Flt4(VEGFR-3)作为靶用于肿瘤成像和抗肿瘤治疗的制作方法

专利名称：Flt4(VEGFR-3)作为靶用于肿瘤成像和抗肿瘤治疗的制作方法
本申请是一份继续申请，它要求申请日为1998年10月9日的美国专利申请系列号09/169,079；现在是美国专利号6,107,046的申请日为1997年7月28日的美国专利申请系列号08/901,710；现在是美国专利号5,776,755的申请日为1994年11月14日的美国专利申请系列号08/340,011；现在放弃的申请日为1994年6月9日的美国专利申请系列号08/257,754的优先权；后两份申请又是现在放弃的申请日为1992年10月9日的美国专利申请系列号07/959,951的部分继续申请。本文引用所有这些申请以其整体作为参考。
本发明的领域本发明一般涉及受体基因，特别是受体酪氨酸激酶的基因，其插入重组DNA载体，和在宿主微生物菌株和宿主真核细胞中生产所得蛋白质。更具体的说，本发明涉及Flt4，一种受体酪氨酸激酶；涉及编码Flt4的核苷酸序列；涉及编码Flt4的DNAs及其基因产物的生产方法；涉及特异性地识别(杂交)编码该受体的核酸的核酸探针；涉及特异性地识别该受体的抗体；和涉及使用该探针和抗体及其它Flt4结合化合物的方法，例如，用于鉴定动物和人体组织中的淋巴管和毛细血管后微静脉(HEV)，和增进或防止表达Flt4的细胞在病理学条件下的生长。
背景负责分化细胞和组织的发育，维持和修复的细胞行为大部分受到通过生长因子和相似配体及其受体传导的细胞间信号调节。受体位于效应细胞的细胞表面且它们结合被认为是生长因子以及其它激素样配体的肽或者多肽。该相互作用的结果是在效应细胞中的迅速生物化学变化，以及细胞基因表达的迅速和长期再调整。与各种细胞表面相联的一些受体可结合特定生长因子。
酪氨酸磷酸化是跨质膜信号传导的一种关键方式。一些酪氨酸激酶基因编码诸如表皮生长因子(EGF)，胰岛素，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)，血小板衍生生长因子(PDGF-A和-B)和成纤维细胞生长因子(FGFs)的多肽生长因子和激素的跨膜受体[Heldin等，Cell Regulation，1555-566(1990)；Ullrich等，Cell，61243-54(1990)]。一些造血生长因子的受体是酪氨酸激酶；它们包括c-fms，即集落刺激因子1受体[Sherr等，Cell，41665-676(1985)]和c-kit，即前造血生长因子受体[Huang等，Cell，63225-33(1990)]。
这些受体的区别在于其特异性和亲和力。一般来说，受体酪氨酸激酶是糖蛋白，它由能够结合特定生长因子的胞外域，通常是该蛋白质的α-螺旋部分的跨膜结构域，近膜结构域(在此该受体可受到例如，蛋白质磷酸化的调节)，酪氨酸激酶结构域(它是该受体的酶组件)，和在许多受体中与酪氨酸激酶底物的识别和结合相关的羧基末端尾组成。
在一些受体酪氨酸激酶中，可选择的剪接加工和可选择的多聚腺苷化能够从相同基因产生一些不同的多肽。它们可以含有或者不含上面列举的各种结构域。因此，一些胞外域可作为细胞分泌的分离蛋白被表达且该受体的一些形式可缺少酪氨酸激酶结构域且仅含有通过跨膜结构域插入质膜的胞外域加上一个短羧基末端尾。
血管系统的生理学，胚胎血管发生和血管生成，血液凝固，伤口愈合和再生，以及一些疾病都与血管内层的血管内皮相关。血管树的形成通过血管生成发生，且根据一些理论，淋巴系统的形成在动脉和静脉形成后短期内通过从静脉萌发开始。参见Sabin，F.R.，Am.J.Anat.，943(1909)；和van derPutte，S.C.J，Adv.Anat.Embryol.Cell Biol.，513(1975)。
胎儿阶段后，除了与新脉管形成相关的血管生成期间外，内皮细胞增殖非常缓慢。生长因子刺激的血管生成通过特异性内皮细胞表面受体酪氨酸激酶发挥其效力。
在受体酪氨酸激酶的配体中，血小板衍生生长因子(PDGF)已经表明在鸡尿囊绒膜中具有血管生成性，尽管较弱。转化生长因子α(TGFα)是由一些肿瘤细胞类型和由巨噬细胞分泌的一种血管生成因子。肝细胞生长因子(HGF)，即c-met原癌基因编码的受体的配体，也具有较强的血管生成性，在培养的内皮细胞中诱导与TGFα相似的反应。
证据表明存在主要负责刺激内皮细胞生长，分化，以及某些分化功能的内皮细胞特异性生长因子和受体。研究最广泛的生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)，即PDGF家族的一个成员。血管内皮生长因子是二硫键连接的23kDa亚基的二聚体糖蛋白，由于其对内皮细胞的促有丝分裂活性及其诱导血管通透性的能力而被发现(因此其替代名称是血管通透性因子)。VEGF的其它报导的效力包括转移细胞内Ca2+，诱导纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂-1的合成，刺激内皮细胞中的己糖运输，和促进单核细胞的体外迁移。由不同mRNA剪接变异体编码的4种VEGF同种型表现出同样能够刺激内皮细胞的有丝分裂。VEGF的121和165氨基酸同种型以可溶性形式分泌，而189和206氨基酸残基的同种型保持与细胞表面相联且具有较强的肝素亲和力。对于有关胎盘生长因子的可溶性非肝素结合形式和肝素结合形式也已有描述(PlGF；分别是131和152个氨基酸)，它在胎盘，滋养层肿瘤，和培养的人内皮细胞中表达。
VEGF的表达方式表明其与正常血管系统的发育和维持及肿瘤血管生成相关。鼠发育期间，整个交配后7.5天的内胚层表达VEGF且神经外胚层室在毛细向内生长阶段产生VEGF。在鹌鹑发育的第二天，卵黄囊的血管化区域以及整个胚胎表现出表达VEGF。另外，在成年小鼠中靠近帘式内皮膜的上皮细胞显示出持续的VEGF表达，表明了在该特定内皮表型和功能的维持中的作用。
已经鉴定了VEGF的两个高亲和性受体，即VEGFR-1/Flt1(fms-样酪氨酸激酶-1)和VEGFR-2/Kdr/Flk-1(含有激酶插入结构域的受体/胎儿肝脏激酶-1)。这些受体属于PDGF-受体家族。然而，VEGF受体在其胞外域中具有7个免疫球蛋白样环(相对于PDGF家族其它成员中的5个)和较长的激酶插入片断。VEGF受体的表达主要发生在血管内皮细胞中，尽管也有一些存在于单核细胞和黑素瘤细胞系中。已报导只有内皮细胞与VEGF反应会增殖，且不同来源的内皮细胞表现出不同的反应。因此，通过VEGFR-1和VEGFR-2介导的信号似乎是细胞类型特异性的。
VEGFR-1和VEGFR-2以高亲和性结合VEGF165(Kd分别为大约20pM和200pM)。Flk-1受体也显示出与VEGF反应进行自身磷酸化，但是Flt1的磷酸化几乎不可检测。VEGFR-2介导的信号引起形态学的显著改变，肌动蛋白的再组织和过度表达该受体的猪主动脉内皮细胞的膜起皱。在这些细胞中，VEGFR-2也介导配体诱导的趋化性和促有丝分裂性；而VEGFR-1转染的细胞缺乏对VEGF的促有丝分裂反应。相反，VEGF对表达VEGFR-1的大鼠窦状隙内皮细胞具有较强的生长刺激效应。磷蛋白与VEGFR-1和VEGFR-2的共沉淀不同，表明不同信号分子与受体特异性细胞内序列相互作用。
在原位杂交试验中，在卵黄囊和胚内中胚层(估计为交配后(p.c.)7.5天的胚胎，内皮从它产生)中，且后来在推定的成血管细胞，心内膜和大血管及小血管内皮(交配后12.5天)中发现小鼠VEGFR-2mRNA的表达。在血管芽和胚胎及出生后早期的大脑的分支血管增生的内皮细胞中丰富的VEGFR-2mRNA和成年大脑中表达减少表明VEGFR-2是血管发生和血管生成的主要调节剂。VEGFR-1的表达同样与小鼠胚胎中的早期血管形成和与愈合皮肤伤口中的新脉管形成相关。然而，在成年器官中检测到高水平的VEGFR-1表达，表明VEGFR-1在不涉及细胞生长的成熟血管的静止内皮中起作用。从原肠胚形成开始的中胚层中观察到VEGFR-2的鸟类同系物，而VEGFR-1同系物首先在共表达内皮标记的细胞中发现。在体外的鹌鹑外胚层培养物中，这些细胞的血管发生性分化所需的FGF-2上调VEGFR-2的表达。发现两种VEGF受体的表达在发育晚期变得更有限。在人类胎儿组织中，VEGFR-1和VEGFR-2表现出重叠的，但略有不同的表达方式。这些资料表明VEGF及其受体以旁分泌方式起作用，以调节内皮细胞的分化和组织的新脉管形成。
最近已表明VEGF是内皮细胞生长和血管生成的低氧症诱导型刺激物，且使用特异性单克隆抗体抑制VEGF活性显示出减小实验肿瘤的生长及其血管的密度。[Ferrara等，Endocrine Reviews，184-25(1997)；Shibuya等，Adv.Cancer Res.，67281-316(1995)；Kim等，Nature，362841-844(1993)]。
大小超过几立方毫米的实体瘤的生长依赖于血管供给，使得血管生成成为抗癌治疗的具有吸引力的靶。用内源性血管生成抑制剂或包括制管张素，纤溶酶原的片断，和内抑制素，胶原蛋白18的片断的“抑制素”报道了令人鼓舞的结果。[O′Reilly等，Cell，79315-328(1994)；O′Reilly等，Cell，88277-85(1997)。]。正常情况下两种因子均由原发性肿瘤产生且保持转移休眠。全身性施用任一抑制素也显示出诱导并维持动物模型中原发性肿瘤的休眠。受体和通过抑制素的信号传导，以及激活它们的蛋白酶有待鉴定。对于在癌症和其它病理学疾病状态的治疗中控制血管生成的其它治疗性分子的需求仍然存在。
已表明原发性乳腺癌表达一些血管生成性多肽，其中VEGF最丰富。[参见，例如，Relf等，Cancer Res.，57963-969(1997)]。在侵入性和非侵入性导管(原位)乳腺癌中，肿瘤细胞含有高水平的VEGF mRNA。[Brown等，Hum.Pathol.，2686-91(1995)]。邻近原位癌的内皮细胞表达VEGFR-1和VEGFR-2 mRNA。VEGF及其受体负责恶性乳房肿瘤的血管生成性进展，因为在一些独立的研究中，发现肿瘤血管密度与该疾病的预后之间相关。[Weidner等，J.Natl.Cancer Inst.，841875-1887(1992)]。存在对于乳腺癌和乳腺癌相关的血管生成的其它标记的需求，以便改进诊断和筛选，和用作治疗性干涉的靶子。
淋巴系统的主要功能是提供组织的液体回流和转运许多血管外物质回血液。另外，在化脓过程期间，淋巴细胞离开血液，通过淋巴器官和其它组织迁移，并进入淋巴管中，通过胸导管返回血液。特化的小静脉，即毛细血管后微静脉(HEVs)，再次结合淋巴细胞并引起其外渗入组织。因此，淋巴管，且特别是淋巴结在免疫学和在不同肿瘤的转移发展中起重要作用。
自20世纪开始以来，关于淋巴系统的胚胎起源提出了三个不同的理论。然而，淋巴管难以鉴定，因为没有可用于它们的已知的特异性标记。
淋巴管最普遍借助于淋巴造影术进行研究。在淋巴造影术中，将X-射线造影剂直接注射进淋巴管中。该造影剂沿淋巴系统的输出导液管分布。造影剂在淋巴结集中，在此停留达半年，在此时间期间的X-射线分析允许追踪淋巴结的大小和结构。该诊断法在患有淋巴结转移瘤和淋巴恶性肿瘤，例如淋巴瘤的癌症患者中尤其重要。然而，本领域仍然需要改进的材料和方法用于淋巴组织造影。
本发明小结本发明阐述了一种位于5号染色体上的新的受体酪氨酸激酶基因，鉴定为来自人白血病细胞的一种未知的酪氨酸激酶-同源性PCR-cDNA片断[Aprelikova等，Cancer Res.，52.746-748(1992)]。该基因及其编码的蛋白质称为Flt4。该缩写来自短语fms-样酪氨酸激酶4。
Flt4是在结构上与VEGFR-1和VEGFR-2基因产物密切相关的受体酪氨酸激酶。由于该相似性和随后发现的在这三个受体的配体之间的相似性，Flt4受体也称为VEGFR-3。名称Flt4和VEGFR-3在本文中可交换使用。尽管这三个受体之间具有相似性，但是Flt4的成熟形式与VEGFRs的区别在于它在胞外域被蛋白酶剪切成两个二硫键连接的125/120kD和75kD的多肽。Flt4基因编码4.5和5.8kb的mRNAs，表现出可选择的3’外显子且分别编码190kD和195kD的多肽。
进一步的区别证据是VEGF不表现出与Flt4的特异性结合且不诱导其自身磷酸化。
在组织研究中Flt4，Flt1，和KDR/Flk-1受体mRNA信号的比较表现出重叠的，但不同的表达方式。Kaipainen等，J.Exp.Med.，1782077(1993)。Flt4基因表达似乎比VEGFR-1或VEGFR-2的表达更有限。Flt4的表达在头间充质成血管细胞，主静脉和在交配后8.5天的小鼠胚胎尿囊的胚外中通过原位杂交首次变得可检测。在交配后12.5天的胚胎中，在发育中的静脉和推定的淋巴管内皮上观察到Flt4信号，而动脉内皮呈现阴性。在发育晚期期间，Flt4 mRNA变得局限在发育的淋巴管中。在成人组织中只在淋巴管内皮和一些毛细血管后微静脉中表达Flt4 mRNA且在淋巴结转移癌的淋巴窦中和在淋巴管瘤中出现表达增加。该结果支持淋巴管的静脉起源的理论。
从人红白血病细胞系中克隆的Flt4受体酪氨酸激酶cDNA的蛋白质产物是N-糖基化的且在其胞外域中含有7个免疫球蛋白样环。Flt4的胞质酪氨酸激酶结构域与Flt1和KDR的相应结构域在氨基酸水平上有大约80％的相同性且与血小板衍生生长因子，集落刺激因子-1，干细胞因子的受体，和Flt3受体有大约60％的相同性。参见Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。
本发明提供了用于Flt4蛋白质及其肽片断生产和用于从其它来源回收相关基因的编码Flt4受体酪氨酸激酶的分离的多核苷酸(例如，确定结构的DNA或RNA片断)。
本发明提供了能被插入微生物或真核细胞中且能够表达该编码蛋白的含有编码Flt4受体酪氨酸激酶或相关蛋白的异源性片断的重组DNA载体。
本发明提供了能够产生有用量的Flt4受体酪氨酸激酶和来自许多物种的功能相似的蛋白质的真核细胞。
本发明提供了可在实室合成或者通过微生物生产的肽，该肽模拟天然Flt4受体酪氨酸激酶蛋白的活性。在另一实施方案中，本发明涉及抑制Flt4受体酪氨酸激酶蛋白的活性的肽。
特别优选的肽选自由如下肽组成的组中(a)Flt4-短链形式，具有SEQ.IDNOs.1和2中所示的核苷酸和推定的氨基酸序列；和(b)在其羧基末端具有不同的核苷酸和相应的氨基酸残基的第二种形式，即Flt4-长链形式，具有SEQ.ID NOs.3和4所示的核苷酸和推定的氨基酸序列。Flt4长链形式具有1363个氨基酸残基的长度。
DNA和RNA分子，重组DNA载体，和包含编码上述任一蛋白质或肽的核苷酸序列的修饰微生物或真核细胞也是本发明的一部分。具体地说，含有如下两个DNA序列的全部或部分的序列，互补DNA或RNA序列，或相应的RNA序列是特别优选的(a)诸如SEQ ID NO1的DNA序列，编码Flt4-短链形式[SEQ ID NO2]，和(b)诸如SEQ ID NO3的DNA序列，编码SEQID NO1的核苷酸3913-4416改变的Flt4，即编码Flt4-长链形式[SEQ ID NO4]。
还提供了含有较长序列之片段的DNA和RNA分子用于实施涉及通过遗传工程技术生产该肽和生产寡核苷酸探针的本发明的优选方面。
由于本文鉴定了编码Flt4蛋白的DNA序列，因此可通过例如，聚合酶链式反应或者使用商业上可得到的设备通过化学合成生产编码Flt4蛋白的DNA，之后使用重组DNA技术的已知技术将该基因插入任一许多可得到的DNA载体中。另外，自动设备也可得到，使得直接合成本文公开的任一肽容易实现。
本发明还涉及Flt4肽和其它构建体，且涉及Flt4作为淋巴管内皮细胞的特异性标记的用途。
在一个具体实施方案中，本发明涉及识别Flt4的核酸探针和抗体，特别是单克隆抗体，和含有该抗体的组合物。
另外在一个具体实施方案中，本发明涉及监测组织样品和生物体中淋巴管的方法。提供描述淋巴组织，且特别是淋巴管状态(发炎，感染，损伤，生长，等)的临床检测方法，和提供检测淋巴管，且从而检测生物体中的淋巴血管化的方法也是本发明的一个目的。
本发明的另一目的是提供特异性识别Flt4受体蛋白或其各种表位的单克隆抗体。使用这些单克隆抗体用于检测和测量组织，且特别是淋巴组织中Flt4受体的量的诊断目的也是本发明的一个目的。在抗-Flt4抗体的上下文中，术语“特异性识别Flt4”，“特异性结合Flt4”，“Flt4特异性的”等是指抗体相对于包括VEGFR-2/Kdr/Flk-1和VEGFR-1/Flt1的其它内皮细胞表面受体优先与Flt4结合(免疫反应)。因此，对Flt4特异性的抗-Flt4抗体或其它Flt4结合化合物可用于按照本文所述的本发明的方法鉴定和/或标记组织或生物学样品中的Flt4(例如，医学造影，检测，筛选，或定向疗法)，因为它们根本不能结合其它抗原的表位，或者仅以明显低于其Flt4结合亲和力的亲和力结合其它抗原以至于在这些实际背景中不明显。
本发明的另一方面涉及测定细胞样品中存在Flt4-受体的方法，包括步骤(a)将细胞样品与本发明的抗体，特别是单克隆抗体接触；和(b)检测所述的单克隆抗体与Flt4受体的结合。从下文的详细描述显而易见的是，有关组织样品中Flt4受体的存在，数量，密度，和位置方面的信息与疾病状态的类型和严重性具有诊断和预后相关性；且如果需要将基于抗-Flt4的治疗方案特异性地只适应于患有特征在于在肿瘤或在围绕，服务或供给肿瘤的血管或淋巴管和组织中表达Flt4的疾病的那些患者时具有治疗相关性。因此筛选Flt4受体的存在可构成治疗方案的第一步，和/或疗程期间的监测步骤。
本发明还涉及在淋巴血管化和炎症，感染和免疫学情况中调节(例如，拮抗或增强)Flt4功能的方法。例如，在一个实施方案中，该方法包括通过提供足够量的Flt4-结合化合物以抑制参与该反应，特别是其中Flt4的功能与诸如转移癌，淋巴瘤，炎症(慢性或急性的)，感染和免疫学疾病的疾病相关的Flt4内皮细胞位点来抑制Flt-4介导的淋巴血管化。由于许多肿瘤通过淋巴管转移，因此涉及抑制Flt4配体和Flt4之间相互作用的疗法预期具有广阔的应用，可作为抗癌治疗方案的一部分用于抑制肿瘤转移。
本发明还涉及特异性Flt4-刺激配体和单克隆抗体及其刺激淋巴管内皮的用途，和从对该配体的研究中得到的在需要时，例如在与Flt4功能相关的各种疾病状态中抑制Flt4功能的片段和肽以及抗体。
本发明提供了Flt4受体酪氨酸激酶的配体的细胞系来源。使用这些细胞的条件培养基，可通过使用本领域的标准方法纯化和克隆Flt4配体。使用该条件培养基或纯化的配体，可获得用于Flt4配体和二聚体化抑制剂以及Flt4信号转导抑制剂的试验系统，它允许鉴定和制备该抑制剂。
在本发明的优选实施方案中，PC-3细胞系的条件培养基包含能够刺激Flt4受体并调节某些内皮细胞的生长和分化以及分化功能的蛋白质或其片段。Flt4配体或其肽或衍生物用于调节内皮细胞生长，分化及其分化功能并用于产生该配体的兴奋剂和拮抗剂。具体地说，Flt4配体用于调节淋巴管内皮。然而，当从重组来源纯化或生产时，Flt4配体也可刺激相关的KDR/Flk-1受体。
Flt4-刺激配体的鉴定使得测定该配体的抑制剂或Flt4功能的抑制剂直接成为可能。可将该抑制剂简单地加入含有Flt4配体的条件培养基中，且如果它们抑制自身磷酸化，则它们起Flt4信号抑制剂的作用。例如，可测定重组或合成肽(包括但不限于Flt4胞外域的片段)对Flt4-配体相互作用或Flt4二聚体化的抑制。这种推定的Flt4抑制剂和另外的抗Flt4配体的抗体，抑制Flt4受体-配体相互作用的肽或其它化合物，以及与编码Flt4配体的mRNA序列互补的反义寡核苷酸可用于调节内皮细胞和用于治疗与内皮细胞功能相关的疾病。
称为VEGF-C的Flt4配体的详细鉴定在申请日为1998年2月2日且作为国际公开号WO 98/33917公开的PCT专利申请号PCT/US98/01973中；在申请日为1996年8月1日且作为国际公开号WO 97/05250公开的PCT专利申请PCT/FI96/00427中；和在其中要求优先权所依赖的美国专利申请优先权文件中提供，所有这些文献在本文中引用以供参考。前体-VEGF-C原的推定氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO21描述。
称为VEGF-D的第二个Flt4配体的详细描述在Achen等，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.，95(2)548-553(1998)，和在Genbank登录号AJ000185中提供，本文引用该两篇文献以供参考。前体-VEGF-D原的推定氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO22描述。
本发明还涉及治疗患有以细胞中表达Flt4酪氨酸激酶(Flt4)为特征的疾病的哺乳动物生物体的方法，包括给哺乳动物生物体施用一种组合物的步骤，该组合物包含有效抑制Flt4配体蛋白与生物体细胞中表达的Flt4的结合的化合物，从而抑制Flt4功能。该疾病可以是上文已经提及的疾病，例如以不希望的淋巴血管化为特征的疾病。另外，已经发现在与至少一些乳腺癌，和可能的其它癌症相关的血管系统中也出现Flt4表达(即，表达水平大大超出相应正常(健康)组织的血管系统中几乎不可检测或者不可检测的表达水平)。因此，在优选的实施方案中，该细胞包含内皮细胞(淋巴管或血管的内皮细胞)。在另一实施方案中，该细胞包含肿瘤细胞，例如表达Flt4的某些淋巴瘤。特别包含人类的治疗。
“有效抑制Flt4配体蛋白质与生物细胞中表达的Flt4的结合的化合物”是指抑制可从PC-3条件培养基分离的本文描述为血管内皮生长因子C的Flt4配体的结合的任何化合物。预期该化合物也有效抑制血管内皮生长因子D与Flt4的结合。举例性的化合物包括下列多肽(a)含有抗-Flt4抗体的抗原结合片段的多肽；(b)含有可溶性Flt4片段的多肽(例如，胞外域片段)，其中该片段和多肽能够与Flt4配体结合；(c)含有脊椎动物血管内皮生长因子C(VEGF-C)多肽的片段或类似物的多肽，其中该多肽和片段或类似物结合，但不能激活在天然宿主细胞(即在其表面表达天然Flt4蛋白质的生物细胞)上表达的Flt4；和(d)含有脊椎动物血管内皮生长因子D(VEGF-D)多肽的片段或类似物的多肽，其中该多肽和片段或类似物结合，但不能激活在天然宿主细胞上表达的Flt4。使用例如，VEGF-C和重组表达的Flt4以标准体外筛选试验可鉴定的小分子抑制剂也是可预期的。含有抗-Flt4抗体的抗原结合片段的多肽是非常优选的。该多肽包括，例如特异性结合Flt4的多克隆和单克隆抗体；该抗体的片段；嵌合和人源化抗体；特异性结合Flt4且也特异性结合另一抗原的双特异性抗体等等。结合循环Flt4配体且从而抑制该配体与Flt4的结合的化合物的用途也是可预期的。该化合物包括抗-VEGF-C或抗-VEGF-D抗体或者包含其抗原结合片段的多肽。在相关变化形式中，本发明包含中断下游细胞内Flt4信号传导，从而抑制Flt4功能的治疗方法。
在一个优选的变化中，该化合物还含有一个在本文别处描述的检测标记，或者细胞毒性剂。举例性的细胞毒性剂包括植物毒素(例如，蓖麻毒蛋白，皂草素)，细菌或真菌毒素，放射性同位素(例如，211-砹，212-铋，90-钇，131-碘，99m-锝，和本文所述的其它元素)，抗-代谢药物(例如，氨甲蝶呤，5-氟脱氧尿苷)，烷基化试剂(例如，苯丁酸氮芥)，抗有丝分裂剂(例如，长春花生物碱)，和DNA插入剂(例如，阿霉素)。其它举例性的试剂包括化合物或应用于细胞时诱导DNA损伤的处理。该试剂和因素包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如-照射，X-射线，紫外照射，微波，电子发射等。也描述为“化疗剂”的各种化合物起诱导DNA损伤的作用，其全部打算用于本文公开的结合治疗方法中。预期可使用的化疗剂包括，例如，阿霉素，5-氟尿嘧啶(5FU)，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)，喜树碱，放线菌素-D，丝裂霉素C，顺式铂氨(CDDP)和甚至是过氧化氢。本发明还包含一种或多种DNA损伤剂的组合使用，不论是以辐射为基础还是实际化合物，例如使用X-射线与顺式铂氨或者使用顺式铂氨与表鬼臼毒素吡喃葡糖苷。还有其它试剂为阿霉素(也称为阿霉素doxorubicin)，VP-16(也称为表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)等，柔红霉素(插入DNA中，抑制DNA-介导的RNA聚合酶且抑制DNA合成)；丝裂霉素(也称为突变霉素和/或丝裂霉素-C)；放线菌素D；长春新碱和环磷酰胺；博莱霉素；VP16(表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)；肿瘤坏死因子[TNF]；紫杉醇；苯丙氨酸氮芥；环磷酰胺，苯丁酸氮芥。本发明的肽的给药可在其它试剂处理之前或者之后间隔几分钟到几周进行。在其它试剂和表达构建体分别给药的实施方案中，一般应确保每次给药时间之间的重要时间期限不期满，以便该试剂和以肽为基础的治疗剂仍然能够发挥优势结合效应。在这种情况下，预期可在互相之间大约12-24小时之内施用两种用药程式，更优选在互相之间大约6-12小时之内，最优选仅大约12小时的延迟时间。在一些情况下，为了治疗有效需要延长时间期限，尽管在各次给药之间过去了几天(2，3，4，5，6或7)到几周(1，2，3，4，5，6，7或8)。特别包含用一种或两种试剂的重复治疗。
同样，为了改良用药，该组合物优选还包含药用上可接受的稀释剂，佐剂，或载体介质。
正如本文所作的详细说明，Flt4的表达尽管大量局限于健康成人的淋巴管内皮，但是在围绕至少某些肿瘤的血管系统中已鉴定到Flt4的表达。因此，本发明还包括治疗患有以血管内皮细胞中表达Flt4酪氨酸激酶(Flt4)为特征的肿瘤疾病的哺乳动物生物体的方法，包括步骤给需要该治疗的哺乳动物生物体施用一种组合物，该组合物包含一种有效抑制Flt4配体蛋白质与生物体血管内皮细胞中表达的Flt4的结合的化合物，从而抑制Flt4-介导的血管内皮细胞的增生。特别包含治疗选自癌(例如，乳腺癌)，鳞状细胞癌，淋巴瘤，黑素瘤，和肉瘤的肿瘤疾病。然而，本文详细描述的筛选技术可鉴定以血管内皮细胞中Flt4表达为特征的其它肿瘤将是显而易见的，该肿瘤是对本文所述的抗-Flt4治疗方案敏感的候选肿瘤。特别包含治疗以血管内皮细胞中Flt4的表达为特征的乳腺癌。以血管内皮细胞中Flt4酪氨酸激酶的表达为特征的肿瘤疾病是指与健康组织的血管中正常观察到的不可检测或者几乎不可检测的水平相比其中的Flt4在血管系统中以高得多的水平可鉴定的疾病，正如本文的例证。
化合物的治疗有效量可使用本领域公认的剂量增大和剂量反应试验根据经验确定。用于肿瘤治疗的治疗有效量是指有效减小肿瘤生长的量，或者有效停止肿瘤生长的量，或者有效缩小或完全消除肿瘤的量，且对于接受癌症治疗的患者无不可接受的副作用水平。如果该化合物包含抗体或其它多肽，特别包含的剂量级别为每千克体重0.1至100mg抗体，且更优选1至10mg/kg。对于一般表现出较长的循环半寿期的人源化抗体，特别包含以从每天到每隔1月范围的间隔给药，更优选以每周的间隔，或者每隔1周，或者每隔3周的间隔给药。监测治疗的进展，病人的副作用，和循环抗体水平将为最佳给药方案提供进一步的指导。来自以其它抗体为基础的癌症治疗(例如，抗-HER2，抗-EGF受体)的公开的和正在进行的临床试验的数据也提供了有用的给药方案指导。
对于本文所述的治疗方法，优选的化合物包括含有抗-Flt4抗体的抗原结合片断的多肽，含有可溶性Flt4胞外域片断的多肽。人的和人源化的抗-Flt4抗体是非常优选的。非常优选的Flt4胞外域片断含有Flt4胞外域的配体结合部分。例如，含有Flt4胞外域的前3个免疫球蛋白样结构域的可溶性片断是非常优选的。仅结合Flt4配体，或者与其它肽(例如VEGFR-1或VEGFR-2的免疫球蛋白样结构域)融合时的更小片断也是可预期的。同样，可预料到提高可溶性和/或稳定性，血清半寿期，或其它特征以提高治疗效力的改良。例如，可预料到含有Flt4胞外域和免疫球蛋白Fc肽(特别是IgG1 Fc同种型)之间的融合以提高可溶性和血清半寿期的多肽。[Compare Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95548-553(1998)]。
本发明的治疗方法可预期的优势在于这样的事实，即在健康组织的血管系统中一般不以任何明显的水平表达Flt4。在一个非常优选的实施方案中，治疗性化合物包含双特异性抗体，或其片断，其中该抗体或片断特异性地结合Flt4且特异性地结合血管内皮标记抗原。“血管内皮标记抗原”是指在增生的血管内皮细胞上表达，且优选不在淋巴管内皮细胞上表达的任何细胞表面抗原。举例性的血管内皮标记包括PAL-E[deWaal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1994)]，VEGFR-1和VEGFR-2[Ferrara等，Endocrine Reviews，184-25(1997)]，Tie[Partanen等，Mol.Cell.Biol.，121698-1707(1992)]，endoglin[美国专利号5,776,427，在本文中引用以其整体作为参考]，和von Willebrandt因子。双特异性抗体预期优选定位于表达Flt4和血管内皮标记的肿瘤相关性血管系统上。在一个非常优选的实施方案中，该化合物还包含用于杀死肿瘤细胞和/或杀死供给肿瘤细胞的血管系统的与双特异性抗体偶连的抗肿瘤剂或细胞毒性剂。举例性的试剂包括上文所述的那些试剂，也包括刺激宿主中针对该肿瘤的免疫反应的治疗性蛋白，例如抑制素，细胞因子，趋化因子等。
在替代的实施方案中，该化合物包含识别由Flt4/Flt4配体复合物(例如，由与VEGF-C或VEGF-D结合的Flt4组成的复合物)组成的一个(或多个)表位的抗体(或双特异性抗体)。
与具有抑制血管生成因子的潜力的广谱试剂偶连或者共同给药的治疗性化合物也是可预期的。该试剂包括，例如，可结合肝素抑制血管生成因子的肝素结合药物(例如戊聚糖和苏拉明类似物)；抑制内皮细胞生长和迁移的化学试剂，例如烟曲霉素类似物。目前研究的其它试剂包括Marimastat(BritishBiotech，Annapolis MD；指示非小细胞肺癌，小细胞肺癌和乳腺癌)；AG3340(Agouron，LaJolla，CA；用于多形成胶质细胞瘤)；COL-3(Collagenex，Newtown PA；用于脑肿瘤)；Neovastat(Aetema，Quebec，Canada；用于肾癌和非小细胞肺癌)；BMS-275291(Bristol-Myers Squibb，Wallingford CT；用于转移性非小细胞肺癌)；Thalidomide(Celgen；用于黑素瘤，头和颈癌，卵巢癌，转移性前列腺癌，和卡波西肉瘤；复发性或转移性结肠直肠癌(含有佐剂)；妇科肉瘤，肝癌，多发性骨髓瘤；CLL，复发性或进行性脑癌，多发性骨髓瘤，非小细胞肺癌，非转移性前列腺癌，顽固多发性骨髓瘤，和肾癌)；Squalamine(Magainin Pharmaceuticals Plymouth Meeting，PA；非小细胞癌和卵巢癌)；Endostatin(EntreMEd，Rockville，MD；用于实体瘤)；SU5416(Sugen，San Francisco，CA；复发性头和颈癌，晚期实体瘤，IIIB或IV期乳腺癌；复发性或进行性脑癌(小儿)；卵巢癌，AML；神经胶质瘤，晚期恶性肿瘤，晚期结肠直肠癌，von-Hippel Lindau疾病，晚期软组织癌；前列腺癌，结肠直肠癌，转移性黑素瘤，多发性骨髓瘤，恶性间皮瘤；转移性肾癌，晚期或复发性头和颈癌，转移性结肠直肠癌)；SU6668(Sugen San Francisco，CA；晚期肿瘤)；干扰素-α；抗-VEGF抗体(国家癌症研究所，Bethesda MD；Genentech SanFranscisco，CA；顽固性实体瘤；转移性肾细胞癌，未治疗的晚期结肠直肠癌)；EMD121974(Merck KCgaA，Darmstadt，Germany；HIV相关性卡波西肉瘤，进行性或复发性退行性神经胶质瘤)；白介素12(Genetics Institute，Cambridge，MA；卡波西肉瘤)和IM862(Cytran，Kirkland，WA；卵巢癌，未治疗的结肠和直肠起源的转移癌和卡波西肉瘤)。
也可预期抗-Flt4化合物与前药的偶连可通过抗-Flt4化合物靶向肿瘤血管并随后在肿瘤生长的位置被定向激活(例如，通过照射)。使用该前药的策略具有最小化该药物对表达Flt4的健康淋巴管的副作用的预期优势。
同样，本发明包括治疗患有以在血管内皮细胞中表达Flt4酪氨酸激酶(Flt4)为特征的肿瘤疾病的哺乳动物生物体的方法，包括步骤鉴定患有以在血管内皮细胞中表达Flt4为特征的肿瘤疾病状态的哺乳动物生物体，和给需要该治疗的哺乳动物生物体施用一种组合物，该组合物包含一种有效抑制Flt4配体蛋白质与生物体血管内皮细胞中表达的Flt4结合的化合物，从而抑制Flt4-介导的血管内皮细胞的增生。
本发明还提供了筛选存在Flt4受体酪氨酸激酶蛋白(Flt4)的生物学样品的方法，包括步骤(a)将怀疑含有Flt4的生物学样品与含有Flt4结合化合物的组合物在该化合物可与该生物学样品中的Flt4结合的条件下接触；(b)在可去掉该样品中未与Flt4结合的Flt4结合化合物的条件下洗涤该生物学样品；和(c)通过检测洗涤步骤后的样品中与Flt4受体酪氨酸激酶结合的Flt4结合化合物筛选存在Flt4的样品。优选的是，该化合物含有选自如下组成的组中的多肽(a)含有抗-Flt4抗体的抗原结合片断的多肽；和(b)含有Flt4配体或Flt4结合片断或其类似物的多肽。特异性结合Flt4，且还含有检测标记的抗体是非常优选的。
本发明还涉及造影怀疑含有表达Flt4受体酪氨酸激酶蛋白质(Flt4)之细胞的脊椎动物组织的方法，包含步骤(a)用含有Flt4结合化合物的组合物接触脊椎动物组织；和(b)通过检测与该组织结合的Flt4结合化合物造影组织。优选的是，该组织是人组织，且该方法还包含在接触步骤后和造影步骤前，在可从组织中去掉未结合该组织中Flt4的Flt4化合物的条件下洗涤该组织的步骤。
在有关变化中，本发明提供了造影脊椎动物生物体组织中的肿瘤的方法，包括步骤(a)将怀疑含有肿瘤的脊椎动物组织与含有Flt4结合化合物的组合物接触；(b)检测与所述组织中的细胞结合的Flt4结合化合物；和(c)通过鉴定Flt4结合化合物结合的血管内皮细胞造影实体瘤，其中表达Flt4的血管与组织中肿瘤的存在和位置相关。在一个优选的实施方案中，该方法还包含用特异性结合在淋巴管内皮中基本上不存在的血管内皮标记(例如，PAL-E，VEGFR-1，VEGFR-2)的第二化合物(例如抗体)接触该组织；和检测与该组织中的细胞结合的第二化合物的步骤；其中该造影步骤包括鉴定用Flt4结合化合物和第二化合物标记的血管，且其中用Flt4结合化合物和第二化合物标记的血管与组织中肿瘤的存在和位置相关。可预料到使用第二化合物可帮助医师更迅速地区分表达Flt4的血管与在其表面表达Flt4的正常淋巴管。
本发明还涉及筛选肿瘤疾病状态的方法，包括步骤(a)用含有特异性结合Flt4受体酪氨酸激酶的抗体或抗体片断的组合物接触怀疑具有肿瘤疾病状态的哺乳动物生物体的组织；(b)检测与哺乳动物生物体中的细胞结合的抗体或抗体片断；和(c)从与哺乳动物生物体的细胞结合的抗体的数量或分布筛选肿瘤疾病。如本文所述，在至少一些肿瘤的血管系统中强烈染色Flt4(它在血管系统中通常是不可检测的或者几乎不可检测的)。因此，在一个实施方案中，在筛选步骤中，与血管内皮细胞结合的抗体或抗体片断的检测与肿瘤疾病的存在相关。在该方法中，应明白“检测”是指按本文所述以比相应正常(健康)组织中存在的几乎不可检测或者不可检测的水平明显更高的水平进行的检测。通过与用健康生物体的组织进行的对照进行比较可证实该差别表达。特别包含筛选哺乳动物组织的肿瘤。如上所述，通过给所述的哺乳动物施用特异性结合血管内皮标记的第二化合物可进一步帮助该方法的实施，其中该检测步骤包含检测与新血管内皮细胞结合的所述第一和第二化合物。
从前面所述也可预料到用于本发明方法中的所述各种化合物也打算作为本发明的方面。该化合物包括例如，抗-Flt4抗体和上文所述的双特异性抗体。同样，本文所述的任何化合物(单独或者结合)在制备用于本文所述的治疗或诊断或造影目的的药物中的用途也打算作为本发明的一个方面。该药物还可包含药用上可接受的稀释剂，佐剂，载体等。
同样，本发明包括以有利于其用于实施本发明的方法的方式包装的含有本发明的化合物或组合物的试剂盒。在最简单的实施方案中，该试剂盒包括在诸如密封的瓶或管的容器中包装的，带有粘贴于容器上或包含在包装中的描述该化合物或组合物在实施本发明方法中的使用的标签的本发明的化合物或组合物。优选的是，该化合物或组合物以单位剂量形式包装。在另一实施方案中，本发明的试剂盒包含与在血管内皮细胞表面表达但在淋巴管内皮中基本上不存在的标记(抗原)结合的第二化合物一起包装的Flt4结合化合物。
另外，在肽或多肽用于造影或治疗，和/或使用抗体将在细胞表面的Flt4蛋白表达用作检测，筛选，造影等的靶的情况中描述了本发明的许多方面。诸如含有配体结合性可溶Flt4片断的多肽的蛋白治疗剂的治疗性递送也可用基因治疗的材料和方法完成。例如，将含有编码目的治疗肽的多核苷酸的裸露DNA构建体或基因治疗表达载体构建体传递给需要该治疗的哺乳动物受试者。优选的是，该构建体含有与编码该治疗肽的序列可操作地相连的启动子或其它表达调控序列以启动该治疗肽在体内的表达。在一种变化中，该核酸包裹在脂质体中。在另一变化中，该核酸是诸如逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，痘苗病毒，疱疹病毒的病毒载体，或者开发用于哺乳动物基因治疗方案的其它载体。举例性的治疗方法包括给患者施用含有基因治疗构建体的药用组合物的步骤，或者离体转化或转染细胞并将转化细胞导入患者的步骤。同样，检测细胞或组织的Flt4表达可使用在Northern杂交或在原位杂交试验中与Flt4 mRNA序列特异性杂交的多核苷酸探针；或者通过进行定量PCR或测量样品中的Flt4 mRNA的其它技术进行。
本发明的其它特征和变化对本领域的技术人员而言从包括详细描述的本申请的整体内容将是显而易见的，且所有这些特征打算作为本发明的方面。同样，本文描述的本发明的特征可再组合进也打算作为本发明的方面的其它实施方案中，而不管该特征的组合是否作为本发明的方面或实施方案在上文被具体提及。另外，只有在本文中作为本发明的关键被描述的该限定特征可照此被考虑；不含在本文中未作为关键被描述的限定特征的本发明的变化打算作为本发明的方面。
除了前面所述，作为另一方面，本发明包括以任何方式比上文具体提及的变化范围更窄的本发明的所有实施方案。尽管申请人发明了所附权利要求书的全部范围，但是所附权利要求书并不打算将他人的现有技术成果包含在其范围内。因此，在专利局或其它实体或个人提醒申请人在某权利要求的范围内包含法定现有技术的情况时，申请人保留按适用的专利法行使修改权利的权利以重新限定该权利要求的主题实体以便明确排除该权利要求范围中的该法定现有技术或法定现有技术的显而易见的变化。以该所附权利要求书限定的本发明的变化也打算作为本发明的方面。
附图的简要描述

图1A是Flt4 cDNA克隆结构的图解描述；图1B是Northern杂交凝胶的照片复印件；图2A-F提供了Flt4的结构特征的图解描述和与Flt1酪氨酸激酶序列的比较；图3A是克隆J.1.1和I.1.1的cDNA插入片断3’端的图解描述；图3B是用反义RNA探针与Flt4 RNA的长链和短链形式杂交的放射自显影照片的复印件；图3C是用反义RNA探针与Flt4 RNA的长链和短链形式杂交的放射自显影照片的复印件；图4是显示来自不同物种的DNA样品中Flt4序列的杂交分析的凝胶照片复印件；图5A-5H显示了在管内癌中表达VEGFR-3的血管的免疫组织化学鉴定。在相邻切片(图5A，B)中，VEGFR-3和PAL-E围绕充满癌细胞的导管装饰成相似形式的“项链”血管(箭头)。比较了染色VEGFR-3(图5C)，层粘连蛋白(图5D)，胶原蛋白XVIII(图5E)和SMA(图5F)的另一组相邻切片。双染色PAL-E和VEGFR-3(图5G)并与仅染色VEGFR-3的相邻切片(图5H)进行比较。与病变导管相邻的血管为双阳性(箭头)，而VEGFR-3阳性血管存在于导管间的基质中离病变导管近距离处(箭头)。注意基底层在双染色操作中为PAL-E阳性。放大倍数图5A，B为400倍。图5C，D，E，F为320倍。图5E，F为480倍。
详细描述下面描述了称为Flt4的新受体酪氨酸激酶的克隆，测序和表达。Flt4基因定位于5q35染色体区域上，其中许多生长因子和生长因子受体位于该区域。Flt4的胞外域由包括12个潜在的糖基化位点的7个免疫球蛋白样环组成。根据结构相似性，Flt4和以前已知的Flt1和KDR/FLK1受体组成一个III型酪氨酸激酶的亚家族。Flt4基因表达为5.8kb和4.5kb的mRNAs，发现其区别在于它们的3’端序列且在HEL和DAMI白血病细胞中差别表达。
Wilm′s肿瘤细胞系，成视网膜细胞瘤细胞系，和未分化的畸胎癌细胞系表达Flt4；而分化的畸胎癌细胞为阴性。大多数胎儿组织也表达Flt4 mRNA，其中脾，脑中间带和肺显示出最高水平。在成人组织中，以表达依次下降的顺序在胎盘，肺，肾，心脏和肝脏中发现最高的表达水平。在原位杂交中，Flt4放射自显影颗粒点缀在胎儿肺的内皮细胞上。胎儿组织中Flt4的免疫组织化学染色证实了内皮细胞的染色。与Flt1和KDR比较Flt4的表达方式在18周大的人胎儿组织中区别极大。参见Kaipainen等，J.Exp.Med.，1782077(1993)。
按实施例4和11所述已产生了含有Flt4 cDNA的表达载体并在COS和NIH3T3细胞中表达。
本发明的Flt4 DNAs和多肽可用于纯化Flt4配体，和调节各种器官中内皮细胞的生长和分化。可证实它们在某些疾病的诊断/治疗中也是有价值的。
在下面的描述中，在重组DNA(rDNA)技术中使用的许多术语是广泛使用的。为了提供对说明书和权利要求书，包括对该术语给定的范围的清楚和一致的理解，提供了下列定义。
基因.含有RNA聚合酶模板的DNA序列。从基因转录的RNA可编码或者不编码蛋白质。编码蛋白质的RNA称为信使RNA(mRNA)，且在真核生物中，它由RNA聚合酶II转录。然而，构建含有可转录RNA序列的RNA聚合酶II模板的基因也是已知的，该模板具有与特定mRNA互补的序列，但一般不翻译。该基因构建体本文称为“反义RNA基因”且该RNA转录子称为“反义RNA”。反义RNA一般不能翻译，因为在反义RNA序列中存在翻译终止密码子。
“互补DNA”或“cDNA”基因包括通过逆转录不含插入序列(内含子)的mRNA合成的重组基因。
克隆载体.它是一种质粒或噬菌体DNA或其它DNA序列，能在宿主细胞中自主复制，且其特征在于有一个或少数核酸内切酶识别位点，可在该位点以可确定的方式切割该DNA序列而不丧失该载体的基本生物学功能，且可将DNA剪接进该位点以便使其复制和克隆。该克隆载体可进一步含有适用于鉴定该克隆载体转化的细胞的标记。例如，该标记可以是四环素抗性或氨苄青霉素抗性。术语“载体”有时用于表示“克隆载体”。
表达载体.它是相似于克隆载体且在转化进宿主后能够表达克隆进其中的基因的载体。克隆的基因通常置于诸如启动子序列的某些调控序列的控制下(即，可操作地相连)。表达调控序列可根据该载体设计成在原核还是在真核宿主中表达可操作相连的基因而变化，且还可含有转录元件，例如增强子元件，终止序列，组织特异性元件，和/或翻译起始和终止位点。
本发明涉及重组Flt4蛋白质(短链和长链形式)的表达和这些蛋白质的功能衍生物。
功能衍生物.Flt4蛋白的“功能衍生物”是具有生物学活性(功能或者结构)基本上相似于非重组Flt4蛋白的生物学活性的蛋白质。Flt4蛋白的功能衍生物可含有或者不含诸如共价连接的糖类的翻译后修饰，这取决于该修饰对特定功能的效果的必要性。术语“功能衍生物”打算包括一种分子的“片断”，“变异体”，“类似物”，和“化学衍生物”。
如本文所用，一个分子含有一般不是该分子的一部分的其它化学半分子时称为是另一分子的“化学衍生物”。该半分子可提高该分子的可溶性，吸收率，生物学半寿期等。作为替代，该半分子可降低该分子的毒性和消除或减弱该分子的任一不良副作用等。能介导该效果的半分子在Remington′sPharmaceutical Sciences(1980)中公开。将该半分子偶连到某分子上的方法是本领域熟知的。
片断.诸如Flt4蛋白的分子的“片断”是指该分子的任一部分，例如肽核心区，或肽核心区的变异体。
变异体.诸如Flt4蛋白的分子的“变异体”是指在结构和生物学活性上基本上相似于整个分子或其片断的分子。因此，只要两个分子具有相似活性，即使一个分子的组成或二级，三级，或四级结构与在另一个中所发现的不同，或者即使氨基酸残基的序列不同，它们仍然可认为是本文所用的术语变异体。
类似物.Flt4蛋白或遗传序列的“类似物”是指在功能上基本上相似于Flt4蛋白或本文的遗传序列的蛋白质或遗传序列。
优选实施方案的描述本发明涉及申请人所称的“Flt4”，酪氨酸激酶的受体，编码Flt4的核酸分子(例如，cDNAs，基因组DNAs，RNAs，反义RNAs，等)，从Flt4基因序列及其产物生产Flt4肽或Flt4蛋白质，重组Flt4表达载体，Flt4的类似物和衍生物，以及Flt4和相关蛋白质的诊断和/或治疗用途，Flt4配体，Flt4拮抗剂和抗-Flt4抗体。
重组Flt4的生产通过在合适的宿主细胞中克隆和表达编码Flt4的序列或其功能等价物可生产有生物学活性的Flt4。
使用重组DNA技术生产Flt4可分成一步一步的方法进行描述(1)分离或产生所需Flt4的编码序列(基因)；(2)构建能够指导所需Flt4合成的表达载体；(3)转染或转化能够复制和表达Flt4基因和/或加工该基因产物以产生所需Flt4的合适宿主细胞；和(4)鉴定和纯化所需的Flt4产物。
Flt4基因的分离或产生Flt4或其功能等价物的核苷酸编码序列可用于构建能指导所需Flt4产物表达的重组表达载体。在本发明的该方法的实施中，本文所述的核苷酸序列，或其片断或功能等价物可用于产生能指导重组Flt4产物在合适宿主细胞中表达的重组分子。编码Flt4的核苷酸序列可从产生Flt4-样活性和/或表达编码Flt4的mRNA的各种细胞来源获得。申请人鉴定了许多Flt4的合适人细胞来源，包括人胎盘，白血病细胞和某些肿瘤细胞系。
从该细胞来源分离和纯化的RNA通过cDNA克隆或者通过基因组克隆可获得编码Flt4的序列。例如，Flt4序列可使用本领域熟知的技术从cDNA或基因组DNA材料通过聚合酶链式反应扩增。克隆的cDNA或基因组文库可使用本领域熟知的技术制备且可用与Flt4基因的任一部分基本上互补的核苷酸探针筛选特定的Flt4 DNAs。可选择全长克隆，即含有所需Flt4的完整编码区的那些克隆用于构建表达载体。作为选择，可使用本领域的标准技术通过化学合成全部或部分合成编码Flt4的DNAs。由于核苷酸编码序列的遗传简并性，编码基本上相同或功能上等价的氨基酸序列的其它DNA序列可用于实施本发明的方法。这种Flt4核苷酸序列的改变包括不同核苷酸的缺失，添加或取代，导致该序列编码相同或功能上等价的基因产物。该基因产物可在序列内含有导致沉默改变的氨基酸残基的缺失，添加或取代，从而产生有生物学活性的产物。该氨基酸取代可根据所涉及的残基的极性，电荷，可溶性，疏水性，亲水性和/或两亲性特性的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团或非极性头部基团的氨基酸包括下列氨基酸亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
Flt4表达载体的构建使用该信息，提供了能以合理数量提供Flt4受体酪氨酸激酶的各种重组DNA载体。编码具有本文鉴定的关键结构特征的合成蛋白质以及其它来源的同一家族的蛋白质的有关结构的其它重组DNA载体可使用重组DNA技术的标准技术从Flt4受体酪氨酸激酶cDNA产生。作为该技术的一个例子产生了表达Flt4受体酪氨酸激酶的转化子(见实施例3和4)。可使用新发现的序列和结构信息，通过转染真核细胞以制备Flt4受体酪氨酸激酶及其各种结构域用于生物学目的。
表达Flt4基因产物的转染子或转化子的鉴定含有重组编码序列且表达具有生物学活性的成熟产物的宿主细胞可通过至少4个普通方法鉴定(a)DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-反义RNA杂交；(b)含有或不含“标记”基因功能；(c)通过测量Flt4 mRNA转录子在宿主细胞中的表达评估转录水平；和(d)通过免疫测定法且最终通过其生物学活性的测量检测成熟基因产物。
在第一种方法中，使用含有与Flt4编码序列同源的核苷酸序列的探针通过DNA-DNA杂交可检测插入表达载体中的Flt4编码序列的存在。
在第二种方法中，可根据是否存在某些“标记”基因功能(例如，胸苷激酶活性，抗生素抗性，氨甲蝶呤抗性，转化表型，在杆状病毒中的包函体形成，等)鉴定和选择重组表达载体/宿主系统。例如，如果Flt4编码序列插入载体的标记基因序列内，可通过缺乏标记基因功能鉴定含有该编码序列的重组子。作为选择，可将标记基因与Flt4序列串连置于用于控制Flt4编码序列表达的相同或不同启动子的控制下。响应诱导或选择表达该标记表明表达Flt4编码序列。
在第三种方法中，Flt4编码区的转录活性可通过杂交试验评估。例如，可分离多聚腺苷化RNA并使用与Flt4编码序列或其特定部分同源的探针通过Northern印迹进行分析。作为选择，可提取宿主细胞的总核酸并测定与该探针的杂交。
在第四种方法中，Flt4的表达可通过免疫学评估，例如，通过Western印迹，诸如放射免疫沉淀，酶联免疫测定等的免疫测定法评估。然而，表达系统成功的最终检验包含检测有生物学活性的Flt4基因产物。如果该宿主细胞分泌该基因产物，可测定从培养转染的宿主细胞获得的无细胞培养基的Flt4活性。如果该基因产物不分泌，可测定细胞溶胞产物的该活性。在每种情况下，可使用测量与Flt4结合的配体或Flt4的其它生物学活性的测定法。
Flt4的衍生物，类似物和肽与Flt4相关的衍生物，类似物和肽的生产和使用也是可预料到的且在本发明的范围内。根据具体应用，与天然Flt4相比可增强或减小该衍生物，类似物，或肽的生物学活性。本发明与Flt4相关的衍生物，类似物和肽可通过本领域已知的各种方法产生。在遗传和蛋白质水平上的方法和操作也在本发明的范围内。可使用本领域标准化的肽合成法获得Flt4肽。在蛋白质水平上，可使用许多化学修饰法通过本领域已知的技术产生Flt4-样衍生物，类似物，或肽，该技术包括但不限于内肽酶(例如，溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶等)或外肽酶的特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，氧化等。
优选的衍生物，类似物，和肽是那些保留Flt4配体结合活性的衍生物，类似物，和肽。结合Flt4配体但不转导与其反应的信号的那些衍生物，类似物和肽用作Flt4抑制剂。结合Flt4配体且通过例如，包含细胞内Flt4自身磷酸化的过程转导与其反应的信号的那些衍生物，类似物和肽可与天然Flt4以相同的方式使用。用于该结合和/或自身磷酸化试验的优选Flt4配体是含有按本文所述可从PC-3条件培养基分离的大约23kd多肽的配体。命名为血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的该配体在申请日为1996年8月1日且作为国际公开WO 97/05250公开的PCT专利申请PCT/FI96/00427中，和在其中要求优先权所依据的美国专利申请优先权文件中已被详细鉴定，本文引用所有这些文献以其整体作为参考。
抗-Flt4抗体识别Flt4或有关蛋白的多克隆和单克隆抗体的生产也在本发明的范围内。
可使用本领域已知的各种方法生产抗Flt4表位的多克隆抗体。为了生产抗体，通过注射Flt4或合成Flt4肽可免疫各种宿主动物(包括但不限于兔，小鼠，大鼠等)。可使用各种佐剂增强免疫反应，依赖于宿主物种，佐剂包括但不限于Freund′s(完全和不完全)佐剂，诸如氢氧化铝的矿物胶，诸如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子，油乳化剂，匙孔帽贝血蓝蛋白，二硝基酚的表面活性物质，和诸如BCG(卡介苗)和Corynebacterium parvum的潜在有用的人佐剂。
抗Flt4表位的单克隆抗体可通过使用为在培养物中通过传代细胞系生产抗体分子而提供的任一技术制备。这些技术包括但不限于最初由Kohler等，Nature，256495-497(1975)描述的杂交瘤技术，和最近的人B-细胞杂交瘤技术[Kosbor等，Immunology Today，472(1983)]和EBV-杂交瘤技术[Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss，Inc.，第77-96页(1985)]。抗Flt4的抗体也可从克隆的免疫球蛋白cDNAs在细菌中生产。使用重组噬菌体抗体系统，可在细菌培养物中迅速生产和选择抗体且可遗传改造其结构。
含有该分子独特型的抗体片断可通过已知技术产生。例如，该片断包括但不限于通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片断；通过还原F(ab′)2片断的二硫键产生的Fab′片断，和通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的两个Fab片断。
抗Flt4的抗体在Flt4多肽的亲和纯化中和在Flt4生物合成，代谢和功能的解释中可用于成熟Flt4和Flt4前体和亚组分形式的定性和定量检测。Flt4酪氨酸激酶活性的检测可用作生成和放大该试验中的Flt4特异性信号的酶手段。抗Flt4抗体也可用作诊断和治疗剂。
Flt4，编码Flt4的核酸分子和抗-Flt4的抗体的用途申请人预期本发明的组合物具有各种广泛的用途，包括Flt4，Flt4类似物和衍生物，编码Flt4的核酸分子，反义核酸分子和抗-Flt4抗体的诊断和/或治疗用途。
编码Flt4的核酸分子或其片断可用作检测和定量编码Flt4的mRNAs的探针。利用核酸探针检测含有全部或部分已知基因序列的序列的试验是本领域熟知的。Flt4 mRNA的水平可表示出现和/或存在瘤形成以及其它人类疾病的发作和/或进行。因此，能检测和定量Flt4 mRNA的试验提供了有价值的诊断工具。
反义Flt4 RNA分子在治疗上用于抑制编码Flt4的mRNAs的翻译，其中治疗目的包含需要除去存在的Flt4或者下调其水平。例如，Flt4反义RNA在治疗Flt4与病因相关，例如由于其过度表达的疾病中可用作Flt4拮抗剂。
另外，Flt4反义RNAs在解释Flt4的功能机制中有用。编码Flt4的核酸分子可用于按本申请中的单独描述生产重组Flt4蛋白和相关分子。
抗-Flt4抗体可用于诊断和定量各种情况中的Flt4。例如，抗Flt4各种结构域的抗体可用作Flt4免疫测定或Flt4免疫组织化学评估的基础。Flt4的酪氨酸激酶活性可用于这些试验中作为酶放大反应以产生Flt4信号。抗-Flt4抗体也可用于研究细胞表面的Flt4量。
可生产起Flt4配体兴奋剂或拮抗剂作用的抗体，从而使得调节Flt4的活性成为可能。另外，可通过合成方法或者从随机寡核苷酸通过重组方法产生随机肽并借助于Flt4胞外域选择表现出与Flt4受体特异性结合的肽。也可使用本领域的标准方法使用Flt4胞外域从噬菌体展示文库选择该肽片断。该肽可具有对抗或拮抗活性。Flt4抗体也可与各种化合物偶连后提供有价值的诊断工具用于体内造影表达Flt4的细胞和组织或者肿瘤。
抗Flt4的单克隆抗体可共价或者非共价偶连到合适的超磁性，顺磁性，电子密集性，声波发生性或放射性试剂上以产生定向造影剂。可用蛋白水解或化学处理产生的抗体片断或者通过使用单克隆抗体的表位结合域产生的分子代替完整抗体。然后可将该造影剂用作人体X-射线，磁共振，声波图或闪烁图造影的造影剂用于诊断目的。
Flt4的分子生物学Flt4 cDNA克隆的完整序列在SEQ ID NOs1和3中描述，依赖于两者择一的剪接，伸展长度为4195个或4795个核苷酸且含有1298个或1363个氨基酸的开放阅读框。核苷酸和推定的Flt4氨基酸序列(短链形式)在SEQ IDNOs1和2中表示。图2显示了Flt4氨基酸序列与Flt1酪氨酸激酶氨基酸序列的比较。参见Shibuya等，Oncogene，55 19-524(1990)。
大部分是疏水氨基酸的推定信号肽序列在起始子甲硫氨酸之后。围绕相应ATG的序列与共有翻译起动序列一致[Kozak，Nucl.Acids Res.，158125-8135(1987)]。两个Flt4多肽的推定胞外部分均是775个氨基酸长且含有12个潜在的天冬酰胺连接的糖基化(NXS/T)位点。它还含有表现出对于免疫球蛋白超家族成员的蛋白质所述的间隔方式的一些氨基酸残基[Williams等，Annu.Rev.Immunol.，6381-405(1988)]。它有12个半胱氨酸残基且可组织成7个免疫球蛋白样结构域。如图2所示，鉴定了大致如下的7个免疫球蛋白样结构域Ig-I(SEQ ID NO1，位置158-364；SEQ ID NO2，氨基酸47-115)；Ig-II(SEQ ID NO1，位置479-649；SEQ ID NO2，氨基酸154-210)；Ig-III(SEQ ID NO1，位置761-961；SEQ ID NO2，氨基酸248-314)；Ig-IV(SEQ ID NO1，位置1070-1228；SEQ ID NO2，氨基酸351-403)；Ig-V(SEQ ID NO1，位置1340-1633；SEQ ID NO2，氨基酸441-538)；Ig-VI(SEQ ID NO1，位置1739-1990；SEQ ID NO2，氨基酸574-657)；和Ig-VII(SEQ ID NO1，位置2102-2275；SEQ ID NO2，氨基酸695-752)。推定的Ig-样结构域IV缺少半胱氨酸残基。图2还显示了Flt1胞外域(SEQ.ID No.5)，它是与Flt4最近的人类同源物。从该附图可见Ig-样区域的半胱氨酸残基对比和极相似的组成。
Flt4的胞质结构域通过23个疏水氨基酸残基的推定跨膜区与胞外部分分开。该序列在胞质侧的侧翼是一个碱性区域，认为它是跨膜与胞质结构域之间的连接点。酪氨酸激酶同源性结构域在残基843处开始且包含一个ATP-结合口袋和在Y1068处与c-src的Y416同源的推定自身磷酸化位点(图2)。Flt4的酪氨酸激酶催化结构域由一个大部分疏水且显示出与Flt1无同源性的65个氨基酸的序列(氨基酸944-1008)分成两个亚结构域。与Flt1不同，Flt4在其激酶插入片断中不含酪氨酸残基。
Flt4 mRNA的第二种形式具有编码Flt4蛋白长链形式的择一3’端。
在图3A-C中，表示了通过择一的剪接产生Flt4 mRNA的短链和长链形式。图3A显示了克隆J.1.1和I.1.1的cDNA插入片断3’端的结构示意图。表示了克隆J.1.1的TAG终止密码子以及多聚腺苷化位点(poly A)。克隆I.1.1与克隆J.1.1的区别在于阴影片断(分别是Flt4 mRNA的长链和短链形式)。TAA和polyA表示克隆I.1.1的终止密码子和多聚腺苷化位点。另外，表示了EcoRI和Aval的限制性核酸内切酶的裂解位点。用于cRNA保护分析的克隆I.1.1的256bp EcoRl-AvaI插入片断在下面表示。阴影最重的片断表示用于体外转录反义链的线型化有义RNA模板上的多接头序列。还显示了RNAse保护分析后保护片断的结构示意图。图3B和3C显示了256bp35S-标记的反义RNA探针的放射自显影图，且211和124bp的消化片断表示从所示细胞系(Tera-2是畸胎癌细胞系，这里用视黄酸(RA)处理10天或不处理进行分析)通过多聚腺苷化RNA保护的Flt4 RNA的短链和长链形式。阴性对照泳道表示了用转移RNA保护的结果。注意到Tera-2细胞分化期间Flt4mRNAs的减量调节。克隆13的Tera-2细胞由Dr.C.F.Graham(英国牛津大学动物学系)提供。传代18-40代的细胞用于该试验。细胞在补充了10％胎牛血清和抗生素的Eagle′s极限必需培养基(MEM)中维持。为了诱导分化，将细胞以1.5×103个细胞/cm2的密度涂布在明胶覆盖的组织培养级平皿上。第二天向培养基中加入2×10-6M的RA。在RA存在下培养细胞达10天。
图3A-C中所示的结果表示了由择一的剪接产生的这两个Flt4(短链和长链)形式的羧基末端的产生。
根据其推定的氨基酸序列，Flt4属于III型RTKs。更具体的说，Flt4属于RTKs超家族，在其胞外部分含有7个Ig-环，因此它与含有5个Ig-环的III型RTKs的其它成员不同。Flt4与从人基因组DNA文库作为v-ros-相关性DNA克隆的FLT家族的原型受体，即Flt1[Shibuya等，Oncogene，5519-524(1990)]和从小鼠肝脏造血干细胞富集区克隆的小鼠FLK1受体[Matthews等，Cell，651143-1152(1991)；Matthews等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，889026-9030(1991)]具有最近的同源性。Flt4的胞外域与人Flt1和小鼠FLK1分别显示出33％和37％的氨基酸序列相同性。Flt1和FLK1与Flt4一样在诸如肺，心脏和肾的各种正常组织中广泛表达。另外，最近鉴定的人内皮细胞受体酪氨酸激酶KDR[Terman等，Oncogene，61677-1683(1991)]与Flt4和Flt1家族成员表现出显著的同源性。从可得到的序列资料可计算出KDR与Flt4在酪氨酸激酶(TK)结构域具有81％的相同性。另外，KDR的胞外域也具有7个Ig-环结构且其TK1和TK2结构域与小鼠FLK1受体的相应结构域具有95％和97％的相同性。这表明KDR是小鼠FLK1的人类同源物。
尽管Flt4 TK结构域与Flt1和FLK1/KDR的TK结构域具有大约80％的相同性，但是它与III型RTK的其它受体的TK结构域仅具有大约60％的相同性。由于这些其它受体在胞外区还仅具有5个Ig-样结构域，因此可将Flt4，Flt1和FLK1/KDR分类进III型RTKs内的一个独立的FLT亚家族中。
在PDGFRs，c-fms和c-kit的激酶插入片断中位于序列D/E-D/E-y-M/V-P/D/E-M[Cantley，等，Cell，64281-302(1991)](SEQ.ID NO.6)中的酪氨酸残基是自身磷酸化位点，当磷酸化时，它结合磷脂酰肌醇3’-激酶(PI-3K)的SH2结构域[Reedijk等，EMBO J.，111365-1372(1992)]。令人感兴趣的是，与这些III型RTKs不同，FLT亚家族的成员或Flt3/FLK2受体不含该共有基序。
8个人III型RTK基因聚集在3个不同染色体上。4号染色体上含有c-kit，PDGFR-α和KDR基因[Yarden等，EMBO J.，63341-3351(1987)；Stenman等，Genes，Chromosomes，Cancer，1155-158(1989)；Terman等，Oncogene，61677-1683(1991)]。Flt1和Flt3基因位于染色体13q12上[Satoh等，Jpn.J.Cancer Res.，78772-775(1987)；Rosnet等，Genomics，9380-385(1991)]，而Flt4位于5号染色体的q35带上[Aprelikova等，Cancer Res.，52746-748(1992)]；靠近fms和PDGFR-β基因[Warrington等，Genomics，11701-708(1991)]。在白血病细胞中发现5号染色体的长臂上包含易位。在患有顽固贫血症和大红细胞症的患者骨髓细胞中发现5号染色体的长臂部分缺失[VanDen Berghe等，Nature，251437-439(1974)]。在一些其它骨髓增生性疾病，例如具有过量胚细胞的顽固性贫血症[Swolin等，Blood，58986-993(1981)]，原因不明的骨髓组织转化[Whang-Peng等，Leuk.Res.，241-48(1978)]，慢性骨髓白血病[Tomiyasu等，Cancer Genet.Cytogenet.，2309-315(1980)]，真性红细胞增多症[Van Den Berghe等，Cancer Genet.Cytogenet.，1157-162(1979)]和原发性血小板增多[Nowell等，Cancer，422254-2260(1978)]中发现畸形5q染色体。
关于Flt4 mRNA表达的发现表明其蛋白质产物对于某些白血病细胞是特征性的。已表明存在一些在成巨核细胞和内皮细胞之间共有的鉴别抗原，一个例子是血小板糖蛋白IIIa[Ylanne等，Blood，721478-1486(1988)；Kieffer等，Blood，721209-1215(1988)；Berridge等，Blood，6676-85(1985)]。另外，某些内皮细胞，例如胎儿时期肺和肾的内皮细胞表达Flt4。
为了进一步了解发育期间Flt4的作用，克隆了小鼠Flt4的部分cDNAs。在原位杂交中使用这些探针分析了小鼠发育期间Flt4 mRNA的表达。确定了在血管发生和淋巴系统的血管生成期间表达Flt4。在正常和病理成人组织中也证实了这些发现的相关性，因为在正常和病理学条件下在成人组织的淋巴管内皮细胞中，以及在一些毛细血管后微静脉(HEVs)中都发现了Flt4。
小鼠Flt4 cDNA片段的克隆显示了其推定的氨基酸序列与相应的人序列几乎相同(在研究的两个片段中有大约96％的氨基酸相同性)。小鼠Flt4cDNA相同性的进一步证据从Northern杂交试验获得，其中来自两物种的探针都从小鼠组织产生典型的5.8kb mRNA信号。对从成年小鼠各种组织分离的RNA进行的分析表明在肝，肺，心，脾和肾中表达Flt4，在脑和睾丸中没有或有极少的杂交。这种表达方式类似于由Galland等，Oncogene，81233(1993)早期报道的方式。Rnase保护的结果表明在小鼠发育期间从交配后8.5天的胚胎开始需要Flt4基因，且相对表达水平似乎十分稳定。
对于原位杂交，选择编码胞外域序列的小鼠Flt4 cDNA的两个片段。这样允许清楚地区分相关FLK-1的杂交模式与Flt1受体模式，Flt1与Flt4在胞外区仅显示出极低程度的序列相同性。参见Millauer等，Cell，72835(1993)；Yamaguchi等，Development，118489(1993)；Peters等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908915(1993)；Finnerty等，Oncogene，82293(1993)。
与FLK-1，Flt1，Tie和Tek内皮受体酪氨酸激酶基因相似，Flt4在交配后(p.c.)7.5天的胚胎中不表达。在交配后8.5天的胚胎中，有强烈的Flt4信号位于尿囊，头间充质的成血管细胞，背主动脉，和主静脉中。在心内膜中可见微弱的信号。相反，卵黄囊的成血管细胞为阴性，与FLK-1和Flt1，Tie和Tek不同。参见Korhonen等，Oncogene，8395(1993)；和Peters等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908915(1993)。Flt4的表达局限于静脉系统在11.5天的小鼠胚胎样品中甚至更清楚，而Tie mRNA还在动脉中表达。在交配后12.5天的胚胎中，Flt4信号点缀发育中的静脉和推定的淋巴管内皮，但与内皮Tie受体酪氨酸激酶不同，动脉内皮为阴性。在发育的晚期，Flt4 mRNA变得局限在无血细胞的血管丛，该血管丛代表发育中的淋巴管。在成人组织中只有淋巴管内皮和一些毛细血管后微静脉表达Flt4 mRNA。在淋巴窦和毛细血管后微静脉，转移性淋巴结，和在淋巴管瘤中出现表达增强。
由于解释来自小鼠胚胎的资料存在困难，因此研究了人内皮，因为人类的淋巴系统更明确。另外，可在细胞培养物中研究从各种内皮建立的细胞以观察在体外条件下是否保持Flt4表达的特异性。已知内皮细胞系在体外培养时丧失分化特征。因此，不能不预期它们为Flt4 mRNA阴性。培养的主动脉内皮细胞也不含Flt4 mRNA。然而，从微血管系统和从股静脉和脐静脉生长的人内皮细胞中可获得信号。因此，在细胞培养物中保留了至少一些Flt4表达特异性。
成人组织的原位杂交分析证实了在发育中的小鼠胚胎中观察到的Flt4局限于淋巴系统的结果。在淋巴管内皮和在人淋巴结窦中可见Flt4的表达。令人感兴趣的是，具有立方内皮，显示出运输白细胞到淋巴结功能的一些HEVs也呈Flt4-阳性。另外，平行杂交分析表明与正常淋巴结相比在转移癌的这些结构中Flt4 mRNA水平增强。在淋巴管瘤中Flt4也极显著，淋巴管瘤是由结缔组织基质和生长的有内皮衬里的淋巴导管组成的良性肿瘤。Flt4mRNA局限在这些肿瘤的淋巴管内皮上且在其动脉，静脉和毛细血管中不存在。在人肺中，淋巴管结构是鉴定的唯一Flt4-阳性管。
上述结果表明Flt4是成人组织中的淋巴管和一些毛细血管后微静脉的新标记。该结果也支持了关于淋巴管的静脉起源的理论。Flt4作为一种生长因子受体可参与这些血管的分化和功能。Flt4通过Flt4的配体，即VEGF-C介导的生物学效应的详细鉴定在申请日为1996年8月1日且作为国际公开号WO97/05250被公开的PCT专利申请PCT/FI96/00427中提供。
这些结果与根据本发明的Flt4-结合化合物结合允许选择性地标记淋巴管内皮，特别是通过使用与放射性，电子密集性或其它可见的报道物质偶连的本发明的抗体进行标记。可将含有Flt4受体内化诱导型单克隆抗体或配体的物质注射进淋巴系统，从而将预定的分子转运到淋巴管内皮。也可使用根据本发明的Flt4-结合化合物检测毛细血管后微静脉，特别是表达Flt4受体的水平增强的活化HEVs。根据我们的了解，目前还没有这样的特异性标记可用于淋巴管内皮。
基因治疗本发明还涉及基因治疗方法。具体地说，可将癌症细胞的血管系统或者癌细胞本身与能够给该细胞的血管系统提供诸如本发明的可溶性VEGFR-3片段的治疗肽的表达构建体以达到治疗效果的方式接触。该治疗效果可以是，例如，在肿瘤血管系统中抑制VEGFR-3，抑制血管生成，抑制淋巴管生成，消除，消退或者抑制肿瘤生长，诱导肿瘤或甚至肿瘤细胞本身的血管或淋巴管系统的编程性细胞死亡。
对于这些实施方案，举例性的表达构建体包含病毒或从病毒基因组产生的改造构建体。该表达构建体一般包含编码待表达的基因的核酸且还含有在给药到其上的细胞中引起该基因表达的其它调控区。该调控区包括，例如，启动子，增强子，多聚腺苷化信号等。
现在普遍认识到可使用各种病毒载体将DNA导入细胞中。在该实施方案中，包括含有目的基因的病毒载体的表达构建体可以是腺病毒(参见例如，美国专利号5,824,544；美国专利号5,707,618；美国专利号5,693,509；美国专利号5,670,488；美国专利号5,585,362；分别在本文中引用以供参考)，逆转录病毒(参见例如，美国专利号5,888,502；美国专利号5,830,725；美国专利号5,770,414；美国专利号5,686,278；美国专利号4,861,719，分别在本文中引用以供参考)，腺伴随病毒(参见例如，美国专利号5,474,935；美国专利号5,139,941；美国专利号5,622,856；美国专利号5,658,776；美国专利号5,773,289；美国专利号5,789,390；美国专利号5,834,441；美国专利号5,863,541；美国专利号5,851,521；美国专利号5,252,479，分别在本文中引用以供参考)，腺病毒-腺伴随病毒杂合体(参见例如，美国专利号5,856,152，本文引用以供参考)或痘苗病毒或疱疹病毒(参见例如，美国专利号5,879,934；美国专利号5,849,571；美国专利号5,830,727；美国专利号5,661,033；美国专利号5,328,688，分别在本文中引用以供参考)载体。
在其它实施方案中，包含非病毒传递。它们包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，Virology，52456-467，1973；Chen和Okayama，Mol.Cell Biol.，72745-2752，1987；Rippe等，Mol.Cell Biol.，10689-695，1990)，DEAE-葡聚糖(Gopal，Mol.Cell Biol.，51188-1190，1985)，电穿孔(Tur-Kaspa等，Mol.CellBiol.，6716-718，1986；Potter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817161-7165，1984)，直接显微注射(Harland和Weintraub，J.Cell Biol.，1011094-1099，1985)，DNA-装载的脂质体(Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721185-190，1982；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352，1979；Felgner，Sci Am.276(6)102-6，1997；Felgner，Hum Gene Ther.7(15)1791-3，1996)，细胞超声处理(Fechheimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，848463-8467，1987)，使用高速微粒的基因轰击(Yang等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，879568-9572，1990)，和受体介导的转染(Wu和Wu，J.Biol.Chem.，2624429-4432，1987；Wu和Wu，Biochemistry，27887-892，1988；Wu和Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12159-167，1993)。
在本发明的一个具体实施方案中，表达构建体(或甚至上述的肽)可包埋在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部的水介质为特征的囊状结构。多层脂质体具有被水介质分开的多个脂层。它们在将磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成。脂类成份在形成密闭结构前进行自我重排并在脂双层之间包埋水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，见Liver diseases，targeted diagnosisand therapy using specific receptors and ligands，Wu G，Wu C编，纽约MarcelDekker，第87-104页，1991)。将DNA加入阳离子脂质体中引起从脂质体向光学双折射的液晶压缩球体的拓扑学转变(Radler等，Science，275(5301)810-4，1997)。这些DNA-脂类复合物是用于基因治疗和传递的潜在非病毒载体。
脂质体介导的核酸传递和外源性DNA的体外表达已经非常成功。本发明还包含涉及“脂转染”技术的各种商业方法。在本发明的某些实施方案中，该脂质体可与血凝病毒(HVJ)复合。已经表明这样有利于与细胞膜的融合且促进脂质体包裹的DNA进入细胞(Kaneda等，Science，243375-378，1989)。在其它实施方案中，脂质体可与核内非组蛋白的染色体蛋白质(HMG-1)复合或连接使用(Kato等，J.Biol.Chem.，2663361-3364，1991)。在另一实施方案中，该脂质体可与HVJ和HMG-1两者复合或连接使用。鉴于该表达构建体已经成功用于体外和体内转移和表达核酸，因此它们可适用于本发明。
可用于将编码治疗基因的核酸传递进细胞的其它载体传递系统包括受体介导的传递载体。它们利用了在几乎所有的真核细胞中通过受体介导的胞吞选择性摄取大分子。由于各种受体的细胞类型特异性分布，该传递可具有高度特异性(Wu和Wu，1993，出处同上)。
受体介导的基因定向载体一般由两种成份组成细胞受体特异性配体和DNA结合试剂。一些配体已被用于受体介导的基因转移。最广泛鉴定的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987，出处同上)和转铁蛋白(Wagner等，Proc.Nat′l.Acad Sci.USA，87(9)3410-3414，1990)。最近，识别与ASOR相同的受体的合成新生糖蛋白已被用作基因传递载体(Ferkol等，FASEB J.，71081-1091，1993；Perales等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 914086-4090，1994)且表皮生长因子(EGF)也被用于将基因传递给鳞状癌细胞(Myers，EPO 0273085)。
在其它实施方案中，传递载体可包含配体和脂质体。例如，Nicolau等(Methods Enzymol.，149157-176，1987)采用乳糖苷神经酰胺，半乳糖末端的脱唾液酸神经节苷脂掺入脂质体中并观察到胰岛素基因的肝细胞吸收增加。因此，可行的是通过含有或不含脂质体的各种受体-配体系统也可将编码治疗基因的核酸特异性地传递进特定细胞类型中。
在本发明的另一实施方案中，表达构建体可简单地由裸露的重组DNA或质粒组成。构建体的转移可通过上文提及的物理或化学穿透细胞膜的任一方法进行。它特别适用于体外转移，然而，它也可适合于体内使用。Dubensky等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817529-7533，1984)成功地将CaPO4沉淀形式的多瘤病毒DNA注射进成年和新生小鼠的肝脏和脾，证实了活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，839551-9555，1986)也证实了直接腹膜内注射CaPO4沉淀的质粒导致转染基因的表达。
用于将裸露的DNA表达构建体转移进细胞的本发明的另一实施方案可包含粒子轰击。该方法依赖于将DNA包裹的微粒加速到允许它们穿透细胞膜并进入细胞而不杀死它们的高速度的能力(Klein等，Nature，32770-73，1987)。已经开发了一些用于加速小粒子的装置。一种该装置依赖于高压放电产生电流，该电流再提供动力(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，879568-9572，1990)。所用的微粒由诸如钨或金珠的生物学惰性物质组成。
本领域的技术人员熟知如何将基因传递应用到体内和离体情况中。对于病毒载体，一般会制备病毒载体原种。依赖于病毒的类型和可达到的效价，可给患者传递1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109，1×1010，1×1011或1×1012个感染性颗粒。对于脂质体或其它非病毒配制品通过比较相对吸收效率可推断出相似的数值。作为药用上可接受的组合物的配制品在下文中描述。
可考虑各种传递途径用于各种肿瘤类型。下面关于传递途径的部分包含广泛列举的可能途径。对于几乎任何肿瘤，可考虑全身性传递。这证实对于攻击微观的或转移性癌症特别重要。如果可鉴定分散的肿瘤块，可采用各种直接的，局部性和区域性方法。例如，可用表达载体或蛋白质直接注射肿瘤。在切除术之前，期间或之后可处理肿瘤基底层。切除术之后，一般通过在手术后的位置留下的导管传递该载体。可利用肿瘤血管系统通过注射支持静脉或动脉将该载体导入肿瘤中。也可利用更末梢的血管供给途径。
在一个不同的实施方案中，可考虑离体基因治疗。在离体实施方案中，取出患者的细胞并在体外维持至少一段时间。在该时间期间，传递该治疗，随后将该细胞再导入患者；优选的是，已杀死了样品中的任何肿瘤细胞。
提供下列实施例仅用于举例说明本发明且不以任何方式限制其范围。
实施例1
编码Flt4的cDNA克隆的分离和鉴定材料和方法寡聚-dT引物产生的在噬菌体λgtl 1[由费城儿童医院，PA的MortimerPoncz博士惠赠；Poncz等，Blood，69219-223(1987)]中的人HEL细胞cDNA文库用从相同文库PCR扩增的cDNA片段进行筛选[Aprelikova等，CancerRes.，52746-748(1992)]。鉴定阳性噬斑并按[Sambrook等，MolecularCloning-A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版，(1989)]所述纯化。噬菌体λ的cDNA插入片段作为EcoRI片段被分离并亚克隆进GEM3Zf(+)质粒(Promega)中。分离完整的Flt4蛋白编码区。使用双脱氧链终止法用根据获得的序列设计的寡核苷酸引物测序从HEL-文库分离的3个重叠克隆(图1所示)。在两条链上测序cDNAs的所有部分。使用GCG软件包程序[Devereux等，Nucleic Acids Res.，12387-395(1984)和Apple MacIntosh的Prosite程序]进行序列分析。
图1A显示了分析的Flt4 cDNA克隆的结构示意图。箭头表示用于探测图1B所示的Northern印迹的亚克隆限制性片段(其大小以kb表示)。E＝EcoRI位点，S＝SphI位点。图1B显示了用图1A所示的探针对DAMI和HEL白血病细胞RNAs的Northern杂交分析。
结果从HEL细胞cDNA文库通过PCR克隆方法分离的210bp长的Flt4 cDNA片段用作分子探针以筛选寡聚-dT-引物产生的人红白血病细胞cDNA文库。
对克隆的核苷酸序列分析揭示了一个1298个氨基酸(aa)残基的开放阅读框(SEQ ID NO2，图2)。图中标记的翻译起始子甲硫氨酸被典型的共有序列包围[Kozak，Nucleic Acids Res.，12857-872(1984)]且随后是用于转移进内质网的信号序列特征性的疏水氨基酸序列。
将Flt4的胞外域排列成7个免疫球蛋白样环(图2)。该图还显示了Flt4与Flt1的比较，它们含有非常相似的结构。Flt1的氨基酸序列作为SEQ.IDNO5提供。
氨基酸残基775-798形成疏水链序列，它很可能作为该受体的跨膜结构域起作用，疏水链后面是一些碱性残基，位于该多肽推定的胞质一侧上。近膜结构域有44个残基的长度，在842位氨基酸的酪氨酸激酶序列同源性的开始处之前。由于在65个氨基酸的激酶插入序列上同源性中断，因此该同源性首先在该受体的羧基末端尾的1175位氨基酸处丧失。在氨基酸序列数据库(Swissprot和NBRF)中对有关酪氨酸激酶结构域的检索鉴定了在催化性酪氨酸激酶区分别具有大约80％和60％同源性的Flt1和PDGFRB酪氨酸激酶。
实施例2抗-Flt4抗血清的制备将编码Flt4短链形式的推定C-末端的657个碱基对的EcoRI片段克隆进pGEX-1λT细菌表达载体(Pharmacia)中含有谷胱甘肽-S-转移酶编码区的阅读框中以便在大肠杆菌中产生GST-Flt4融合蛋白。在细菌中生产所得的融合蛋白并通过谷胱甘肽亲和色谱法按照厂商的指导进行部分纯化。使用该蛋白质免疫家兔以便产生抗Flt4的多克隆抗体。使用第三次加强免疫后的抗血清。
实施例3Flt4在COS细胞中的表达材料和方法将全长Flt4蛋白的编码序列(从3个克隆组合，图1)插入SVpoly哺乳动物表达载体[Stacey等，Nucleic Acids Res.，182829(1990)]的HindIII-BamHI位点构建SV14-2。将该表达载体(SV-FLT4短链和SV-FLT4长链，含有各自形式的Flt4 cDNA)通过DEAE-葡聚糖转染法[McCutchanetal.，J.Natl.Cancer Inst.，41.351-357(1968)]导入COS细胞中。转染2天后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞并刮擦进免疫沉淀缓冲液(10mM Tris pH7.5，50mMNaCl，0.5％脱氧胆酸钠，0.5％ Nonidet P40，0.1％SDS，0.1TIU/ml抑肽酶)中。超声处理溶胞产物，在10,000xg下离心15分钟并与3ml抗血清在冰上温育过夜。加入蛋白A琼脂糖(Pharmacia)并在旋转条件下继续温育30分钟。沉淀物用免疫沉淀缓冲液洗涤4次，用PBS洗涤一次且在SDS-PAGE分析前用水洗涤一次。
结果通过将全长Flt4短链和长链蛋白的编码区克隆进pSVpoly表达载体的HindIII-BamHI位点并将这些表达载体转染进COS细胞检验Flt4 cDNA序列的预期结构。这两个构建体产生的蛋白质区别在于其C-末端长链形式含有额外的65个氨基酸。转染2天后，裂解细胞并使用针对含有预期Flt4蛋白短链形式的40个羧基末端氨基酸残基(即，Flt4的短链和长链形式共有的部分)的GST-Flt4融合蛋白产生的抗体进行免疫沉淀。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析免疫沉淀的多肽。免疫前的血清没有显示出任何特异性带，而Flt4-特异性抗体识别大约170和190KD的两条带。这两条带代表Flt4蛋白的不同糖基化形式。
实施例4Flt4在NIH3T3细胞中的表达材料和方法将全长Flt4 cDNA(短链形式)亚克隆进含有莫洛尼鼠类白血病毒长末端重复启动子的LTRpoly载体(参见Makela，等，Gene，118293-294(1992)，公开了质粒载体pLTRpoly，具有ATCC保藏号77109和GeneBank登录号X60280)中。该LTR-FLT4表达载体与pSV2neo标记质粒用于共转染NIH3T3细胞，分析G418抗性克隆的Flt4表达。
对于Western免疫印迹分析，将一个汇合的大平板上的细胞在2.5％SDS，125mM Tris，pH6.5中裂解。细胞溶胞产物在SDS-PAGE上电泳并电印迹到硝酸纤维素膜上。用针对Flt4羧基末端肽产生的抗血清温育膜，并使用辣根过氧化物酶偶连的猪抗兔抗血清(Dako)和ECL试剂(Amersham)观察结合的抗体。对于代谢标记，用100μCi/ml35S-甲硫氨酸标记培养物1小时。标记后，洗涤细胞两次并在其生长培养基中培养1或2小时，裂解，用抗-Flt4抗体免疫沉淀，并通过SDS-PAGE和自动荧光术分析。
结果在Flt4短链形式转染的NIH3T3细胞中可检测到170和190KD的多肽，但在仅用pSV2neo转染的细胞中没有。除了这两条带外，在产生Flt4的克隆中观察到大约120Kd的主要带。代谢标记和脉冲追踪实验表明作为Flt4多肽短链形式的翻译后加工的结果产生该蛋白质。
实施例5Flt4基因座的染色体定位由于已经观察到一些III型受体基因的聚集，因此测定Flt4的染色体定位具有重大意义。因此，分析了啮齿类-人杂交细胞，表明Flt4与人5号染色体连锁。
使用携带部分5号染色体的杂交细胞确定了Flt4基因位于5q33-＞5qter区。通过滤膜杂交检验这些杂交细胞中Flt4基因座的存在。Flt4-阳性杂交细胞共有的且在Flt4-阴性杂交细胞中不存在的5号染色体区域是5q33.1-qter。因此在杂交细胞中人染色体5q33-qter与Flt4序列的存在相关。该区域定位结果表明Flt4基因座与CSF1R/血-小板衍生生长因子受体-β(PDGFRB)基因座以及与β-肾上腺素能受体(ADRBR)基因座远端聚集(telomeric)，因为这些基因座均存在于Flt4阴性的杂交细胞GB13中。
实施例6Flt4 mRNA在肿瘤细胞系和内皮细胞中的表达用于本试验的白血病细胞系(K562)在一些以前的文献中已有报导；[Lozzio等，Blood，45321-334(1975)]，HL-60[Collins等，Nature，270347-349(1977)]，HEL[Martin等，Science，2161233-1235(1982)]，DAMI[Greenberg等，Blood，721968-1977(1988)]，MOLT-4[Minowada等，J.Natl.Cancer Inst.，49891-895(1972)]，Jurkat[Schwenk等，Blut，31299-306(1975)]，U937[Sundstrom等，Int.J.Cancer，17565-577(1976)]，KG-1[Koeffler等，Science，2001153-1154(1978)]，JOK-1[Andersson等，1982，见R.F.Revoltella(编)，Expression of Differentiated Functions in Cancer Cells，239-245，Raven Press，纽约]和ML-2[Gahmberg等，1985，见L.C.Anderson，等(编)，Gene Expression During Normal and Malignant Differentiation，107-123，Academic Press，London]。还分析了从美国典型培养物保藏中心获得的下列肿瘤细胞系JEG-3，绒毛膜癌；A204，横纹肌肉瘤；SK-NEP-1，肾胚细胞瘤；BT-474，乳腺癌；Y79，成视网膜细胞瘤。白血病细胞在含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素的RPMI中生长。Dami细胞在含有10％马血清的Iscove′s改良的DMEM中培养。通过融合第一代人脐静脉内皮细胞与A549肺癌细胞获得的永久内皮杂交细胞系(EAhy926)[Edgell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，503734-3737(1983)]在含有10％FCS和抗生素的DMEM-HAT培养基中培养。
按[Sambrook等，见上文]所述从该细胞系提取Poly(A)+RNA。5μg的Poly(A)+RNA样品在含有甲醛的琼脂糖凝胶中电泳并使用标准条件印迹[Sambrook等，见上文]。Flt4 cDNA克隆的插入片断通过随机引物方法标记并与该印迹杂交。杂交在50％甲酰胺，5x Denhardt′s溶液(100x Denhardt′s溶液是Ficoll，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)，5x SSPE(3M NaCl，200mM NaH2PO4·H2O，20mM EDTA，pH7.0)，0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)，和0.1mg/ml超声处理的鲑精DNA中42℃下18-24小时。滤膜在1x SSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)，0.1％ SDS中65℃下洗涤并用柯达XAR-5胶片曝光。
用从8个白血病细胞系(HEL，K562，DAMI，U937，MOLT4，HL60，Jurkat，和KG-1)和内皮杂交细胞系(EAhy926)提取的poly(A)+RNA进行Northern分析。用GAPDH探针进行的杂交用作内部对照用于上样等量的RNA进行分析。只有HEL红白血病细胞，和DAMI成巨核细胞白血病细胞表达5.8kb和4.5kb的Flt4 mRNA。K562红白血病，Jurkat和MOLT-4 T-细胞白血病，以及HL-60前髓细胞白血病，U937单核细胞白血病，和KG-1髓细胞样白血病细胞为Flt4 mRNA阴性。
用从5个肿瘤细胞系(JEG-3，A-204，SK-NEP-1，BT-474，和Y79)和两个上述白血病细胞系(JOK-1，MOLT4)提取的poly(A)+RNA进行Northern分析。标记的S2.5 cDNA克隆(见图1)用作杂交探针。用β-肌动蛋白探针进行的杂交用作内部对照用于上样等量的RNA进行分析。只有SK-NEP-1nefroblastoma和Y79成视网膜细胞瘤细胞观察到含有Flt4转录子。
用载体(-)或视黄酸(+)处理10天后分析Tera-2畸胎癌细胞以诱导神经元分化[Thompson等，J.Cell Sci.，7237-64(1984)]。在对从该细胞分离的poly(A)+RNA进行的Northern印迹分析中，发现未分化的细胞表达5.8kb和4.7kb的Flt4 mRNAs，但在分化10天后，在Northern印迹和杂交中检测不到Flt4 mRNA。这些结果表明在这些细胞的分化期间减量调节Flt4。
在未分化的和TPA-分化的HEL细胞中也分析了Flt4 mRNA的表达。HEL和DAMI细胞系都具有双重成红细胞/成巨核细胞表型且可通过用肿瘤促进剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)处理诱导成巨核细胞标记的进一步表达。我们分析了在其分化期间在这些细胞中是否刺激Flt4的表达。用TPA或用于溶解它的DMSO处理2天后分析HEL细胞。剥离Flt4信号后，用Rb-1和β-肌动蛋白cDNAs探测该滤膜以证实泳道的均等上样。根据放射自显影的光密度计扫描分析和相对于GAPDH基因的组成型表达的标准化(normalization)，测定了在TPA诱导的HEL细胞中，当该细胞进行成巨核细胞分化时Flt4 mRNA水平增加大约3.4倍。
实施例7胎儿肺中的Flt4表达在原位杂交中在芬兰中央医院大学和Turku大学的联合伦理委员会的许可下获得了15周年龄的人胎儿肺组织。该样品在4℃下在10％的福尔马林中固定18小时，脱水，包埋于蜡中，并切成6μm的切片。使用SP6和T7聚合酶和[35S]-UTP从线形化质粒DNA中产生206和157个碱基(反义和有义)的RNA探针。按照Wilkinson等，Development，99493-500(1987)；Wilkinson，Cell，5079-88(1987)所述对切片进行原位杂交，使用下列改良1)在石蜡包埋前使用二甲苯代替甲苯；2)切成6μm的切片，放在用2％3-氨丙基-三乙氧基甲硅烷(Sigma)预处理的载玻片表面的二乙基焦碳酸酯处理的水层上；3)省去对该探针的碱性水解；4)杂交混合物含有60％的去离子甲酰胺；5)高度严格条件洗涤是在含有50mM DTT和1x SSC的溶液中在65℃下80分钟；6)该切片用NTB-2乳剂(Kodak)覆盖且在4℃下储存。曝光14天后，载玻片在柯达D-19显影剂中显影2.5分钟并用Unifix(柯达)固定5分钟。切片用溶于水中的苏木精染色。
在使用反义探针的杂交试验中，主要在15周年龄的胎儿肺的某些内皮细胞中观察到Flt4 mRNA。用有义链探针和用RNAse A-处理的切片进行的对照杂交中未产生超出背景的信号。
对于免疫过氧化物酶染色，使用1∶100稀释的抗-Flt4抗体，过氧化物酶偶连的猪抗-兔抗体和本领域的标准方法。用免疫前的血清或免疫原封闭的血清的对照染色未产生信号。分析了17周年龄的人胎儿肺组织，结果与原位杂交实验中的那些mRNA一致某些肺大血管的内皮用兔抗-Flt4抗血清染色为阳性。
实施例8在非人哺乳动物物种中鉴定Flt4基因在图4中，显示了在不同物种DNA中检查Flt4序列存在的实验结果。为了揭示Flt4基因在进化中的保守程度，将2.5kb的cDNA片断(见图1)与从不同动物和酵母中纯化且用EcoRI消化的基因组DNAs杂交。该杂交溶液包含50％的甲酰胺，5x Denhardt′s溶液(100x Denhadt′s溶液是Ficoll，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)，5x磷酸钠盐溶液-EDTA(3M NaCl，200mM NaH2PO4-H2O，20mM EDTA，pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸钠，和0.1mg/ml超声处理的鲑精DNA。在42℃下进行杂交24小时。滤膜在1x标准柠檬酸盐溶液(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)和0.1％十二烷基磺酸钠中65℃下洗涤且用柯达XAR-5胶片曝光。在猴，大鼠，小鼠，狗，奶牛，兔，和鸡DNAs中发现了特异性带，但酵母DNA未产生信号。从鹌鹑中已经分离出Flt4 cDNA。参见Eichmann等，Gene，174(1)3-8(1996年9月26日)和Genbank登录号X83287。
实施例9Flt4基因在成人组织中的表达使用心脏，脑，胎盘，肺，肝脏，骨骼肌，肾和胰腺组织的2μgpoly(A)+RNA(Multiple Tissue Northern Blot，Clontech Inc.)通过与Flt4 cDNA探针杂交分析成人组织中的Flt4 mRNA表达。用组成型表达的基因的探针进行的对照杂交显示出泳道均匀上样。
各种人组织的poly(A)+RNA与Flt4 cDNA片断的杂交显示出在胎盘，肺，心脏和肾中有5.8和4.5kb迁移率的mRNA带和6.2kb的微弱标记带。在肝脏和骨骼肌中可见微弱的mRNA带，而胰腺和脑中即使含有Flt4 RNA，也似乎含量极少。
实施例10人胎儿组织中的Flt4表达为了检查人胎儿组织中的Flt4 mRNA表达，将含有来自16-19周人胎儿的下列组织的总RNA的Northern印迹与1.9kb Flt4 cDNA片断(见图1)杂交且所得的放射自显影用光密度计扫描。从相应的溴化乙锭(EtBr)染色凝胶的紫外照片估计RNA的量对该结果进行标准化。下列符号表示依次递增的mRNA水平-，+，++，+++。
表1胎儿组织mRNA脑脑膜 +皮层板++中间带+++室管膜区 +小脑 ++脉络丛+肝脏 +胰腺 +小肠 -心脏 +肺+++肾++肾上腺++皮肤 ++脾脏 +++胸腺 -人胎儿组织的分析表明除了胸腺和小肠外均含有Flt4转录子。在肺和脾脏中发现最高的表达水平。
实施例11Flt4表达载体全长Flt4 cDNA(短链形式)通过如下方式产生a)将SphI-裂解的Flt4 PCR片断[使用引物寡核苷酸5′-ACATGCATGCCACCATGCAGCGGGGCGCCGCGCTGTGCCTGCGACTGTGGCTCTGCCTGGGACTCCTGGA-3′(SEQ.IDNO.7)(正向)和5′-ACATGCATGCCCCGCCGGTCATCC-3′(反向)(SEQ.IDNO.8)从S2.5kb克隆(见图1)扩增]连接到S2.5kb片断的5’端，使用两个SphI位点亚克隆进pSP73载体(Promega)；b)将用寡核苷酸引物5′-CGGAATTCCCCATGACCCCAAC-3′(SEQ.ID NO.9)(正向)和5′-CCATCGATGGATCCTACCTG AAGCCGCTTTCTT-3′(SEQ.ID NO.10)(反向)从0.6kb EcoRI片断(见图1)扩增的含有最后138个碱基的PCR片断使用EcoRI和BamHI位点连接到构建体a)的3’端；c)在构建体b)的EcoRI位点连接1.2kb的EcoRI片断；d)将所得的全长HindIII-BamHI片断连接进HindIII-BamHI裂解的SV-poly表达载体[Stacey等，Nucl.Acids Res.，182829(1990)]中。
实施例12Flt4配体的鉴定在不含胎牛血清(FBS)的F12培养基中培养7天的PC-3前列腺癌细胞系(ATCC CRL 1435)中得到的条件培养基通过以16,000xg离心20分钟澄清并筛选诱导Flt4酪氨酸磷酸化的能力。
将重组表达Flt4的NIH3T3-细胞(见实施例13)再接种到5cm直径的细胞培养皿上并在含有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco′s改良极限必需培养基(DMEM)中生长至汇合。汇合细胞在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤两次并在DMEM/0.2％牛血清白蛋白中饥饿过夜。为了进行刺激，用1ml条件培养基代替饥饿培养基且细胞在37℃下培养5分钟。
用PC-3条件培养基刺激后，将含有该细胞的培养板放在冰上并用含有100mM NaVO4的Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl洗涤两次。从培养皿上去掉该洗涤溶液并在含有抑肽酶，1mM PMSF和1mM NaVO4的RIPA缓冲液[10mM Tris-HCl pH7.5，50mM NaCl，0.5％脱氧胆酸钠，0.5％ Nonidet P40，0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)]中裂解该细胞，超声处理该溶胞产物10秒两次。然后以16,000xg离心该溶胞产物30分钟，将上清转移到新试管中并用于免疫沉淀。
抗Flt4 C-末端的多克隆抗体(上文所述)可用于免疫沉淀。将细胞溶胞产物的上清用2至4μl兔多克隆抗-Flt4抗血清在冰上温育2小时。加入大约30μl50％(vol/vol)的蛋白质A-Sepharose(Pharmacia)的PBS溶液，在+4℃旋转条件下继续温育45分钟。用RIPA缓冲液洗涤免疫沉淀3次并用PBS洗涤一次。然后在7.5％凝胶中对免疫沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并印迹到硝酸纤维素膜上。用单克隆抗磷酸酪氨酸抗体(anti-P-Tyr)(1∶2000稀释的PT-66 Sigma，cat.P-3300)温育Western印迹，接着用过氧化物酶偶连的兔抗小鼠抗体(1∶1000稀释，Dako，cat.P 161)使用化学发光检测系统(Amersham)进行检测。在有些情况下，在50℃的100mM 2-巯基乙醇，2％ SDS，62.5mM Tris-HCl pH6.7中偶尔搅拌的条件下剥离印迹30分钟以清除以前的信号并用抗-Flt4抗体(1∶1000稀释)再染色，接着用过氧化物酶偶连的猪抗兔抗体(1∶1000稀释，Dako，P217)染色。作为Flt4的酪氨酸磷酸化的阳性对照，使用以100mM酪氨酰磷酸酶抑制剂过钒酸钠(PerVO4)处理20分钟的表达Flt4的NIH3T3细胞的抗-Flt4免疫沉淀。通过向细胞培养基中加入100mM(终浓度)的正钒酸钠和2mM(终浓度)的过氧化氢并在37℃下5％CO2中培养细胞20分钟进行细胞的过钒酸钠处理。该操作导致产生钒酸盐的过氧化形式(氧钒基氢过氧化物)，它是活细胞中蛋白质酪氨酸磷酸酶的非常有效的抑制剂。
PC-3细胞的条件培养基刺激120kD多肽的酪氨酸磷酸化，该多肽与Flt4的酪氨酸磷酸化的加工后的成熟形式共同迁移。用抗-Flt4抗体再染色印迹后可证实该共同迁移。
为了证实120kD多肽不是该条件培养基的非特异性成份，通过SDS-PAGE分离15ml的条件培养基，印迹到硝化纤维素上，并用anti-P-Tyr抗体染色印迹。检测到一些多肽，但它们中没有一个与Flt4共同迁移，表明120kD带确实是从刺激细胞免疫沉淀的酪氨酸磷酸化蛋白。通过用肝素琼脂糖CL-6B(Pharmacia)在室温下预处理2小时的PC-3条件培养基的刺激分析(泳道3)表明Flt4配体不与肝素结合。
非条件培养基不诱导Flt4自身磷酸化。另外，未转染的NIH3T3细胞和用FGFR-4转染的NIH3T3细胞用来自PC-3细胞的条件培养基刺激时都没有表现出120KD多肽的酪氨酸磷酸化。当使用Centricon-10浓缩器(Amicon)将PC-3条件培养基浓缩4倍时刺激活性大量增加。另外，浓缩后获得的流走液含有分子量不超过10,000(＜10,000)的蛋白质，不能刺激Flt4的磷酸化。用50ml偶连到CNBr-活化的琼脂糖上的Flt4胞外域(Flt4EC-6xHis，见下文)(1mg/ml)按厂商的指导预处理PC-3细胞的浓缩条件培养基完全消除Flt4的酪氨酸磷酸化。用琼脂糖CL-4B同样预处理该条件培养基不影响其刺激活性。
这些数据证实PC-3细胞产生Flt4的可溶性配体。上述实验证实了该配体与重组Flt4 EC结构域结合。因此，可使用重组Flt4 EC结构域在亲和色谱中纯化该配体。纯化的蛋白质可在SDS-PAGE中电泳，印迹到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上并通过本领域的标准方法可测定其氨基末端序列。另外，可将纯化的配体消化成肽用于其氨基末端序列的测定。从该纯化的蛋白质获得的肽序列用于合成编码该序列的寡核苷酸的混合物。可放射性标记该寡核苷酸及其互补DNA链配对物并用于筛选从PC-3细胞制备的cDNA文库以获得编码该配体的cDNA，这些都通过本领域的标准方法进行(Wen等，Cell 69559-572(1992))。作为选择，该寡核苷酸及其配对物可用作聚合酶链式反应(PCR)中的引物以便使用从PC-3细胞RNA制备的cDNA作模板扩增编码该配体的序列。该cDNA合成和PCR(RT-PCR)的方法是本领域的标准方法(Innis等，1990，PCR protocols，Academic Press；McPherson，M.J.等，1991，PCR，a practical approach，IRL Press；Partanen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，878913-8917(1990))。另一选择是通过使用克隆进真核表达载体(例如，使用提供的Invitrogen Librarian克隆试剂盒和载体，例如pcDNA I或pcDNA III)的cDNAs并用Flt4-碱性磷酸酶(Cheng和Flanagan，Cell，79157-168，(1994))，Flt4-免疫球蛋白(Flt4-Ig)(Lyman等，Cell，751157-1167(1993))，或相似的亲和试剂通过本领域的标准方法筛选转染进例如，COS细胞的该文库从PC-3细胞克隆Flt4配体。
实施例13细胞系和转染NIH3T3细胞和293-EBNA细胞(Invitrogen)在含有10％ FCS的DMEM中培养。为了稳定表达，用LTR-FLT41载体与pSV-neo载体(见上文实施例4)一起通过使用DOTAP转染试剂(Boehringer-Mannheim)的脂转染法转染NIH3T3细胞，其中Flt4 cDNA在莫洛尼鼠类白血病毒LTR启动子的控制下表达。COS-1细胞通过DEAE葡聚糖方法(McClutchan和Pagano，J.Natl.Cancer Inst.，41351-35(1968))转染。转染细胞在500mg/ml新霉素中选择。
实施例14Flt4融合蛋白的构建和表达pVTBac-FLT4EC-6xHis融合构建体。编码Flt4的cDNA末端修饰如下编码胞外域(EC)的Flt4 cDNA序列3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO13，SalI位点下划线，含有相应于SEQ ID NO1的核苷酸2184-2204的序列)和编码用于结合Ni-NTA柱(Qiagen，Hilden，Germany)的6个组氨酸残基和接着的终止密码子的5′CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3′(SEQ ID NO14，BamHI位点下划线，含有与SEQ ID NO1的核苷酸2341-2324互补的序列)进行扩增。该扩增的片断用SalI和BamHI消化并作为SalI-BamHI片断连接进LTR-FLT41载体(见实施例4)，代替含有编码Flt4跨膜和胞质结构域的序列的单一SalI-BamHI片断。
无Flt4信号序列编码区的Flt4 cDNA 5’端使用寡核苷酸5′-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3′(SEQ ID NO11，HindIII和BamHI位点下划线，含有相应于SEQ ID NO1的核苷酸86-103的序列)和5′-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3′(SEQ ID NO12，含有与SEQ ID NO1的核苷酸700-681互补的序列)通过PCR扩增。该扩增片断(含有SEQ ID NO1的核苷酸86-700)用HindIII和SphI消化(相应于SEQ ID NO1的核苷酸588-593的SphI位点在Flt4 cDNA的扩增区内)。
所得的HindIII-SphI片断用于代替刚在上文所述的修饰的LTR-FLT41载体中的HindIII-SphI片断(HindIII位点在Flt4插入片断与该载体的pLTRpoly部分的接头5’端，SphI位点在Flt4 cDNA中且相应于SEQ ID NO1的核苷酸588-593)。然后所得的Flt4EC-6xHis插入片断作为BamHI片断连接进pVTBac质粒的BamHI位点(Tessier等，Gene 98177-183(1991))。该构建体与杆状病毒基因组DNA一起通过脂转染法转染进SF-9细胞。产生重组病毒并用于感染High-Five细胞(Invitrogen)。
Flt4-AP融合构建体。编码Flt4 EC结构域的序列的3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO15)和5′-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3′(SEQ ID NO16)进行扩增并作为SalI-BamHI片断连接进LTR-FLT41载体，代替编码跨膜和胞质结构域的序列。然后所得的插入片断作为HindIII-BamHI片断连接进质粒APtag-1的HindIII-BglII位点，位于碱性磷酸酶编码区的阅读框中(Flanagan和Leder，1990，Cell63，185-194)。用该Flt4-AP构建体和pSV2neo(Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1327-341(1982))通过使用DOTAP转染试剂(Boehringer)的脂转染法共转染NIH3T3细胞并在500mg/ml新霉素存在下选择转染细胞。通过染色碱性磷酸酶活性的比色反应检测生产进该培养基中的重组蛋白(Cheng和Flanagan，Cell 79.157-168(1994))。
Flt4-Ig构建体。编码Flt4-免疫球蛋白嵌合体的重组DNA构建如下。编码Flt4的cDNA 5’端，包括编码信号序列的Flt4核苷酸使用引物5′-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCA GCGGGGCGCC-3′(SEQ ID NO17)和5′-GTTGCCTGTGAT GTGCACCA-3′(SEQ ID NO18)通过PCR进行扩增并作为HindIII-SphI片断连接进LTR-FLT41载体。Flt4 EC-编码序列的3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO19)和5′-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCT GCCCTTATCCTCG-3′(SEQ ID NO20)进行扩增并作为SalI-BamHI片断连接进LTR-FLT41载体代替编码跨膜和胞质结构域的序列。含有剪接供体位点的该Flt4 EC插入片断首先连接进含有编码人免疫球蛋白重链铰链的外显子和恒定区外显子的pHγCE2(Karjalainen，K.，TIBTECH，9109-113(1991))中。然后将含有Flt4-Ig嵌合体的EcoRI-BamHI插入片断通过本领域的标准方法(Klenow)钝端化并连接进pREP7(Invitrogen)的钝端化HindIII位点中。将该构建体通过磷酸钙沉淀法转染进293-EBNA细胞中且该条件培养基用于通过蛋白质A-琼脂糖亲和色谱法分离Flt4-Ig蛋白质。
实施例15-17Flt4配体的纯化和测序在血清耗尽条件下由PC-3细胞产生的细胞培养物上清使用Centriprep过滤筒浓缩30-50倍并上样到固定Flt4胞外域的柱子上。使用可供选择的构建体和方法制备两种亲和性基质。在第一种情况下，Flt4EC-6xHis融合蛋白与CNBr-活化的琼脂糖4B(Pharmacia)交联，在第二种情况下，Flt4-Ig融合蛋白与蛋白质A琼脂糖使用二甲基庚二酸(dimethylpimelidate)偶连(Schneider等，1982，J.Biol.Chem.25710766-10769)。从亲和柱上洗脱的物质使用离子交换和反相高压色谱法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化。检验色谱馏分刺激Flt4的酪氨酸磷酸化的能力。微量测序纯化的生物学活性配体蛋白并根据获得的氨基酸序列制备简并寡核苷酸用于从例如，PC-3细胞分离的poly(A)+RNA产生的cDNA文库中分离和克隆编码该配体的cDNA。
命名为血管内皮生长因子C(VEGF-C)的Flt4配体的详细鉴定，以及天然人，非人哺乳动物，和鸟类编码VEGF-C的多核苷酸序列，和VEGF-C变异体和类似物在1998年2月2日申请的国际专利申请号PCT/US98/01973(作为国际公开号WO 98/33917于1998年8月6日公开)；Joukov等，J.Biol.Chem.，273(12)6599-6602(1998)；Joukov等，EMBO J.，16(13)3898-3911(1997)；和在1996年8月1日申请的国际专利申请号PCT/FI96/00427(作为国际公开号WO 97/05250公开)中提供，本文引用所有这些文献以其整体作为参考。正如其中的详细说明，人VEGF-C开始作为419个氨基酸的prepro-VEGF-C多肽在人细胞中产生。人prepro-VEGF-C的氨基酸序列在SEQ ID NO21中提供，且编码人VEGF-C的cDNA根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209(USA)(保藏日期为1995年7月24日且ATCC保藏号为97231)。其它物种的VEGF-C序列也有报导。例如，见Genbank登录号MMU73620(Mus musculus)；和CCY15837(Coturnix coturnix)，本文引用以供参考。
prepro-VEGF-C多肽在多个阶段中加工以产生大约21-23KD(通过在还原条件下的SDS-PAGE估计)的成熟且最有活性的VEGF-C多肽。该加工包括裂解信号肽(SEQ ID NO21，残基1-31)；裂解羧基末端肽(大约相应于SEQID NO21的氨基酸228-419且具有Balbiani环3蛋白质(BR3P)序列的间隔半胱氨酸残基痕迹的模式[Dignam等，Gene，88133-40(1990)；Paulsson等，J.Mol.Biol.，211331-49(1990)])以产生大约29KD的部分加工形式；裂解(明显在细胞外)氨基末端肽(大约相应于SEQ ID NO21的氨基酸32-103)以产生大约21-23kD的完全加工后的成熟形式。实验证据证实VEGF-C的部分加工后的形式(例如，29kD的形式)能结合Flt4(VEGFR-3)受体，而与VEGFR-2的高亲和力结合仅与VEGF-C的完全加工后形式发生。似乎VEGF-C多肽天然相联成非二硫化键连接的二聚体。
另外，已证实SEQ ID NO2的氨基酸103-227对于维持VEGF-C的功能不都是关键性的。由SEQ ID NO2的氨基酸113-213(且不含残基103-112和214-227)组成的多肽保留结合和刺激VEGF-C受体的能力，预期跨越从大约残基131到大约残基211的多肽将保留VEGF-C的生物学活性。已表明在156位置的半胱氨酸残基对于VEGFR-2的结合能力是重要的。然而，VEGF-CΔC156多肽(即，由于缺失或取代而缺少该半胱氨酸的类似物)仍是VEGFR-3的有效激活剂。SEQ ID NO2中165位置的半胱氨酸对于结合任一受体是必需的，而在83或137位置缺少半胱氨酸的类似物与天然VEGF-C竞争结合两种受体并刺激两种受体。
人VEGF-C与来自其它物种的VEGF-C的序列对比(使用任一普遍接受的序列对比算法进行)显示了可导入修饰(例如，插入，取代，和/或缺失)而不破坏VEGF-C的生物学活性的其它残基。在对比排列的两个或多个物种的VEGF-C多肽上具有不同的氨基酸，特别是具有不同化学特性的侧链的不同氨基酸的任一位置很可能是容许修饰而同时不消除功能的位置。人，鼠和鹌鹑VEGF-C的一个举例性的序列对比在PCT/US98/01973的图5中提供。
除了上述因素外，应明白可对野生型VEGF-C序列进行无数的保守氨基酸取代，这样，特别是如果该取代的数目较小时，很可能导致多肽保留VEGF-C的生物学活性。“保守氨基酸取代”是指用具有相似化学特性的侧链的氨基酸进行的氨基酸取代。进行保守取代的相似氨基酸包括具有酸性侧链(谷氨酸，天冬氨酸)；碱性侧链(精氨酸，赖氨酸，组氨酸)；极性酰胺侧链(谷氨酰胺，天冬酰胺)；疏水脂肪族侧链(亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸，甘氨酸)；芳香侧链(苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)；小侧链(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸)；或脂肪族羟基侧链(丝氨酸，苏氨酸)的那些氨基酸。也包含不破坏VEGF-C生物学活性的一个或几个内部氨基酸的添加或缺失。
从前面所述可预期许多VEGF-C多肽和变异体以高亲和力结合Flt4(VEGFR-3)，因此它们可在涉及使用Flt4结合化合物造影或筛选组织样品的本发明方面中用作Flt4结合化合物。特别有利的是含有减小或消除VEGFR-2结合亲和性以便所得的多肽对VEGFR-3结合特异性增加的改变的VEGF-C形式。如上所述，该改变包括Cys156的缺失或取代，它基本上消除了VEGFR-3结合亲和性，或者破坏天然prepro-VEGF-C蛋白酶解加工位点的氨基酸序列改变(因为完全加工后的VEGF-C具有最高的VEGFR-2亲和性)。另外，修饰成保留Flt4结合亲和性但不能激活Flt4自身磷酸化的VEGF-C分子在本文所述的治疗方法中是有用的Flt4拮抗剂。从上述教导显而易见的还有本文所述的Flt4配体可用于测定法中作为一种另外的标记以便证实人Flt4等位基因变异体的身份，和证实与本文教导的Flt4序列具有同源性的非人基因序列(参见，例如，实施例8和图4)事实上是Flt4的非人相应物。prepro-VEGF-C推定的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO21提供。
命名为血管内皮生长因子D(VEGF-D)的第二种Flt4配体的详细描述，以及编码VEGF-D的人多核苷酸序列，和VEGF-D变异体和类似物在申请日为1997年8月21日且作为国际公开号WO 98/07832于1998年2月26日公开的国际专利申请号PCT/US97/14696；和Achen，等，Proc.Nat′l Acad.Scu.U.S.A.，95(2)548-553(1998)中提供，也在本文中引用以供参考。正如其中的详细说明，人VEGF-D首先作为354个氨基酸的prepro-VEGF-D多肽在人细胞中产生。prepro-VEGF-D的cDNA和推定的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO22描述。来自其它物种的VEGF-D序列也有报导。参见例如，Genbank登录号D89628(Mus musculus)；和AF014827(Rattus norvegicus)，本文引用以供参考。
prepro-VEGF-D多肽具有21个氨基酸的推定信号肽且以与prepro-VEGF-C的加工类似的方式明显通过蛋白酶解加工。缺少SEQ ID NO22的残基1-92和202-354的“重组成熟”VEGF-D保留激活受体VEGFR-2和VEGFR-3的能力，且似乎作为非共价相连的二聚体缔合。VEGF-D多肽作为本发明的Flt4结合化合物的用途与上文对VEGF-C所述类似。同样，预期对VEGF-D的类似改变(除去VEGF同源性结构域中8个保守半胱氨酸的第二个，即Cys136，或除去蛋白酶解加工位点)将导致多肽的VEGFR-2结合亲和性降低或消失，从而增加Flt4的特异性。修饰成保留Flt4结合亲和性但不能激活Flt4自身磷酸化的VEGF-D分子在本文所述的治疗方法中是有用的Flt4拮抗剂。
实施例18小鼠Flt4 cDNA探针的克隆来自129SV小鼠的λFlXII基因组文库(Stratagene)的大约106个噬斑用覆盖胞外域的上述S2.5人Flt4受体cDNA片断进行筛选。也参见Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。从阳性噬斑亚克隆2.5kb的BamHI片断并从两端测序。从该亚克隆，使用聚合酶链式反应扩增一个覆盖小鼠Flt4cDNA序列的核苷酸1745-2049的外显子片断并克隆进pBluescript KSII+/-载体(Stratagene)。参见Finnerty等，Oncogene，82293(1993)。
同样克隆覆盖核苷酸1-192的第二个片断。
实施例19小鼠组织中Flt4 mRNA的分析按照Chomczynski等，Anal.Biochem.，162156(1987)所述从发育中的胚胎(交配后8-18天和年龄为1天的小鼠)中分离总RNA。来自交配后8天的胚胎样品也包括胎盘。
对于Rnase保护分析，使用[32P]-UTP和用于反义方向的T7聚合酶从实施例18获得的线型化鼠类Flt4质粒产生RNA探针。所用的β-肌动蛋白探针相应于公开的小鼠β-肌动蛋白序列的核苷酸1188-1279。参见Tokunaga，等，Nucleic.Acid.Res.，142829(1986)。在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶中纯化后，将标记的转录子与30μg总RNA在52℃下杂交过夜。未杂交的RNA用RNase A(10 U/ml)和T1(1mg/ml)在37℃，pH 7.5下消化1小时。Rnases通过蛋白酶K在37℃下消化15分钟灭活且该样品在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶中分析。
在本实验中分析的Flt4的表达模式表明从肺，肝脏，心，肾，骨骼肌和脾中获得了极微弱的mRNA信号，而睾丸和脑明显没有特异性信号。通过Rnase保护试验对在小鼠发育的不同时期中收集的一系列RNAs的分析表明在从交配后第8天到新出生的小鼠的整个胚胎发生中表达Flt4 mRNA，且信号强度无大的变化。
实施例20在小鼠胚胎中对Flt4的原位杂交为了更好地将Flt4转录子定位到细胞和组织上，将交配后7.5天和8.5天的小鼠胚胎切片与标记的Flt4 RNAs杂交。小鼠胚胎从CBA与NMRI小鼠的交配产生。通过颈脱位处死怀孕的小鼠且立即冷冻胚胎或者通过磷酸盐缓冲液转移进4％低聚甲醛中。胚胎和分离的小鼠器官在4℃下固定18小时，脱水，包埋于石蜡中，并切成6μm的切片。
192个和305个核苷酸的RNA探针(反义和有义)(见实施例18)使用[35S]-UTP从线形化质粒产生。对切片的原位杂交按照Wilkinson等，Development，99493(1987)；和Wilkinson等，Cell，5079(1987)所述进行，本文引用它们以供参考，并采用下列改良1)在石蜡包埋前使用二甲苯代替甲苯；2)切成6μm的切片，放在用2％3-三乙氧基甲硅烷基丙胺预处理的载玻片表面的二乙基焦碳酸酯处理的水层上；3)省去对该探针的碱性水解；和4)高度严格洗涤是在含有30mM DTT和1x SSC的溶液中在65℃下80分钟。该切片用NTB-2乳剂(Kodak)覆盖且在4℃下储存。载玻片曝光14天，显影，并用苏木精染色。用有义链进行的对照杂交和RNAse A-处理的切片中未产生超出背景的特异性信号。
在交配后7.5天的小鼠胚胎中未检测到Flt4 mRNA表达，但在发育的第8.5天在发育中的主动脉中检测到明亮的信号。相反，发育中的卵黄囊为Flt4-阴性。在胚外组织中，在尿囊中显著表达Flt4，而发育中的卵黄囊血岛为阴性。另一方面，头间充质的成血管细胞为强烈的Flt4-阳性。在发育中的胎盘中，首先在外周静脉窦中可见Flt4信号。在交配后9.5天的胎盘中，静脉窦内皮和与Reichert′s膜部分融合的巨细胞表达Flt4 mRNA。
因此，尽管在最早的内皮细胞前体，即成血管细胞中Flt4的表达非常显著，但是似乎仅局限于交配后8.5天的胚胎的某些血管中。已知在发育中的小鼠胚胎的所有内皮细胞中都表达Tie受体，因此为这些细胞提供了一个标记。参见Korhonen，等，Oncogene，8395(1993)；和Korhonen等，Blood.802548-2555(1992)。显然，与Tie探针相反，Flt4探针与交配后11.5天的胚胎的动脉内皮，例如与发育中的背主动脉或颈动脉内皮杂交极弱。相反，Flt4信号在发育中的静脉中更显著得多。例如，在围绕发育中的后肾的静脉中检测到Flt4信号，而Tie探针主要识别后肾内的毛细血管。
观察到Flt4 mRNA分布在交配后12.5天的小鼠胚胎的一些区域，特别是在腋区的扩张血管中特别显著。在颈区的中部矢状切片中可见相似的Flt4-阳性血管结构(数据未显示)。表达Flt4的血管的血管丛样方式出现在眶周区和围绕发育中的脊椎。另外，位于发育中的皮肤正下方，有明显的Flt4-阳性血管网。在包括发育中的大脑的一些区域获得了较弱的毛细血管信号。在颈区小血管中，在发育中的鼻口部的小血管中和在发育中的舌基部以及在尾区也可检测到Flt4 mRNA。另外，肝脏为点状方式的Flt4 mRNA强阳性。
在进一步的发育期间，Flt4 mRNA似乎变得更局限于胚胎的某些血管。交配后14.5天的胚胎恰好表现出这种限制表达方式。在该胚胎的中间矢状切片中，在其前面部分沿发育中的脊柱观察到最显著的Flt4信号。认为该信号来源于胸导管的内皮细胞，胸导管是在该发育时期形成的最大淋巴管。相反，背主动脉和下腔静脉为阴性。肠系膜区扩张的血管也是Flt4强阳性。另外，与交配后12.5天的胚胎一样，沿眶周，下颚，以及颈区的解剖学边界的血管网含有Flt4阳性内皮。在围心腔和在全部皮下组织中存在相似结构。显然，与Flt4-阴性血管相反，所有Flt4-阳性血管在其腔内没有血细胞。这些表达方式表明Flt4变得局限于该发育时期的淋巴管内皮。我们观察到Flt4表达的另一位点在发育中的骨髓窦状隙中。
也分析了交配后16.5天的胚胎胸腔上部的横切面与Flt4探针的杂交。进行苏木精-曙红染色以观察该区域的不同血管类型。它们包括颈动脉和头臂动脉，静脉腔，和胸导管，其中胸导管较小且没有围绕的肌肉和结缔组织。在更高放大倍数下观察到胸导管以及附近的小血管的内皮细胞与Flt4探针杂交。
实施例21在培养的内皮细胞中分析Flt4 mRNA实施例20中所述的原位杂交结果表明在静脉内皮细胞及后来在淋巴管和一些静脉内皮细胞中表达Flt4，但在动脉内皮中不表达。为了确定在体外是否维持该调控，我们使用Northern印迹和杂交分析研究了培养的内皮细胞。
从人主动脉，股静脉，脐静脉，和从包皮微血管分离内皮细胞，培养并按本领域以前所述鉴定。参见Van Hinsberg等，Arteriosclerosis，7389(1987)；和Van Hinsberg，等，Thromb.Haemostas，57148(1987)。在5至8代(分裂比率为1∶3)后达到汇合密度时将它们用于分离多聚腺苷化RNA。
内皮细胞系EA hy926(Edgell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，803734-3737(1983))，BCE(Folkman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，765217-5221(1979))和LEII(Schreiber等，Proc.Natl.Acad.Sci.，826138(1985))不表达Flt4。然而，培养的人微血管，静脉和脐静脉内皮细胞为Flt4-特异性5.8和4.5kb mRNAs阳性，而主动脉内皮细胞为阴性。相反，另一内皮受体酪氨酸激酶基因Tie作为4.4kb mRNA在所有试验的内皮细胞类型中都表达。
实施例22成人组织中的Flt4 mRNA实施例20中获得的结果表明Flt4 mRNA变得大部分局限于发育期间的淋巴管内皮。由于该发现在人体中的潜在意义，我们还使用人Flt4探针研究了在成人组织中Flt4的表达。所用的人Flt4探针是覆盖cDNA碱基对1-595(SEQ ID NO1)的EcoRI-SphI片断。也参见Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。Von Willebrand因子探针是覆盖碱基对1-2334的EcoRI-HindIII片断。Bonthron，等，Nucleic Acids Res.，1417125(1986)。
我们使用常规固定的材料进行了组织病理学诊断。正常肺组织从患有表皮样癌的左侧下肺叶切除术获得。肠系膜和肠系膜淋巴结从患有结肠腺癌的患者获得。邻近唾液腺的正常淋巴结由于其异常大小而被摘除。来自两个病人的扁桃体和两个阑尾无诊断改变。研究的两个淋巴管肌瘤和三个胆囊淋巴管瘤具有相似的结果。
对于人体组织，用10％福尔马林固定的常规样品用于组织病理学诊断，正常的原位杂交法正好产生背景，而微波处理代替蛋白酶K能够特异性杂交。Shi，等，J.Biol.Chem.，2665774(1991)；Catoretti，等，J.of Pathol.，168357(1992)。
在肠系膜，肺和阑尾淋巴管内皮中产生Flt4信号，而静脉，动脉和毛细血管为阴性。为了研究Flt4是否在HEVs中表达，研究了扁桃体。事实上，在扁桃体中，在一些HEVs中检测到Flt4-特异性放射自显影颗粒。
实施例23分析正常和转移性淋巴结和淋巴管瘤中的Flt4 mRNA分析了部分人肠系膜淋巴结(见实施例22)的Flt4表达。在淋巴窦和输入及输出淋巴管中观察到Flt4表达。在含有腺癌转移瘤的淋巴结中观察到相同的方式。在正常和转移性淋巴结的一些HEVs中也呈阳性。与所有血管中vonWillebrandt因子的原位信号相比显而易见的是在胆囊淋巴管瘤中Flt4的表达是淋巴管内皮特有的。
与这些结果一致，在皮肤淋巴管瘤(一种以推测的淋巴管内皮增生为特征的罕见疾病)的内皮中对Flt4的免疫染色呈强阳性。参见Lymboussaki等，Am.J.Pathol.，153(2)395-403(1998年8月)，本文引用以其整体作为参考。
另外，对Flt4的免疫染色在卡波西肉瘤皮肤结状病灶组织样品内鉴定到纺锤形细胞。参见Jussila等，Cancer Res.，581599-1604(1998年4月)。鉴于Flt4的明显淋巴管特异性，可认为这些结果与卡波西肉瘤中某些细胞具有淋巴管内皮起源的观点一致。参见，例如，Beckstead等，Am J.Pathol.，119294-300(1985)；和Dictor等，Am J.Pathol.，130411-417(1988)。
实施例24Flt4定位于胎儿内皮细胞正如实施例2所述，编码短链形式的40个羧基末端氨基酸的Flt4 cDNA片断作为657bp的EcoRI片断克隆进pGEX-1λT细菌表达载体(Pharmacia)的谷胱甘肽-S-转移酶编码区的阅读框内。在大肠杆菌中生产所得的GST-Flt4融合蛋白并使用谷胱甘肽-琼脂糖4B柱通过亲和色谱法纯化。冻干纯化的蛋白，溶于PBS中，与Freund′s佐剂混合，并用于免疫兔。使用第三次加强免疫后的抗血清。
从用前列腺素诱导的合法流产获得17和20周大的人胎儿组织。本研究由郝尔辛基大学中心医院的伦理委员会批准。从胎儿足长度估计妊娠年龄。将胎儿组织包埋于Tissue-Tek(Miles)中，立即冷冻，并储存在-70℃。
抗-Flt4抗血清与GST-琼脂糖柱交叉吸附以去掉抗-GST-抗体并然后通过GST-Flt4亲和色谱法纯化。用丙酮固定一些6μm厚的恒冷箱组织切片并用在甲醇中的0.3％H2O2处理30分钟以抑制内源性过氧化物酶活性。洗涤后，用5％正常猪血清温育该切片。然后用抗Flt4抗体温育切片并洗涤。用过氧化物酶偶连的猪抗兔IgG随后通过使用0.2％3，3-二氨基联苯胺(Amersham)作底物染色过氧化物酶活性检测结合的抗体。切片在Meyer′s苏木精中复染。
人胎儿肠系膜的抗-Flt4免疫过氧化物酶染色表明在一些血管的内皮上存在Flt4蛋白，而用抗原封闭的抗-Flt4抗体和免疫前的血清进行的对照染色为阴性。为了进行比较，用抗因子VIII-相关性抗原的抗血清染色切片，该抗原是血管内皮细胞特有的。在不含红血细胞的血管内皮细胞中观察到对Flt4的免疫过氧化物酶染色，而血管为阴性。无红血细胞的血管很可能是淋巴管内皮细胞；该血管在肠系膜中特别常见。抗因子VIII相关性抗原的抗体染色所有血管中的内皮细胞。
实施例25抗Flt4单克隆抗体的生产融合I通过在High-Five细胞中表达Flt4EC-6xHis-pVTBac质粒构建体(实施例14)生产重组Flt4胞外域蛋白。使用Ni-NTA亲和色谱法按照厂商的指导(Qiagen)结合并洗脱重组Flt4胞外域的COOH-末端编码的6xHis标记从感染的High-Five细胞的培养基纯化Flt4胞外域(Flt4EC)。
通过腹膜内注射用Freund′s完全佐剂乳化的纯化重组产生的Flt4胞外域蛋白(150μg/只小鼠)免疫4月龄Balb/c雄性小鼠。以3到4周的间隔给予150μg的加强注射且在另一3周间隔后给予最后加强(10μg Flt4 EC溶于PBS中，腹膜内给药)。最后加强剂量4天后，处死小鼠且将小鼠脾淋巴细胞与SP 2/0浆细胞瘤细胞分别以2∶1的比率融合。
在96-孔培养板(NUNC)中在含有20％胎牛血清和HAT添加剂(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷；GIBCO，043-01060H；稀释50倍)的Ex-Cell 320培养基(SERALAB)中收获融合细胞。细胞在+37℃下，5％ CO2的空气中培养。10天后，将添加了HAT的培养基更换成补充了HT的细胞培养基(GIBCO；043-01065H，稀释50倍)。HT培养基与HAT培养基相同，但缺少氨基蝶呤。
在3周时，通过下面实施例26所述的抗原特异性ImmunoFluoroMetric试验(IFMA)测定特异性抗体的产量。按Staszewski等，Yale Journal of Biologyand Medicine，57865-868(1984)所述的有限稀释法克隆该主克隆。将阳性克隆传代到24-孔组织培养板(NUNC)上，再克隆，并按相同方法再检验。通过荧光激活细胞分类术(FACS)检测阳性克隆。
除了一个克隆产生很可能属于IgA型的Ig外，稳定克隆分泌的免疫球蛋白属于IgG1类型。使用针对小鼠亚类的大鼠单克隆抗体作为IFMA中的生物素偶连物(SEROTEC)测定单克隆抗体的亚类。
使用Balb/c小鼠在腹水中产生单克隆抗体。将上述杂交瘤腹膜内注射进用降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷98％，ALDRICH-CHEMIE D7924Steinheim，Cat.No.T 2，280-2)预处理动物后的小鼠中。在杂交瘤细胞前大约两周注射0.5ml降植烷(i.v.)。注射的细胞量是每只小鼠大约7.5到9×106个。注射杂交瘤后10至14天收集腹水。
融合II通过用Freund′s完全佐剂乳化的重组产生的Flt4胞外域蛋白(20μg/只小鼠)腹膜内注射免疫两个月大的Balb/c小鼠(雌性)。以3到4周的间隔给予20μg的加强注射且在另一3周间隔后给予最后加强(10μg Flt4溶于PBS中，i.v.给药)。最后加强给药4天后，处死小鼠且将小鼠脾淋巴细胞与SP 2/0浆细胞瘤分别以2∶1的比率融合。
在96-孔培养板(FALCON)中在含有20％胎牛血清和HAT添加剂(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷；GIBCO BRL 21060-017；稀释1∶50倍)的OptiMEM 1(含有Glutamax，1，51985-026，GIBCO BRL)中收获融合细胞。细胞在37℃下，5％CO2的空气中培养。10天后，将添加了HAT的培养基更换成补充了HT的细胞培养基(GIBCO BRL；41065-012，稀释1∶50倍)。
在3周时，通过下面实施例26所述的抗原特异性ImmunoFluoroMetric试验(IFMA)测定特异性抗体的产量。按Staszewski等，(1984)所述的有限稀释法克隆该主克隆。将阳性克隆传代到24-孔组织培养板(FALCON)上，再克隆，并按相同方法再检验。通过FACS检测阳性克隆。
2E11和6B2克隆分泌属于IgG1型的免疫球蛋白，2B12克隆产生属于亚类IgM的Ig。使用抗小鼠亚类重链的大鼠单克隆抗体作为IFMA中的生物素偶连物(SEROTEC)测定小鼠亚类IgG1且使用小鼠单克隆抗体同种型分类试剂盒(Dipstick Format)(19663-0 12，Life Technologies Inc.)测定小鼠亚类IgM。
实施例26抗Flt4单克隆抗体的特异性纯化的，重组Flt4胞外域-6xHis融合产物(按实施例14和25所述生产)按Mukkala等，Anal.Biochem，176(2)319-325(1989)所述用铕标记，并采用如下改良将过量250倍摩尔数的异硫氰酸DTTA-Eu(N1螯合物，WALLAC，Finland)加入Flt4溶液(0.5mg/ml溶于PBS)中且通过加入0.5M碳酸钠缓冲液，pH9.8将pH调节到大约9。在+4℃下进行标记过夜。使用以TSA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.8，含有0.15M NaCl)作洗脱剂的PD-10(PHARMACIA，Sweden)去掉未结合标记。
纯化后，将1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)加入标记的Flt4中且标记物在+4℃下储存。通过测量该荧光与已知EuCl3标准的比率(Hemmila等，Anal.Biochem.，137335-343(1984))测定为，每个Flt4分子掺入的铕离子的平均数目为1.9。
使用兔抗小鼠Ig(Z 259，DAKOPATTS)覆盖的微量滴定条孔(NUNC，polysorb)，使用夹心式免疫荧光测定试验筛选实施例25中产生的抗体。通过Platewash 1296-024(WALLAC)用DELFIA洗涤溶液将预覆盖的孔洗涤一次。DELFIA测定缓冲液用作细胞物培养上清和脾切除的小鼠血清的稀释缓冲液(以1∶1000至1∶100,000的稀释度)，其中脾切除的小鼠血清用作初步筛选试验的阳性对照。
通过在Plateshake摇床(1296-001，WALLAC)上摇动5分钟开始在+4℃下过夜温育(或者在室温下温育2小时)，接着按上文所述用洗涤溶液洗涤4次。
在100μl测定缓冲液中以1∶500的稀释度加入铕标记的Flt4。在Plateshake摇床上5分钟和在室温下温育1小时后，按上文所述洗涤滴定条。
以200μl/孔加入增强溶液(DELFIA)。然后在Plateshake摇床上摇动平板5分钟，通过ARCUS-1230(WALLAC)10-15分钟测量荧光的强度。(Lovgren等，见Collins W.P.(编)Alternative Immunoassays，John Wiley & Sons Ltd.(1985)，第203-216页)。DELFIA结果表明试验的所有单克隆抗体结合Flt4 EC抗原。选择与Flt4反应的单克隆抗体(和产生该抗体的杂交瘤)用于进一步筛选。
所得的单克隆抗体用于双抗体免疫荧光染色表达LTR-FLT41构建体的NIH3T3细胞和新霉素抗性转染的NIH3T3细胞。使用EDTA从培养板分离该细胞，染色，并在荧光激活细胞分选仪(FACS)上分析。FACS分析的结果以所示单克隆抗体染色阳性的细胞百分数提供(见下文表2)。
a)LTR转染的细胞的FACS结果b)NEO细胞的FACS结果(对照)LTR-FLT41-转染的细胞的FACS结果表明该抗体有效识别Flt4-表达细胞。同一抗体对新霉素磷酸转移酶转染的NIH3T3细胞仅产生背景染色。因此，该抗体特异性识别细胞表面的Flt4酪氨酸激酶。
发现命名为抗-Flt4杂交瘤9D9F9的一个克隆稳定分泌通过IFMA测定为属于免疫球蛋白类型IgG1的单克隆抗体。杂交瘤9D9F9于1995年3月23日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心，人和动物细胞培养物和病毒部，Mascheroder Weg lb，3300 Braunschweig，Germany，且给定保藏号为ACC2210。
融合II抗体还使用了上述铕标记的Flt4胞外域蛋白筛选实施例25所述的融合II抗体。使用兔抗小鼠Ig(Z 259，DAKO)覆盖的微量滴定孔(Nunc，Polysorb)，使用Flt4-特异性IFMA筛选该抗体。通过使用DELFIA Plate洗涤用洗涤溶液(Wallac)洗涤预覆盖的孔一次。
DELFIA试验缓冲液用作细胞培养物上清(在初步筛选中稀释度为1∶2)和脾切除的小鼠血清(稀释度从1∶1000到1∶100,000)的稀释缓冲液，其中脾切除的小鼠血清用作阳性对照。作为标准，使用浓度在1.0ng/ml和250ng/ml之间的纯化抗-Flt4 9D9F9(小鼠亚类IgG1)。样品首先在Plateshake摇床上室温下摇动5分钟，然后在+4℃下温育大约18小时。首先洗涤支架4次，然后加入Eu-标记的Flt4(1∶2000，在100μl测定缓冲液中)，最后在室温下温育支架1小时。按所述方法洗涤后，加入增强溶液(200μl/孔，Wallac)，并在Plateshake摇床上摇动支架5分钟。通过ARCUS-1230(Wallac)测量荧光强度。选择与Flt4反应的单克隆抗体在采用表达Flt4的NIH3T3细胞的双抗体免疫荧光染色测定法中按上文所述进一步筛选。
所得的融合II的抗Flt4单克隆抗体和相应的FACS分析结果(表示为用所示单克隆抗体染色阳性的细胞百分数)在表3中总结。
使用亲和纯化的抗-Flt4 9D9F9制备用于定量抗-Flt4抗体的标准曲线。线型范围达到从1.0ng/ml到250ng/ml。
在表面表达全长Flt4的用pLTRFLT41构建体共转染的NIH3T3细胞的溶胞产物在6.5％SDS-PAGE上电泳，将蛋白质转移到硝化纤维素硝酸盐膜(0.45μm，SCHLEICHER & SCHUELL)上且用含单克隆抗体的杂交瘤细胞培养物上清(1∶10，在含有甲醇4％，SDS 0.04％的50mM TRIS-40mM甘氨酸缓冲液中)免疫印迹。使用与HRP-偶连的兔抗小鼠Ig(P161，DAKO，在含有150mM盐水，5％奶粉的20mM TRIS缓冲液，pH7.5中1∶1000稀释)和ECL(增强化学发光，AMERSHAM)温育检测单克隆抗体的特异性。％a
a)LTR转染的细胞的FACS结果b)NEO细胞的FACS结果(对照)c)基于亲和纯化的抗-FLT 9D9F9抗体用作标准定量的Mab产量NF在FACS中不起作用WB成功用于Western免疫印迹实施例27使用抗-Flt4抗体鉴定在细胞溶胞产物中和在人组织淋巴管内皮细胞中表达的Flt4前面实施例所述的杂交瘤9D9生产的单克隆抗体用于免疫沉淀和Western印迹HEL细胞的溶胞产物。正如实施例6的报道，以前在HEL细胞中观察到Flt4 mRNA的表达。大约2×107个培养的HEL细胞在实施例11限定的RIPA缓冲液中裂解并用大约2微克的9D9抗体(按实施例11对多克隆抗体所述)免疫沉淀。对于Western分析，通过SDS-PAGE(6％凝胶)电泳免疫沉淀并电印迹到硝酸纤维素膜上。使用1微克/ml 9D9抗体的稀释液在免疫沉淀的Western印迹分析中检测相应于Flt4多肽的175kD和125kD的多肽带。
使用9D9单克隆抗体和碱性磷酸酶ABC-AP试剂盒(Dako)进行人皮肤组织的免疫染色。简单地说，含有6μm成人皮肤样品的载玻片在室温(RT)下干燥30分钟，用冷丙酮固定10分钟，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次5分钟。然后将样品在RT下用2％马血清温育30分钟并在PBS中洗涤3次5分钟。
对于免疫染色，将样品与9D9第一抗体在室温下温育1小时并用PBS洗涤3次5分钟。洗涤后，样品与生物素标记的兔抗小鼠第二抗体在室温下温育30分钟，并再用PBS洗涤3次5分钟。
通过用ABC-AP复合物在室温下温育样品30分钟，用PBS洗涤3次，用AP-底物(Sigma Fast Red TR/Naphtol AS-MX(Cat.No.F-4648))室温下温育15分针，并用水漂洗可检测结合的抗体。然后用Mayer′s苏木精复染样品30秒并用水漂洗。使用水封固并盖上盖玻片，在显微镜下分析该样品。观察这些人皮肤切片中淋巴管内皮细胞的9D9抗体染色。血管内皮显示出极弱的染色或无染色。进一步的分析用于证实淋巴管内皮的明显特异性。参见Lymboussaki等，Am.J.Pathol.，153(2)395-403(1998年8月)；和Jussila等，Cancer Res.，581599-1604(1998年4月)，本文引用这两篇文献以其整体作为参考。
这些结果还证实了Flt4作为淋巴管内皮的有用标记的用途和抗-Flt4抗体用于鉴定和观察组织样品在这些细胞中表达的Flt4的用途。
实施例28VEGF-C/VEGFR-3信号途径在乳腺癌血管生成中的增量调节上面的实施例证实了Flt4(VEGFR-3)用作正常组织淋巴管内皮的特异性抗原标记。下列方法还证实了VEGFR-3用作抗原标记(例如，用于诊断和筛选)和作为恶性乳腺肿瘤的治疗靶。与组织学上正常的乳腺组织相比在侵袭性乳腺癌中发现VEGFR-3阳性血管大量增多(P＜0.0001)。
材料和方法新鲜冷冻的乳腺组织样品从郝尔辛基大学病理学系的病例中取回。样品由导管癌(n＝6)，小叶癌(n＝6)，管内癌(n＝8)，纤维腺瘤(n＝4)，和组织学正常的乳腺组织(n＝12)组成。所有样品在手术切除后立即在液氮中冷冻，并存储在-70℃。
抗人Flt4(VEGFR-3)的小鼠单克隆抗体(Mabs)基本上按前面实施例，例如实施例25所述生产。VEGFR-3胞外域蛋白(VEGFR-3EC)通过在昆虫细胞中的重组杆状病毒表达，从培养基中纯化。然后使用标准方法生产抗VEGFR-3EC的小鼠单克隆抗体且通过蛋白质A亲和色谱法从杂交瘤腹水液或Tecnomouse培养物上清纯化该免疫球蛋白馏分。
空气干燥5μm的组织样品冷冻切片并在冷丙酮中固定10分钟。切片在磷酸盐缓冲液(PBS)中再水合并在5％正常马血清中室温下温育30分钟。然后在潮湿大气中室温下用Mabs 9D9F9(实施例26)以1.0μg/ml的浓度温育切片2小时。还研究了抗VEGFR-3EC不同表位的其它抗-VEGFR-3 Mab；克隆2E11D11(实施例26)和7B8F9(基本上按实施例26所述制备)分别以9.5和8.5μg/ml的浓度使用。随后在生物素标记的抗小鼠血清中温育30分钟，接着使用Vectastain Elite Mouse IgG ABC试剂盒的试剂(Vector laboratories，Burlingame，USA)温育60分钟。用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，Sigma，St.Louis，USA)显色过氧化物酶活性10分钟。最后，用苏木精染色切片20秒。通过省去第一抗体，或者通过使用相同同种型的无关第一抗体进行阴性对照。使用纯化的杆状病毒免疫原封闭9D9抗体的结合作为另一阴性对照。在这些实验中，抗体与在PBS中过量10倍摩尔数的VEGFR-3EC蛋白质温育过夜。在+4℃下以4000rpm离心4分钟后，小心收集上清，然后用作第一抗体。与用抗-VEGFR-3抗体染色的切片邻近的5μm冷冻切片用于免疫染色血管内皮标记PAL-E(0.15μg/ml，Monosan，Uden，荷兰)，层粘连蛋白(1∶4000稀释的克隆LAM-89上清，Sigma，St Louis，MO)，胶原蛋白XVIII(1.9μg/ml)，α-平滑肌肌动蛋白(SMA，0.5μg/ml，克隆1A4，Sigma)，VEGFR-1(1∶200稀释的克隆19上清)或VEGFR-2(1∶100稀释)。
染色程序后对所有样品进行病理学检查。按照Gasparini和Harris.[Gasparini G，和Harris A，J Clin.Oncol.，13765-782(1995)]推荐的指导从PAL-E染色的载玻片[de Waal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1997)]获得血管密度。以相同的方式试验VEGFR-3阳性血管的密度。首先在低放大倍数下浏览载玻片，然后通过在最高血管密度的区域(“血管热点”)或在具有最高VEGFR-3阳性血管密度的区域计数每个400x放大倍数的高倍视野(hpf)中染色血管的数目来估计肿瘤内的血管密度。每张载玻片最少计数5个视野，随后平均3个最高的计数。
在两个管内癌中进行双染色以区分淋巴管和血管的免疫组织化学染色。丙酮固定的5μm冷冻切片与抗-PAL-E抗体温育1小时，与生物素标记的马抗小鼠抗体(Vectastain Elite Mouse IgG ABC试剂盒，Vector laboratories，Burlingame，USA)温育30分钟，与ABC-过氧化物酶(Vectastain，1∶100)温育45分钟，最后用AEC显色10分钟。对于第二步，用抗-VEGFR-3抗体温育切片1小时(0.14μg/ml)，接着用生物素标记的抗小鼠抗体温育30分钟(1∶200稀释的克隆上清)，ABC-过氧化物酶温育30分钟(1∶100)，含有0.01％过氧化物的生物素标记的酪胺(tyramin)溶液(1∶2.000)温育5分钟，ABC-碱性磷酸酶(1∶100)温育20分钟，并用坚牢蓝(Sigma，St.Louis，USA)按照以前文献中所述的ISH信号增强方法显色20分钟。[Kerstens等，J.Histochem.Cytochem.，43347-352(1995)]。与双染色切片相邻的冷冻切片(5μm)按上文所述仅用VEGFR-3抗体也进行了免疫染色。
在兔中针对相应于文献中所述的成熟分泌的人血管内皮生长因子C(VEGF-C)N-末端氨基酸残基2-18的合成肽(VEGF-C的prepro-VEGF-C多肽的残基104-120)生产多克隆抗体。[Joukov等，EMBO J.，163898-3911(1997)，本文引用以其整体以供参考]。使用与环氧活化的琼脂糖-6B柱偶连的免疫原性多肽亲和纯化该抗血清并使用以表达VEGF-C或对照β-半乳糖苷酶的腺病毒载体感染的细胞试验VEGF-C的特异性染色。
选择8个管内癌和用于分析VEGFR-3的所有侵袭性癌进一步分析VEGF-C的表达。空气干燥与用抗-VEGFR-3抗体染色的切片相邻的5微米冷冻切片并在冷丙酮中固定10分钟。该切片在PBS中再水合并在5％正常山羊血清中温育30分钟，然后在潮湿的空气中室温下用在PBS中1∶200稀释的兔抗人VEGF-C多克隆抗体温育2小时。随后在生物素标记的抗兔血清中温育30分钟，接着使用Vectastain Elite Rabbit IgG ABC试剂盒的试剂(Vector laboratories，Burlingame，USA)温育60分钟。该切片按上文所述进一步处理。作为阴性对照，使用纯化的免疫原封闭VEGF-C抗体的结合。在这些实验中，VEGF-C抗体与在PBS中过量10倍摩尔数的VEGF-C蛋白质温育过夜。在+4℃下以4000rpm离心4分钟后，小心收集上清并用于免疫染色。
通过用相应于人XVIII型胶原蛋白N-末端NC1结构域共有区域的重组多肽QH48.18[Saarela等，Matrix Biology，16319-28(1998)]免疫小鼠由DiaBor Ltd.(Oulu，Finland)产生抗人XVIII型胶原蛋白的单克隆抗体。通过ELISA试验和使用多肽QH48.18的Western分析且还通过对冷冻人组织切片的免疫荧光染色筛选该克隆。杂交瘤克隆的筛选产生了3个单克隆抗体，在提及的所有三个试验(ELISA，Western，免疫荧光染色)中均为阳性。具有最强信号的一个抗体，DB 144-N2用于随后的实验中。它产生与多克隆抗-all hu(XVIII)相同的染色方式(例如，在成人皮肤和肾样品中)。
结果A.在组织学正常的乳腺组织和在良性纤维腺瘤中的VEGFR-3在正常乳腺组织中VEGFR-3的免疫组织化学染色表明在管间基质的毛细血管中表现出极弱的染色。这些血管不形成任一特异性方式，但是分散在各处的基质中。在正常乳腺组织样品中VEGFR-3阳性血管的密度范围为每个hpf从6到17个，中值为9(n＝12)。大多数该血管为血管内皮标记PAL-E和基底层成份胶原蛋白XVIII强染色，表明VEGFR-3在正常乳腺组织的血管中弱表达。然而，清楚染色VEGFR-3的基质中的一些薄血管为PAL-E阴性和XVIII型胶原蛋白弱阳性，表明它们是淋巴管。在良性纤维腺瘤中也同样发现了VEGFR-3阳性血管，而其密度(每个hpf中值为8条血管；范围为3-19；n＝4)与组织学正常的乳腺组织(中值8相对于9；P＞0.1，Mann-Whitney检验)没有区别。
B.管内癌中的VEGFR-3阳性血管在管内癌中，观察到不同方式的强染色VEGFR-3阳性血管。该血管围绕病变导管形成弓形结构(图5A)。在相邻切片的血管内皮标记PAL-E的染色(图5B)中也观察到该“项链”形式，表明在毛细血管内皮中VEGFR-3表达增强。为了更明确地区分血管和淋巴管和搜寻血管壁中存在的平滑肌细胞和外膜细胞，使用抗平滑肌α-肌动蛋白(SMA)和基底层成份层粘连蛋白和XVIII型胶原蛋白的抗体进行进一步染色。根据该染色，靠近管内癌的小血管同时表达VEGFR-3和基底层蛋白，但SMA染色更弱，表明它们在血管壁中被外膜细胞/平滑肌细胞不完全覆盖(图5C-5F中的黑色箭头)。相反，与管内病灶有一些距离的更大血管一般是VEGFR-3阴性，而对层粘连蛋白，胶原蛋白XVIII和SMA为阳性(红色箭头)。另外，发现了VEGFR-3阳性，但对基底层蛋白层粘连蛋白和XVIII型胶原蛋白仅极弱染色且对SMA根本不染色的血管(绿色箭头)。认为它们代表淋巴管。
C.血管和淋巴管的差别双染色选择两个管内癌用于免疫组织化学双染色操作以便更清楚地区分淋巴管与血管。[参见de Waal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1997)]。使用该方法，将VEGFR-3阳性血管染成蓝色，而PAL-E阳性血管和基底层染成棕色。两种试验的样品都表现出相似的染色方式肿瘤充满导管内层的血管主要为PAL E阳性(图5G和5H中的箭头)而在管间基质中相距短距离的推测为淋巴管的VEGFR-3阳性血管为PAL E阴性(图5G和5H中的黑色箭头)。为了排除由于可能的双染色人为现象造成的错误判断，用抗-VEGFR-3单独染色相邻的5μm切片。该染色证实了一些PAL-E阳性血管也是VEGFR-3阳性。
D.管内癌细胞中的VEGF-C，VEGFR-1，和VEGFR-2及其相邻血管中的受体抗人VEGF-C的多克隆亲和纯化抗体用于染色8个管内癌样品。所有试验的样品含有至少一些VEGF-C，但是在染色强度和表达方式上观察到相当大的不均一性。在一些情况下，大多数癌细胞为VEGF-C强阳性，而在其它情况下，只有一些癌细胞产生染色信号。相反，在围绕病变导管的正常组织中观察到极少或者没有染色，尽管在未病变的正常导管上皮中也获得了微弱的信号。抗原封闭实验表明VEGF-C染色是特异性的。其它VEGF-C受体，VEGFR-2，以及其它VEGF受体(VEGFR-1)都在邻近管内癌细胞的相同“项链”血管中表达。
E.VEGFR-3阳性血管和侵袭性乳腺癌中的VEGF-C强染色的VEGFR-3阳性血管也存在于试验的所有侵袭性导管癌和小叶癌中。VEGFR-3阳性血管似乎不形成任何特异性的分布方式；大多数这种血管也与PAL-E抗原发生免疫反应。在侵袭性乳腺癌中肿瘤内VEGFR-3阳性血管密度(中值为21，范围为每个hpf有9-56个血管；n＝12)与正常乳腺组织相比(中值21比9；P＜0.0001，Mann-Whitney检验)显著提高。有时，可观察到癌细胞侵入VEGFR-3阳性淋巴管中。
在试验的侵袭性癌(n＝12)中VEGF-C的免疫染色差异极大。一些癌细胞为VEGF-C强阳性，而其它染色极弱，或者在一些情况下观察不到染色。与管内癌一样，在这些切片的结缔组织中观察到极少染色或无染色。
上述数据揭示了似乎主要是大多数成人组织中淋巴管内皮标记的VEGFR-3也在正常乳腺组织的毛细血管内皮中极弱表达。更有意义的是，在管内癌中，在充满肿瘤的导管内层检测到“项链”形式的强染色VEGFR-3阳性血管。这些血管中大多数表达血管内皮标记PAL-E和基底层成份层粘连蛋白和胶原蛋白XVIH，但是比位于离肿瘤细胞更远的血管明显具有更少的外膜细胞/平滑肌细胞，正如使用抗SMA的抗体染色所示。这些特征表明“项链”血管正在进行血管生成。离病变导管一段距离的第二组血管为VEGFR-3阳性，但对基底层成份为极弱的阳性且为PAL-E阴性，表明它们是淋巴管。这些血管也缺少SMA-阳性外膜细胞成份。另外在侵袭性乳腺癌中，PAL-E阳性血管增量调节VEGFR-3，尽管所见的血管形式在围绕肿瘤细胞的结缔组织基质中更随机地组织。该结果表明与肿瘤生长相关的血管生成期间在乳腺癌中增量调节VEGFR-3表达。在原位癌中发现的VEGFR-3阳性血管的数目大量提高与这样的假说一致，即癌细胞产生可激活紧靠癌细胞附近的血管生长的因子。
由于VEGF-C以高亲和性结合VEGFR-3和VEGFR-2，且由于管内癌和侵袭性癌细胞通常为VEGF-C蛋白染色阳性，因此该生长因子是癌症中VEGFR-3和VEGFR2阳性血管的候选生长因子。这些资料与另一研究一致，其中35个随机恶性侵袭性肿瘤(包括乳腺癌，鳞状细胞癌，淋巴瘤，黑素瘤，和肉瘤)几乎一半在Northern印迹分析中含有VEGF-C mRNA。[参见Salven等，Am.R Pathol.，153(1)103-108(1998年7月)，本文引用以其整体作为参考]。总之，本文报道的数据提供了用可抑制VEGFR-3和/或VEGFR-2的VEGF-C介导性刺激的试剂治疗乳腺癌且可能还有其它非淋巴癌的指征。预期的抑制剂包括抗-VEGF-C抗体；抗-VEGFR-3抗体；抗-VEGFR-2抗体；与VEGFR-3和VEGFR-2或VEGFR-1之一结合的双特异性抗体；结合循环VEGF-C的VEGFR-3的可溶性胞外域片段；结合VEGFR-3和/或VEGFR-2且抑制该受体活化的VEGF-C片段和类似物；结合VEGFR-3和/或VEGFR-2且与合适的治疗剂偶连的VEGF-C多肽，片段，和类似物；VEGFR-3酪氨酸激酶抑制剂；和结合并抑制这些受体的小分子。另外，由于VEGF-D结合VEGFR-3和VEGFR-2，预期抗-VEGF-D抗体和抑制性VEGF-D片段和类似物是合适的抑制剂。人或人源化抗体及其片段对于选择抗体试剂用于人体治疗的情况是优选的。另外，作为本发明的另一方面，可预期使用任一上述试剂评估体外或体内的哺乳动物组织用于，例如诊断目的和筛查恶性肿瘤和恶性肿瘤的扩散。
对于任一上述试剂，预期可通过附着一个可检测的标记，包括但不限于放射性同位素(例如，14C，133I和125I)，发色团(例如，荧光素，藻胆蛋白质；四乙基罗丹明；产生用于通过荧光，吸光度，可见色，或凝集作用检测的荧光或有色产物，产生用于通过电子显微镜检术检测的电子密集产物的酶)；或诸如铁蛋白的电子密集分子，过氧化物酶，或金粒进一步改良该试剂用于诊断和筛查。同样，可通过与诸如植物，动物，微生物或真菌来源的毒素的具有抗肿瘤特性的分子；放射性同位素；药物，酶；和/或细胞因子及其它治疗蛋白连接(例如，偶连)或共同给药进一步改良该试剂用于治疗目的。(参见，例如，Pietersz & McKenzie，“治疗癌症的抗体偶连物”，Immunological Reviews，12957-80(1992)，本文引用以供参考。
实施例29作为人体治疗剂给药的抗-Flt4抗体A.抗-Flt4单克隆抗体的人源化在本文中，例如在实施例28中报道的Flt4的生物学表明了抑制配体介导的Flt4受体信号传导的Flt4抑制剂(拮抗剂)的治疗用途。Flt4-中和抗体包含用作Flt4拮抗剂的一类治疗剂。下面的方法用于提高作为人体治疗剂的抗-Flt4单克隆抗体的实用性，通过“人源化”单克隆抗体以提高其血清半寿期并导致它们在人类宿主中具有较小的免疫原性(即，防止对非人抗-Flt4抗体的人抗体反应)。
人源化的原理在文献中已有描述且通过抗体蛋白的模块组装实现。为了最小化结合补体的可能性，优选IgG4同种型的人源化抗体。
例如，通过产生含有诸如本文所述的抗-Flt4单克隆抗体的非人目的抗体蛋白的可变区与人抗体分子恒定区的嵌合抗体达到人源化水平。(参见，例如，Morrison和Oi，Adv.Immunol.，4465-92(1989))。Flt4中和抗-Flt4抗体的可变区从B-细胞杂交瘤的基因组DNA或者从目的杂交瘤分离的mRNA产生的cDNA中克隆。将V区基因片段与编码人抗体恒定区的外显子连接，且所得的构建体在合适的哺乳动物宿主细胞(例如，骨髓瘤或CHO细胞)中表达。
为了实现更高水平的人源化，仅将编码非人单克隆抗体基因的抗原结合互补性决定区(“CDR”)的那部分可变区基因片段克隆进人抗体序列中。[参见，例如，Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-36(1988)；和Tempest等，BiolTechnology，9266-71(1991)]。如有必要，将围绕CDR3区的人抗体的β-折叠结构也修饰成更接近反映原始单克隆抗体的抗原结合区的三维结构。(参见，Kettleborough等，Protein Engin.，4773-783(1991)；和Foote等，J.Mol.Biol.，224487-499(1992))。
在另一替代方法中，通过例如，定点诱变改变非人抗体的选定表面残基，同时保留非人抗体的所有内部和接触残基可人源化非人目的单克隆抗体的表面。参见Padlan，Molecular Immunol.，28(4/5)489-98(1991)。
采用上述方法使用Flt4-中和抗-Flt4单克隆抗体和产生它们的杂交瘤，例如抗体9D9F9，以产生人源化的Flt4-中和抗体用作治疗或减轻其中Flt4表达有害的病症。
B.来自噬菌体展示的人Flt4-中和抗体通过噬菌体展示技术产生人Flt4-中和抗体，例如按Aujame等，HumanAntibodies，8(4)155-168(1997)；Hoogenboom，TIBTECH，1562-70(1997)；和Rader等，Curr.Opin.Biotechnol.，8503-508(1997)所述，引用所有这些文献以供参考。例如，Fab片断形式或连接的单链Fv片断的抗体可变区与丝状噬菌体次要外壳蛋白pIII融合。该融合蛋白的表达及其掺入成熟噬菌体外壳产生在其表面存在抗体且含有编码该抗体的遗传材料的噬菌体颗粒。含有该构建体的噬菌体文库在细菌中表达，且使用标记的或固定的Flt4作为抗原探针淘选(筛选)该文库的Flt4-特异性噬菌体抗体。
C.来自转基因小鼠的人Flt4-中和抗体基本上按Bruggemann和Neuberger，Immunol.Today，17(8)391-97(1996)，和Bruggemann和Taussig，Curr.Opin Biotechnol.，8455-58(1997)所述在转基因小鼠中产生人Flt4-中和抗体。使用常规免疫方法用Flt4组合物免疫在种系结构中携带人V-基因片断且在其淋巴组织中表达该转基因的转基因小鼠。使用常规方法用来自免疫小鼠的B细胞产生杂交瘤并进行筛选以鉴定分泌抗-Flt4人抗体的杂交瘤(例如，如上所述)。
D.双特异性抗体产生特异性结合Flt4且特异性结合与病理学和/或治疗相关的其它抗原的双特异性抗体，分离，并使用已在文献中描述的标准方法检验。参见，例如Pluckthun & Pack，Immunotechnology，383-105(1997)；Carter等，J.Hematotherapy，4463-470(1995)；Renner & Pfreundschuh，ImmunologicalReviews，1995，第145期，第179-209页；Pfreundschuh的美国专利号5,643,759；Segal等，J.Hematotherapy，4377-382(1995)；Segal等，Immunobiology，185390-402(1992)；和Bolhuis等，Cancer Immunol.Immunother.，341-8(1991)，本文引用所有这些文献以其整体作为参考。
实施例30证实抗-Flt4疗法对于癌症治疗的效果的动物模型预期任何癌症治疗可接受的动物可用于证实抗-Flt4疗法对于癌症治疗的效果。使用标准剂量-反应试验证实乳腺癌治疗效果的实验模型包括在Tekmal和Durgam，Cancer Lett.，118(1)21-28(1997)；Moshakis等，Br.J.Cancer，43575-580(1981)；和Williams等，J.Nat.Cancer Inst.，66147-155(1981)中所述的那些模型。除了鼠类模型外，还包含狗和猪模型，因为至少某些抗-人Flt4抗体(例如，9D9抗体)也识别来自狗和猪的Flt4。监测肿瘤大小和副作用以证实相对于对照的治疗效果。
实施例31可溶性FLT4抑制VEGF-C介导的肿瘤生长和转移为了进一步证实VEGF-C在肿瘤发生中的体内作用，将过量表达重组VEGF-C的MCF-7人乳腺癌细胞同位移植进SCID小鼠。VEGF-C的过量表达增进肿瘤生长，但与VEGF-A的过量表达不同，它对肿瘤血管生成的影响很小。另一方面，VEGF-C强烈促进与肿瘤相关的淋巴管的生长，该淋巴管在肿瘤周围，通常有肿瘤细胞渗入。VEGF-C的这些效果可被可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制。这些数据表明VEGF-C可增量调节肿瘤生长和/或通过淋巴管的转移，且可通过抑制VEGF-C与其受体之间的相互作用来抑制这些效果。具体地说，可使用可溶性VEGFR-3/Flt4抑制该相互作用。
材料和方法A.质粒表达载体的制备将编码人VEGF-C或VEGF165的cDNAs导入pEBS7质粒(Peterson和Legerski，Gene，107279-84，1991)中。使用相同载体表达含有与人免疫球蛋白γ链的Fc-结构域融合的VEGFR-3前3个免疫球蛋白同源结构域的可溶性受体嵌合体VEGFR-3-Ig，和在相似构建体中含有VEGFR-1前5个Ig同源结构域的VEGFR-1-Ig(Achen，等，Proc NatlAcadSci USA，95548-53，1998)。
B.转染细胞的产生和分析通过电穿孔用质粒DNA转染人MCF-7乳腺癌细胞系的MCF-7S 1亚克隆并按以前所述(Egeblad和Jaattela，Int J Cancer，86617-25，2000)选择和培养稳定的细胞集落。在补充了100μCi/ml[35S]-甲硫氨酸和[35S]-半胱氨酸(Redivue Pro-Mix，Amersham Pharmacia Biotech)的无甲硫氨酸和半胱氨酸的MEM(Gibco)中代谢标记该细胞。使用抗VEGF-C抗体从该条件培养基中免疫沉淀该标记的生长因子(Joukov，等，EMBO J，163898-911，1997)或VEGF(MAB293，R & D Systems)。使用蛋白质A琼脂糖(AmershamPharmacia Biotech)沉淀该免疫复合物和VEGFR-Ig融合蛋白，在0.5％ BSA，0.02％ Tween 20的PBS中洗涤两次并在PBS中洗涤一次，在还原条件下在SDS-PAGE中分析。
C.细胞增生和肿瘤发生试验将细胞(20,000个/孔)在24孔板中一式四份涂板，1，4，6，或8天后在平行板上胰酶消化并使用血细胞计数器计数。4和6天后提供新鲜培养基。对于肿瘤发生试验，通过胰酶作用收获亚汇合培养物，洗涤两次并将PBS中的107个细胞接种进切除卵巢的SCID小鼠第二(腋窝)乳腺的脂肪垫中，该小鼠携带含有0.72mg 17β-雌二醇(Innovative Research of America)的皮下60天缓释型药丸。卵巢切除和药丸移植在肿瘤细胞接种前4-8天进行。以盲试方式每周两次测量肿瘤的长度和宽度，肿瘤体积计算为长度×宽度×深度X0.5，假定肿瘤为半椭圆体且深度与宽度相同(Benz等，Breast Cancer ResTreat，2485-95，1993)。
D.血管的组织学和定量切除肿瘤，在4％多聚甲醛(pH7.0)中固定24小时，并包埋于石蜡中。按照公开的方法(Partanen等，Cancer，862406-12，1999)用抗PECAM-1(Pharmingen)，VEGFR-3(Kubo等，Blood，96546-553，2000)或PCNA(Zymed Laboratories)的单克隆抗体或抗LYVE-1(Banerji等，J CellBiol，144789-801，1999)，VEGF-C(Joukov等，EMBO J，163898-911，1997)或层粘连蛋白的多克隆抗体免疫染色切片(7μm)。从切片中最高血管密度(血管热点)的3个区域(60x放大倍数)测定PECAM-1阳性血管数目的平均值。使用盲试肿瘤样品进行所有组织学分析。
E.可溶性VEGFR-3的腺病毒表达和伊文思蓝排出试验将编码VEGFR-3-Ig融合蛋白的cDNA亚克隆进pAdBglII质粒并按以前所述(Laitinen等，Hum Gene Ther.，91481-6，1998)产生腺病毒。在肿瘤细胞接种前3小时将VEGFR-3-Ig或LacZ对照(Laitinen等，Hum Gene Ther.，91481-6，1998)腺病毒以109pfu/只小鼠静脉内注射进SCID小鼠中。3周后，麻醉每组中的四只小鼠，切开腹部皮肤并将几微升PBS中的3％伊文思蓝染料(Sigma)注射进肿瘤中。肉眼观察肿瘤中染料的排出。
结果A.VEGF-C或VEGFR-3-Ig的表达不影响体外的MCF-7细胞生长如上所述用编码全长人VEGF-C或可溶性VEGFR-3融合蛋白(VEGFR-3-Ig)的表达质粒转染MCF-7人乳腺癌细胞并选择稳定的细胞集落。为进行比较，在相同细胞中表达人VEGF165或VEGFR-1-Ig。使用免疫沉淀法分析这些细胞的条件培养基的有效产量和该蛋白质的分泌。在还原条件下在PAGE中分析来自代谢标记的MCF-7细胞的VEGF-C，VEGF或可溶性受体蛋白的免疫沉淀。
该研究揭示了VEGF-C，VEGF，可溶性VEGFR-3融合蛋白或可溶性VEGFR-1融合蛋白的过量表达不影响MCF-7乳腺癌细胞的体外增生。当将该细胞接种进24孔平板并使用血球计数器测量其生长时，发现不影响转染细胞的生长率。
B.VEGF-C 增′进肿瘤生长而不影响肿瘤血管生成为了测定VEGF-C的体外效力，将MCF-7细胞集落植入切除卵巢的SCID小鼠的乳腺脂肪垫中，该小鼠携带缓释雌激素药丸以提供支持MCF-7肿瘤生长所需的恒定激素水平。
VEGF-C的过量表达显著增加肿瘤生长(VEGF-C545mm3±110mm3，对照268mm3±69mm3，在第13天，n＝8，p＜0.0001，学生t-检验)。然而，VEGF-C的过量表达对肿瘤生长的影响比VEGF-A的显著性低得多(VEGF-A1136mm3±339mm3，对照189mm3±57mm3，在第15天，n＝6，p＜0.0001，学生t-检验)。通过分别混合VEGF-C或VEGF过量表达的MCF-7细胞与表达可溶性VEGFR-3或VEGFR-1融合蛋白的细胞可抵消增加的肿瘤生长。另外，发现通过静脉内注射重组腺病毒在肝脏中表达的循环可溶性VEGFR-3-Ig也抑制VEGF-C过量表达的肿瘤生长的增加。
为了研究VEGF-C对肿瘤血管生成的影响，染色肿瘤切片的PECAM-1，它是一种主要在血管中表达且在淋巴管中微弱表达的内皮抗原。肿瘤中PECAM-1阳性血管的定量揭示了VEGF-C的过量表达对肿瘤血管的密度具有极小的影响(VEGF-C肿瘤为40.2±12.2个血管/个显微镜视野，n＝18且对照肿瘤为36.6±11.6，n＝23，三个不同实验的平均值)。相反，VEGF-A的过量表达使得血管密度增加大约两倍。
C.VEGF-C的过量表达与淋巴管形成和肿瘤细胞的内部淋巴管生长相关通过免疫染色淋巴管特异性标记LYVE-1分析VEGF-C对肿瘤相关的淋巴管的影响(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)。该标记揭示了在VEGF-C过量表达的肿瘤周围淋巴管高度增生。在许多LYVE-1日性内皮细胞中检测到增生的细胞核抗原(PCNA)，表明这些淋巴管活跃增生。通过VEGFR-3染色且缺乏基底层成份层粘连蛋白染色鉴定淋巴管结构。在一些VEGF-C过度表达的肿瘤内部也存在薄淋巴管。
肿瘤外周的淋巴管通常被VEGF-C阳性肿瘤细胞渗入。截然相反的是，VEGF过度表达和对照肿瘤不含或者仅含少量淋巴管。
D.循环可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制VEGF-C诱导的淋巴管生成在人乳腺癌中，使用centinel node方法跟踪淋巴排出和转移癌扩散(作为综述，参见Parker等，Radiol Clin North Am，38809-23,2000)。为了跟踪MCF-7肿瘤的淋巴排出，将伊文思蓝染料注射进用VEGFR-3-Ig或对照腺病毒感染的小鼠中的VEGF-C过量表达或对照肿瘤中。对照实验表明用VEGFR-3-Ig腺病毒感染培养的人胚胎肾细胞导致大量分泌可溶性VEGFR-3-Ig融合蛋白且静脉内感染小鼠导致血清中VEGFR-3-Ig融合蛋白的高系统水平。将伊文思蓝染料注射进肿瘤导致淋巴管染色而血管不染色，且揭示了与对照肿瘤相比围绕VEGF-C过量表达的肿瘤的扩张的淋巴管的数目增加。大多数扩张的淋巴管在用VEGFR-3-Ig腺病毒处理的小鼠的VEGF-C过量表达的肿瘤中不存在。
上述数据证实了在MCF-7乳房肿瘤中VEGF-C过量表达强烈且特异性地诱导肿瘤相关的淋巴管生长，但对肿瘤血管生成无重大影响。另外，证实了VEGF-C-介导的肿瘤生长增加和肿瘤相关性淋巴管形成受到可溶性VEGFR-3融合蛋白(即，一种选择用于抑制对表达VEGFR-3的内皮细胞的VEGF-C-介导的刺激的试剂)的抑制。
由于缺乏特异性标记，过去难以确定肿瘤是主动诱导淋巴管形成还是仅仅通过过度生长包围已有的淋巴管且由于肿瘤内的高间隙液压而压迫它们。最近来自各种实验模型的数据表明存在后一种情况(Leu等，Cancer Res，604324-7,2000；Stohrer等，Cancer Res，604251-5，2000)。这里首次表明VEGF-C的过度表达可诱导与实验肿瘤相关的淋巴管生长。VEGF-C诱导的肿瘤外周的淋巴管高度增生且大多数充满肿瘤细胞，而肿瘤内的淋巴管是扁平的且没有腔。与正常成人组织中的淋巴管内皮细胞不同，与MCF-7肿瘤相关的淋巴管内皮细胞活跃增生。因此，似乎大多数肿瘤外周和肿瘤内部的淋巴管可通过已有淋巴管内皮细胞的增生产生。
通过淋巴进入局部淋巴结的癌扩散在临床使用中长期作为一种重要的预后指标。本实施例中证实的与VEGF-C过量表达的肿瘤相关的扩张淋巴管内部肿瘤细胞的生长非常类似于人乳腺癌中与转移瘤扩散进淋巴结且存活率低相关的肿瘤外周的淋巴侵入(Lauria等，Cancer，761772-8，1995)。因此，本文报导的数据提供了VEGF-C表达促进通过淋巴系统的肿瘤转移的证据。因此，鉴于实施例28和其它数据表明在许多类型的实体瘤血管中VEGFR-3受到增量调节(Valtola等，Am J Pathol，1541381-90，1999；Partanen等，Cancer，862406-12，1999；Kubo等，Blood，96546-553，2000)，本实施例证实了实现VEGF-C过量表达的肿瘤模型大都有淋巴管生成。
正如VEGFR-3融合蛋白抑制VEGF-C过量表达的肿瘤生长的能力所示，VEGF-C对肿瘤生长的影响不仅仅是由于细胞集落之间的变异。通过将伊文思蓝染料注射进肿瘤，证实了大型排出淋巴管数目的增加与VEGF-C过量表达的肿瘤相关。很可能功能性淋巴管的数目越多导致淋巴排出越好，因此间隙压力越低且VEGF-C过量表达的肿瘤中血液灌注增强。无论是VEGF-C/D-VEGFR-3介导进行性肿瘤通过血管发生的淋巴管生成达到特定的肿瘤进程，还是两者都有，本发明的治疗方法将抑制这些进程。
最后，上述结果表明肿瘤细胞产生的VEGF-C可诱导肿瘤周围的淋巴管生长，从而促进癌的淋巴内扩散。该数据表明通过，例如采用可溶性VEGFR-3蛋白的基因疗法抑制肿瘤相关的淋巴管生成是抑制肿瘤转移的有价值的方法。
实施例32
在表达可溶性VEGFR-3/FLT4的小鼠中抑制淋巴管生成前面的实施例证实了VEGF-C增加体内肿瘤生长且该肿瘤生长的促进与淋巴管相关。VEGF-C的这些效果受到可溶性VEGFR-3融合蛋白的抑制。本实施例提供了可溶性VEGFR-3是VEGF-C/VEGF-D信号传导的有效抑制剂的进一步证据，当在转基因小鼠的皮肤中表达时，它抑制淋巴管生成且诱导已经形成的淋巴管退化而血管系统保持完整。
更具体的说，本实施例表明由与免疫球蛋白(Ig)γ-链的Fc区连接的VEGFR-3胞外部分的配体结合部分组成的嵌合蛋白(VEGFR-3-Ig)中和VEGF-C和VEGF-D的活性且在小鼠表皮中在角蛋白-14(K14)启动子控制下表达时抑制皮肤淋巴管系统的形成。由于在这些小鼠中血管网络保持正常，因此该抑制对于淋巴管似乎是特异性的。VEGFR-3-Ig诱导胚胎发育期间淋巴管的退化，表明该受体的连续信号对于淋巴管系统的维持是必需的。
材料和方法A.VEGF-C，VEGF-D和VEGFR-Ig融合蛋白的生产人VEGF-C的成熟形式如上文实施例31和Joukov等，(EMBO J.163898-3911，1997)所述。VEGF-D从R&D Systems(Minneapolis，Minnesota)获得。由与人IgGI Fc区融合的人VEGFRs的配体结合区组成的VEGFR-1-Ig和VEGFR-3-Ig蛋白在果蝇属S2细胞(Invitrogen，Carlsbad，California)中生产。
B.VEGFR-3生物测定将表达VEGFR-3/EpoR嵌合体的Ba/F3细胞(Achen，Eur.J Biochem.267，2505-2515，2000)以15,000个细胞/孔一式三份接种在补充了100ng/ml的VEGF-C和所示浓度的VEGFR-Ig蛋白的96-孔微量滴定平板上。48小时后，通过加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-yl)-2，5-二苯基溴化四氮唑(Sigma)，0.5mg/ml)测定细胞活力，接着再培养2小时，加入等体积的细胞溶胞产物溶液(10％SDS，10nM HCl)并在37℃下培养过夜。在540nm下测量吸光度。
C.转基因小鼠的产生使用PCR扩增编码人VEGFR-3 Ig-同源性结构域1-3的序列。用于该目的的引物是5′-TACAAAGCTTTTCGCCACCATGCAG-3′(SEQ ID NO23)和5’-IACAGGATCCI℃ATGCACAATGACCTC-3′(SEQ ID NO24)。
将该PCR产物克隆进plg-plus载体(Ingenius，R & D Systems)的含有人IgGI Fc尾的阅读框中。然后将VEGFR-3-Ig构建体转移进人角蛋白-14启动子表达载体中。将该表达盒片断注射进FVB/NIH和DBAxBalbC杂交品种的受精的小鼠卵母细胞中产生7个品系的K14-VEGFR-3-Ig小鼠。分析转基因表达且从表达转基因的所有3个建立品系按下文所述证实其表型。
D.转基因表达的分析对于northern印迹，对在1％琼脂糖中的从皮肤提取的10μg总RNA进行电泳，转移到尼龙膜(Nytran)上，用相应的[32P]-标记的cDNA探针进行杂交且通过放射自显影法曝光。对于western印迹，将皮肤活组织匀浆进补充了1mM PMSF，1mU/ml抑蛋白酶肽，1mM Na3VO4和10μg/ml亮抑蛋白酶肽的裂解缓冲液(20mM Tris，pH7.6，1mM EDTA，50mM NaCl，50mM NaF，1％ Triton-X100)中。从1mg总蛋白中沉淀Ig-融合蛋白并在SDS-PAGE中分离，转移到硝化纤维素上并使用辣根过氧化物酶偶连的兔抗人IgG抗体(DAKO，Carpinteria，California)和增强化学发光检测系统进行检测。
E.免疫组织化学和TUNEL染色用抗小鼠VEGFR-3的大鼠单克隆抗体(Kubo等，Blood 96546-553，2000)或CD31/PECAM-1(PharMingen，San Diego，California)，抗小鼠LYVE-1的兔多克隆抗体(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)，或生物素标记的抗人IgG Fc区的小鼠单克隆抗体(Zymed，San Diego，California)染色来自4％多聚甲醛(PFA)固定的组织的石蜡切片(5μm)。对于TUNEL染色，使用原位细胞死亡检测试剂盒(荧光素；Roche，Indianapolis，IN)进行DNA片断的检测。
F.血管和淋巴管的观察为了观察血管(Thurston等，Science 286，2511-2514(1999))，通过股静脉注射(IV)100μl 1mg/ml生物素标记的番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素(Sigma)且使其循环2分钟。通过用PBS中的1％ PFA/0.5％戊二醛灌注固定后，通过ABC-3，3′-二氨基联苯胺过氧化物酶反应观察结合的凝集素。然后通过β-半乳糖苷酶底物X-Gal(Sigma，St.Louis，MO)染色VEGFR-3+/LacZ小鼠中的淋巴管。为了观察功能性淋巴管，将伊文思蓝染料(5mg/ml；Sigma，St.Louis，MO)注射进下肢爪垫或者将TRITC-葡聚糖(Sigma，8mg/ml)注射进耳朵或尾巴并分别通过光学或荧光显微镜分析淋巴管。
G.血清中VEGFR-3-Ig蛋白的检测用抗人IgG(Zymed，2μg/ml溶于PBS中)或人VEGFR-3(克隆7B8，4μg/ml)的小鼠抗体覆盖ELISA平板(Nunc Maxisorp，Copenhagen，Denmark)。将小鼠血清稀释进温育缓冲液(5mg/ml BSA，0.05％ Tween 20溶于PBS中)并使其在室温下结合2小时。然后在加入小鼠抗人IgG1(Zymed，1∶500)前1小时用温育缓冲液洗涤平板3次。然后在孔中温育与碱性磷酸酶偶连的链霉菌抗生物素蛋白(Zymed，1∶5000)30分钟，接着加入底物(1mg/ml对硝基苯磷酸溶于0.1M二乙醇胺，pH10.3中)且在405nm下阅读吸光度。
H.磁共振成像使用连接到9.4 T垂直磁体(Oxford Instruments，Oxford，UK)上的s.m.i.s.控制台(Surrey Medical Imaging Systems，Guildford，UK)获得MRI数据。使用单环表面线圈(直径为35mm)用于信号传输和检测。T2-加权的(TR2000ms，TE 40ms，4次扫描/行)多切片自旋-回波顺序使用的FOV为25.6mm2(矩阵大小256×128)且切片厚度横向为1.3mm。集中在1.2ppm的饱和脉冲用于减少T2-图像中的脂肪信号。使用在自旋-回波顺序(TR 2000ms，TE 40ms)中沿切片轴的单极扩散梯度(b-值≈800s/mm2)获得扩散加权的MRI，通过将MRI数据拟合成b-值的单指数函数计算水表面扩散系数(ADC)。
结果A.可溶性VEGFR-3抑制VEGF-C-介导的体外信号传导为了抑制通过VEGFR-3的VEGF-C信号传导，采用由VEGFR-3的前3个Ig-同源结构域和IgG Fc结构域组成的融合蛋白。VEGFR-3-Ig以与全长胞外域相同的效率结合VEGF-C和VEGF-D并抑制VEGF-C-诱导的VEGFR-3磷酸化及随后在表达VEGFR-3的内皮细胞中p42/p44促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)激活。相反，不结合VEGF-C的相似VEGFR-1-Ig融合蛋白不影响p42/p44 MAPK激活。
使用能够在不存在IL-3的条件下传输IL-3依赖型Ba/F3细胞的VEGF-C依赖型存活和增生信号的嵌合VEGFR-3/促红细胞生成素(Epo)受体在生物试验中也测定了可溶性VEGFR-3对VEGF-C信号传导的影响(Achen等，Eur.J.Biochem.，2672505-2515，2000)。在该细胞测定中，在0.5∶1摩尔比(VEGFR-3-IgVEGF-C)下VEGF-C-依赖型细胞存活受到完全抑制，而VEGFR-1-Ig无影响。同样，VEGFR-3-Ig也消除VEGFR-3/EpoR细胞的VEGF-D-诱导型存活。相反，即使VEGFR-2-Ig的摩尔数过量10倍也只能部分消除VEGF-C依赖性活力，这也许是由于VEGF-C与VEGFR-2的亲和性更低。
B.可溶性VEGFR-3抑制体内淋巴管的形成为了测定体内VEGFR-3-Ig的抑制效果，在指导转基因表达到皮肤的基层表皮细胞中的K14启动子控制下表达该融合蛋白。通过对皮肤RNA的northern印迹和对皮肤蛋白提取物的western印迹检测小鼠中的VEGFR-3-Ig表达。这些小鼠表现健康且能生育并具有正常寿命。对皮肤的组织学检查揭示了真皮和皮下层增厚。抗体染色证实了在基层角质细胞中表达VEGFR-3-Ig。染色皮肤切片的淋巴管内皮标记VEGFR-3(Jussila等，CancerRes.581599-1604，1998；Kubo等，Blood，96546-553，2000)和LYVE-1(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)时，在转基因小鼠中没有观察到淋巴管，即使在对照小鼠的皮肤中淋巴管被染色。相反，在转基因和野生型皮肤中均染色了血管的泛内皮标记PECAM-1/CD31。
C.可溶性VEGFR-3抑制淋巴管生成但不能抑制血管生成为了更好地观察淋巴管，将K14-VEGFR-3-Ig小鼠与在Flt4基因座表达β-gal的杂合型VEGFR-3+/LacZ小鼠(Dumont等，Science 282，946-949，1998)交配。当使用底物X-gal染色耳朵皮肤的整体固定的组织标本时，没有检测到淋巴管，而在对照小鼠中，观察到染成蓝色的淋巴管。在使用生物素标记的凝集素进行的血管灌注染色(Thurston等，Science 286，2511-2514，1999)中，在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中血管表现正常。
使用功能性测定监测注射进皮肤的伊文思蓝染料或TRITC-葡聚糖的命运也证实了不存在淋巴管。注射进野生型小鼠下肢爪垫后，该染料迅速集中到围绕坐骨静脉的淋巴管，而在集合淋巴管不存在或者退化的转基因小鼠中在该淋巴管中未见染料。对真皮内注射进耳朵或尾巴的TRITC葡聚糖使用荧光显微镜检术也观察到对照小鼠中的淋巴管，而在转基因小鼠中未见该淋巴管。
D.循环可溶性VEGFR-3与内部器官的淋巴组织瞬时丢失相关在两周大时，与对照VEGFR-3+/LacZ同窝交配的小鼠相比时，VEGFR-3-Ig/VEGFR-3+/LacZ小鼠在诸如隔膜，心，肺，盲肠，胰腺，肠系膜和食道的器官内如果还有淋巴管，也仅有少量薄且退化的淋巴管。通过免疫染色VEGFR-3和LYVE-1证实了X-Gal染色获得的该发现。另外，在心包中缺乏淋巴管与至少一些小鼠中心包液的积累相关。在3周大时，淋巴管的再生长明显。在成年转基因小鼠中，只有一些诸如心脏和隔膜的器官有异常形式和不完全发育的淋巴管。
在内部器官中可见的该效果表明可溶性VEGFR-3-Ig蛋白质在血流中循环。事实上使用特异性酶联免疫吸附试验在转基因小鼠血清中检测到该融合蛋白；其水平在100-200ng/ml之间变化，在幼龄小鼠中最高。根据我们的体外实验，该浓度可中和大约20-40ng/ml的VEGF-C。VEGFR-3-Ig蛋白在血流中相当稳定，因为静脉内注射的重组VEGFR-3-Ig在血清中存在至少9小时。
E.转基因表型具有人淋巴水肿特征K14-VEGFR-3-Ig小鼠与其野生型同窝交配小鼠的区别在于其脚肿胀，且在出生时已经可见。老年小鼠表现出皮肤增厚，真皮纤维变性和皮下脂肪沉积增加。磁共振成像(MRI)揭示了在转基因小鼠的脚部皮肤和皮下组织有显著的T2-高强度区，表明液体累积增加，而在同窝交配的对照小鼠中没有该区域。这些高强度区的表面扩散系数(ADC)为1.99
×10-3mm2/s，比ADC为1.32
×10-3mm2/s的正常组织更高，且比脂肪的该值高大约1-2个数量级(Thurston，等，Science 286，2511-2514(1999)。另外，淋巴结的大小和外观有变化，特别是在围绕下腔静脉的大型主动脉旁淋巴结中。然而，在VEGFR-3-Ig小鼠中可见肠系膜淋巴结和淋巴集结。
F.发育中的淋巴管通过内皮细胞的编程性细胞死亡进行退化在胚胎发生期间，在E14.5时出现K14-启动的转基因表达显著增加，到E16.5时，该表达包围整个胚胎皮肤(Byrne，等，Development 120，2369-2383，1994)。当通过X-Gal染色在VEGFR-3+/LacZ背景中分析时，E15的转基因和野生型胚胎之间皮肤的淋巴网无区别。在E15.5-16.5时，转基因胚胎的淋巴管在某些区域退化。在E17.5时，淋巴管仍形成连续网络但是比对照胚胎中更细。在E18.5时，转基因胚胎中全部皮肤淋巴网络中断，且在出生后在皮肤中没有或者仅有少量单个中断的淋巴管，主要伴随着大型皮肤血管。因此，在胚胎发生期间在皮肤中开始形成淋巴管，但是当转基因开始表达时发生退化。然而，正如在Tie-启动子-LacZ背景中通过X-Gal染色所示，在K14-VEGFR-3-Ig胚胎中不会抑制皮肤血管系统的形成(Korhonen等，Blood86，1828-1835(1995))。
使用TUNEL染色检测内皮细胞中的编程性细胞死亡，通过同时染色PECAM-1可鉴定该细胞。在E17.5和E18.5时在转基因胚胎的真皮中首先看见编程性死亡的内皮细胞。在野生型胚胎中没有看见内皮细胞的编程性死亡。在转基因皮肤中几乎仅在VEGFR-3阳性内皮中检测到TUNEL-阳性细胞，表明VEGFR-3-Ig介导的编程性细胞死亡靶向淋巴管内皮。
本实施例表明可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制淋巴管生成且导致已有的胎儿体内淋巴管退化。因此连续的VEGFR-3信号传导是胎儿发育和淋巴管系统的维持所必需的。
K14-VEGFR-3-Ig小鼠的皮肤中缺乏淋巴管与在诸如人淋巴水肿(淋巴系统不全引起的一种疾病且其特征在于严重性递增的肢端肿大)的真皮且特别是皮下脂肪层的增厚相关(Witte等，淋巴管发生机理，意义和临床含义。参见Regulation of Angiogenesis(编辑，Goldberg，I.D.& Rosen，E.M.)65-112(Birkhauser Verlag，Basel，瑞士)1997；Mortimer，Cancer 83，2798-2802(1998))。在作为遗传疾病的原发性淋巴水肿中，表面或皮下淋巴管通常发育不全或有再生障碍，它们不能将淋巴液转运进静脉循环。当手术，辐射，感染或创伤损伤淋巴管时形成非遗传的继发性或获得性淋巴水肿。在淋巴水肿中，间隙空间内富含蛋白的液体累积导致组织纤维变性和脂肪变性，干扰伤口愈合，且对感染易感。在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中，在真皮中缺乏大分子运输，且特别是在老年小鼠中存在真皮纤维变性的迹象。另外，在转基因小鼠中脚肿大且在皮肤和皮下组织中液体累积增加与人淋巴水肿的症状相似。因此K14-VEGFR-3-Ig小鼠的皮肤表型共有人淋巴水肿的一些特征。在一些淋巴水肿家族的研究中，在Flt4的酪氨酸激酶编码区中检测到杂合失活的错义突变(Karkkainen等，Nature Genet.，25153-159，2000；Irrthum等，Am.J.Hum.Gen.67259-301 2001)。至少一些淋巴水肿患者由于VEGFR-3信号传导有缺陷而具有淋巴机能障碍。与这些观察一致，本实施例中的结果表明通过可溶性VEGFR-3蛋白中断VEGFR-3的信号传导可完全破坏淋巴网络并导致淋巴水肿样表型。另外，在一些淋巴水肿病例中，某些局部淋巴结的大小和外观可变，表明淋巴流动和有功能的淋巴管系统是正常淋巴结形成所必需的。
VEGFR-3-Ig也诱导已经形成的淋巴管退化。因此，发育期间抑制VEGF-C和/或VEGF-D与VEGFR-3的结合导致淋巴管内皮细胞的编程性细胞死亡和淋巴管网络的破坏，这表明连续的VEGFR-3信号是淋巴管内皮细胞存活所必需的。在细胞培养物中，VEGFR-3激活与内皮细胞存活相关的生化信号传导级联。尽管在皮肤中过量表达VEGF-C(Jeltsch等，Science，2761423-1425，1997)或VEGF-D的转基因小鼠形成增生的真皮淋巴管系统，但是当与K14-VEGFR-3-Ig小鼠交配时其真皮淋巴管也退化。由于两种VEGFR-3配体也在皮肤中表达，因此在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中观察到的表型可能是由于同时抑制了VEGF-C和VEGF-D。
尽管VEGF-C和VEGF-D对于体外和体内的血管内皮细胞都具有促有丝分裂活性(Joukov等，EMBO J.16，3898-3911，1997；Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，548-553，1998；Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，14389-143921998；Witzenbichler等，Am.J..Pathol.153，381-394，1998；Marconcini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，9671-9676，1999)，但是VEGFR-3-Ig似乎不影响血管。K14-启动子表达的延迟起动可解释VEGFR-3-Ig蛋白的淋巴管特异性。在大约E14.5-16.5之前看不到K14-启动子活性的大量增加(Byrne等，Development 1202369-2383，1994)。尽管在E8.5时在发育中的血管中首先检测到内源性VEGFR-3的表达，但到E14.5-16.5时，在健康血管内皮中该表达受到大幅度减量调节(Dumont等，Science 282，946-949 1998；Kaipainen，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，3566-3570，1995)。因此，在发育期间，当正常情况下在健康组织的血管内皮中不再存在VEGFR-3时，VEGFR-3信号比其它受体在皮肤的血管发生中起更小的作用。
在幼龄VEGFR-3-Ig小鼠中，一些内部器官几乎完全缺乏淋巴管，但是它们在成年小鼠中再生，尽管在一些器官中再生成异常形式。因此淋巴管系统的生长和维持可在成年器官中被再活化。VEGFR-3抑制水平的降低或来自例如，成熟结缔组织基质的独立信号可再活化淋巴管发生，但是没有获得可表明VEGF-C或VEGF-D水平增加对其负责的证据。然而，通过腺病毒载体以超过通常在间隙液中发现的VEGF-C的量施用VEGF-C可导致成人组织中的淋巴管生长。在基因治疗中使用不再结合VEGFR-2的修饰的VEGF-C(美国专利号6,130,071；Joukev等，J.Biol.Chem.，2736599-6602)可防止其对血管内皮的潜在影响。
因此，可溶性VEGFR-3是体内淋巴管发生的有效且特异性的抑制剂。可溶性VEGFR-3包含在本说明书别处所述的Flt4的胞外片断。正如上文所见，优选的可溶性VEGFR-3是包含VEGFR-3前3个结构域的VEGFR-3，然而，应明白可溶性VEGFR-3可以是或多或少含有图2所示的VEGFR-3野生型序列的VEGFR-3的片断。例如，该可溶性肽也可包含一个或多个IgIV，IgV，IgVI，IgVII。作为选择，可溶性VEGFR-3可包含只有IgI与选自由IgII，IgIII，IgIV，IgV，IgVI和IgVII组成的组中的一个或多个结构域的任意组合。
另外，本实施例还建立了具有人淋巴水肿特征的小鼠模型。由于淋巴水肿通常与皮肤相关，因此该小鼠模型用于了解和鉴定该疾病和用于试验可应用于病人的新疗法。
在本发明小结和详细描述中引证的包括专利和杂志文章的所有文献在此引用以其整体作为参考。
尽管结合其具体实施方案已经在此描述了本发明，但应理解可作出进一步的修改，且本申请试图覆盖一般遵循本发明的原理且包括与本说明书有偏差的本发明的任何变化，用法，或改编，因为它们落在本发明所属领域的已知或常规实践的范围内，且可应用于上文所述和下面所附权利要求书范围内的必要特征。
序列表<110>路德维格癌症研究院利森蒂亚有限公司<120>Flt4(VEGFR-3)作为靶用于肿瘤成像和抗肿瘤治疗<130>28113/34891<140>
<141>
<150>08/901,710<151>1997-07-28<150>08/340,011<151>1994-11-14<150>08/257,754<151>1994-07-09<150>07/959,951<151>1992-10-09<160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4195<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(20)..(3913)<400>1ccacgcgcag cggccggag atg cag cgg ggc gcc gcg ctg tgc ctg cga ctg 52Met Gln Arg Gly Ala Ala Leu Cys Leu Arg Leu1 5 10tgg ctc tgc ctg gga ctc ctg gac ggc ctg gtg agt ggc tac tcc atg 100Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Asp Gly Leu Val Ser Gly Tyr Ser Met15 20 25acc ccc ccg acc ttg aac atc acg gag gag tca cac gtc atc gac acc 148Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val Ile Asp Thr30 35 40ggt gac agc ctg tcc atc tcc tgc agg gga cag cac ccc ctc gag tgg 196Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp45 50 55gct tgg cca gga gct cag gag gcg cca gcc acc gga gac aag gac agc 244Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser60 65 70 75gag gac acg ggg gtg gtg cga gac tgc gag ggc aca gac gcc agg ccc 292
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atc agc ctg gag ctg gtg gtg aat gtg ccc ccc cag ata cat gag aag 1300Ile Ser Leu Glu Leu Val Val Asn Val Pro Pro Gln Ile His Glu Lys415 420 425gag gcc tcc tcc ccc agc atc tac tcg cgt cac agc cgc cag gcc ctc 1348Glu Ala Ser Ser Pro Ser Ile Tyr Ser Arg His Ser Arg Gln Ala Leu430 435 440acc tgc acg gcc tac ggg gtg ccc ctg cct ctc agc atc cag tgg cac 1396Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Val Pro Leu Pro Leu Ser Ile Gln Trp His445 450 455tgg cgg ccc tgg aca ccc tgc aag atg ttt gcc cag cgt agt ctc cgg 1444Trp Arg Pro Trp Thr Pro Cys Lys Met Phe Ala Gln Arg Ser Leu Arg460 465 470 475cgg cgg cag cag caa gac ctc atg cca cag tgc cgt gac tgg agg gcg 1492Arg Arg Gln Gln Gln Asp Leu Met Pro Gln Cys Arg Asp Trp Arg Ala480 485 490gtg acc acg cag gat gcc gtg aac ccc atc gag agc ctg gac acc tgg 1540Val Thr Thr Gln Asp Ala Val Asn Pro Ile Glu Ser Leu Asp Thr Trp495 500 505acc gag ttt gtg gag gga aag aat aag act gtg agc aag ctg gtg atc 1588Thr Glu Phe Val Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Lys Leu Val Ile510 515 520cag aat gcc aac gtg tct gcc atg tac aag tgt gtg gtc tcc aac aag 1636Gln Asn Ala Asn Val Ser Ala Met Tyr Lys Cys Val Val Ser Asn Lys525 530 535gtg ggc cag gat gag cgg ctc atc tac ttc tat gtg acc acc atc ccc 1684Val Gly Gln Asp Glu Arg Leu Ile Tyr Phe Tyr Val Thr Thr Ile Pro540 545 550 555gac ggc ttc acc atc gaa tcc aag cca tcc gag gag cta cta gag ggc 1732Asp Gly Phe Thr Ile Glu Ser Lys Pro Ser Glu Glu Leu Leu Glu Gly560 565 570cag ccg gtg ctc ctg agc tgc caa gcc gac agc tac aag tac gag cat 1780Gln Pro Val Leu Leu Ser Cys Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Tyr Glu His575 580 585ctg cgc tgg tac cgc ctc aac ctg tcc acg ctg cac gat gcg cac ggg 1828Leu Arg Trp Tyr Arg Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala His Gly590 595 600aac ccg ctt ctg ctc gac tgc aag aac gtg cat ctg ttc gcc acc cct 1876Asn Pro Leu Leu Leu Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro605 610 615ctg gcc gcc agc ctg gag gag gtg gca cct ggg gcg cgc cac gcc acg 1924Leu Ala Ala Ser Leu Glu Glu Val Ala Pro Gly Ala Arg His Ala Thr620 625 630 635ctc agc ctg agt atc ccc cgc gtc gcg ccc gag cac gag ggc cac tat 1972Leu Ser Leu Ser Ile Pro Arg Val Ala Pro Glu His Glu Gly His Tyr640 645 650gtg tgc gaa gtg caa gac cgg cgc agc cat gac aag cac tgc cac aag 2020Val Cys Glu Val Gln Asp Arg Arg Ser His Asp Lys His Cys His Lys
655 660 665aag tac ctg tcg gtg cag gcc ctg gaa gcc cct cgg ctc acg cag aac 2068Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ala Leu Glu Ala Pro Arg Leu Thr Gln Asn670 675 680ttg acc gac ctc ctg gtg aac gtg agc gac tcg ctg gag atg cag tgc 2116Leu Thr Asp Leu Leu Val Asn Val Ser Asp Ser Leu Glu Met Gln Cys685 690 695ttg gtg gcc gga gcg cac gcg ccc agc atc gtg tgg tac aaa gac gag 2164Leu Val Ala Gly Ala His Ala Pro Ser Ile Val Trp Tyr Lys Asp Glu700 705 710 715agg ctg ctg gag gaa aag tct gga gtc gac ttg gcg gac tcc aac cag 2212Arg Leu Leu Glu Glu Lys Ser Gly Val Asp Leu Ala Asp Ser Asn Gln720 725 730aag ctg agc atc cag cgc gtg cgc gag gag gat gcg gga cgc tat ctg 2260Lys Leu Ser Ile Gln Arg Val Arg Glu Glu Asp Ala Gly Arg Tyr Leu735 740 745tgc agc gtg tgc aac gcc aag ggc tgc gtc aac tcc tcc gcc agc gtg 2308Cys Ser Val Cys Asn Ala Lys Gly Cys Val Asn Ser Ser Ala Ser Val750 755 760gcc gtg gaa ggc tcc gag gat aag ggc agc atg gag atc gtg atc ctt 2356Ala Val Glu Gly Ser Glu Asp Lys Gly Ser Met Glu Ile Val Ile Leu765 770 775gtc ggt acc ggc gtc atc gct gtc ttc ttc tgg gtc ctc ctc ctc ctc 2404Val Gly Thr Gly Val Ile Ala Val Phe Phe Trp Val Leu Leu Leu Leu780 785 790 795atc ttc tgt aac atg agg agg ccg gcc cac gca gac atc aag acg ggc 2452Ile Phe Cys Asn Met Arg Arg Pro Ala His Ala Asp Ile Lys Thr Gly800 805 810tac ctg tcc atc atc atg gac ccc ggg gag gtg cct ctg gag gag caa 2500Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp Pro Gly Glu Val Pro Leu Glu Glu Gln815 820 825tgc gaa tac ctg tcc tac gat gcc agc cag tgg gaa ttc ccc cga gag 2548Cys Glu Tyr Leu Ser Tyr Asp Ala Ser Gln Trp Glu Phe Pro Arg Glu830 835 840cgg ctg cac ctg ggg aga gtg ctc ggc tac ggc gcc ttc ggg aag gtg 2596Arg Leu His Leu Gly Arg Val Leu Gly Tyr Gly Ala Phe Gly Lys Val845 850 855gtg gaa gcc tcc gct ttc ggc atc cac aag ggc agc agc tgt gac acc 2644Val Glu Ala Ser Ala Phe Gly Ile His Lys Gly Ser Ser Cys Asp Thr860 865 870 875gtg gcc gtg aaa atg ctg aaa gag ggc gcc acg gcc agc gag cac cgc 2692Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu His Arg880 885 890gcg ctg atg tcg gag ctc aag atc ctc att cac atc ggc aac cac ctc 2740Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly Asn His Leu895 900 905aac gtg gtc aac ctc ctc ggg gcg tgc acc aag ccg cag ggc ccc ctc 2788
Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gln Gly Pro Leu910 915 920atg gtg atc gtg gag ttc tgc aag tac ggc aac ctc tcc aac ttc ctg 2836Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Phe Leu925 930 935cgc gcc aag cgg gac gcc ttc agc ccc tgc gcg gag aag tct ccc gag 2884Arg Ala Lys Arg Asp Ala Phe Ser Pro Cys Ala Glu Lys Ser Pro Glu940 945 950 955cag cgc gga cgc ttc cgc gcc atg gtg gag ctc gcc agg ctg gat cgg 2932Gln Arg Gly Arg Phe Arg Ala Met Val Glu Leu Ala Arg Leu Asp Arg960 965 970agg cgg ccg ggg agc agc gac agg gtc ctc ttc gcg cgg ttc tcg aag 2980Arg Arg Pro Gly Ser Ser Asp Arg Val Leu Phe Ala Arg Phe Ser Lys975 980 985acc gag ggc gga gcg agg cgg gct tct cca gac caa gaa gct gag gac 3028Thr Glu Gly Gly Ala Arg Arg Ala Ser Pro Asp Gln Glu Ala Glu Asp990 9951000ctg tgg ctg agc ccg ctg acc atg gaa gat ctt gtc tgc tac agc ttc 3076Leu Trp Leu Ser Pro Leu Thr Met Glu Asp Leu Val Cys Tyr Ser Phe100510101015cag gtg gcc aga ggg atg gag ttc ctg gct tcc cga aag tgc atc cac 3124Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His1020 102510301035aga gac ctg gct gct cgg aac att ctg ctg tcg gaa agc gac gtg gtg 3172Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Ser Asp Val Val104010451050aag atc tgt gac ttt ggc ctt gcc cgg gac atc tac aaa gac cct gac 3220Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp105510601065tac gtc cgc aag ggc agt gcc cgg ctg ccc ctg aag tgg atg gcc cct 3268Tyr Val Arg Lys Gly Ser Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro107010751080gaa agc atc ttc gac aag gtg tac acc acg cag agt gac gtg tgg tcc 3316Glu Ser Ile Phe Asp Lys Val Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser108510901095ttt ggg gtg ctt ctc tgg gag atc ttc tct ctg ggg gcc tcc ccg tac 3364Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr1100 110511101115cct ggg gtg cag atc aat gag gag ttc tgc cag cgg ctg aga gac ggc 3412Pro Gly Val Gln Ile Asn Glu Glu Phe Cys Gln Arg Leu Arg Asp Gly112011251130aca agg atg agg gcc ccg gag ctg gcc act ccc gcc ata cgc cgc atc 3460Thr Arg Met Arg Ala Pro Glu Leu Ala Thr Pro Ala Ile Arg Arg Ile113511401145atg ctg aac tgc tgg tcc gga gac ccc aag gcg aga cct gca ttc tcg 3508Met Leu Asn Cys Trp Ser Gly Asp Pro Lys Ala Arg Pro Ala Phe Ser115011551160
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Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met130 135 140Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu145 150 155 160Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys165 170 175Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp180 185 190Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile195 200 205Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr210 215 220Asn Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln225 230 235 240Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val245 250 255Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr260 265 270Trp Ser Tyr Pro Asp Asn Asn Asn Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val275 280 285Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser290 295 300Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr305 310 315 320Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val325 330 335His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln340 345 350Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys355 360 365Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu370 375 380Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu385 390 395 400Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu405 410 415Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu420 425 430Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe435 440 445Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser Arg Gln Ile Leu Thr Cys450 455 460
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Val Gln Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr785 790 795 800Cys Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu805 810 815Ile Arg Lys Met Lys Arg Ser Ser Asn Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr820 825 830Leu Ser Ile Ile Met Asp Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys835 840 845Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg850 855 860Leu Lys Leu Gly Lys Ser Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val865 870 875 880Gln Ala Ser Ala Phe Gly Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val885 890 895Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala900 905 910Leu Met Thr Glu Leu Lys Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn915 920 925Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met930 935 940Val Ile Val Glu Tyr Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys945 950 955 960Ser Lys Arg Asp Leu Phe Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met965 970 975Glu Pro Lys Lys Glu Lys Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys980 985 990Pro Arg Leu Asp Ser Val Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly99510001005Phe Gln Glu Asp Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser101010151020Asp Gly Phe Tyr Lys Glu Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr1025 103010351040Ser Phe Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys104510501055Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn106010651070Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn107510801085Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met109010951100Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val
1105 111011151120Trp Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser112511301135Pro Tyr Pro Gly Val Gln Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg114011451150Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr115511601165Gln Ile Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg117011751180Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val1185 119011951200Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly120512101215Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe122012251230Lys Glu Ser Ile Ser Ala Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp123512401245Val Arg Tyr Val Asn Ala Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys125012551260Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr1265 127012751280Gln Gly Asp Ser Ser Thr Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe128512901295Thr Trp Thr Asp Ser Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Glu Val130013051310<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在第1位和第2位的氨基酸独立地选自天冬氨酸或谷氨酸<220>
<223>在第4位的氨基酸独立地选自甲硫氨酸或缬氨酸<220>
<223>在第5位的氨基酸独立地选自脯氨酸或天冬氨酸或谷氨酸<220>
<223>人工序列的描述共有序列<400>6Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Met1 5<210>7<211>70
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>7acatgcatgc caccatgcag cggggcgccg cgctgtgcct gcgactgtgg ctctgcctgg 60gactcctgga70<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>8acatgcatgc cccgccggtc atcc 24<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>9cggaattccc catgacccca ac22<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>10ccatcgatgg atcctacctg aagccgcttt ctt 33<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>11cccaagcttg gatccaagtg gctactccat gacc 34
<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>12gttgcctgtg atgtgcacca 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>13ctggagtcga cttggcggac t 21<210>14<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>14cgcggatccc tagtgatggt gatggtgatg tctaccttcg atcatgctgc ccttatcctc 60<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>15ctggagtcga cttggcggac t 21<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>16cgggatccct ccatgctgcc cttatcct28
<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>17ggcaagcttg aattcgccac catgcagcgg ggcgcc 36<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>18gttgcctgtg atgtgcacca 20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>19ctggagtcga cttggcggac t 21<210>20<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探针<400>20cgcggatcca agcttactta ccttccatgc tgcccttatc ctcg 44<210>21<211>419<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe
20 25 30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala35 40 45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser50 55 60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65 70 75 80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln85 90 95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala100 105 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys115 120 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe130 135 140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145 150 155 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr165 170 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu180 185 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser195 200 205Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile210 215 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225 230 235 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys245 250 255Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser260 265 270Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu275 280 285Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys290 295 300Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys305 310 315 320Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu325 330 335Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro340 345 350
Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys355 360 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr370 375 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser385 390 395 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro405 410 415Gln Met Ser<210>22<211>354<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val1 5 10 15Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser20 25 30Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser35 40 45Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu50 55 60Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg65 70 75 80Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile85 90 95Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser100 105 110Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr115 120 125Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly130 135 140Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr145 150 155 160Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro165 170 175Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu180 185 190Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln195 200 205Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile
210 215 220Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu225 230 235 240Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala245 250 255Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val260 265 270Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys275 280 285Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His290 295 300Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe305 310 315 320His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys325 330 335Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys340 345 350Asn Pro
权利要求
1.一种纯化的多肽，它包含哺乳动物血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)胞外域(EC)的一部分，其中所述的部分结合至少一种VEGFR-3配体且由VEGFR-3 EC的至少第一个，第二个，和第三个免疫球蛋白样结构域组成，且其中该多肽缺少VEGFR-3免疫球蛋白结构域IV-VII，其中该多肽是缺少任何跨膜结构域的可溶性多肽。
2.根据权利要求1的纯化多肽，其中该部分基本上由VEGFR-3-EC的第一个，第二个，和第三个免疫球蛋白结构域组成。
3.根据权利要求1-2任一项的纯化多肽，其中VEGFR-3是人VEGFR-3。
4.根据权利要求1-3中任一项的纯化多肽，其中该多肽还包含VEGFR-2或VEGFR-3的免疫球蛋白样结构域。
5.根据权利要求1-4中任一项的纯化多肽，其中该VEGFR-3包含选自由SEQ ID NO2和SEQ ID NO4组成的组中的一个氨基酸序列。
6.根据权利要求1-4中任一项的纯化多肽，其中该VEGFR-3包含由多核苷酸或寡核苷酸编码的氨基酸序列，该多核苷酸或寡核苷酸在所述多核苷酸或寡核苷酸不能与编码VEGFR-1的人基因杂交的杂交条件下与编码VEGFR-3的人基因杂交，所述的杂交条件包括(a)杂交溶液含有50％的甲酰胺，5x Denhardt′s溶液，5x SSPE，0.1％SDS，和0.1mg/ml超声处理的鲑精DNA；(b)在42℃的温度中杂交持续18至24小时；和(c)杂交后在65℃的洗涤温度中洗涤，所用洗涤溶液包含1x SSC和0.1％SDS。
7.一种融合蛋白，它含有与免疫球蛋白Fc肽融合的根据权利要求1-6任一项的多肽。
8.根据权利要求1-7任一项的多肽或融合蛋白，它还包含附着到该多肽上的细胞毒性剂。
9.根据权利要求8的多肽或融合蛋白，其中该细胞毒性剂选自由植物毒素，细菌毒素，真菌毒素，放射性同位素，抗代谢产物，烷基化试剂，抗有丝分裂剂，和DNA插入剂组成的组中。
10.一种组合物，它含有根据权利要求1-9任一项的多肽或融合蛋白以及一种药用上可接受的载体。
11.一种多核苷酸，它含有编码根据权利要求1-7任一项的多肽或融合蛋白的核苷酸序列。
12.根据权利要求11的多核苷酸，还包含与编码该多肽的序列可操作相连的表达控制序列。
13.一种表达载体，它包含与根据权利要求11的多核苷酸可操作地相连的表达调控序列。
14.根据权利要求13的表达载体，其中该表达调控序列包含在哺乳动物细胞中启动表达的启动子。
15.根据权利要求14的表达载体，它是选自由逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，痘苗病毒和疱疹病毒组成的组中的病毒载体。
16.一种组合物，它含有根据权利要求11-15任一项的多核苷酸或载体和一种药用上可接受的载体。
17.用根据权利要求11-15任一项的多核苷酸或载体转化或转染的细胞。
18.根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白，或组合物在诊断肿瘤疾病的方法中的用途。
19.根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白，或组合物在治疗肿瘤疾病的方法中的用途。
20.根据权利要求18-19任一项的多肽，融合蛋白，或组合物，其中该肿瘤疾病是以血管或淋巴管的新脉管形成为特征的肿瘤，且其中新脉管形成包括表达VEGFR-3的内皮细胞。
21.根据权利要求18-19任一项的多肽，融合蛋白，或组合物，其中该肿瘤疾病是乳腺癌。
22.根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白，或组合物在诊断肿瘤转移的方法中的用途。
23.根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白，或组合物在预防肿瘤转移的方法中的用途。
24.根据权利要求11-17任一项的多核苷酸，载体，细胞，或组合物在诊断肿瘤疾病的方法中的用途。
25.根据权利要求11-17任一项的多核苷酸，载体，细胞，或组合物在治疗肿瘤疾病的方法中的用途。
26.根据权利要求24-25任一项的多核苷酸，载体，细胞，或组合物，其中该肿瘤疾病是以血管或淋巴管的新脉管形成为特征的肿瘤，且其中新脉管形成包含表达VEGFR-3的内皮细胞。
27.根据权利要求24-25任一项的多核苷酸，载体，细胞，或组合物，其中该肿瘤疾病是乳腺癌。
28.根据权利要求11-17任一项的多核苷酸，载体，细胞，或组合物在诊断肿瘤转移的方法中的用途。
29.根据权利要求11-17任一项的多核苷酸，载体，细胞，或组合物在预防肿瘤转移的方法中的用途。
30.一种抑制癌细胞增生或转移扩散的方法，包括给患有癌症的哺乳动物受试者施用含有编码一种多肽的核苷酸序列的多核苷酸，该多肽含有哺乳动物VEGFR-3-EC结构域的一部分，其中所述的部分与至少一种VEGFR-3配体结合且由VEGFR-3-EC的至少一种免疫球蛋白样结构域组成，其中该编码的多肽是缺少任何跨膜结构域的可溶性多肽，且其中在允许所述的多核苷酸吸收且从而由哺乳动物受试者中的细胞表达编码的多肽的条件下进行给药，且其中以抑制所述细胞增生的有效量施用该多核苷酸，载体，或组合物。
31.权利要求30的方法，其中该给药包括施用包含该多核苷酸的载体。
32.根据权利要求30的方法，其中所述的给药包含施用在根据权利要求11-17任一项的多核苷酸，载体，或组合物中的所述多核苷酸。
33.权利要求30-32的方法，其中所述的多核苷酸，载体或组合物包裹在脂质体中。
34.权利要求31的方法，其中所述的病毒载体选自由逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，痘苗病毒和疱疹病毒组成的组中。
35.根据权利要求30-34任一项的方法，其中该哺乳动物受试者被诊断为患有以表达VEGFR-3的内皮细胞增生为特征的癌症且其中所述的给药抑制所述受试者中血管生成和淋巴管生成中的至少一种。
36.根据权利要求35的方法，其中该癌症包括以血管或淋巴管的新脉管形成为特征的肿瘤，且其中新脉管形成包含表达VEGFR-3的内皮细胞且其中所述的给药抑制所述受试者中血管生成和淋巴管生成中的至少一种。
37.根据权利要求30-33任一项的方法，其中该癌症细胞表达选自由VEGFR-3，VEGF-C和VEGF-D组成的组中的至少一种多肽。
38.根据权利要求30-37任一项的方法，其中该受试者是人。
39.根据权利要求30-37任一项的方法，其中所述的癌症是乳腺癌。
40.根据权利要求30-37任一项的方法，它还包含给受试者施用第二种癌症治疗剂的步骤。
41.权利要求40的方法，其中所述的第二种癌症治疗剂包括化疗剂，放射性试剂，编码癌症治疗剂的核酸和抗淋巴管生成剂或抗血管生成剂。
42.根据权利要求30-41任一项的方法，其中该细胞在可手术的肿瘤中，且其中在切除肿瘤之前，期间，或之后进行该给药步骤。
43.根据权利要求30的方法，其中该受试者具有选自由脑，肺，肝脏，脾脏，肾，淋巴结，小肠，血细胞，胰腺，结肠，胃，乳房，子宫内膜，前列腺，睾丸，卵巢，皮肤，头颈，食道，骨髓和血液组成的组中的组织，器官，或细胞的癌症。
44.抑制哺乳动物受试者中癌症的转移扩散的方法，包括给怀疑患有癌症的哺乳动物受试者施用抑制所述癌症转移扩散有效量的根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白或组合物。
45.抑制哺乳动物受试者中癌症的转移扩散的方法，包括给怀疑患有癌症的哺乳动物受试者施用抑制或减小所述癌症生长有效量的根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白或组合物。
46.治疗癌症的方法，包括给诊断患有癌症的哺乳动物受试者施用一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白或组合物，而施用的量能有效抑制或减小该癌症生长或肿瘤扩散。
47.一种含有编码一种多肽的核苷酸序列的多核苷酸在制备用于抑制癌细胞的细胞增生的药物中的用途，该多肽含有哺乳动物VEGFR-3-EC结构域的一部分，其中所述的部分与至少一种VEGFR-3配体结合且由VEGFR-3-EC的至少一种免疫球蛋白样结构域组成，其中该编码的多肽是缺少任何跨膜结构域的可溶性多肽。
48.根据权利要求47的用途，其中所述的多核苷酸在载体中。
49.根据权利要求47的用途，其中所述的多核苷酸是根据权利要求11-17任一项的多核苷酸，载体，细胞或组合物。
50.根据权利要求47-49的用途，其中所述的多核苷酸包裹在脂质体中。
51.根据权利要求48的用途，其中所述的载体是包含选自由逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，痘苗病毒和疱疹病毒组成的组中的病毒载体。
52.根据权利要求47的用途，其中所述的药物用于被诊断为患有以表达VEGFR-3的内皮细胞增生为特征的疾病的哺乳动物受试者且其中所述的药物抑制所述受试者中血管生成和淋巴管生成中的至少一种。
53.根据权利要求52的用途，其中该疾病包含以血管或淋巴管的新脉管形成为特征的肿瘤，且其中新脉管形成包含表达VEGFR-3的内皮细胞且其中所述的药物抑制所述受试者中血管生成和淋巴管生成中的至少一种。
54.根据权利要求52的用途，其中该癌细胞表达选自由VEGFR-3，VEGF-C和VEGF-D组成的组中的一种多肽。
55.根据权利要求47-54任一项的用途，其中所述的癌症是乳腺癌。
56.根据权利要求47-54任一项的用途，所述的药物还包含第二种癌症治疗剂。
57.根据权利要求56的用途，其中所述的第二种癌症治疗剂包括化疗剂，编码癌症治疗剂的核酸和抗淋巴管生成剂或抗血管生成剂。
58.根据权利要求47的用途，其中该细胞在可手术的肿瘤中，且其中在切除肿瘤之前，期间，或之后进行该给药步骤。
59.根据权利要求47的用途，其中所述的药物用于具有选自由脑，肺，肝脏，脾脏，肾，淋巴结，小肠，血细胞，胰腺，结肠，胃，乳房，子宫内膜，前列腺，睾丸，卵巢，皮肤，头颈，食道，骨髓和血液组成的组中的组织，器官，或细胞癌症的受试者。
60.根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白或组合物在制备用于抑制哺乳动物受试者中癌转移扩散的药物中的用途。
61.根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白或组合物在制备用于抑制或减小哺乳动物受试者中癌生长的药物中的用途。
62.根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白或组合物在制备用于治疗哺乳动物受试者中癌症的药物中的用途。
63.根据权利要求1-10任一项的多肽，融合蛋白或组合物在制备用于治疗哺乳动物受试者中癌症的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了纯化的Flt4受体酪氨酸激酶多肽和其片断，编码该多肽的多核苷酸，特异性结合该多肽的抗体，及其用途。
文档编号C07K19/00GK1494552SQ02806049
公开日2004年5月5日 申请日期2002年1月22日 优先权日2001年1月19日
发明者卡里·阿利塔洛, 奥尔加·阿普雷利科瓦, 卡特里·帕朱索拉, 埃利那·阿姆斯特朗, 贾纳·科霍南, 阿贾·凯佩南, 帕朱索拉, 阿姆斯特朗, 阿普雷利科瓦, 凯佩南, 卡里 阿利塔洛, 科霍南 申请人:路德维格癌症研究院, 利森蒂亚有限公司