专利名称：饱食因子及其制备方法和其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)饱食因子及其制备方法和其基因，属生物医学领域。
缓激肽(bradykinin)是一类神经内分泌多肽，具有广泛而复杂的生物学效应，主要包括肌肉收缩，降血压，增加血管通透性。目前主要用于研究和开发心血管系统药物(5)。
很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效(6)。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物(7)。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点(8)。据文献报道，国外学者已从东方铃蟾(Bombina orientalis)中分离出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。从蟾蜍和林蛙皮肤中得到的降压肽类物质bufokinin和ranakinin有舒张血管和降血压的作用，已在治疗心血管疾病方面显示出诱人的应用前景(9)；最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。近十几年对几百种两栖类皮肤活性肽和有机小分子进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景(10)。
发明人将本发明的饱食因子全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的饱食因子编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
参考文献1，孙志娟，黄之瑜，肥胖的研究进展。生理科学进展，2001，32(1)，39-44。2，Schwartz MW，Woods SC，Jr Porte D，Central nervous system control offood intake.Nature，2000，404，661-671.3，Bray GA，Tartaglia LA，Medical strategies in the treatment of obesity.Nature，2000，404，672-677.4，Couce ME，Green D，Brunetto A，Achim C，Lloyd RV，Burguera B.Limitedbrain access for leptin in obesity.Pituitary 2001 Jan-Apr；4(1-2)，101-10.5，陈修，陈维洲，曾贵云，心血管药理学，1998版，北京，人民卫生出版社。6，江苏新医学院，中药大词典，1997版，上海，上海科学技术出版社。7，叶昌嫒，费梁，胡淑琴，中国珍稀及经济两栖动物，1993，成都，四川科学技术出版社。8，Lazarus，L.H.，Attila，M.，1993.The toad，ugly and venomous，wearsyet a precious jewel in his skin.Prog.Neurobiol.41，473-507.9，Clarke BT，1997.The Natural History of Amphibian Skin Secretions，Their Normal Function and Potential Medical Applications.Biol Rev，72(3)，365-379.10，赖仞，赵宇，刘衡，张玉洁，李文辉，张云，两栖类动物皮肤活性物质的利用兼论中国两栖类资源开发的策略。动物学研究，2002，23(1)，65-70。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案饱食因子，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为天冬氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-氨基化缬氨酸(Asp Met Tyr Glu IleLys Gln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu GlnCys Pro Ile Trp Val-AMIDATION)，其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。
饱食因子的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，冷冻干燥后，经Sephadex G-50分子筛凝胶过滤分离，收取所得峰V再经CM-Sephadex C-25阳离子交换分离得到4个分离峰，峰I经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化即可得到该饱食因子(箭头所示)。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardmentmass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
饱食因子作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。
饱食因子基因的克隆包括大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，根据编码大蹼铃蟾缓激肽的基因序列设计引物，利用PCR方法筛选新型饱食物因子基因。PCR扩增引物LR115，其长度为21个核苷酸，其序列为5’GATTTGCCNAAGATCAACCGN 3’，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码饱食因子的基因由1041个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为cagttctgta acaagttctc agtgtcactt ccagctctga tcatgagact gtggttctgt 60ctaagtttct tcattgtcct gtgcctggag cattttacag gaaccctggc agatgaaagg 120aatgttccag agagtgaaga aaaaactgag cagttcctga gggatttgcc taagatcaac 180cgcaaaggac cacgtccacc ggggttctcc ccttttcgag gaaaattcca tagccagtcc 240ctgcgggatt tgcctaagat caaccgcaaa ggaccacgtc caccggggtt ctcccctttt 300cgaggaaaat tccatagcca gtccctgcgg gatttgccta agatcaaccg caaaggacca 360cgtccaccgg ggttctcccc ttttcgagga aaattccata gccagtccct gcgggatttg 420cctaagatca accgcaaagg accacgtcca ccggggttct ccccttttcg aggaaaattc 480catagccagt ccctgcggga tttgcctaag atcaaccgca aaggaccacg tccaccgggg 540ttctcccctt ttcgaggaaa attccatagc cagtccctga gggatttgcc taagatcaac 600cgcaaaggac cacgtccacc ggggttctcc ccttttcgag gaaaattcca tagccagtcc 660ctgagggatt tgcctaagat caaccgcaaa ggaccacgtc caccggggtt ctcccctttt 720cgaggaaaat tccatagcca gtccctgcgg gatttgccta agatcaaccg caaaggacca 780cgtccaccgg ggttctcccc ttttcgagga aaattccata gccagtccct gcgggatatg 840tatgaaatca agcagtacaa aactgcacac ggacgcccac cgatctgcgc tccgggtgag 900cagtgtccga tatgggttgg gaagtagcgt cccctgatat aaataagcat tgttatgtca 960cctctgtaat accagctctg actgacatgg tttattaaac agcagatttg tgctctcaaa 1020aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1041编码成熟饱食因子为第835-918位核苷酸，其氨基酸序列为Asp Met Tyr Glu Ile Lys Gln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro15 10 15Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln Cys Pro Ile Trp Val-AMIDATION20 25其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。
饱食因子基因作为基因工程制备饱食因子的应用。
本发明的有益效果在于该饱食因子与其他饱食因子相比，具有结构简单，生物活性强且多样化，能够有效地抑制进食，增强缓激肽生物效应等优点。
附图2为本发明饱食因子CM-Sephadex C-25阳离子交换的层析图。
附图3是本发明饱食因子的HPLC反相C18柱层析图。
附图4是本发明饱食因子的基因核苷酸序列。
附图5是本发明饱食因子的氨基酸序列。
附图6为本发明饱食因子抑制进食的作用。
附图7为本发明饱食因子增强缓激肽的作用。
实施例一
1，制备饱食因子活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。
第一步Sephadex G-50凝胶过滤按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；上样品于经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液平衡的Sephadex G-50(Pharmacia产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液洗脱，收集峰V(
图1)。
第二步，CM-Sephadex C-25阳离子交换层析第一步Sephadex G-50凝胶过滤得到的峰V上样于经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液平衡的CM SephadexC-25(Pharmacia产品)阳离子交换柱(300mm长，26mm直径)，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集峰I(图2)。
第三步，反相高压液相层析(RP-HPLC)第二步CM-Sephadex C-25阳离子交换得到的峰I以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰(箭头标记)即饱食因子(图3)。
2.纯化的饱食因子用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的饱食因子，为我们从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为天冬氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-氨基化缬氨酸(Asp Met Tyr Glu Ile LysGln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln CysPro Ile Trp Val-AMIDATION)，其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。
实施例二1，饱食因子基因克隆1)，大蹼铃蟾皮肤总RNA提取活体大蹼铃蟾用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟，加入等体积酚/氯仿溶液，，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀，上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为大蹼铃蟾皮肤总RNA。
2)，大蹼铃蟾皮肤mRNA的纯化采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒。取大蹼铃蟾皮肤总RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠(SA-PMP)的洗涤将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的大蹼铃蟾皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异戊醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
3)，大蹼铃蟾皮肤cDNA文库构建采用美国GIBCOBRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒，但方法操作有改进。cDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μl Not I引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl 0.1MDTT，1μl 10mM dNTP混合物，在加入1μl SuperScript II反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。cDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μlT4 DNA多聚酶继续保温5分钟。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净试管中，加入70μl 7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。SalI adapter的连接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，10μl SalI adapter，5μl T4 DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶水解，于cDNA溶液中加入5μl React 3缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μlTEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组份合并，体积为200μl，加入5ml酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN缓冲液中。合成的cDNA连接到pSPORT1质粒，取10μl溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT1质粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4 DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞。感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于，50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nm OD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2悬浮，再2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内备用。连接产物的转化取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存。构建的cDNA含4×104个单独克隆。
4)，饱食因子基因克隆筛选根据编码大蹼铃蟾缓激肽的基因序列设计引物，利用PCR方法筛选饱食因子基因。PCR扩增引物LR115，其长度为21个核苷酸，其序列为5’GATTTGCCNAAGATCAACCGN3’，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反应在如下条件下进行94℃ 1分钟，45℃1分钟和72℃ 1分钟，30个循环。首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约500个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板(Costar)上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。
5〕，饱食因子基因序列测定和结果提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems373A全自动核昔酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7启动子，SP6启动子序列5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’，T7启动子序列5’TAATACGACTCACTATAGGGA3’。基因测序结果自5’端至3’端(见图4)。图4所示饱食因子基因核苷酸的序列表为序列长度，1041个碱基，序列类型核酸，链数单链，拓扑学直链状，序列种类cDNA，来源大蹼铃蟾皮肤，序列特征1编码成熟饱食因子为第835-918位核苷酸，其氨基酸序列见图5。
饱食因子基因作为基因工程制备饱食因子的应用。
实施例三1，饱食因子抑制进食的作用进食抑制活性测定方法大白鼠(250-300克，雌雄各半)于头部第3脑室包埋导管，恢复2个星期后，从导管注入5μl不同浓度的溶解于0.9％的NaCl的饱食因子，以0.9％的NaCl溶液作对照，给药后观察大白鼠的进食行为和计算进食量，试验6次取平均值。结果如图6，结果表明该饱食因子具有显著的抑制动物进食的效应，而且呈现良好的量效关系。实验动物连续观察30天后，处死解剖，与对照组相比，未发现任何毒副作用。
2，饱食因子增强缓激肽的作用小白鼠(20±2克，雌雄各半)后肢足底注射10μl不同浓度的饱食因子与缓激肽的混合物，观察和统计其痛觉相关性行为，试验6次取平均值，结果如图7，结果表明，该饱食因子具有显著的增强缓激肽生物效应的作用。
实验结果表明该饱食因子具有显著的抑制动物进食的效应，4-8微克/每只大白鼠给药即可抑制动物50％的进食量，而且呈现良好的量效关系，且未发现任何明显毒副作用。另一方面，动物足底痛觉反应实验表明，该饱食因子具有显著的增强缓激肽生物效应的作用。
<110>中国科学院昆明动物研究所<120>饱食因子及其制备方法和其基因<160>3<210>1<211>1041<212>DNA<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220><221>CDS<222>(43)...(927)<400>1cagttctgta acaagttctc agtgtcactt ccagctctga tc atg aga ctg 51Met Arg Leu1tgg ttc tgt cta agt ttc ttc att gtc ctg tgc ctg gag cat ttt96Trp Phe Cys Leu Ser Phe Phe Ile Val Leu Cys Leu Glu His Phe5 10 15aca gga acc ctg gca gat gaa agg aat gtt cca gag agt gaa gaa141Thr Gly Thr Leu Ala Asp Glu Arg Asn Val Pro Glu Ser Glu Glu20 25 30aaa act gag cag ttc ctg agg gat ttg cct aag atc aac cgc aaa186Lys Thr Glu Gln Phe Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys35 40 45gga cca cgt cca ccg ggg ttc tcc cct ttt cga gga aaa ttc cat231Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe His50 55 60agc cag tcc ctg cgg gat ttg cct aag atc aac cgc aaa gga cca276Ser Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro65 70 75cgt cca ccg ggg ttc tcc cct ttt cga gga aaa ttc cat agc cag321Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe His Ser Gln80 85 90tcc ctg cgg gat ttg cct aag atc aac cgc aaa gga cca cgt cca366Ser Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro95 100 105ccg ggg ttc tcc cct ttt cga gga aaa ttc cat agc cag tcc ctg411Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe His Ser Gln Ser Leu110 115 120cgg gat ttg cct aag atc aac cgc aaa gga cca cgt cca ccg ggg456Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly125 130 135ttc tcc cct ttt cga gga aaa ttc cat agc cag tcc ctg cgg gat501Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg Asp140 145 150ttg cct aag atc aac cgc aaa gga cca cgt cca ccg ggg ttc tcc546Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser155 160 165cct ttt cga gga aaa ttc cat agc cag tcc ctg agg gat ttg cct591Pro Phe Arg Gly Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro170 175 180aag atc aac cgc aaa gga cca cgt cca ccg ggg ttc tcc cct ttt636Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe185 190 195cga gga aaa ttc cat agc cag tcc ctg agg gat ttg cct aag atc681Arg Gly Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile200 205 210aac cgc aaa gga cca cgt cca ccg ggg ttc tcc cct ttt cga gga726Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly215 220 225aaa ttc cat agc cag tcc ctg cgg gat ttg cct aag atc aac cgc771Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg230 235 240aaa gga cca cgt cca ccg ggg ttc tcc cct ttt cga gga aaa ttc816Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe245 250 255cat agc cag tcc ctg cgg gat atg tat gaa atc aag cag tac aaa861His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Met Tyr Glu Ile Lys Gln Tyr Lys260 265 270act gca cac gga cgc cca ccg atc tgc gct ccg ggt gag cag tgt906Thr Ala His Gly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln Cys275 280 285ccg ata tgg gtt ggg aag tag cgtcccctga tataaataag cattgttatg 957Pro Ile Trp Val Gly Lys *290tcacctctgt aataccagct ctgactgaca tggtttatta aacagcagat ttgtgctctc 1017aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1041<210>2<211>294<212>PRT<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220><221>PEPTIDE<222>(265)...(292)<400>2Met Arg Leu Trp Phe Cys Leu Ser Phe Phe Ile Val Leu Cys Leu15 10 15Glu His Phe Thr Gly Thr Leu Ala Asp Glu Arg Asn Val Pro Glu20 25 30Ser Glu Glu Lys Thr Glu Gln Phe Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile35 40 45Ash Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly50 55 60Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg65 70 75Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe80 85 90His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly95 100 105Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe His Ser110 115 120Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg125 130 135Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe His Ser Gln Ser140 145 150Leu Arg Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro155 160 165Gly Phe Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg170 175 180Asp Leu Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe185 190 195Ser Pro Phe Arg Gly Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Leu200 205 210Pro Lys Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro215 220 225Phe Arg Gly Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Lys230 235 240Ile Asn Arg Lys Gly Pro Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg245 250 255Gly Lys Phe His Ser Gln Ser Leu Arg Asp Met Tyr Glu Ile Lys260 265 270Gln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly275 280 285Glu Gln Cys Pro Ile Trp Val Gly Lys290<210>3<211>28<212>PRT<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220><221>AMIDATION<222>(28)<220><221>DISULFID<222>(FROM 18 TO 24)<400>3Asp Met Tyr Glu Ile Lys Gln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro1 5 10 15Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln Cys Pro Ile Trp Val-AMIDATION20 2权利要求
1，饱食因子，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为天冬氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-氨基化缬氨酸，其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。
2，饱食因子的制备方法，其特征是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、离子交换柱层析、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。
3，饱食因子编码基因核苷酸序列，其特征在于其cDNA由1041个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为cagttctgta acaagttctc agtgtcactt ccagctctga tcatgagact gtggttctgt 60ctaagtttct tcattgtcct gtgcctggag cattttacag gaaccctggc agatgaaagg 120aatgttccag agagtgaaga aaaaactgag cagttcctga gggatttgcc taagatcaac 180cgcaaaggac cacgtccacc ggggttctcc ccttttcgag gaaaattcca tagccagtcc 240ctgcgggatt tgcctaagat caaccgcaaa ggaccacgtc caccggggtt ctcccctttt 300cgaggaaaat tccatagcca gtccctgcgg gatttgccta agatcaaccg caaaggacca 360cgtccaccgg ggttctcccc ttttcgagga aaattccata gccagtccct gcgggatttg 420cctaagatca accgcaaagg accacgtcca ccggggttct ccccttttcg aggaaaattc 480catagccagt ccctgcggga tttgcctaag atcaaccgca aaggaccacg tccaccgggg 540ttctcccctt ttcgaggaaa attccatagc cagtccctga gggatttgcc taagatcaac 600cgcaaaggac cacgtccacc ggggttctcc ccttttcgag gaaaattcca tagccagtcc 660ctgagggatt tgcctaagat caaccgcaaa ggaccacgtc caccggggtt ctcccctttt 720cgaggaaaat tccatagcca gtccctgcgg gatttgccta agatcaaccg caaaggacca 780cgtccaccgg ggttctcccc ttttcgagga aaattccata gccagtccct gcgggatatg 840tatgaaatca agcagtacaa aactgcacac ggacgcccac cgatctgcgc tccgggtgag 900cagtgtccga tatgggttgg gaagtagcgt cccctgatat aaataagcat tgttatgtca 960cctctgtaat accagctctg actgacatgg tttattaaac agcagatttg tgctctcaaa 1020aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1041
4，根据权利要求3所述的饱食因子基因核苷酸序列，其特征在于，编码成熟饱食因子为第835-918位核苷酸，其氨基酸序列为Asp Met Tyr Glu Ile Lys Gln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro15 10 15Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln Cys Pro Ile Trp Val-AMIDATION20 25其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。
全文摘要
本发明涉及一种饱食因子及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。该饱食因子为从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为Asp Met Tyr Glu Ile Lys Gln Tyr Lys The Ala His Gly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln Cys Pro Ile Trp Val－AMIDATION。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、离子交换柱层析、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。编码饱食因子的基因由1041个核苷酸组成，其中编码成熟饱食因子为第835－918位核苷酸。具有抑制进食，增强缓激肽生物效应的作用，作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。
文档编号C07K14/435GK1446823SQ0211351
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月25日 优先权日2002年3月25日
发明者张云, 赖仞, 刘衡, 李文辉 申请人:中国科学院昆明动物研究所