近红外荧光造影剂和荧光成像的制作方法

专利名称：近红外荧光造影剂和荧光成像的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种近红外荧光造影剂以及使用所述造影剂的荧光成像。
在治疗疾病方面，在疾病的早期阶段检测由疾病引起的活体中的形态与功能性变化至关重要。尤其是在治疗癌症时，肿瘤的位置与大小是有效治疗方案的重要的决定性因素。用于这一目的的已知方法包括通过穿刺进行活检及类似方法，以及成像诊断如X射线成像、MRI、超声成像及类似方法。活检对确诊是有效的，但同时它给受试者施加很大的负担，并且它不适用于追踪损伤的时间过程变化。X射线成像和MRI不可避免地将受试者暴露于辐射和磁波中。另外，如上面提到的常规成像诊断需要复杂的操作和长的时间用于测定和诊断。用于这一目的的大型设备也使在操作中运用这些方法变得困难。
成像诊断的一种是荧光成像(Lipspn R.L.等，J.Natl.CancerInst.，26，1-11(1961))。这一方法使用当暴露于具有特定波长的激发光时发射荧光的物质作为造影剂。因而，体被暴露于来自体外的激发光，由体内荧光造影剂发出的荧光可被检测到。
这样的荧光造影剂可以是，例如，在肿瘤中累积的卟啉化合物，它被用于光动力学治疗(PDT)，如血卟啉。其它例子包括光敏钠和benzoporphyrin(见Lipspn R.L.等，supra，Meng T.S.等，SPIE，1641，90-98(1992)，WO 84/04665等)。这些化合物最初用于PDF并具有光毒性，因为这是PDF所需要的。因此，这些并不是理想的诊断试剂。
同时，使用已知的荧光染料如荧光黄、fluorescamin和riboflabin的视网膜循环微血管造影术已为人所知(美国专利第4945239号)。这些荧光染料在400-600nm的可见光区发射荧光。在这一区域，穿透活组织的光传输很慢，因此体内深层部位损伤的检测几乎是不可能的。
另外，包括吲哚花青绿(本文以下略为ICG)在内的花青化合物作为荧光造影剂的用途已有文件记载(Haglund M.M.等，Neurosurgery，35，930(1994)，Li，X.等，SPIE，2389，789-797(1995))，吲哚花青绿用于测定肝功能和心输出量。花青化合物在近红外区(700-1300nm)显示吸收。
近红外光显示高的穿透活组织的传输，并且能够穿透大小约10cm的头骨。因此，它在临床医学上日益引起人们的注意。例如，使用介质光传输的光CT技术已作为新技术在临床领域引起人们的注意。这是因为近红外光能够穿透活体，并能被用于监控活体中的氧浓度和循环。
花青化合物在近红外区发射荧光。这一区域的荧光能穿透活组织而提供作为荧光造影剂的潜力。近年来已经开发了许多花青化合物，并被尝试用作荧光造影剂(WO96/17628、WP97/13490等)。然而，具有足够水溶性且对活体安全，并具有区分正常组织和疾病组织能力(对成像靶位的选择性)的试剂还不存在。
发明概述因而本发明的目的之一是提供一种荧光造影剂。本发明的试剂是低毒性的，并具有优越的水溶性。另外，它发射能够穿透活组织的近红外区的荧光，形成肿瘤和/或血管的特定影像。
本发明的另一目的是提供一种使用所述近红外荧光造影剂的荧光成像方法。
本发明基于将三个或更多个磺酸基团引入到花青染料化合物中导致产生具有高水溶性的荧光造影剂的发现。还发现当使用该造影剂时可建立一种荧光成像方法。
因而，本发明提供以下(1)一种近红外荧光造影剂，包括分子中具有三个或更多个磺酸基团的化合物，它可用分子式[I]表示 其中R1和R2相同或不同，各自是取代或未取代的烷基；Z1和Z2各自是形成取代或未取代的稠苯环或稠萘环所需的非金属原子；r是0、1或2；L1-L7相同或不同，各自是取代或未取代的次甲基，条件是r是2时，同时出现的L6和L7相同或不同；以及X和Y相同或不同，各自是下列分子式中的一个基团 其中R3和R4相同或不同，各自是取代或未取代的烷基，或其药学可接受的盐。
(2)上述(1)中的近红外荧光造影剂，分子中没有羧酸基团。
(3)上述(1)或(2)中的近红外造影剂，其中，在分子式[I]中，r是1。
(4)上述(1)到(3)中任一项中的近红外荧光造影剂，其中分子中具有4个或更多个磺酸基团。
(5)上述(1)到(4)中任一项中的近红外荧光造影剂，其中分子中具有10个或低于10个磺酸基团。
(6)上述(1)到(4)中的任一项中的近红外荧光造影剂，其中分子中具有8个或低于8个磺酸基团。
(7)上述(1)到(6)中的任一项中的近红外荧光造影剂，其中药学可接受的盐是钠盐。
(8)上述(1)到(7)中的任一项中的近红外荧光造影剂，用于肿瘤成像和/或血管造影术。
(9)分子式[II]的化合物的钠盐，分子中具有三个或更多个磺酸基团 其中，R1、R2、L1-L7、X和Y如上定义，R5到R16相同或不同，各自是氢原子、磺酸基团、羧基、羟基、烷基(磺烷基)氨基、二(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺酰基或(磺烷基)氨基磺酰基，不包括以下分子式

(10)上述(9)中的钠盐，其中，在分子式[II]中，R1和R2各自是具有1到5个碳原子的被磺酸基团取代的低级烷基，且X和Y相同或不同，各自是分子式如下的基团 其中R17和R18是未取代的具有1到5个碳原子的低级烷基。
(11)上述(10)中的钠盐，具有如下分子式 (12)如分子式[III-1]的分子中具有三个或更多个磺酸基团的化合物的钠盐 其中L1-L7如上定义，R19和R20是具有1到5个碳原子的被磺酸基团取代的低级烷基，R21-R28相同或不同，各自是氢原子、磺酸基团、羧基、羟基、烷基(磺烷基)氨基、二(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺酰基或(磺烷基)氨基磺酰基，且X’和Y’相同或不同，各自是以下分子式中的一个基团 其中R17和R18如上定义，不包括以下分子式
(13)上述(12)中的钠盐，其中，在分子式[III-1]中，L4是被具有1到4个碳原子的烷基取代的次甲基。
(14)上述(12)中的钠盐，是分子中具有三个或更多个磺酸基团的如分子式[III-2]的化合物的钠盐， 其中R19-R28、X’和Y’如上定义，Z3是形成5-或6-元环所需的非金属原子基团，且A是氢原子或一价基团。
(15)上述(14)中的钠盐，具有如下分子式 (16)上述(12)中的钠盐，具有如下分子式 (17)上述(9)、(10)、(12)、(13)和(14)中的任一项中的钠盐，分子中包括4个或更多个磺酸基团。
(18)上述(9)、(10)、(12)、(13)、(14)和(17)中的任一项中的钠盐，分子中包括10个或低于10个磺酸基团。
(19)上述(9)、(10)、(12)、(13)、(14)和(17)中的任一项中的钠盐，分子中包括8个或低于8个磺酸基团。
(20)一种包括上述(9)到(19)中的任一项中的钠盐的近红外造影剂。
(21)上述(20)中的近红外造影剂，用于肿瘤成像和/或血管造影术。
(22)一种荧光成像方法，包括将上述(1)中的近红外荧光造影剂引入活体中，将体暴露于激发光，并检测来自造影剂的近红外荧光。
(23)上述(9)中的钠盐，至少是选自由下列分子式的化合物组成的组的一员

以及
(24)上述(12)中的钠盐，至少是选自由下列分子式的化合物组成的组的一员






(25)上述(1)中的近红外荧光造影剂，包括至少一种选自由下列分子式的化合物组成的组的化合物












以及
(26)上述(14)中的钠盐，其中一价基团A是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、低级烷氧基，任选地是取代的氨基、烷基羰氧基(alkylcarbonyloxy)、取代或未取代的烷硫基、取代或未取代的芳硫基、氰基、硝基或卤素原子。
附图的简要说明

图1到4是给予化合物24小时后的荧光成像照片，其中给予的是AICG(5mg/Kg)，BNK-1967(5mg/Kg)，C化合物(29)(0.5mg/Kg)和D化合物(6)的K盐(5mg/Kg)。
图5是给予化合物24小时后的荧光成像照片，其中给予的是E化合物(31)(5mg/Kg)。
图6到9是给予化合物(5mg/Kg)20秒和5分钟后的荧光成像照片，其中给予的是AICG(20秒后)，BICG(5分钟后)，C化合物(29)(20秒后)和D化合物(29)(5分钟后)。
图10是给予化合物0.5、1、4和24小时后在血浆中的化合物浓度的图，其中纵轴是在各时间点血浆中的化合物浓度(μg/ml)。
图11是化合物(29)的红外吸收谱图。
图12是化合物(31)的红外吸收谱图。
图13是化合物(6)的红外吸收谱图。
图14是化合物(54)的红外吸收谱图。
发明详述本说明书所用术语定义如下。
本发明中的近红外荧光造影剂指发射近红外区荧光的造影剂。
在本发明中，当磺酸基团被用于形成内盐时，所述磺酸基团可以指磺酸根(-SO3-)。在本发明中，优选的X和Y是以下分子式 其中R3和R4相同或不同，各自是取代或未取代的烷基。
在R1、R2、R3和R4中的“取代或未取代的烷基”的烷基优选为直链或支链的具有1到5个碳原子的低级烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、2-甲基丙基、1，1-二甲基丙基等。取代基可以是，例如磺酸基团、羧基、羟基等。取代的烷基的例子包括羟甲基、1-羟乙基、2-羟乙基、2-羟丙基、3-羟丙基、4-羟丁基、羧甲基、羧乙基、羧丁基、磺甲基、2-磺乙基、3-磺丙基、4-磺丁基等。优选的R1和R2是被磺酸基团取代的具有1到5个碳原子的低级烷基(如2-磺乙基、3-磺丙基、4-磺丁基等)，R3和R4是未取代的具有1到5个碳原子的低级烷基(如甲基、乙基等)。
R17和R18的具有1到5个碳原子的未取代低级烷基以以上提到的那些关于R1、R2、R3和R4的“取代的或未取代的烷基”的烷基作为例子。
R19和R20的被磺酸基团取代的具有1到5个碳原子的低级烷基的烷基基团以以上提到的那些关于R1、R2、R3和R4的“取代或未取代的烷基”的烷基作为例子，具有1到5个碳原子的取代的低级烷基的例子包括2-磺乙基、3-磺丙基和4-磺丁基。
R21-R28的烷基(磺烷基)氨基、二(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺酸基团和(磺烷基)氨基磺酸基团的烷基部分优选是具有1到5个碳原子的直链或支链低级烷基，以以上提到的那些关于R1、R2、R3和R4的“取代或未取代的烷基”的烷基为例子。
在本发明中，“形成取代或未取代的稠苯环或稠萘环所需的非金属原子”指形成稠苯环或稠萘环所需的连接基团，它是分子式如下的一个基团 当稠苯环或稠萘环有取代基时，所述的连接基团可以具有取代基。
其特定的例子包括碳原子、氮原子、氧原子、氢原子、硫原子、卤素原子(如氟原子、氯原子、溴原子和碘原子)等。
由非金属原子Z1和Z2形成的稠苯环或稠萘环的取代基以磺酸基团、羧基、羟基、卤素原子(如氟原子、氯原子、溴原子和碘原子)、氰基、取代的氨基(如二甲氨基、二乙氨基、乙基4-磺丁氨基，二-(3-磺丙基)氨基等)，以及以上定义的直接或通过二价连接基团键合于环上的取代或未取代的烷基为例子。优选的二价连接基团可以是，例如-O-、-NHCO-、-NHSO2-、-NHCOO-、-NHCONH-、-COO-、-CO-、-SO2-等。直接或通过二价连接基团键合于环的取代或未取代的烷基的烷基优选地以甲基、乙基、丙基和丁基为例子，取代基优选地以磺酸基团、羧基和羟基为例子。
L1-L7的次甲基的取代基以取代或未取代的烷基(如上定义)、卤素原子(如上定义)、取代或未取代的芳基、低级烷氧基等为例子。“取代或未取代的芳基”的芳基以苯基、萘基等为例子，优选为苯基。取代基的例子包括卤素原子(如上定义，优选为氯原子)等。取代的芳基包括，如4-氯苯基等。低级烷基优选为具有1到6个碳原子的直链或支链烷氧基，特定地是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基等，优选为甲氧基和乙氧基。另外，L1-L7的次甲基的取代基可以相互连接形成具有三个次甲基基团的环，该环可以进一步与具有另外的次甲基基团的环形成稠环。通过L1-L7的次甲基的取代基连接而形成的具有三个次甲基基团的环以4，4-二甲基环己环等为例子。
由L1-L7基团组成的具有一个环的共轭次甲基链优选为分子式(a)的基团 其中Z3表示形成5-或6-元环所需的非金属原子，A是氢原子或一价基团。
“形成5-或6-元环所需的非金属原子”以以上提到的那些原子为例子。
在分子式(a)和后面将提到的分子式[III-2]中，Z3的5-或6-元环以环戊烯环、环己烯环、4，4-二甲基环己烯环等为例子，特别优选的是环戊烯环。
A代表的一价基团包括，如取代或未取代的烷基(如上定义)、取代或未取代的芳基(如上定义)、取代或未取代的芳烷基、低级烷氧基(如上定义)、被任选地取代的取代的氨基、烷基羰氧基(如乙酰氧基)、取代或未取代的烷硫基、取代或未取代的芳硫基、氰基、硝基、卤素原子(如上定义)等。如本文所用的，“取代或未取代的芳烷基”的芳烷基以苯甲基、2-苯乙基、1-苯乙基、3-苯丙基等为例子，取代基可以是磺酸基团、羧基、羟基、取代或未取代的烷基(如上定义)、烷氧基(如上定义)、卤素原子(如上定义)等。“取代的氨基”的被任选地取代的取代的氨基包括，例如，烷氨基(如甲氨基、乙氨基等)、二烷氨基(二甲氨基、二乙氨基等)、二苯基氨基、甲基苯基氨基、环状氨基(如吗啉代、imidazolidino、ethoxycarbonylpiperadino等)等。关于“被任选地取代的取代的氨基”的任选的取代的取代基包括磺酸基团、羧基等。“取代或未取代的烷硫基”的烷硫基可以是，例如，甲硫基、乙硫基等。取代基的例子包括磺酸基团、羧基等。“取代或未取代的芳硫基”的芳硫基以苯硫基、萘硫基等为例子。取代基的例子包括磺酸基团、羧基等。
A代表的一价基团优选为氟原子、氯原子、二烷基氨基(优选具有6个或低于6个碳原子，且任选地成环)或吗啉代。该基团特别优选地具有磺酸基团。
在分子式[I]中，r优选为1。
药学可接受的盐可以是与分子式[I]的化合物形成的任何无毒盐。其例子包括碱金属盐如钠盐、钾盐，碱土金属盐如镁盐、钙盐等，有机铵盐如铵盐、三乙基铵盐、三丁基铵盐、吡啶盐等，氨基酸盐如赖氨酸盐、精氨酸盐等。特别优选的是在活体内引起更低毒性的钠盐。
用于活体的荧光造影剂特别地应该是水溶性的。在本发明中，因在上述化合物中引入3个或更多个磺酸基团而使近红外荧光造影剂具有显著提高的水溶性。为了有更好的水溶性，磺酸基团的数目优选为4个或更多。为合成简单起见，磺酸基团的数目不超过10个，优选不超过8个。水溶性的提高可以通过测定各化合物的分配系数来确定，例如，可以在丁醇/水的两相体系中测定。更具体地说，3个或更多个磺酸基团的引入导致正丁醇/水的分配系数logPo/w不超过-1.00。
磺酸基团特别优选是引入到分子式[I]的R1、R2、Z1和/或Z2的位置和分子式[II]的R1、R2、R5、R7、R11和/或R13的位置上。
另外，这些磺酸基团优选通过二价基团如亚烷基引入到上述分子式(a)的共轭次甲基链在位置A的L4上。
在分子中具有3个或更多个磺酸基团的分子式[II]的化合物的钠盐中，优选的是以下化合物的钠盐，其中R1和R2是具有1到5个碳原子的被磺酸基团取代的低级烷基，X和Y相同或不同，各自是如下分子式的基团 其中R17和R18相同或不同，各自是具有1到5个碳原子的未取代的烷基，所述的盐分子中具有3个或更多个磺酸基团，特别优选的是分子式如下的化合物 在分子中具有3个或更多个磺酸基团的分子式[I]的化合物及其药学可接受的盐中，优选的是分子式[III-1]的化合物的钠盐
其中L1-L7如上定义，R19和R20是被磺酸基团取代的具有1到5个碳原子的低级烷基，R21到R28相同或不同，各自是氢原子、磺酸基团、羧基、羟基、烷基(磺烷基)氨基、二(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺酰基或(磺烷基)氨基-磺酰基，且X’和Y’相同或不同，各自是如下分子式的基团 其中R17和R18如上定义，所述的分子中具有3个或更多个磺酸基团的盐，特别优选的是如下分子式的化合物 在分子中具有3个或更多个磺酸基团的分子式[III-1]的化合物的钠盐中，优选的是分子式[III-2]的化合物的钠盐 其中R19-R28、X’和Y’如上定义，Z3是形成5-或6-元环所需的非金属原子，A是氢原子或一价基团，所述的分子中具有3个或更多个磺酸基团的盐，特别优选的是如下分子式的化合物
包含于本发明的近红外荧光造影剂中的化合物可以是任何具有分子式[I]或[II]，分子中还具有3个或更多个，优选为4个或更多个磺酸基团的化合物。这些化合物可根据已知的花青染料化合物的生产方法来合成，这些方法在《花青染料和相关化合物》(The CyanineDyes and Related Compounds)，F.M.Hamer，John Wiley和Sons，纽约，1964，《血细胞计数》(Cytometry)，10，3-10(1989)，《血细胞计数》，11，418-430(1990)，《血细胞计数》，12，723-730(1990)，《生物共轭化学》(Bioconjugate Chem.)，4，105-111(1993)，《生物分析化学》(Anal.Biochem.)，217，197-204(1994)，《四面体》(Tetrahedron)，45，4845-4866(1989)，EP-A-0591820A1，EP-A-0580145A1等中被公开。或者，它们可以通过已知方法从商品化的花青染料半合成。具体地说，它们可以通过将dianyl化合物与杂环季盐反应而合成。
本发明的分子式[I]的化合物可通过以下方法合成。
(i)当r＝0时(a)L1＝L5，X＝Y，R1＝R2，Z1＝Z2分子式[IV-1]的杂环季盐(2摩尔)
其中L1、X、Z1和R1如上定义，与分子式[V-1]的dianyl化合物(1摩尔) 其中L2、L3和L4如上定义，在碱和溶剂的存在下反应，生成分子式[VI-1]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、R1、Z1和X如上定义，该化合物[VI-1](1摩尔)和需要摩尔量的分子式[VII]的化合物T1-Na [VII]其中T1是有机酸残基，反应生成上述分子式[VI-1]的化合物的钠盐。
(b)L1≠L5或X≠Y或R1≠R2或Z1≠Z2上述分子式[IV-1]的杂环季盐化合物(1摩尔)和上述分子式[V-1]的diany化合物(1摩尔)在碱和溶剂的存在下反应生成分子式[VIII-1]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、R1、Z1和X如上定义，该化合物[VIII-1](1摩尔)和分子式[XI-1]的杂环季盐化合物 其中L5、Y、Z2和R2如上定义，反应生成分子式[X-1]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、R1、R2、Z1、Z2、X和Y如上定义，该分子式[X-1]的化合物(1摩尔)和需要摩尔量的上述分子式[VII]的化合物反应生成上述分子式[X-1]的化合物的钠盐。
(ii)当r＝1时(a)L1＝L7，X＝Y，R1＝R2且Z1＝Z2分子式[IV-1]的杂环季盐化合物(2摩尔)
其中L1、X、Z1和R1如上定义，和分子式[V-2]的diany化合物(1摩尔) 其中L2、L3、L4、L5和L6如上定义，在碱和溶剂的存在下反应生成分子式[VI-2]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、R1、Z1和X如上定义，该分子式[VI-2]的化合物(1摩尔)和需要摩尔量的分子式[VII]的化合物T1-Na [VII]其中T1如上定义，反应生成上述分子式[VI-2]的化合物的钠盐。
(b)L1≠L7或X≠Y或R1≠R2或Z1≠Z2上述分子式[IV-1]的杂环季盐化合物(1摩尔)和上述分子式[V-2]的diany化合物(1摩尔)在碱和溶剂的存在下反应生成分子式[VIII-2]的化合物
其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、R1、Z1和X如上定义，该化合物[VIII-2](1摩尔)和分子式[IX-2]的杂环季盐化合物(1摩尔) 其中L7、Y、Z2和R2如上定义，反应生成分子式[X-2]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、R1、R2、Z1、Z2、X和Y如上定义，该分子式[X-2]的化合物(1摩尔)和需要摩尔量的上述分子式[VII]的化合物反应，生成上述分子式[X-2]的化合物的钠盐。
(iii)当r＝2时当r是2时，L6和L7在分子式[I]中重叠。为了避免这一点，重叠的L6和L7被称为L8和L9以清楚表达。
(a)L1＝L9，X＝Y，R1＝R2且Z1＝Z2分子式[IV-1]的杂环季盐化合物(2摩尔)
其中L1、X、Z1和R1如上定义，和分子式[V-3]的dianyl化合物(1摩尔) 其中L2、L3、L4、L5、L6和L7如上定义，L8是被任选地取代的次甲基基团，在碱和溶剂的存在下反应，生成分子式[VI-3]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、R1、Z1和X如上定义，该化合物[VI-3](1摩尔)和需要摩尔量的分子式[VII]的化合物T1-Na [VII]其中T1如上定义，反应生成上述分子式[VI-3]的化合物的钠盐。
(b)L1≠L9或X≠Y或R1≠R2或Z1≠Z2上述分子式[IV-1]的杂环季盐化合物(1摩尔)和上述分子式[V-3]的dianyl化合物(1摩尔)在碱和溶剂的存在下反应，生成分子式[VIII-3]的化合物
其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、R1、Z1和X如上定义，该化合物[VIII-3](1摩尔)和分子式[IX-3]的杂环季盐化合物(1摩尔) 其中Y、Z2和R2如上定义，L9是被任选地取代的次甲基基团，反应生成分子式[X-3]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、R1、R2、Z1、Z2、X和Y如上定义。该分子式[X-3]的化合物(1摩尔)和需要摩尔量的上述分子式[VII]的化合物反应，生成上述分子式[X-3]的化合物的钠盐。
需要摩尔量的分子式[VII]的化合物是不少于与分子式[I]的化合物的目标钠盐的一个分子中含有的钠的量相等的量。
L8和L9的取代的次甲基基团的取代基以上述L1到L7的次甲基基团的取代基为例子。
在上述合成方法(i)、(ii)和(iii)中，化合物[IV-1]和[V-1]的反应，化合物[VIII-1]和[XI-1]的反应，化合物[IV-1]和[V-2]的反应，化合物[VIII-2]和[IX-2]的反应，化合物[IV-1]和[V-3]的反应，以及化合物[VIII-3]和[IX-3]的反应在-20℃到80℃，优选在-10℃到40℃的温度间，优选在酰化试剂如乙酸酐的存在下进行。
在上述合成方法(i)、(ii)和(iii)中，化合物[IV-1]和[VII]的反应，化合物[X-1]和[VII]的反应，化合物[VI-2]和[VII]的反应，化合物[X-2]和[VII]的反应，化合物[VI-3]和[VII]的反应，以及化合物[X-3]和[VII]的反应在0℃到40℃的温度间，优选在溶剂如乙醇和水的存在下进行。
在上述合成方法(i)、(ii)和(iii)中，所用的碱可以是，例如，三乙胺、三丁胺、嘧啶、二氮杂双环十一烯(diazabicycloundecene)、甲醇钠等；所用溶剂可以是，例如，酰胺化合物如N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮和N，N-二乙基甲酰胺，或醇类如甲醇；有机酸残基可以是，例如，CH3COO等。
关于前述分子式[I]的化合物的各种药学可接受的盐的生产，分子式[I]的化合物的铵盐和钾盐可通过，例如分子式[VII]的化合物，其中钠原子变成铵基团或钾原子，取代上述合成方法(i)、(ii)和(iii)中使用的分子式[VII]的化合物而得到；前述分子式[I]的化合物的不同阳离子盐可以通过按需要使用离子交换树脂将所述铵盐和钾盐转换成不同的阳离子盐而得到。
包括分子式[II]的化合物在内的用于本发明的上述分子式[I]的化合物特定地以以下分子为例子，本发明并不限于它们。












包含于本发明的近红外荧光造影剂中的上述化合物在700-1300nm，特别是约700-900nm的近红外区具有吸收和荧光，摩尔吸光系数不小于100,000。
只要本发明的近红外荧光造影剂具有分子式[I]或[II]的化合物和/或其药学可接受的盐，且分子中具有3个或更多个，优选为4个或更多个磺酸基团，它不受到特别的限制。该化合物或其盐可以独自或以组合形式包含于所述造影剂中。
具体地说，所述造影剂包括所述化合物或在溶剂，如注射用蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液等中悬浮或溶解的所述化合物。当需要时，可以加入药学可接受的添加剂如载体、赋形剂等。这些添加剂含有如药学可接受的电解质、缓冲剂、洗涤剂以及调节渗透压并提高稳定性和溶解性的物质(例如环糊精、脂质体等)的物质。在相关领域中常用的各种添加剂可以被使用。当本发明的近红外荧光造影剂打算供药用时，它优选通过杀菌过程制备。
所述造影剂可以通过注射、喷雾或涂敷、血管内(静脉内的、动脉内的)、口服、腹膜内、经皮、皮下、囊内或气管内给予。优选地，该剂以水溶液剂、乳剂或混悬剂给予到血管中。
只要剂量使要最终诊断的部位能够被检测，本发明的近红外荧光造影剂的剂量没有特别地限制。它依赖于所使用的发出近红外荧光的化合物的种类、给药对象的年龄、体重和目标器官等而被适当地调节。通常，剂量在0.1-100mg/kg体重的范围内，优选为0.5-20mg/kg体重，以所述化合物的量计。
除了人以外，本发明的造影剂可以被适当地用于各种动物。给药形式、途径和剂量依赖于目标动物的体重和症状而被适当地确定。
另外，在本发明中，上述分子中具有3个或更多个，优选为4个或更多个磺酸基团的分子式[I]，特别是分子式[II]的化合物，倾向于显著地积聚于肿瘤组织。利用这一特性，使用本发明的荧光造影剂，肿瘤组织能够被特定地成像。另外，一系列所述化合物能够长时间地存在于血管中，它们预期能被很好地用作血管造影术的造影剂。
本发明的荧光成像方法的特征是本发明的近红外荧光造影剂的使用。该方法用已知方法实施，各个参数，如激发波长和所检测的荧光波长，是依赖于要给予的近红外荧光造影剂的种类和给药目标而被适当地确定以实现最佳的影像和评价。从给予测定目标的本发明的近红外荧光造影剂到开始用本发明的荧光成像方法测定的时间花费依赖于所使用的近红外荧光造影剂的种类和给药目标而变化。例如，当该剂含有肿瘤成像用的分子式[1]的化合物时，间隔时间是给药后约4-120小时。在分子式[II]的化合物情况中，间隔时间是给药后约24-120小时。当间隔时间太短时，荧光太强以至于靶部位与其它部位不能被清楚地区分。当间隔时间太长时，所述造影剂可能从体内被清除。当需要进行血管成像时，分子式[I]或[II]的化合物在给药后立即或在其后约30分钟后被检测。
该方法通常包括以下步骤。
即，给予检测目标本发明的近红外荧光造影剂并将检测目标暴露于来自激发光源的激发光。然后，来自近红外造影剂的由所述激发光源导致的荧光用荧光检测器检测。
激发波长依赖于所使用的近红外荧光造影剂而变化。只要所述化合物在近红外区有效地发射荧光，它没有限制。优选地，使用具有较好生物传输能力的近红外光。
所检测的近红外荧光的波长也依赖于所使用的造影剂而变化。概括而言，使用具有600-1000nm，优选为700-850nm波长的激发光，检测700-1000nm，优选为750-900nm区的近红外荧光。在这种情况中，激发光源可以是常规的激发光源，如各种激光(如离子激光器、染料激光器、半导体激光器)、卤素光源、氙光源等。当需要时，可使用各种滤光片来得到最佳激发波长。同样，可以使用各种滤光片来测定荧光，以仅得到来自所述近红外荧光造影剂的荧光。
检测到的荧光作为荧光信息进行数据处理并被用于产生能被记录的荧光影像。荧光影像通过照射包括靶组织在内的较大区域，用CCD相机检测荧光并对得到的荧光信息进行影像处理而产生。或者，可以使用光学CT设备，可以使用内窥镜，或者可以使用眼底照相机。
本发明的荧光成像方法使人们能够目测全身疾病、肿瘤、血管等而不损伤活体。
本发明通过实施例和试验实施例的方式进行详细解释，但本发明不限于这些实施例。在以下实施例和实验例中的化合物序号与结构式表示的化合物序号一致。其中在化合物序号后有标明“钾盐”、“钙盐”或“吡啶盐”的符号的化合物(如化合物(29)K盐)是指除了抗衡离子是钾盐、钙盐或吡啶盐而不是钠盐之外与该化合物序号表示的化合物(钠盐)相同的化合物。例如，“化合物(31)K盐”是指除了抗衡离子是钾而不是钠之外，与化合物(31)相同的化合物；“化合物(31)Ca盐”是指除了抗衡离子是钙而不是钠之外，与化合物(31)相同的化合物；“化合物(31)吡啶盐”是指除了抗衡离子是吡啶而不是钠之外，与化合物(31)相同的化合物。
得到作为本发明的近红外荧光造影剂的活性成分的化合物的合成方法在实施例中得到解释。
以下合成方法主要由表1中列出的杂环季盐化合物和表2和3中列出的dianyl化合物的反应组成。
表1杂环季盐化合物
表2 Dianyl化合物-1
表3 Dianyl化合物-2
实施例在以下实施例中，为方便起见，化合物用表1到3中的符号表示(如A1、Q1等)实施例1化合物(29)的合成向杂环季盐化合物Q1(5g)中加入甲醇(100ml)、N，N-二甲基甲酰胺(25ml)、三乙胺(5.6ml)、dianyl化合物A1(1.83g)和乙酸酐(3ml)，混合物在室温下搅拌4小时。加入三乙胺(2.2ml)和乙酸酐(2ml)，混合物在室温下搅拌3小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(2g)在甲醇(15ml)中的溶液，接着在室温下搅拌1小时。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。加入水(20ml)溶解得到的粗晶体(3.5g)。加入乙酸钠(1g)，然后加入甲醇(30ml)，接着搅拌1小时。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，生成3g化合物(29)。得到的化合物(29)在焰色试验中显示黄色。
最大吸收波长(H2O)780nm摩尔吸光系数(H2O)243,000最大荧光发射波长(H2O)802nm使用傅利叶变换红外光谱仪(VALOR-III，JASCO制造)，用溴化钾压片法测定得到的化合物(29)的红外吸收光谱。检测到以下峰。光谱如图11所示。
IR(＜max(KBr))1414，1086，1037，995，889cm-1实施例2化合物(34)的合成向杂环季盐化合物Q2(2.13g)中加入甲醇(20ml)，混合物冷至10℃。向其中加入dianyl化合物A2(0.75g)、三乙胺(4ml)和乙酸酐(2ml)，混合物搅拌20分钟。加入乙酸酐(2ml)，混合物在10℃下搅拌4小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(2g)在少量甲醇中的溶液。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。加水(7ml)溶解得到的粗晶体。加入甲醇(7ml)沉淀晶体。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，生成1.2g化合物(34)。得到的化合物(34)在焰色试验中显示黄色。
最大吸收波长(H2O)794nm摩尔吸光系数(H2O)176,000最大荧光发射波长(H2O)812nn实施例3化合物(6)的合成向杂环季盐化合物Q3(9.5g)中加入甲醇(50ml)、三乙胺(7ml)、dianyl化合物A3(3.1g)和乙酸酐(3.9ml)，混合物在室温下搅拌7小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(5g)在少量甲醇中的溶液。混合物放置过夜。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。加水(30ml)溶解晶体。加入乙酸钠(2g)，然后加入甲醇(30ml)。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥生成化合物(6)。
实施例4化合物(45)的合成向杂环季盐化合物Q3(4.8g)中加入甲醇(50ml)、三乙胺(4ml)、dianyl化合物A4(1.7g)和乙酸酐(2ml)，混合物在室温下搅拌3小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(4g)在少量甲醇中的溶液。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。加水(10ml)溶解晶体。然后加入甲醇(10ml)。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并风干，生成1.6g化合物，除次甲基链上的取代基是-Cl而不是-SCH2CH2SO3Na外，该化合物与化合物(45)相同。
重复以上步骤，生成4.2g所述化合物。向其中加入水(30ml)、三乙胺(1.2ml)和2-巯基乙烷磺酸钠(0.8g)，混合物在室温下搅拌4小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(2g)在少量甲醇中的溶液。过滤收集生成的晶体，用甲醇(20ml)洗涤并风干，生成2.3g化合物(45)。得到的化合物(45)在焰色试验中显示黄色。
最大吸收波长(H2O)815nm摩尔吸光系数(H2O)196,000最大荧光发射波长(H2O)827nm实施例5化合物(2)的合成向杂环季盐化合物Q3(4.7g)中加入甲醇(25ml)、三乙胺(2.8ml)、dianyl化合物A5(1.5g)和乙酸酐(2.4ml)，混合物在室温下搅拌1小时。向其中另外加入三乙胺(3.5ml)和乙酸酐(1.5ml)，混合物在室温下搅拌3.5小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(3g)在少量甲醇中的溶液。混合物在室温下搅拌1小时。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。加入水(15ml)溶解晶体。然后加入甲醇(15ml)。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，生成化合物(2)。
实施例6化合物(43)的合成向杂环季盐化合物Q3(3.75g)中加入甲醇(25ml)、三乙胺(3.5ml)、dianyl化合物A6(1.95g)和乙酸酐(2.4ml)，混合物在室温下搅拌1小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(3.9g)在少量甲醇中的溶液。混合物在室温下搅拌1小时。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。加入水(10ml)溶解晶体。加入乙酸钠(2g)，然后加入甲醇(10ml)。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，生成1.8g化合物(43)。得到的化合物(43)在焰色试验中显示黄色。
最大吸收波长(H2O)773nm
摩尔吸光系数(H2O)204,000最大荧光发射波长(H2O)789nm实施例7化合物(4)的合成向杂环季盐化合物Q3(3.5g)中加入甲醇(20ml)、三乙胺(3.5ml)、dianyl化合物A7(1.2g)和乙酸酐(1.9ml)，混合物在室温下搅拌10小时，然后放置过夜。混合物在加热下在50℃搅拌5小时。加水(2ml)并滤除不溶物。向滤液中加入乙酸钠(5g)在少量甲醇中的溶液。混合物在室温下搅拌30分钟。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，生成化合物(4)。
实施例8化合物(31)的合成向杂环季盐化合物Q4(3.5g)中加入甲醇(35ml)、三乙胺(3.5ml)和乙酸酐(2ml)，搅拌下分批加入dianyl化合物A2(1.8g)，混合物在室温下另外搅拌1小时。加入乙酸酐(2ml)，混合物在室温下搅拌5小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(4g)在少量甲醇中的溶液。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。加入水(10ml)溶解晶体。加入甲醇(10ml)，混合物在室温下搅拌2小时。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，生成1.3g化合物(31)。得到的化合物(31)在焰色试验中显示黄色。
最大吸收波长(H2O)755nm摩尔吸光系数(H2O)228,000最大荧光发射波长(H2O)774nm使用傅利叶变换红外光谱仪(VALOR-III，JASCO制造)，用溴化钾压片法测定得到的化合物(31)的红外吸收光谱。检测到以下峰。光谱如图12所示。
IR(vmax(KBr))1518，1183，1149，1111，995cm-1
实施例9化合物(41)的合成向杂环季盐化合物Q1(12g)中加入甲醇(120ml)、三乙胺(13.6ml)、dianyl化合物A8(4.4g)和乙酸酐(2.4ml)，混合物搅拌30分钟。加入乙酸酐(2.4ml)，混合物搅拌1.5小时，然后加入乙酸酐(2.4ml)，混合物在室温下搅拌6小时。另外加入杂环季盐化合物Q1(1g)、三乙胺(3ml)和乙酸酐(3ml)，混合物在室温下搅拌2小时。混合物放置过夜。加入乙酸钠(5g)，过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。加水(200ml)溶解得到的粗晶体。滤除不溶物并向滤液中加入乙酸钠(10g)。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。向晶体中加入水(200ml)和三乙胺(10ml)，加入乙酸钠(10g)在甲醇(10ml)中的溶液以生成晶体。重复该步骤两次。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，生成9.7g化合物(41)。得到的化合物(41)在焰色试验中显示黄色。
最大吸收波长(H2O)811nm摩尔吸光系数(H2O)230,000最大荧光发射波长(H2O)822nm实施例10化合物(3)的合成根据实施例5，使用杂环季盐化合物Q3和相应的dianyl化合物，生成化合物(3)。
实施例11除了使用乙酸钾(2g)而不是乙酸钠(2g)以外，用与实施例1中化合物(29)的合成的相同方式合成与化合物(29)相同的化合物，除了其抗衡离子是钾而不是钠。在下文中，这一化合物指代为化合物(29)钾盐。获得的化合物(29)钾盐在焰色试验中显示紫色。
最大吸收波长(H2O)780nm摩尔吸光系数(H2O)254,000最大荧光发射波长(H2O)800nm其它前面提到的化合物用与该实施例相同的方式处理，得到具有钾抗衡离子而不是钠的化合物。
这些具有钾抗衡离子的化合物通过在相应化合物序号后附加“K盐”来与上述化合物区分开。
实施例12用与实施例11相同的方式，得到化合物(6)K盐。得到的化合物(6)K盐在焰色试验中显示紫色。
最大吸收波长(H2O)788nm摩尔吸光系数(H2O)226,000最大荧光发射波长(H2O)806nm实施例13用与实施例11相同的方式，得到化合物(2)K盐。得到的化合物(2)K盐在焰色试验中显示紫色。
最大吸收波长(H2O)743nm摩尔吸光系数(H2O)266,000最大荧光发射波长(H2O)762nm实施例14用与实施例11相同的方式，得到化合物(4)K盐。得到的化合物(4)K盐在焰色试验中显示紫色。
最大吸收波长(H2O)753nm
摩尔吸光系数(H2O)212,000最大荧光发射波长(H2O)767nm实施例15用与实施例11相同的方式，得到化合物(3)K盐。得到的化合物(3)K盐在焰色试验中显示紫色。
最大吸收波长(H2O)751nm摩尔吸光系数(H2O)241,000最大荧光发射波长(H2O)767nm实施例16化合物(6)K盐(50mg)溶于少量水中并通过离子交换树脂将化合物(6)K盐的钾转化成质子。向其中加入用乙酸钠饱和的甲醇以沉淀晶体。重复该过程两次。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，得到化合物(6)(32mg)。得到的化合物(6)在焰色试验中显示黄色。
使用傅利叶变换红外光谱仪(VALOR-III，JASCO制造)，用溴化钾压片法测定得到的化合物(6)的红外吸收光谱。检测到以下峰。光谱如图13所示。
IR(vmax(KBr))1395，1372，1188，1102，1020cm-1实施例17化合物(54)的合成向杂环季盐化合物Q4(3.5g)中加入甲醇(20ml)、三乙胺(3.5ml)和乙酸酐(2ml)，搅拌下分批加入dianyl化合物A1(1.4g)，混合物另外搅拌20分钟。加入乙酸酐(1ml)，混合物在室温下搅拌1.5小时。滤除不溶物，向滤液中加入乙酸钠(4g)在少量甲醇中的溶液。过滤收集生成的晶体并用少量甲醇洗涤。将晶体溶于少量水中。然后溶液用甲醇(10ml)稀释，混合物在室温下搅拌1小时。过滤收集生成的晶体，用少量甲醇洗涤并干燥，得到1.5g化合物(54)。得到的化合物(54)在焰色试验中显示黄色。
最大吸收波长(H2O)743nm摩尔吸光系数(H2O)244,000最大荧光发射波长(H2O)766nm使用傅利叶变换红外光谱仪(VALOR-III，JASCO制造)，用溴化钾压片法测定得到的化合物(54)的红外吸收光谱。检测到以下峰。光谱如图14所示。
IR(vmax(KBr))1511，1421，1099，1004，926cm-1实验例1测定了化合物(29)、化合物(43)、化合物(45)、化合物(31)、化合物(3)K盐、化合物(11)[NK-3261，来自NipponKankoh-Shikiso Kenkyusho CO.、LTD.]、化合物(6)K盐、化合物(2)K盐、化合物(4)K盐、化合物(34)和化合物(54)的正丁醇/水分配系数(logPo/w)。
作为对照化合物，所用的是分子中只具有2个磺酸基团的NK-1967(Nippon Kankoh-Shikiso Kenkyusho CO.，LTD.)和ICG(TokyoKasei Kogyo)。结果列于表4。
表4
实验例2荧光成像试验(1)小鼠结肠癌(结肠26癌)的肿瘤组织碎片被皮下移植到BALB/c裸鼠(5周大，Clea Japan，Inc.)左肺。10天后当肿瘤长到直径约8厘米时，此裸鼠用于试验。
钛蓝宝石激光被用作荧光激发光源。使用环形光导向设备(Sumita Optical Glass Co.)，试验小鼠被均匀地暴露于激光中，其中光照的分散作用在10％以内。光照功率输出被调节到在小鼠皮肤表面附近约为40μW/cm2。在各化合物的最大激发波长下激发荧光，来自小鼠的荧光发射通过短波长截止滤光片(IR84，IR86，IR88，FujiPhoto Film CO.，LTD)用CCD相机(C4880，Hamamatsu PhotonicsK.K.)检测并照相。选择截止滤光片以适合于化合物的激发波长。暴露时间依赖于各化合物的荧光强度而调节。
所用的测试化合物是本发明的化合物(29)、化合物(31)和化合物(6)K盐，以及作为对照化合物的分子中只具有2个磺酸基团的NK-1967和ICG。各测试化合物(0.5mg/ml)溶于蒸馏水中并经尾静脉给予小鼠。化合物(31)、化合物(6)K盐、NK-1967和ICG的剂量是5.0mg/Kg，化合物(29)的剂量是0.5mg/Kg。给予化合物24小时后，小鼠用乙醚麻醉，小鼠整个身体的荧光影像被拍摄下来。结果如图1到5所示。
与具有2个磺酸基团的对照化合物(具有苯并三羰花青结构的NK-1967和具有三羰花青结构的ICG)相比，具有苯并三羰花青结构和6个磺酸基团的化合物(29)和两者均具有三羰花青结构和4个磺酸基团的化合物(6)K盐和化合物(31)明显产生清楚的肿瘤影像。特别地，化合物(29)即使在低剂量时也能清楚的描绘出肿瘤并显著地有效。
实验例3荧光成像试验(2)本试验使用裸鼠。在用七氟醚连续吸入麻醉下，本发明的化合物(29)和对照化合物ICG以5.0mg/Kg的剂量从尾静脉被注入。同时，开始间歇地拍摄荧光影像。为了拍摄荧光影像，进行暴露于激发激光并通过滤光片提取荧光，其中暴露时间是1秒钟。给予化合物20秒后，血管被适当地成像。拍摄荧光影像直到给药5分钟后。图6到9显示了小鼠给药20秒和5分钟后的整个身体的荧光影像。
ICG不能在5分钟后选择性地显示血管，而化合物(29)能够使血管成像的时间长于ICG。
实验例4在血管中的停留用实验例2中相同的方式，肿瘤组织碎片被移植到CDF1小鼠(雌性，5周大，日本SLC，Inc.)，约2周后当肿瘤长到直径约1厘米时，小鼠用于试验测试。
测试的化合物是具有苯并三羰花青结构和6个磺酸基团的化合物(29)K盐和化合物(41)K盐，具有三羰花青结构和4-5个磺酸基团的化合物(6)K盐、化合物(4)K盐、化合物(45)K盐、化合物(31)、化合物(31)K盐、化合物(3)K盐、化合物(2)K盐、化合物(43)K盐和化合物(11)，以及对照化合物ICG和NK-1967。各测试化合物溶于蒸馏水中(0.5mg/ml)使用。得到的各化合物的溶液从小鼠尾静脉注入(0.5mg/Kg)。在给药0.5、1、4和24小时后从小鼠取血并离心出血浆。
血浆的荧光强度通过荧光分光光度计(RF 5300 PC，SHIMADZUCORPORATION)测定。作出各化合物的校正曲线，计算血浆中化合物的浓度。结果如图10所示。
本发明的化合物长时间高浓度地保留在血浆中。
实验例5急性毒性研究了通过引入磺酸基团和转化成钠盐降低毒性。
测试化合物列于表5中。
各化合物溶于蒸馏水中得到化合物的溶液。该溶液从尾静脉静脉注射入有知觉的小鼠。给药后，小鼠被监测3天，评估急性毒性[LD50(mg/Kg体重)]。结果列于表5。
表5

分子中磺酸基团数目的增加或转化为钠盐导致急性毒性明显下降。
本发明的近红外荧光造影剂被激发光激发并发射近红外荧光。该近红外荧光在穿透生物组织方面较为优越。因而，使测定活体深层部分的损伤成为可能。另外，发明的造影剂在水溶性和低毒性方面较为优越，因而它能被安全地使用。
权利要求
1.分子式如下的钠盐
2.一种包括权利要求1的钠盐的近红外荧光造影剂。
3.权利要求1和2的近红外荧光造影剂，其用于肿瘤成像。
4.权利要求1和2的近红外荧光造影剂，其用于血管造影术。
全文摘要
本发明涉及分子式如下的钠盐，以及包括该钠盐的近红外荧光造影剂。所述近红外荧光造影剂用于肿瘤成像和/或血管造影术。
文档编号C07D401/14GK1515552SQ0215484
公开日2004年7月28日 申请日期1999年9月16日 优先权日1998年9月18日
发明者三轮直人, 史, 稻垣陆史, 明, 江口博明, 奥村正文, 文, 夫, 稻垣由夫, 原田徹 申请人:舍林股份公司, 富士胶片株式会社