魔芋凝集素蛋白编码序列及其应用的制作方法

专利名称：魔芋凝集素蛋白编码序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种在魔芋中表达的a-Lectin蛋白(魔芋凝集素蛋白，Amorphophalluskonjacagglutinin，AKA)及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。
本发明中，我们在天南星科(Araceae)植物魔芋(Amorphophallus konjac)中克隆到雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)基因的同源基因a-Lectin。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的魔芋a-Lectin蛋白序列及其核酸序列。
本发明的第二目的是提供一种新的魔芋蛋白a-Lectin。
本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的魔芋a-Lectin蛋白和核酸序列的方法。
本发明还提供了这种魔芋a-Lectin蛋白多肽和编码序列在利用转基因技术控制植物病虫害上的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有魔芋a-Lectin蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离出的魔芋a-Lectin蛋白质多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。
在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是BL21和烟草。
在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有魔芋a-Lectin蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下(1)将编码具有魔芋a-Lectin蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成魔芋a-Lectin蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成魔芋a-Lectin蛋白的重组细胞；(3)在适合表达魔芋a-Lectin蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有魔芋a-Lectin蛋白活性的基本纯的多肽。
较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第17-493位的序列。
在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有魔芋a-Lectin蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物对病虫害抗性的方法，其步骤如下(1)将编码具有魔芋a-Lectin蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含魔芋a-Lectin蛋白的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有魔芋a-Lectin蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有魔芋a-Lectin蛋白基因的转基因植株对植物病虫害具有增强的抗性作用。
较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第17-493位的序列。
本发明还提供了与a-Lectin蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“魔芋a-Lectin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有魔芋a-Lectin蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第17-493位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第17-493位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第17-493位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的魔芋a-Lectin相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“魔芋a-Lectin蛋白或多肽”指具有魔芋a-Lectin蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然魔芋a-Lectin相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括魔芋a-Lectin蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的魔芋a-Lectin多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与魔芋a-Lectin DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗魔芋a-Lectin多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含魔芋a-Lectin多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括魔芋a-Lectin多肽的可溶性片段。通常，改片段具有魔芋a-Lectin多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“魔芋a-Lectin保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1

发明还包括魔芋a-Lectin蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然魔芋a-Lectin多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的魔芋a-Lectin多肽时，可以将魔芋a-Lectin编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成魔芋a-Lectin蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为原核或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括BL21，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析魔芋a-Lectin基因产物的表达，即分析魔芋a-Lectin的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
魔芋a-Lectin RNA的Northern印迹分析和魔芋a-Lectin特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实魔芋a-Lectin在生物样本中的表达。
此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有魔芋a-Lectin核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码魔芋a-Lectin的核酸分子。
本发明还提供了检测样品中是否存在魔芋a-Lectin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于魔芋a-Lectin核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的魔芋a-Lectin核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选魔芋a-Lectin同源基因或同源蛋白。
为了得到与魔芋a-Lectin基因相关的魔芋cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选魔芋cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对魔芋a-Lectin的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自魔芋的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与魔芋a-Lectin相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的魔芋a-Lectin核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明魔芋a-Lectin蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的魔芋a-Lectin蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与魔芋a-Lectin发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
表2为本发明的魔芋凝集素(AKA)蛋白与石蒜科植物雪花莲凝集素(GNA)蛋白的核苷酸序列(GenBank Accession No.M55559)的同源比较(GAP)表。
表3为本发明的魔芋a-Lectin蛋白与石蒜科植物雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)蛋白的氨基酸序列(GenPept Accession No.AAA33349.1)的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。
实施例1魔芋a-Lectin基因的克隆1.组织分离(isolation)魔芋球茎来源于上海中医药大学，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。
2.RNA的分离(RNA isolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50mL管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)根据雪花莲和其它天南星科凝集素氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)3’-RACEPCR(AP+TNX001)得到2001MY3’(0.6kb)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知石蒜科植物如雪花莲(Galanthus nivalis)和天南星科植物如芋头(Colocasia esculenta)、疆南星(Arum maculatum)的凝集素基因的同源性很高，故初步认为它是一个凝集素基因。
(2).5’-RACE第一轮PCR (AAP+MYR02)第二轮PCR (AUAP+MYR03)得到2001MY 5’(0.3kb) (过程同(1))(3).PCR扩增2001MY编码区(MYF01+R1)得到2001MY编码区(0.5kb)(过程同(1))。
BLAST的结果证明从魔芋中新得到的基因确为一个植物凝集素基因。由于已知的同源凝集素如雪花莲凝集素(GNA)基因具有较强的抗同翅目类昆虫包括蚜虫和飞虱功能(Hilder等，1994；Powell等，1993，1995)，故推测此基因具有相同的功能。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的魔芋a-Lectin蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物R15’-ACCAATCACATACACAATGG-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸R25’-AAGCACAGATGATGGAGAGC-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以魔芋总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，R1/R2的PCR条件为94℃ 5分钟，随之以94℃45秒、58℃45秒和72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为668 bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。
实施例2魔芋a-Lectin基因的序列信息与同源性分析本发明新的魔芋a-Lectin全长cDNA的长度为668 bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于17-493位核苷酸。根据全长cDNA推导出魔芋a-Lectin的氨基酸序列，共158个氨基酸残基，分子量17112.73，pI为11.07。详细序列见SEQ ID NO.4。
将a-Lectin的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与雪花莲凝集素(GNA)基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与雪花莲凝集素基因的mRNA全编码序列(GenBank Accession No.M55559)有62.3％的相同性(附表2)，在氨基酸水平上，它与雪花莲g-Lectin蛋白(GenPept Accession No.AAA33349.1)的第1-158位氨基酸残基有52％的相同性和59％的相似性(附表3)。由上可见，a-Lectin基因与雪花莲g-Lectin(GNA)基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。
实施例3魔芋a-Lectin蛋白的结构和功能研究1.魔芋a-Lectin蛋白的氨基酸序列blocks分析。将魔芋a-Lectin蛋白的氨基酸序列在blocks数据库(网址为http//www.blocks.fhcrc.org)中检索结构域，得到以下结果 (1)在氨基酸序列中，存在以下结构域区加框区(26-50，65-99，103-122)Lectin蛋白功能模块(Lectin)。
(2)功能分析在该基因氨基酸序列中存在Lectin蛋白功能模块，因而可预见其的确具有相应功能。
2.魔芋凝集素蛋白氨基酸序列的前体蛋白和成熟蛋白分析。通过对魔芋凝集素蛋白同其它植物凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列的比较分析，发现魔芋凝集素蛋白基因编码一前体蛋白含有信号肽序列、成熟蛋白序列和C-末端肽序列，按van Hei jine(1986)等预测凝集素蛋白信号肽的规则和对魔芋凝集素蛋白同其它植物凝集素如GNA蛋白的比较，鉴定出魔芋凝集素蛋白的信号肽剪切位点在第25氨基酸(A)和第26氨基酸(Q)之间，该位置也符合目前已知的大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA，Van Damme等，1991)、君子兰凝集素(Van Damme等，1994)等的凝集素蛋白的信号肽剪切位点。通过比较大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA，Van Damme等，1991)、君子兰凝集素(Van Damme等，1994)等的凝集素蛋白的C-末端肽序列的剪切位置，推测出魔芋凝集素蛋白的C-末端肽的剪切位置在第135位的A和第136位的L之间。因此，魔芋凝集素蛋白的凝集素成熟蛋白序列为QALYAPGALFSGQSLTVGNYRFTMQADCNLVLYDRGRAIWASGTARRGINCVLRMQRDGNLVVYTPGGRAIWASGTNRGAGNYYLTLQSDRNVVIYGPDGRAIWATNTKA3.魔芋a-Lectin蛋白的专一结合糖基化分析。通过对魔芋a-Lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等的专一结合糖基化分析，发现魔芋a-Lectin蛋白同大多数甘露糖专一结合的凝集素如雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素、水仙凝集素等一样，具有3个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)，见下图(图中甘露糖专一结合位点盒QDNY用方框框住)。因此证明魔芋a-Lectin蛋白也同雪花莲凝集素(GNA)、君子兰凝集素等一样，为甘露糖专一结合的凝集素蛋白。 实施例4魔芋a-Lectin多肽的制备和提纯在该实施例中，将魔芋a-Lectin编码成熟蛋白的序列或片段构建入原核表达载体之中，以表达和提纯目的蛋白。
原核表达载体的构建以及转化原核表达宿主菌感受态细胞根据魔芋a-Lectin的全长编码序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整成熟蛋白编码阅读框的引物(分别对应于完整成熟蛋白编码序列5’和3’端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的原核表达质粒pET-32a而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将魔芋a-Lectin基因在保证阅读框正确的前提下克隆至原核表达质粒pET-32a(Novagen)。转化大肠杆菌DH5α菌株，经PCR鉴定后测序确认，然后在抽提质粒，转化到原核表达宿主菌BL21的感受态细胞中，涂LB+Amp(100mg/L)的平板，37℃培养1d。
魔芋a-Lectin蛋白的表达随机挑取长出的单菌落，LB+Amp(100mg/L)的液体培养基37℃培养过夜，吸取50μl然后煮沸5min。12 000rpm/min离心1min，取上清为模板。使用魔芋a-Lectin的引物进行PCR扩增反应。同时以未转化的宿主菌作对照。观察重组子中能否扩增出魔芋a-Lectin的基因片段。将PCR阳性的重组菌接种于5ml的LB+Amp(100mg/L)培养基中，37℃振荡培养(250rpm/min)3h至OD600＝0.6，取1ml菌液做为对照(诱导前)，在剩下的4ml菌液中加入IPTG使终浓度为1mM，继续37℃振荡培养(250rpm/min)3h，吸取1ml菌液，两次吸取的菌液12000rpm/min离心5min。沉淀用100μl 1×PBS培养基悬浮，取10μl进行SDS-PAGE检测表达产物(见

图1)。
图1.魔芋凝集素(AKA)的原核表达图。1蛋白大小标准(从上到下依次为97kD、66kD、43kD、31kD、20kD、14kD)；2BL21大肠杆菌菌株在IPTG诱导表达前；3BL21大肠杆菌菌株在IPTG诱导表达后；4pET-32a转化到BL21中在IPTG诱导表达前；5pET-32a转化到BL21中在IPTG诱导表达后；6pET-32a-AKA转化到BL21中在IPTG诱导表达前；7pET-32a-AKA转化到BL21中在IPTG诱导表达后。
魔芋a-Lectin融合蛋白的提取纯化按上述方法大量表达魔芋a-Lectin蛋白，对离心管称重后加入菌液，10000g离心10min，弃上清，再次称重，计算细菌的湿重。按5ml/g细菌的比例加入BugBuster reagent(Novagen)，在每毫升BugBuster reagent中加入1μlBenzonase(Novagen)，重悬细菌沉淀。室温缓慢摇动温育20min，4度16000g离心20min，将上清液(含可溶的蛋白)移入一干净管中。用等体积的BugBuster Reagent重悬沉淀，加入lysozyme至终浓度为200mg/L，混匀，室温放置5min，10000g离心10min，弃上清。加6倍体积的稀释了10倍的BugBuste reagent，混匀，4度5000g离心15min，收集包涵体，弃上清。用1/2原培养基体积的稀释了10倍的BugBuste reagent重悬包涵体，混匀，4度5000g离心15min。再用1/2原培养基体积的稀释了10倍的BugBuste reagent洗涤一次，同上一步骤。再次洗涤，4度16000g离心15min，弃上清，称量包涵体的湿重。用1*IB Solubilization Buffer/0.3％N-lauroylsarcosine(Novagen)重悬包涵体，使终浓度达到10-20mg/ml，混匀，反复吹打以破碎包涵体。室温，温育15min。室温，10000g离心10min，将上清(含有可溶的包涵体蛋白)转入一新管子中，小心不要吸入沉淀。用至少是样品体积50倍的dialysis buffer(Novagen)透析，中间更换dialysis buffer，至少透析两次。如果透析后看到有不溶物，4度10000g离心10min，将上清吸入一新管中。用rEK酶(Novagen)切除融化蛋白后进行SDS-PAGE变性蛋白电泳，检测提取的魔芋a-Lectin蛋白的纯度。在12kDa处的蛋白质条带即为魔芋a-Lectin成熟蛋白。
实施例5魔芋a-Lectin蛋白或多肽在烟草细胞中进行真核细胞表达及转基因植株的抗虫性鉴定含目的基因(魔芋a-Lectin基因)表达载体的构建根据魔芋a-Lectin的全长编码序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将魔芋a-Lectin cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121)，在保证阅读框架的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。利用叶盘法转化烟草1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4,000g离心10min；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。利用western blot检测AKA蛋白在转基因烟草植株中的表达1.蛋白的提取a)取50mg叶片，加入100ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml eppondorf管中研磨；b)13000，4℃离心10分钟；c)取上清，备用。注以上过程于冰上进行。2.蛋白的定量参考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白样品，加入1ml Bradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595；蛋白含量计算1 OD595＝28.57μg。3.SDS-PAGE分离蛋白SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加样前，将样品置于含50mmol/L DTT的加样缓冲液(2*加样缓冲液甘油2.4g，1M Tris-HClpH6.8 1ml；溴酚兰0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分钟；b)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。4.蛋白质向硝酸纤维膜上转移a)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmol TrisBase，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b)室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；5.膜上蛋白的检测a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml 1*PBS(含0.5g叠氮钠)；b)再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗魔芋a-Lectin的抗体或抗雪花莲g-Lectin的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤三次；d)加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤两次；e)加入底物显色观察蛋白条带。含魔芋凝集素基因(aka)的转基因植株的抗虫性鉴定鉴于编码甘露糖专一结合的植物凝集素如雪花莲凝集素(GNA)的基因已被证明对病虫害如刺吸式口器类昆虫如蚜虫(Hilder等，Transgenic Res，1995，418～25)、飞虱(Tang等，Plant Breeding，2002，12193～95)及咀嚼式口器类昆虫如番茄蛾Lacanohia olerucea(Gatehouse等，Molecular Breeding，1997，349～63)都具有抗性，而魔芋凝集素(AKA)也为甘露糖专一结合的凝集素且与雪花莲凝集素(GNA)具有较高的同源性，由此推测魔芋凝集素基因(aka)同雪花莲凝集素基因(gna)相似，也应具有抗虫功能，因此我们对含魔芋凝集素基因(aka)的转基因植株进行抗虫性鉴定。按Hilder等(Transgenic Res，1995，418～25)的方法对含魔芋凝集素基因(aka)的转基因烟草植株(20-30厘米高)进行蚜虫(桃蚜)抗性鉴定，研究其对蚜虫存活率和发育进度的影响。对蚜虫存活率的研究中，在每株植株上接种10头蚜虫一龄若虫后每2天测定蚜虫存活数(共测定14天)。对蚜虫发育进度的研究中，在每株植株上接种5头蚜虫一龄若虫，13天后测定存活的蚜虫成虫数和若虫数。结果表明，在含魔芋凝集素基因(aka)的转基因烟草植株上存活的蚜虫数量同非转基因对照上的相比显著减少(P＜0.05)，同时，在含魔芋凝集素基因(aka)的转基因烟草植株上存活的蚜虫其发育进度同非转基因对照上的相比也被显著减缓(P＜0.05)，其13天后发育成成虫的数量也显著减少(P＜0.05)。因此抗虫性结果证明，魔芋凝集素基因(aka)对昆虫(如蚜虫)确有抗性，魔芋凝集素基因(aka)将可用于利用转基因技术控制植物虫害的研究和产业化中。
表262.3％identity in 321 nt overlap8090 100 110 120 130GNATGTACTCTGGCGAGACTCTCTCTACTGGCGAATTTCTCAACTACGGCAGTTATGTTTTTA::::: : :: : :::: : :::: : : :::: : ::::: :::: :AKATGTACGCGCCCGGCGCCCTCTTTTCTGGGCAGTCCCTCACCGTCGGCAACTACAGGTTCA100 110 120 130 140 150140 150 160170 180 190GNATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGAC-GTTGACAAGCCTATCTGGGCAACA:::::::: :::::::: ::::: : :::::: : : : ::: :: ::::: :AKACCATGCAAGCAGACTGCAACCTGGTTCTCTACGACCGAGGCCGCGCC-ATATGGGCCTCC160 170 180 190 200210200 210 220 230 240 250GNAAACACAGGTGGCCTCTCCCGTAGCTGCTATCTCAACATGCAGACCGACGGGAACCTCGTC::: : :::: : :::: :: : ::::::: ::::: :::::::::AKAGGCACCGCCCGCCGGGGCATCAACTGCGTGCTGAGGATGCAGAGGGACGGCAACCTCGTC220 230 240 250 260 270260 270 280 290 300GNAGTGTACAA-CCCGTCGAACAAACCGATTTGGGCAA---GCAACACTGGAGGCCAGAATGG:: :::: :::: :: : :: :: :::::::: :: : ::: ::AKAGTCTACACTCCCGGCGGCCGCGCC-ATCTGGGCCTCCGGCACCAACAGGGGCGCC---GG280 290 300310 320 330310320 330 340 350 360GNATAATTA-TGTGTGCATCCTTCAGAAGGATCGGAACGTTGTGATCTACGGACCTGCTCGTT:: :: : :: : ::: :::: :: :::::::: :: ::::: :: :: : :AKACAACTACTACCTG-ACCCTGCAGAGTGACCGGAACGTCGTCATCTATGGCCCGGACGGCA340350 360 370 380 390370 380GNAGGGCTA-CTGGA--ACCAATA:::: : :::: ::::: :AKAGGGCCATCTGGGCGACCAACA400 410上列雪花莲凝集素(GNA)蛋白的核酸序列(GenBank Accession No.M55559)下列魔芋凝集素(AKA)蛋白的核酸序列表352％identity in 113 aa overlap，59％similarity in 113 aa overlapa.pep28 LYAPGALFSGQSLTVGNYRFTMQADCNLVLYDRGRAIWASGTARRGINCVLRMQRDGNLV 87+Y+ L +G+ L G+Y F MQ DCNLVLYD + IWA+ T +CL MQ DGNLVg.pep24 MYSGETLSTGEFLNYGSYVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSRSCYLNMQTDGNLV 83a.pep88 VYTPGGRAIWASGTNRGAGNYYLTLQSDRNVVIYGPDGRAIWATNTKALSKGI 140VY P + IWAS TGNY LQ DRNVVIYGP A WAT T GIg.pep84 VYNPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYGP---ARWATGTNIHGAGI 133a.pep魔芋a-Lectin蛋白氨基酸序列g.pep雪花莲g-Lectin蛋白氨基酸序列(GenBank Accession No.AAA33349.1)
序列表<110>复旦大学<120>魔芋凝集素蛋白编码序列及其应用<130>12<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>核苷酸<213>魔芋<400>1accaatcaca tacacaatgg20<210>2<211>20<212>核苷酸<213>魔芋<400>2aagcacagat gatggagagc20<210>3<211>668<212>核苷酸<213>魔芋<220><221>编码序列<222>(17)..(493)<223><400>3accaatcaca tacaca atg gcg gcc aaa cct gcc agc ctt gcc ttc ctc ctc 52Met Ala Ala Lys Pro Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu1 5 10ctc ctc ctc ggc gtg gta ttg cgg cct tcc gaa gca gcc caa gcc ctg 100Leu Leu Leu Gly Val Val Leu Arg Pro Ser Glu Ala Ala Gln Ala Leu15 20 25tac gcg ccc ggc gcc ctc ttt tct ggg cag tcc ctc acc gtc ggc aac 148Tyr Ala Pro Gly Ala Leu Phe Ser Gly Gln Ser Leu Thr Val Gly Asn30 35 40tac agg ttc acc atg caa gca gac tgc aac ctg gtt ctc tac gac cga 196Tyr Arg Phe Thr Met Gln Ala Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asp Arg45 50 55 60ggc cgc gcc ata tgg gcc tcc ggc acc gcc cgc cgg ggc atc aac tgc 244Gly Arg Ala Ile Trp Ala Ser Gly Thr Ala Arg Arg Gly Ile Asn Cys65 70 75gtg ctg agg atg cag agg gac ggc aac ctc gtc gtc tac act ccc ggc 292Val Leu Arg Met Gln Arg Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Pro Gly80 85 90ggc cgc gcc atc tgg gcc tcc ggc acc aac agg ggc gcc ggc aac tac 340Gly Arg Ala Ile Trp Ala Ser Gly Thr Asn Arg Gly Ala Gly Asn Tyr95 100 105tac ctg acc ctg cag agt gac cgg aac gtc gtc atc tat ggc ccg gac 388Tyr Leu Thr Leu Gln Ser Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Pro Asp110 115 120ggc agg gcc atc tgg gcg acc aac acc aag gca ttg tct aag gga atc 436Gly Arg Ala Ile Trp Ala Thr Asn Thr Lys Ala Leu Ser Lys Gly Ile125 130 135 140cgg cga tgg gtg ggc ggc gtc atg cga cgc aca acc cgg tcc acc cct 484Arg Arg Trp Val Gly Gly Val Met Arg Arg Thr Thr Arg Ser Thr Pro145 150 155acc agc tga tccatcacac gcaatctcca accatgcatc tgtgcatgct 533Thr Sertgcttactct tgtaataagc aggctggacg gccggtgatc gaaagctttt acatgtttat593gtatagcaag tgctcaactg tatgcgttat gacgcgcgtg tctgccggag aaggagctct653ccatcatctg tgctt 668<210>4<211>158<212>氨基酸<213>魔芋<400>4Met Ala Ala Lys Pro Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu Gly1 5 10 15Val Val Leu Arg Pro Ser Glu Ala Ala Gln Ala Leu Tyr Ala Pro Gly20 25 30Ala Leu Phe Ser Gly Gln Ser Leu Thr Val Gly Asn Tyr Arg Phe Thr35 40 45Met Gln Ala Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Asp Arg Gly Arg Ala Ile50 55 60Trp Ala Ser Gly Thr Ala Arg Arg Gly Ile Asn Cys Val Leu Arg Met65 70 75 80Gln Arg Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Thr Pro Gly Gly Arg Ala Ile85 90 95Trp Ala Ser Gly Thr Asn Arg Gly Ala Gly Asn Tyr Tyr Leu Thr Leu100 105 110Gln Ser Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Pro Asp Gly Arg Ala Ile115 120 125Trp Ala Thr Asn Thr Lys Ala Leu Ser Lys Gly Ile Arg Arg Trp Val130 135 140Gly Gly Val Met Arg Arg Thr Thr Arg Ser Thr Pro Thr Ser145 15015权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有魔芋a-Lectin蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列。
4.一种分离出的魔芋a-Lectin蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ IDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是原核或真核细胞。
8.一种产生具有魔芋a-Lectin蛋白质活性的多肽的方法，特征在于其步骤如下(1)将编码具有魔芋a-Lectin蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成魔芋a-Lectin蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成魔芋a-Lectin蛋白的重组细胞；(3)在适合表达魔芋a-Lectin蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有魔芋a-Lectin蛋白活性的基本纯的多肽。
9.一种利用转基因技术将编码具有魔芋a-Lectin蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物对病虫害抗性的方法，以及魔芋a-Lectin蛋白基因在改良植物病虫害抗性上的应用，特征在于其步骤如下(1)将编码具有魔芋a-Lectin蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含魔芋a-Lectin蛋白的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第17-493位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物细胞；(3)通过筛选如抗生素筛选，获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。转基因植物及其后代对植物病虫害具有增强的抗性。
10.一种能与权利要求7所述的魔芋a-Lectin蛋白多肽特异性结合的抗体，其特征在于它包括多克隆抗体和单克隆抗体。
11.一种核酸分子，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
12.一种用于检测样品中是否存在魔芋a-Lectin核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求10所述探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于魔芋a-Lectin核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度为15～50个核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种在魔芋中表达的新的a－Lectin蛋白、编码序列及其在改良植物对病虫害抗性上的应用。本发明涉及包含所说基因的融合基因构建体,携带该构建体的新的重组表达载体。还涉及被所说的表达载体转化植物细胞,以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代,包括植物种子及植物组织。本发明将所说基因在植物中表达,所获得的转基因植物对植物病虫害具有增强的抗性。
文档编号C07K14/415GK1384196SQ0211194
公开日2002年12月11日 申请日期2002年6月4日 优先权日2002年6月4日
发明者唐克轩, 费炯, 孙小芬, 游学军 申请人:上海复旦迪恩生物技术有限公司