专利名称：一种乙酰胆碱酯酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于果蔬中农药残留量测定的乙酰胆碱酯酶的制备方法。
背景技术：
果蔬中农药残留可引起人急性中毒死亡，微量积累又会造成慢性中毒如致癌、致畸、致突变等，严重危害人们的身体健康。目前上市的蔬菜，除了依靠气相色谱等常规方法进行检测外，快速测定技术也得到应用。目前在国内使用的快速测定产品—农药速测试纸，其主要原料乙酰胆碱酯酶是依靠国外进口，这些乙酰胆碱酯酶由于产品原料和制备工艺复杂的原因，价格昂贵，使对果蔬中农药残留的快速测定产品难以普及应用。
发明内容
本发明的目的是提出一种能用于果蔬中农药残留量快速测定的，工艺简单且生产成本低廉乙酰胆碱酯酶的制备方法。
本发明为一种从动物血液中提取乙酰胆碱酯酶的制备方法，包括以下工艺步骤(1)将新鲜动物血液于室温下凝固后，于0～4℃下冷冻2～48小时，取其上清液；(2)将上一步所得的上清液以2000～15000r.p.m，0～4℃离心，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；(3)用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶a、在冰浴中于乙酰胆碱酯酶粗提液中缓慢搅拌下加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵的饱和度在20％～90％的范围内；b、上述所得溶液于3000-15000r.p.m，0-4℃冷冻离心，保留沉淀；c、加入pH7.5-8.0的磷酸缓冲液溶解沉淀，并用pH7.5-8磷酸缓冲液稀释2-10倍；(4)用透析法脱硫酸铵将上步经过硫酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用其体积20～30倍的蒸馏水透析，直至透析液不产生沉淀为止；(5)将上一步所得的酶液浓缩，干燥，即得已纯化的乙酰胆碱酯酶制品。
本发明用于提取乙酰胆碱酯酶的动物血液原料可采用从大白鼠、鸡、鸭、猪、牛、狗、黄鳝鱼、镘鱼或兔中提取的血液。
所述方法中的第(3)步工艺步骤，即用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶的工艺，经试验表明，使酶液中硫酸铵的饱和度在40％～60％的范围内的效果较好。
所述方法中的第(5)步工艺步骤，可采用真空冷冻干燥机，在0～4℃条件下浓缩酶液至固体。也可采用透析法浓缩酶液，将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，于0～4℃下浓缩酶液。
本发明所提供的乙酰胆碱酯酶的制备方法，其动物血液原料来源广泛，制备工艺简单稳定，生产成本较低。用本发明方法所制备的乙酰胆碱酯酶产品，产品纯度高，经测定，用于对残留农药的检测，具有较高灵敏度，经本发明纯化后的乙酰胆碱酯酶灵敏度比酶粗提液提高4倍以上。
具体实施例方式
实施例一从鸡血中提取乙酰胆碱酯酶的工艺步骤如下(1)新鲜鸡血室温下冷凝后，置于冰箱4℃下冷冻2小时，弃去沉淀，取其上清液；(2)将上清液以8000r.p.m，4℃下冷冻离心15分钟，再弃去沉淀，其上清液即为乙酰胆碱酯酶粗提液；(3)硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶a、取乙酰胆碱酯酶粗提液10ml，在冰浴缓慢搅拌下加入饱和度为60％的硫酸铵3.61克(根据硫酸铵饱和度用量表)；b、对上述所得溶液于11000r.p.m，4℃下冷冻离心10分钟，倾去上清液，得到硫酸铵饱和度为60％的沉淀；c、加1ml，pH8磷酸缓冲液溶解沉淀，并用pH8磷酸缓冲液稀释4倍；(4)透析法脱去硫酸铵将上述经过硫酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用酶液体积25倍的蒸馏水透析24小时，其间换水3-5次，直至用1％BaCl2无法测出硫酸根为止；(5)浓缩乙酰胆碱酯酶用真空冷冻干燥机，在4℃条件下浓缩酶液至固体，然后干燥即得纯化的乙酰胆碱酯酶产品。所得的乙酰胆碱酯酶产品密封后于低温下(0℃)保存。
按本例工艺制备的纯化乙酰胆碱酯酶产品根据靛酚乙酸酯显示法，其活性经测定为0.397。对该产品的灵敏度测定结果如下测定样品本方法从鸡血清中提取的纯化乙酰胆碱酯酶。
测定方法靛酚乙酸酯显色法。在含有一定量经硫酸铵沉淀纯化后的酶液的圆滤纸上分别加入0.2毫升500、250、100、50微克/毫升的甲胺膦溶液，对照加0.2mlpH8磷酸缓冲液，静置1分钟后，与另一含有染色剂的滤纸片(每毫升苯中含1.5毫克靛酚乙酸酯)对折，让其反应1.5分钟，观察颜色变化，呈蓝色为完全不被甲胺膦抑制，退色为部分抑制，呈白色为完全被抑制。
反应体系30μl酶液+0.2ml甲胺膦溶液+30μl染色剂。
测定结果由60％硫酸胺饱和度纯化的乙酰胆碱酯酶液的检出极限为100微克/毫升。经纯化的的乙酰胆碱酯酶灵敏充比酶粗提液提高4倍。
实施例二从猪血中提取乙酰胆碱酯酶的工艺步骤如下(1)新鲜猪血室温下冷凝后，置于冰箱4℃下冷冻2小时，弃去沉淀，取其上清液；(2)将上清液以8000r.p.m，4℃下冷冻离心15分钟，再弃去沉淀，其上清液即为乙酰胆碱酯酶粗提液；(4)硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶a、取乙酰胆碱酯酶粗提液10ml，在冰浴缓慢搅拌下加入饱和度为50％的硫酸铵2.91克(根据硫酸铵饱和度用量表)；b、对上述所得溶液于11000r.p.m，4℃下冷冻离心10分钟，倾去上清液，得到硫酸铵饱和度为50％的沉淀；c、加1ml，pH8磷酸缓冲液溶解沉淀，并用pH8磷酸缓冲液稀释4倍；；(4)透析法脱去硫酸铵将上述经过硫酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用酶液体积30倍的蒸馏水透析24小时，其间换水3-5次，直至用1％BaCl2无法测出硫酸根为止；(5)浓缩乙酰胆碱酯酶采用透析法浓缩酶液，将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，用量为5毫升/克(W/V)，于4℃下浓缩酶液，然后将浓缩液干燥即得纯化的乙酰胆碱酯酶产品。所得的乙酰胆碱酯酶产品密封后于低温下(0℃)保存。
权利要求
1.一种从动物血液中提取乙酰胆碱酯酶的制备方法，包括以下工艺步骤(1)将新鲜动物血液于室温下凝固后，于0～4℃下冷冻2～48小时，取其上清液；(2)将上一步所得的上清液以2000～15000r.p.m，0～4℃离心，取其上清液，即得乙酰胆碱酯酶粗提液；(3)用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶a、在冰浴中于乙酰胆碱酯酶粗提液中缓慢搅拌下加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵的饱和度在20％～90％的范围内；b、上述所得溶液于3000-15000r.p.m，0-4℃冷冻离心，保留沉淀；c、加入pH7.5-8.0的磷酸缓冲液溶解沉淀，并用pH7.5-8磷酸缓冲液稀释2-10倍；(4)用透析法脱硫酸铵将上步经过硫酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用其体积20～30倍的蒸馏水透析，直至透析液不产生沉淀为止；(5)将上一步所得的酶液浓缩，干燥，即得已纯化的乙酰胆碱酯酶制品。
2.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于用于提取乙酰胆碱酯酶的动物血液原料采用从大白鼠、鸡、鸭、猪、牛、狗、黄鳝鱼、镘鱼或兔中提取的血液。
3.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶，使酶液中硫酸铵的饱和度在40％～60％的范围内。
4.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于工艺的第(5)步采用真空冷冻干燥机，在0～4℃条件下浓缩酶液至固体。
5.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于工艺的第(5)步采用透析法浓缩酶液，将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，于4℃下浓缩酶液。
全文摘要
一种用于果蔬中农药残留量测定的乙酰胆碱酯酶的制备方法，本发明以动物血液为酶源，其工艺步骤包括从酶源中提取乙酰胆碱酯酶粗提液，以及用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶和用透析法脱硫酸铵，再将酶液浓缩，干燥，即得已纯化的乙酰胆碱酯酶制品。本发明所提供的乙酰胆碱酯酶的制备方法，其动物血液原料来源广泛，制备工艺简单稳定，生产成本较低。用本发明方法所制备的乙酰胆碱酯酶产品，产品纯度高，经测定，用于对残留农药的检测，具有较高灵敏度，经本发明纯化后的乙酰胆碱酯酶灵敏度比酶粗提液提高4倍以上。
文档编号C07K1/00GK1472316SQ0213446
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月29日 优先权日2002年7月29日
发明者李盾, 陈仪本, 范怀忠, 陈娇娣, 李 盾 申请人:广东省微生物研究所