技术人员已知的连接技术将编码免疫球蛋白样结构域的DNA分子，scFv分子或外来氨基酸序列通过框内连接获得。参见Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，2ndEd.(1989)。将所述scFv分子共价连接到多价结合蛋白其他部分的肽接头可通过PCR技术引入，例如利用整合了编码所述肽接头的DNA序列的引物。编码抗体可变区和恒定区结构域的DNA序列可从已公开的来源中获得也可以通过本领域技术人员已知的方法获得。例如，Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，4thed(1991)，发表在U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，公开了在其出版日前本领域中已有描述的大部分抗体的可变区序列。合成抗体可变区或恒定区的常用技术在下述文献中有描述，例如Orlandi等，Proc.Nat＇lAcad.Sci.USA，863833(1989)和Larrick等，MethodsACompaniontoMethodsinEnzymology，2106(1991)。还可以参见Ward等，发表在MONOCLONALANTIBODIESPRINCIPLESANDAPPLICATIONS，137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)中的″GeneticManipulationandExpressionofAntibodies，″，和Courtenay-Luck，″GeneticMahr.＇pulatioxofMonoclohalActibodies，″在MONOCLONALANTIBODIESPRODUCTION，ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION，Ritter等(编)，166-179页(CambridgeUniversityPress1995)。抗体可变区和恒定区的DNA序列还可通过编码所述抗体的mRNA反转录获得。抗体mRNA的可来自多种杂交瘤。参见例如ATCC细胞系和杂交瘤目录，AmericanTypeCultureCollection，20309ParklawnDrive，RockvilleMd.，USA(1990)。那里列出了杂交瘤分泌的，能与多种抗原反应的单克隆抗体，并可以从他们那里获得上述的单克隆抗体。这些细胞系或其它类似的来源可作为编码抗体可变区和恒定区的mRNA的来源。抗体的可变区和恒定区也可通过免疫合适的脊椎动物，一般是家畜，最常用的是小鼠。免疫原可以是有用的抗原，或有用的半抗原时，将半抗原的抗原性偶联物连接到抗原上，如匙孔血蓝蛋白(KLH)。所述的免疫可常规地通过一次或多次将所述的免疫原重复注射到宿主哺乳动物中而进行，通常间隔两到三周。通常在最后一次攻击的三天后，去除脾细胞，分离单细胞以用于细胞融合制备杂交瘤，再通过本领域已知的标准技术制备mRNA。通过mRNA反转录获得DNA序列。上述的过程可以产生对任意选择的免疫性抗原，例如，细胞表面蛋白，T细胞标记，如CD28和CD3，Fc受体，药物，毒素，细胞因子，酶，细胞毒性蛋白，螯合物，肿瘤抗原，放射性化学物质具有特异性的抗体。所述的编码抗体可变区和恒定区的DNA可用于构建本发明的多价靶结合蛋白。抗体的可变区和恒定区也可以利用M13噬菌体显示获得。参见Burtonetal，Adv.Immuno.57191-280(1994)。本质上，由大量抗体产生细胞，如B-淋巴细胞获得的mRNA制备抗体cDNA文库。将扩增的cDNA克隆到M13噬菌体显示载体中制备在噬菌体表面表达所述抗体片段的噬菌体文库。利用与所述抗体的亲和筛选显示所述有用抗体片段的噬菌体。扩增所筛选出的噬菌体以产生有用的抗体。用于scFv分子的DNA序列的构建已在例如EuropeanPatentApplicationNo.239400和U.S.PatentNo.4,946,778中有描述。这些文献在此引入作为参考。ScFv序列的构建也在R.E.Bird和B.W.Walker，″SingleChainAntibodyvariableRegions，″TIBTECH，Vol9132137(1991)中有描述，该文引入此处作为参考。另外，编码scFv分子VL和VH区域的DNA可从上述制备的抗体中获得。信号肽，优选具有抗体基因来源的，可通过常规的DNA克隆技术，例如，利用含有信号肽的5＇端引物进行PCR，添加到靶结合蛋白的N-末端。另外，信号肽也可以通过抗体mRNA的反转录整合。编码天然存在的抗体的mRNA通常包含信号肽序列。MRNA的反转录技术将产生编码抗体可变区和信号肽的DNA序列。由此获得的DNA序列可用于构建多价靶结合蛋白的第一和第二免疫球蛋白样结构域。DNA序列可通过Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，745463(1977)中所述的方法进行测定，上述文献引入此处作为参考。多价靶结合蛋白的表达将DNA载体引入到宿主细胞的方法是本领域已知的。这些方法包括，但不限于，电穿孔，磷酸钙，阳离子脂类，基因枪和Biolistic(Bio-Rad)的方法。为表达多价靶结合蛋白的第一和第二多肽，所述的编码两个多肽的DNA序列需要可操作地连接到调节在宿主细胞中转录和翻译的调节序列上。控制转录的调节序列包括启动子和增强子。所述的宿主细胞可以是原核细胞也可以是真核细胞。表达载体也可以包括标记基因以便筛选带有所述表达载体的宿主细胞。适用于在原核宿主细胞中表达的启动子可以是阻遏型的，组成型的，或诱导型的。这些启动子是本领域已知的。这些启动子包括，但不限于能识别T4，T3，Sp6和T7聚合酶的启动子噬菌体λPR和PL启动子，E.colitrp，recA，热激，和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)α-淀粉酶启动子和σ28-特异性启动子，芽孢杆菌噬菌体的启动子，链霉菌启动子，噬菌体λint启动子，pBR322的β-内酰胺酶bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因CAT启动子。原核生物启动子参见Glick，J.Ind.Microbiol.，1277(1987)的综述和Watson等，MOLECULARBIOLOGYOFTHEGENE，4thEd.，BenjaminCumins(1987)。优选的原核宿主是大肠杆菌。优选的大肠杆菌菌株包括Y1089，CSH18，ER1451，和ER1647。参见，例如Brown(Ed.)，MOLECULARBIOLOGYLABPAX，AcademicPress(1991)。另外优选的宿主是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，其中的菌株例如，BR151，YB886，MI119，MI120，和B170。参见，例如Hardy，″BacillusCloningMethods，″inDNACLONINGAPRACTICALAPPROACH，Glover(Ed.)，IRLPress(1985)。在原核宿主中表达抗体的方法上本领域技术人员已知的。参见例如Ward等，″GeneticManipulationandExpressionofAntibodies，″MONOCLONALANTIBODIESPRINCIPLESANDAPPLICATIONS，pages137-185(WileyLiss，Inc.1995)。而且，在原核生物中克隆抗体的表达系统是可商购的。例如IMMUNOZAPCloningandExpressionSystem(StratageneCloningSystems；LaJolla，CA)提供在大肠杆菌中表达抗体重链和轻链的表达载体。本领域的技术人员应当知道在无需过多不必要的劳动的前提下即可应用在原核细胞中表达可克隆抗体重链和轻链的技术表达和克隆本发明的多价结合蛋白。另外，本发明的多价结合蛋白的第一和第二多肽也可以在真核细胞中宿主表达。真核宿主细胞包括哺乳动物，昆虫和酵母细胞。优选地，所述真核宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以对所表达的多肽提供合适的翻译后修饰。合适的哺乳动物细胞包括COS-7细胞(ATCCCRL1651)，非分泌的骨髓瘤细胞(SP2/0-AG14；ATCCCRL1581)，鼠脑垂体细胞(GH1；ATCCCCL82)，和鼠肝细胞瘤细胞(H-4-II-E；ATCCCRL1548)。对于哺乳动物细胞，所述的转录和翻译调节信号可来源于病毒，如腺病毒，牛乳头瘤病毒，类人猿病毒。另外，可以利用来自哺乳动物表达产物，如肌动蛋白，胶原，肌球蛋白的启动子。优选地是利用金属硫蛋白启动子。另外也可以用原核启动子，如噬菌体T3RNA聚合酶启动子，其中，所述的原核启动子受真核启动子的调节，参见Zhou等，Mol.Cell.Biol.，104529(1990)，和Kaufman等，Nucl.AcidsRes.，194485(1991)。可选择转录起始调节信号以便于调节所述基因的表达，例如使其易于抑制或激活。一般真核调节区包括足以指导RNA合成起始的启动子区域。这种真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1273(1982))；疱疹病毒TK启动子(McKnight，Cell31355(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，Nature(London)290304(1981))；鲁斯氏肉瘤病毒启动子；巨细胞病毒启动子(Foecking等，Gene45101(1980))；酵母gal4基因启动子(Johnston，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)796971(1982)；Silver，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)815951(1984))；IgG启动子(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833(1989))。对本发明的调节序列而言，强调节序列是优选的。这种优选的强调节序列的例子包括SV40启动子增强子(Gorman，″HighEfficiencyGeneTransferintoMammaliancells，″inDNACLONINGAPRACTICALAPPROACH，VolumeII，Glover(Ed.)，IRLPresspp.143-190(1985))，hCMV-MIE启动子-增强子(Bebbington等，Bio/Technology10169(1992))，和抗体重链启动子(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833(1989))。还优选的是用于表达轻链的κ链增强子，和IgH增强子(Gillies，″DesignofExpressionVectorsandMammalianCellSystemsSuitableforEngmeeredAntibodies，″inANTIBODYENGINEERINGAPRACTICALGUIDE，C.Borrebaeck(Ed.)，W.H.FreemanandCompany，pp.139-157(1992))。编码第一或第二多肽的DNA序列可操作地与启动子相连，然后作为非复制的DNA分子引入真核宿主细胞中。这些DNA序列可以是线状的，但更优选地是共价闭合环状的。由于这些DNA分子不能自主复制，其所编码的蛋白的表达可能是通过所引入的DNA序列的瞬间表达出现的。优选地是使用永久性表达，这是当所引入的DNA序列整合到宿主的染色体上时出现的。优选地，将所引入的DNA序列整合到能在受体宿主中自我复制的质粒或病毒载体中。已存在几种可能用于这一目的的载体系统。一类载体使用可使染色体外质粒自我复制的DNA元件，所述的DNA元件可来源于动物病毒，如牛乳头瘤病毒，polyoma病毒，腺病毒或SV40病毒。第二类载体依赖将有用的基因组或cDNA序列整合到宿主染色体上。优化mRNA的合成还可能需要其他的附加元件。这些元件可能包括间隔信号，及转录启动子，增强子，和终止信号。包含这些序列的cDNA表达载体包括在下述文献中所描述的那些如Okayama，Mol.Cell.Biol.3280(1983)，Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，2ndEd.(1989)，andFouser等，BiolTechnology101121(1992)。也可以使用包含内含子序列的基因组DNA表达载体，参见，Lerner等(Eds.)，NEWTECHNIQUESINANTIBODYGENERATION，Methods2(2)(1991)。另外，优选地所述表达载体包含选择标记，如药物抗性标记或其他可是宿主细胞表达选择性特征的标记。“宿主细胞”是指可被用重组DNA技术构建的载体重组转化或转染的细胞。抗药性标记或其他标记利于在经转化或转染的宿主细胞中的筛选。例如，G418可用于筛选用带有氨基糖苷磷酸转移酶基因的表达载体转染的细胞，参见Southern等，J.Mol.Appl.Getz.，1327(1982)。另外，潮霉素-B可用于筛选带有潮霉素-B-磷酸转移酶基因的经转染宿主细胞。参见Palmer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，841055(1987)。另外，氨基蝶呤霉酚酸可用于筛选带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖核苷转移酶基因基因的经转染宿主细胞。参见Mulligan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，782072(1981)。优选地，用甲氨蝶呤筛选经转染的细胞，如经转染的SP2/0细胞，所述细胞带有具DHFR基因的表达载体，所筛选出的经转化细胞接下来经逐步提高甲氨蝶呤的浓度，以便提高所需蛋白的产量。对于同时带有两个表达载体的宿主细胞，每一载体包含编码不同多价结合蛋白的，优选地设计为每一载体带有不同的筛选标记，以便于将两种药物结合对宿主细胞进行筛选。另外，筛选标记，如抗药性标记的存在也可用于防止污染微生物在培养基中的增殖。在这一实施方案中，可在需具有与选择标记相关的表型才能存活的条件下培养所述细胞以获得经转化或转染的宿主细胞的纯培养。优选的，所述表达载体和编码本发明的多价结合蛋白的第一或第二多肽的插入物带有相容的位于插入接点处的限制性酶切位点，而且这些位点对于插入区域而言是独一无二的。载体和插入物均用限制性内切酶处理，然后通过在下述文献中描述的任意一种方法进行连接，Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，2ndEd.(1989)。在一个实施方案中，所述的包含编码多价靶结合蛋白中的第一多肽的DNA序列的表达载体还包括编码所述蛋白第二多肽的DNA序列。每一种这样的DNA均可操作地与独立的一套调节序列相连，所述的调节序列控制转录和翻译的表达。还可将上述表达载体引入原核或真核宿主细胞，并在其中表达。优选地，所述的多价靶结合蛋白在宿主细胞中进行组装，并由下文所描述的方法分离。另外可将所表达的多肽分离，然后在体外组装成多价靶结合蛋白。在一个实施方案中，所述的编码靶结合蛋白第一和第二多肽的DNA序列可克隆到不同的表达载体中。每一DNA序列均可操作地与控制转录和翻译表达的调节序列相连。将每一载体引入到原核或真核宿主细胞中，并在其中进行表达。可分离出所产生的第一和第二多肽或依照下文描述的方法进行浓缩。然后将经分离和浓缩的第一和第二多肽混合在一起联合形成所述的多价结合蛋白。所述多价结合蛋白的最终产物可用下文中描述的方法进行分离。另外，也可将编码第一和第二多肽的两个载体引入同一宿主细胞中共表达。所表达的第一和第二在宿主细胞中进行组装，然后分离。多价靶结合蛋白的分离选择并培养经转化或转染的宿主细胞，然后用去污剂或渗压振扰裂解细胞。对于具有使所表达蛋白分泌的信号肽的表达构建体，需保留带有细胞裂解物的细胞培养物悬液以分离所表达的蛋白。可用本领域已知的技术分离、浓缩所表达的蛋白，所述技术如亲和层析，G蛋白亲和层析，凝胶过滤层析，离子交换层析。详细技术的描述参见Coligan等(eds.)，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY，JohnWiley&Sons(1991)。所述的亲和层析柱可用至少与三种靶结合位点中的一种结合的靶物质偶联。在原核宿主细胞中表达的多肽可能是折射体或包含体的形式。通过溶解细胞纯化包含体，重复离心经溶解的细胞并清洗所得的颗粒状物。最终的颗粒状物包含经分离的包含体。经分离的包含体用盐酸胍溶解，然后经凝胶过滤层析分离所表达的蛋白。盐酸胍的处理特别适合于本发明的多价靶结合蛋白，该蛋白具有通过至少一个二硫键共价相连的第一和第二多肽。亲和层析是本领域已知的。简要地说，是将多价靶结合蛋白的目的性靶物质偶联到层析柱的基质上，如琼脂糖小珠。所表达的多价靶结合蛋白或两多肽之一可留在与靶物质偶联的亲和柱上，条件是它们具有特异于靶物质的功能性结合位点。然后洗脱留在柱上的蛋白。如本领域技术人员所了解的那样，G蛋白亲和柱也可以用于纯化多价靶结合蛋白。离子交换层析也是本领域技术人员所熟知的。大部分的蛋白带有正或负电。这样，带有相反类型电荷的层析柱可以留住所述的蛋白。凝胶过滤层析基于蛋白的分子量不同用凝胶样物质分离蛋白。“凝胶”通常是水和多聚物的基质，如琼脂糖或聚丙烯酰胺。如本领域技术人员所知，本发明包括使用HPLC(高效液相色谱)凝胶过滤。标准的回收和收集程序是本领已知的。回收所表达的多肽或多价靶结合蛋白优选地包含收集由亲和柱、离子交换柱或凝胶过滤柱中有用的峰中所包含的分离物组分。人工的和自动的组分收集均是本领域已知的。接下来的过程包括将所收集的洗脱物冷冻干燥以产生稳定的固体或进一步地纯化。所述的活性包括所分离的多肽或多价靶结合蛋白结合和亲和活性，可通过本领域已知的实验进行评估，例如竞争试验，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射性免疫试验(RIA)。多价靶结合蛋白的稳定化在一个实施方案中，多价靶结合蛋白的第一和第二多肽可通过共价相互作用，如二硫键稳定化。例如每一第一和第二可包含富含半胱氨酸的外来氨基酸序列。这些外来氨基酸序列彼此之间可以形成二硫键，由此稳定第一和第二多肽之间的联合。在优选的实施方案中，所述的第一多肽可包含CL区域，其将第一scFv分子共价连接到第一免疫球蛋白样结构域，所述的第二多肽可以包含完整的或部分的重链铰链区。所述的CL区域可以通过二硫键与铰链区共价相连。二硫键的形成可以出现在多价靶结合蛋白在宿主细胞中合成的过程中。合适的宿主细胞可以包含原核细胞(如大肠杆菌)酵母或昆虫细胞。优选的宿主细胞包括培养的哺乳动物细胞。二硫键也可以在体外通过Kostelny等，J.Immunol.，1481547-1553(1992)所描述的利用氧化的方法形成。在这一方法中，混合所述的多价结合蛋白的第一和第二多肽，经氧化还原缓冲液透析。最终的产物可通过凝胶过滤层析或亲和层析纯化，亲和层析柱与靶物质偶联，所述的靶物质与第一和第二免疫球蛋白样结构域联合形成的靶结合位点结合。为阻止不需要的二硫键形成，可用非半胱氨酸残基替换不需要的半胱氨酸残基，例如通过定点诱变。尽可能使所引入在自然条件下保守的突变以便保持所得蛋白结构域的最终四级结构。例如，在一定条件下用丝氨酸替换半胱氨酸可认为是保守取代。半胱氨酸残基的取代，优选地不显著地影响多价靶结合蛋白的结合特异性和稳定性。当第一多肽包含含有VL和CL区域的轻链片段，第二多肽包含含有VL和CL区域的重链片段，参见图2，在轻链片段和重链片段相互作用中所包含的氨基酸残基易于引起突变以增强两片段之间的联合。用于诱变的合适氨基酸残基是基于抗体的晶体结构确定的。所述的抗体的晶体结构是本领域已知的。被选的诱变可直接引入离子键或二硫键，或提高疏水相互作用或氢键的数量。这些残基的突变优选地不显著影响多价结合蛋白的结合和亲和特异性。最终的诱变产物可利用已与靶物质相偶联的亲和层析分离。如果所述的诱变不显著地影响多价结合蛋白的结合活性，所述的蛋白将留在亲和柱上并通过常规的收集技术回收。多价靶结合蛋白的应用本发明的多价靶结合蛋白有多种用途。基本上单克隆或多克隆抗体或其片段的已知用途均可由本发明的多价靶结合蛋白体现。多价靶结合蛋白可进行标记检测。标记的类型对本领域的技术人员是已知的。它们包括放射性标记，化学发光标记，荧光标记和发色团标记。其他的应用包括通过施用有效剂量的标记形式的多价结合蛋白，测定与所述动物相关的可检测的辐射动物(包括人)对所述动物进行内部结构成相。还包括经改进的免疫测定，包括夹心免疫测定，竞争免疫测定，和用经标记的本发明的多价靶结合蛋白替换经标记的抗体的其他免疫测定方式。多价靶结合蛋白也可用于募集特异于细胞靶物质，如肿瘤细胞或被感染的细胞的细胞毒素细胞，如天然杀伤细胞(NK)或细胞毒性T细胞，参见Staerz等，Nature，314628(1985)，和SongilvilaiandLachmann，Clin.Exp.Immunol.，79315(1990)。多价靶结合蛋白也可用于递送针对肿瘤细胞或感染细胞的毒素，药物，螯合物，细胞因子，酶，如原药激活的酶，放射性化合物，细胞毒性蛋白，或其他细胞毒性试剂。多价靶结合蛋白共价或非共价地与放射性化合物或其他细胞毒性试剂相偶联的应用使将这些试剂直接递送到肿瘤或损害位点，减少使正常的组织暴露于这些试剂的可能性。参见Goldenberg，Semin.Nucl.Med.，19332(1989)。近年来，基于治疗的多价靶结合蛋白(包括抗体)及其定位于肿瘤相关抗原的准确度在实验室和临床中都有表现。参见，例如Thorpe，TIBTECH，1142(1993)；Goldenberg，ScientificAmericn，Science&Medicine，164(1994)；USPatentNos.4,925,922and4,916,213；USPatentNo.4918163；USPatentNo.5,204,095；USPatentNo.5,196,337；和USPatentNos.5,134,075和5,171,665。此外，多价靶结合蛋白在体外条件下靶定肿瘤细胞或感染细胞也是有用的，例如在分离的体外样品中治疗和检测肿瘤细胞或感染细胞。多价靶结合蛋白对来自体内的由骨髓催泻白血病细胞也是有用的。参见Kaneko等，Blood，811333-1341(1993)。在一个实施方案中，所述的多价结合蛋白具有至少一个能与细胞毒性试剂或细胞毒性细胞相结合的靶结合位点，和至少一个其他的结合位点，优选两个能与肿瘤细胞或感染细胞上的抗原相结合的其他的结合位点。在另一个实施方案中，所述的多价结合蛋白具有至少一个结合位点，优选三个能与肿瘤细胞或感染细胞上的抗原相结合的结合位点。细胞毒性试剂与多价结合蛋白相偶联，优选地通过共价地附加方式，如通过所述蛋白的氨基酸残基的侧链，或通过工程化到所述蛋白的糖链。多价靶结合蛋白也可用于检测或治疗肿瘤细胞，感染细胞，肿瘤或感染细胞。优选地，多价靶结合蛋白可直接应用于人或非人动物以治疗特定的肿瘤或感染损伤或确定受试者是否具有所述肿瘤或感染损伤。参见Doussal等，Int.J.Cancer，Supplement758-62(1992)；Peltier等，.J.Nucl.Med.，341267-1273(1993)；Somasundaram等.CancerImmunol.Immunother.，36337-345(1993)；Bruynck等，Br.J.Cancer，67436-440(1993)。例如多价结合蛋白可具有肿瘤抗原结合位点和半抗原结合位点。这一蛋白可通过注射引入到病人中，注射蛋白在体内与于肿瘤位点与肿瘤抗原相结合。放射性标记的半抗原，如金属螯合物通过注射引入病人体内，定位于肿瘤位点经半抗原结合位点与所述蛋白相结合，由此对肿瘤进行检测或治疗。在上述的实施例中，放射性标记的半抗原也可以与多价靶结合蛋白相偶联，例如，通过工程化到多价靶结合蛋白上的糖链。在另一实施方案中，多价靶结合蛋白可具有一个特异于靶细胞的靶结合位点，和两个特异于效应细胞表面抗原的靶结合位点。优选的靶细胞包括肿瘤细胞，感染细胞，或任何其他类型的非需要的细胞。效应细胞是那些能产生或参与产生生理应答，如针对抗原或靶细胞的免疫应答的细胞。优选的效应细胞包括，但不限于T细胞，NK细胞和巨噬细胞。特异于效应细胞的两个靶结合位点可与效应细胞表面的相同或不同的表面抗原相结合。例如，所述的两个靶结合位点可与细胞毒性T细胞和NK细胞的表面抗原相结合。这种多价靶结合蛋白能够将细胞毒性T细胞和NK细胞募集于单一的靶细胞，由此产生针对靶细胞的增强的免疫应答。在优选的实施方案中，多价靶结合蛋白可具有一个特异于靶细胞(如，肿瘤细胞)的靶结合位点，特异于单一效应细胞(如T细胞)上两个不同的表面抗原的靶结合位点。由此，多价靶结合蛋白可通过两个不同的表面抗原结合于单一的效应细胞，其可在效应细胞中引发不同的信号转导途径。在单一的效应细胞中两个信号途径的激活可产生来自效应细胞的增强的生理应答。在优选的实施方案中，多价靶结合蛋白具有一个能与肿瘤抗原或感染细胞抗原结合的靶结合位点，和两个分别能与T细胞表面蛋白CD3和CD28结合的靶结合位点。这一多价靶结合蛋白能在T细胞中引发两个不同的信号转导途径，一个通过CD3另一个通过CD28，以产生针对靶肿瘤或感染细胞的增强的免疫应答。参见Holliger等，CancerResearch，592099(1999)。在又一个实施方案中，多价靶结合蛋白三个靶结合位点中的一个与细胞毒性试剂或效应细胞(如T细胞的CD8或CD4)表面抗原相结合。另外两个靶结合位点与肿瘤抗原，如CEA(抗-癌胚抗原)或CSAp(结肠-特异抗原p)相结合。CEA和CSAp均在结肠癌细胞表面表达。带有与同一肿瘤抗原相结合的两个靶结合位点的多价靶结合蛋白可具有对靶肿瘤细胞更高的亲合力，从而减少将正常的组织暴露于与细胞毒性试剂或效应细胞相关的细胞毒性效应物的可能。在又一实施方案中，所述的两个肿瘤抗原结合位点具有不同的结合特异性，例如，一个与CEA结合，另一个与CSAp结合。具有两个不同的肿瘤-靶结合特异性可提高对肿瘤靶定的机会，从而降低由于抗原修饰造成的肿瘤逃避的机会。在又一实施方案中，多价靶结合蛋白的第一或第二多肽在N-或C末端与附加的氨基酸残基共价相连。这些附加的氨基酸残基可以包含肽标签，信号肽，酶，如原药激活酶，细胞因子，肽毒素，肽药物，细胞毒性蛋白或其他功能性蛋白。这种多价靶结合蛋白可用于治疗和诊断肿瘤。例如，肽毒素，如假单胞菌外毒素，或细胞因子，如IL-1，IL-2，IFN.γ.，TNF.α.和GM-SF，可添加到多价靶结合蛋白的N-或C-末端，其优选地具有三个肿瘤抗原结合位点。由于具有三个肿瘤抗原结合位点，所述的多价结合蛋白可具有对肿瘤更高的偏嗜性，从而更有效地将附加的毒素或细胞因子递送到靶肿瘤位点。在另一个实施例中，具有三个肿瘤抗原结合位点的多价靶结合蛋白可带有肽标签，其能被另一种放射性抗体识别。这一多价结合蛋白可用于在体内检测和治疗肿瘤。由于带有三个肿瘤结合位点，这一多价结合蛋白可提供检测和治疗肿瘤的更多敏感途径。在一个优选的实施方案中，多价靶结合蛋白可以“亲和增强系统”用于预靶定。例如具有三个靶结合位点的多价靶结合蛋白，两个针对肿瘤抗原，一个针对如In-DTPA半抗原的半抗原。两个肿瘤抗原结合位点优选地与同一抗原相结合，或与同一肿瘤细胞相关的不同抗原相结合。一个受试者可以是，例如人或非人动物，可用靶结合蛋白预处理。此处所用的术语受试者和患者可相互替换。在预定的时间可将非结合的靶结合蛋白从受试者清除。对所述的受试者施用带有半抗原的肽载体。优选地所述肽载体带有至少两个半抗原。所述的肽载体可以是放射性标记的，或与药物，毒素，或其他毒性试剂相偶联，由此对靶肿瘤细胞的生长起抑制作用。本发明的多价靶结合蛋白可依照已知的方法配制以制备药学上有用的组合物或药剂，由此，所述的蛋白可与药学上可接受的载体结合形成混合物。无菌的磷酸盐缓冲液是药学上可接受的载体的例子。其他合适的载体是本领域已知的，参见例如REMINGTON＇SPHARMACEUTICALSCIENCES，19thEd.(MackPublishingCo.1995)，andGILMAN＇STHEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS，7thEd.(MacMillanPublishingCo.1985)。可通过静脉内的，动脉内的，腹膜内的，肌内的，皮下的，胸膜内的，鞘内的，通过局部导管灌注或直接的损害部位内注射向患者或非人动物施用多价靶结合蛋白。当通过注射施用多价靶结合蛋白时，所述的施用可通过连续的浸泡或单一或多重大丸剂施用。为治疗或检测感染损伤，或引发针对肿瘤或感染细胞的免疫应答可将有效剂量的多价靶结合蛋白或其他试剂施用于非人动物。为治疗肿瘤或感染损伤的目的，可以有效极量施用多价靶结合蛋白，条件是所谓“有效剂量”是生理上显著的。在生理上显著的有效剂量是在受体患者或非人动物的至少一个靶细胞引起生理上可检测的改变，优选地在受体患者或非人动物的靶肿瘤或感染损伤部位引起生理上可检测的改变。具体说来，治疗肿瘤或损伤部位显著的生理剂量是导致至少一个靶肿瘤或感染细胞生长受到抑制，优选地是对靶肿瘤或感染损伤产生抑制效果。为检测肿瘤或感染损伤可以“有效剂量”施用靶结合蛋白或另一种试剂，条件是其可引起非背景检测信号。为引起针对肿瘤或感染损伤可以“有效剂量”施用靶结合蛋白或另一种试剂，条件是所施用的剂量在至少一个靶肿瘤或感染细胞引起增强的可检测的免疫应答，优选地与未施用所述靶结合蛋白或试剂相比，可引起针对靶肿瘤或感染细胞的增强的可检测的免疫应答。所引用的所有文献均引入此处作为参考。参照下述实施例可更容易地理解本发明，下述的实施例仅是示例性的，并非要对本发明作任何形式的限制。实施例1编码包含带有两个ScFvFor734的hMN14Fab分子的多价结合蛋白的DNA序列的构建，所述的两个ScFvFor734中的一个与κ链融合，另一个与Fd序列的C-末端融合此处所用的，DTPA表示二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaaceticacid)。hMN-14表示人源化的单克隆抗体MN-14。hMN-14在USPatentNo.5，874,540中有描述，该文献引入此处作为参考。抗体的Fd是经胃蛋白酶消化后的抗体重链部分。抗体的Fd部分包含VH，CH1和部分铰链区。″734″表示针对DTPA的单克隆抗体。κ链是一种类型的免疫球蛋白轻链。scFvfor734表示734scFv，框内插入hMN14Fd的C-末端，如下框内连接hMN14重链Fd到734scFv所必需的合适接头，利用特异的引物通过PCR反应导入到734的VL和VK结构域，分别表示为734VL和734VK。PCR扩增734VL是利用引物对734VLscFv5＇(Cys)和734VLscFv3＇进行的。引物734VLscFv5＇(Cys)的序列为5′TCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGGTGGCGGTTCACAGCTGGTTGTGACTCAG3′PKSCGGGSQLVVTQ其代表编码人IgG1铰链区前四个氨基酸序列(PKSC)的有义链序列，其通过一个短可变接头GGGS与734VL的前六个残基(QLVVTQ)框内相连。人铰链的一个Cys也包含在内，这是因为其需要hMN14重链Fd-734scFv和hMN14轻链融合体间的链间二硫键。还包含一个Pst1位点(下划线)以便于在连接CH1结构域和铰链区的内含子序列处的连接。引物734VLscFv3＇的序列5′AGCCTCCGCCTCCTGATCCGCACCTCCTAAGATCTTCAGTTTGGTTCC3′GGGGSGGGGLIKLKTG其代表编码734VL结构域最后六个氨基酸残基(TKLKIL)的反义序列和部分可变接头序列(GGGGSGGGG)，其框内融合到VL结构域的下游。先用T4DNA聚合酶处理PCR扩增产物，以去除在PCR过程中添加到末端的多余的A残基，接下来用Pst1消化。所得的产物是带有Pst1突出端和平末端的双链DNA。734VH的PCR扩增是利用引物对734VHscFv5＇和734VHscFv3＇(Sac1)进行的。引物734VHscFv5＇的序列5′CCGGAGGCGGTGGGAGTGAGGTGAAACTGCAGGAGT3′SGGGGSEVKLQE其代表编码与VL和VH序列相连的可变接头序列(SGGGGS)剩余部分的有义链序列，和734VH结构域的前六个氨基酸(EVKLQE)残基。引物734VHscFv3＇(Sac1)的序列5′AACCTTGAGCTCGGCCGTCGCACTCATGAGGAGACGGTGACCGT3′*SSVTVT其代表编码734VH最后六个残基(TVTVSS)的有义链序列。还包括翻译终止密码子(*)。在终止密码子下游位点引入了限制性酶切位点Eag1(粗体)和Sac1(下划线)以便于亚克隆。类似地，先用T4DNA聚合酶处理PCR扩增产物，以去除在PCR过程中添加到末端的多余的A残基，接下来用Sac1消化，得到带有平端-粘端构象的VHDNA片段。构建包含人IgG1基因组序列SacII片段的基于pBlueScript(Stratagene，LaJolla)的阶段载体(HClkbpSK)。所述的基因组SacII片段包含部分5＇内含子，人IgG1CH1结构域，将CH1连接到铰链区的内含子序列，铰链区序列，将铰链区连接到CH2结构域的内含子序列，和部分CH2结构域。在HClkbpSK中的所述的节段包含铰链区和部分CH2结构域通过Pst1/Sac1消化去除，所产生的克隆位点用于连接上述的VL(Pst1/平端)和VH(平端/Sac1)PCR产物。所得构建体(CH1-734pSK)的CH1结构域通过内含子与734scFv基因序列相连。由于IgG1的基因组SacII片段仅包含部分CH1结构域侧翼的5＇内含子序列，全部的内含子序列需将剩余的内含子序列作为BamH1/SacII节段插入到相应的CH1-734pSK中的位点得以恢复。然后分离含有全长5＇内含子，CH1结构域，连接内含子，5铰链残基，短GGGS接头和734scFv序列的BamH1/Eag1片段，用于替换在hMN14pdHL2载体中含人基因组IgG1恒定区序列的HindIII/Eag1节段。所述的hMN14pdHL2载体在LeungSO，LosmanMJ，QuZ，GoldenbergDMandHansenHJ，EnhancedProductionofaHumanizedAnticarcinoembryonicAntigenAntibody，TumorTargeting2184(#95)(1996)中有描述。对于pdHL2载体，请参阅LosmanMJ，QuZ，KrishnanIS，WangJ，HansenHJ，GoldenbergDMandLeungSO，GenerationandMonitoringofcelllinesproducinghumanizedantibodies，Clin.CancerRes.，53101s-3105s(1999)，andLosmanMJ，HansenHJ，DworakH，KrishnaIS，QuZ，ShihLB，ZengL，GoldenbergDMandLeungSO，Generationofahigh-producingcloneofahumanizedanti-B-celllymphomamonoclonalantibody(hLL2)，Cancer(suppl)，802660-2666(1997)。这些文献和本说明书中的其他文献一样引入此处作为参考。用一头带有BamH1突出端，一头带有HindIII突出端的HNB接头，以便于BamHI/Eag1片段连接到hMN14pdHL2载体中的HindIII/Eag1位点。它的序列5′AGCTTGCGGCCGC3′3′ACGCCGGCGCTAG5′所得的载体称为hMN14-734pdHL2。为将734scFv插入到hMN-14Fabκ链的C-末端，可以利用相似的策略，如下含有人CK结构域侧翼区部分5＇内含子的Sac1片段和大部分的CK区域序列共连接到存在接头CKSB的pBlueScript载体的Sac1/BamH1克隆位点。所述的CKSB接头包含两个合成的DNA核苷酸，其在退火时将产生编码人CK区域最末13个氨基酸的DNA，其与人IgG1铰链的头4个氨基酸残基框内连接，在其C-末端包含一个短的可变接头(GGGS)。所述的CKSB具有双链序列5′CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGAGCCCAAATCTGGTGGCG3′3′TCGAGCGGGCAGTGTTTCTCGAAGTTGTCCCCTCTCACACTCGGGTTTAGACCACCGCCTAG5′SPVTKSFNRGECEPKSGGGS所述的CKSB接头的Sac13＇突出端与CK片段C-末端的Sac1相连，BamH1末端与相应的pBlueScript的BamH1位点相连。所得的阶段载体称作CK(B)pSK。所述的734的VL区域利用引物对734VLscFv5＇(BglII)和734VLscFv3＇进行PCR扩增。734VLscFv5＇(BglII)的序列5′TCTAGATCTCAGCTGGTTGTGACTCAG3＇SQLVVTQ其代表编码734VL前6个氨基酸残基(QLVVTQ)的有义链序列。掺入5＇BglII位点(下划线)以便于接下来将可变接头连接到CK结构域。734VLscFv3＇的序列已在上述列出。用T4DNA聚合酶和BglII处理734VL的PCR-扩增产物，产生平末端/BgIII粘末端片段。734VH的PCR-的扩增利用引物对734VHscFv5＇和734VHscFv3＇(Sal1)进行。734VLscFv5＇的序列已在上述列出。734VHscFv3＇(Sall)的序列基本上与734VHscFv3＇(Sac1)的序列相同，除了用Sal1(下划线)位点代替Sac1位点。5＇AACCCTTGTCGACGGCCGTCGCACTCATGAGGAGACGGTGACCGT3′*SSVTVT类似地，先用T4DNA聚合酶处理PCR-扩增的VH产物以产生平末端，再用Sal1消化以产生粘末端。阶段载体CK(B)pSK用BamH1和Sal1，然后，所暴露的克隆位点处插入VL和VHPCR产物。所述的VL的BglII突出端与BamH1突出端与在消化载体的CK-片段的C-末端互补，而Sal1末端与所述载体下游末端的相应位点连接。所得的载体，称作CK-734scFvpSK，带有通过短肽序列与734scFv序列融合的基因组CK序列。所述的CK-734scFvpSK载体先用Hindi酶线性化，其在Sal1位点切开以产生平末端，CK-734scFv片段用Sac1部分消化。分离包含大小约为1.3Kb的CK-734scFv基因序列的片段，连接到hMN14pdHL2载体的Sac1/PflM1位点，替代原有的CK序列。PflM1位点位于CK终止密码子下游约50bp的3＇非编码区，在CK-734scFv片段连接到hMN14-734pdHL2载体之前，经PflM1消化产生的3＇端经Klenow酶补平。最终的表达载体称作hMN14-Di-734pdHL2，编码带有两个scFvfor734的hMN14Fab分子，其中的一个与κ链的C-末端融合，另一个与Fd序列的C-末端融合。实施例2含由抗体734衍生的两个抗-DTPAScFv连接的CEA特异的Fab的三价双特异性抗体的表达和纯化为构建含由抗体734衍生的两个抗-DTPAScFv连接的CEA特异的Fab的三价双特异性抗体，734scFv与hMN-14Fd序列的C-末端融合以形成Fd-scFv基因序列；相同的734scFv添加到hMN-14κ链序列C-末端，形成κscFv基因序列。Fd-scFv和κ-scFv序列在表达载体pdHL2中组装，所得的表达载体称作hMN14-discFv734pdHL2，其将利用标准的技术通过电穿孔转染SP2/0细胞。所述的表达载体包含DHFR基因，其可用作用0.1，μM甲氨蝶呤(MTX)筛选转染细胞的选择标记。可利用ELISA试验检测抗体分泌克隆，所述的克隆接下来通过逐步扩增，提高在MTX中的浓度。所分泌的抗体可通过G蛋白亲和柱纯化，并可通过离子交换层析进行进一步的纯化。权利要求1.一种靶结合蛋白，其包含a.含有第一单链Fv分子(scFv)和第一免疫球蛋白样结构域的第一多肽；和b.含有第二单链Fv分子(scFv)和第二免疫球蛋白样结构域的第二多肽，其中，所述的第一和第二scFv各自独立地形成两个靶结合位点，或所述的第一scFv与所述的第二scFv联合形成两个靶结合位点；其中所述的第一免疫球蛋白样结构域与所述的第二免疫球蛋白样结构域联合形成第三个靶结合位点。2.如权利要求1所述的靶结合蛋白，其中，所述的第一scFv和第一免疫球蛋白样结构域通过第一外来氨基酸序列相连，所述的第二scFv和第二免疫球蛋白样结构域通过第二外来氨基酸序列相连。3.如权利要求2所述的靶结合蛋白，其中，所述的第一外来氨基酸序列与所述的第二外来氨基酸序列相联合。4.如权利要求2或3所述的靶结合蛋白，其中，所述的第一外来氨基酸序列与所述的第二外来氨基酸序列通过至少一个二硫键相联合。5.如权利要求2到4中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，所述的第一免疫球蛋白样结构域包含免疫球蛋白轻链可变区结构域或其衍生物，其中所述的第一外来氨基酸序列包含免疫球蛋白轻链恒定区结构域或其衍生物，其中所述的第二免疫球蛋白样结构域包含免疫球蛋白重链可变区结构域或其衍生物，所述的第二外来氨基酸序列包含免疫球蛋白重链恒定区结构域或其衍生物。6.如权利要求5所述的靶结合蛋白，其中所述的第一免疫球蛋白样结构域包含免疫球蛋白轻链可变区结构域，其中，所述的第一外来氨基酸序列包含免疫球蛋白轻链恒定区结构域，其中，所述的第二免疫球蛋白样结构域包含免疫球蛋白重链可变区结构域，其中，所述的第二外来氨基酸序列包含免疫球蛋白重链恒定区结构域。7.如权利要求5或6所述的靶结合蛋白，其中，所述的第一scFv和所述的免疫球蛋白轻链恒定区结构域通过第一肽接头相连，其中的第二scFv和所述的免疫球蛋白重链恒定区结构域通过第二肽接头相连。8.如权利要求7所述的靶结合蛋白，其中，所述的第一肽接头包含氨基酸序列EPKSADKTHTCPPCPGGGS，所述的第二肽接头包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPGGGS。9.如权利要求1到8中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，三个靶结合位点中的至少两个具有不同的靶结合特异性。10.如权利要求1到8中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，三个靶结合位点中的至少两个具有相同的靶结合特异性。11.如权利要求1到10中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，所述的第一多肽或第二多肽在其N-或C-末端与一种外来氨基酸序列相连。12.如权利要求11中所述的靶结合蛋白，其中，所述的外来氨基酸包含选自下组的多肽，即肽标签，信号肽，酶，细胞因子，毒素，药物，细胞毒性蛋白或其他功能性蛋白。13.如权利要求1到12中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，所述的第一多肽或第二多肽进一步包含N糖基化识别序列。14.如权利要求13中所述的靶结合蛋白，其中，糖链与N-糖基化识别序列相连。15.如权利要求14中所述的靶结合蛋白，其中，糖链与选自下组的试剂相连，即毒素，药物，细胞因子，螯合物，酶，放射性化合物，细胞毒性蛋白或其他功能性试剂。16.如权利要求1到15中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，所述的靶结合蛋白与选自下组的试剂共轭相连，即毒素，药物，细胞因子，螯合物，酶，放射性化合物，细胞毒性蛋白或其他功能性试剂。17.如权利要求1到16中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，一种靶结合位点能够与毒素，药物，细胞因子，螯合物，酶，放射性化合物，细胞毒性蛋白或其他功能性试剂相连，其中另外两个靶结合位点能与肿瘤抗原相结合。18.如权利要求1到16中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，一种靶结合位点能与肿瘤抗原相结合，另外两种靶结合位点能与毒素，药物，细胞因子，螯合物，酶，放射性化合物，细胞毒性蛋白或其他功能性试剂相结合。19.如权利要求1到16中任意一项中所述的靶结合蛋白，其中，一种靶结合位点能与肿瘤抗原相结合，另外两种靶结合位点能与T细胞或其他效应细胞表面蛋白相结合。20.如权利要求19所述的靶结合蛋白，其中，所述的T细胞表面蛋白是CD28和CD3。21.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1中所述第一多肽的多核苷酸。22.一种包含权利要求21中所述核酸的载体。23.一种包含权利要求22中所述载体的宿主细胞。24.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1中所述第二多肽的多核苷酸。25.一种包含权利要求24中所述核酸的载体。。26.一种包含权利要求25中所述载体的宿主细胞。27.一种包含权利要求22中所述载体和权利要求25中所述载体的宿主细胞。28.一种生产靶结合蛋白的方法，该方法包括在合适的培养基中培养如权利要求27中所述的宿主细胞，从所述的培养基中分离所述的靶结合蛋白。29.一种分离的核酸分子，其包含编码如权利要求1中所述第一和第二多肽的多核苷酸。30.一种包含权利要求29中所述核酸的载体。31.一种包含权利要求30中所述载体的宿主细胞。32.一种生产靶结合蛋白的方法，该方法包括在合适的培养基中培养如权利要求31中所述的宿主细胞，从所述的培养基中分离所述的靶结合蛋白。33.一种引发针对肿瘤的免疫应答的方法，该方法包含向受试者施用有效剂量的如权利要求19或20中所述的靶结合蛋白。34.一种治疗受试者中的肿瘤的药物，其包含如权利要求1-20中任意一项中所述的靶结合蛋白。全文摘要本发明描述了一种新的多价靶结合蛋白，其包含第一和第二多肽，并具有至少三个靶结合位点。多价靶结合蛋白中的第一多肽包含第一scFv分子和第一免疫球蛋白样结构域，所述免疫球蛋白样结构域优选地包括免疫球蛋白轻链可变区结构域。多价靶结合蛋白中的第二多肽包含第二scFv分子和第二免疫球蛋白样结构域，所述免疫球蛋白样结构域优选地包含免疫球蛋白重链可变区结构域。第一scFv分子和第一免疫球蛋白样结构域优选地通过第一外来氨基酸序列相连，所述的外来氨基酸序列优选地包含免疫球蛋白轻链恒定区结构域。所述的第二scFv分子和第二免疫球蛋白样结构域优选地通过第二外来氨基酸序列相连，所述的外来氨基酸序列优选地包含免疫球蛋白重链恒定区结构域。所述的第一和第二外来氨基酸序列，优选地通过至少一个二硫键共价联合。本发明的多价靶结合蛋白可用于治疗和检测肿瘤和感染性损伤。文档编号C07K16/00GK1461344SQ01815972公开日2003年12月10日申请日期2001年7月25日优先权日2000年7月25日发明者S·-O·梁申请人:免疫医疗公司