辣木种子蛋白质的制作方法

专利名称：辣木种子蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及从辣木种子中获取的或衍生自辣木种子蛋白质的蛋白质。
更确切的说，本发明涉及从辣木种子中获取或衍生于辣木种子蛋白质的蛋白质家族，其可用于多种用途，比如作为水处理的凝聚剂。
现有技术辣木属包含14个植物种，特别如辣木(Moringa oleifera)。
辣木种子主要用于制取一种可通过机械压榨提取的食用油。
已发现辣木种子中含有可作为污水处理中凝聚剂的水溶性、低分子量、高碱性蛋白质。这些活性化合物中的一部分已得到分离和鉴定(Gassenschmidt，U.，Jany，K.-D.，Tauscher，B.，and Niebergall，H.(1995).Isolation and characterization of a flocculatingprotein from Moringa oleifera Lam.Biochim.Biophys.Acta 1243，477-481)。其中一种蛋白质部分——MO2.1经测定表明其含有60个氨基酸，并具有高含量的谷氨酸、精氨酸和脯氨酸。
国际专利申请WO99/48512(LABORATOIRES SEROBIOLOGIQUES)公开了从辣木种子提取的蛋白质中至少一种蛋白质部分在化妆品或者皮肤病领域中的用途，例如MO2.1。
国际专利申请WO 00/46243(OPTIMA ENVIRONNEMENT SA)涉及此类提取自辣木种子并可作为凝聚剂的蛋白质以及制备这些蛋白质的特殊方法。
发明简述本发明涉及一种从辣木种子中获取的或衍生于辣木种子蛋白质的蛋白质新家族。这些蛋白质可用于多种用途，比如作为水处理的凝聚剂以及/或作为抗生剂，特别是它们有效杀灭人类病原体，包括具有抗生素抗性的临床分离物。
该新蛋白质家族包含至少5个亚家族A首先根据重组方法获得。其他亚家族根据特定的提取方法获得。本文中将根据本发明提取方法获得的蛋白质称为E蛋白质。
本文中的术语“抗生”特别指抑制细菌、杀菌、抗真菌或者对其他任何种类细胞有毒性以及抗病毒。
必须提到的是，在此之前表达重组形式的辣木蛋白质的尝试已经在现有技术中公开(Tauscher，B.(1994).Water treatment byflocculant compounds of higher plants.Plant Res.And Dev.40，56-70)，并且为证明相关凝聚活性的尝试没有成功。
本发明的发明者开发了一种方法来获得细菌生产、有活性的重组蛋白质。
E蛋白质与现有技术中公开的辣木蛋白质相比具有不同的结构。
根据本发明，该蛋白质族作为凝聚剂不仅可用于水，还可以用于其他流体，比如血液、乳汁或其他任何可食用液体。它们还可以用于制药和化妆品领域，特别参照WO 99/48512中引用的所有说明。
和本发明相关的一些实施例将在后面与下面的图一起进行讨论附图简述

图1.Flo表达和纯化的示意图。
图2.Flo蛋白质的表达。
图3.Flo凝聚活性分析。
图4.Flo对大肠杆菌(E.coli)培养物生长的影响。
图5.辣木的种子蛋白质提取物、油脂体蛋白质和合成肽的SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)图示。
图6.还原条件下提取的辣木的种子蛋白质提取物和合成肽的SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)图示。
图7.在pH为7、50mM的KPO4中的总样分析特性。
图8.MHB营养肉汤中的总样分析特性。
图9.MHB营养肉汤以及pH为7、50mM的KPO4缓冲液中使用Flo杀灭金黄色葡萄球菌(S.aureus)P8。
图10.DNA序列以及H1、H2和H3相应的肽序列。
发明详述在本发明接下来的实施例中将详细描述重组方法以及从辣木种子中提取E蛋白质的特定方法。所制取得蛋白质将与一种辣木种子提取物的商业制剂PHYTOFLOC进行比较。简单说来，制取PHYTOFLOC需将一块辣木种子的碾压饼(ground presscake)与盐水按照1∶5的重量/体积比混和。过滤提取物并在75℃加热。离心除去沉淀的固体，并通过5kD截断膜过滤将上清液浓缩。
材料和方法质粒设计一段编码MO2.1多肽序列的DNA序列(Gassenschmidt等人，1995，参见图.1A)。本文中将该多肽的重组形式称为Flo。寡聚核苷酸双链由Horton等人(1989)描述的PCR装配方法合成。设计寡聚核苷酸序列，使其密码子最适于大肠杆菌的表达，且在其两末端设计有SapI和PstII限制性酶切位点。选用IMPACT表达系统(InteinMediatedPurification with anAffinityChitin-bindingTagsystem，New England Biolabs，Inc.)的pTYB11质粒在大肠杆菌中对辣木种子Flo蛋白质进行克隆和表达。将寡聚核苷酸与SapI/PstI消化后的pTYB11载体连接，从而将编码靶蛋白质Flo的N末端的序列、一个内部蛋白质自剪切位点(内切子intein)以及几丁质结合区域融合。通过测序确定阳性克隆。
蛋白质表达和纯化pTYB载体使用Lac阻遏蛋白调控(阻遏调控)的T7启动子和lacI基因使融合基因的表达得到严格的调控。在缺乏IPTG诱导时，紧贴T7启动子下游端的lac操纵子序列与lac阻遏蛋白结合抑制了融合基因的基础表达。大肠杆菌菌株为ER2566，携带有在lac启动子调控下的T7 RNA聚合酶基因的一个染色体拷贝。诱导融合蛋白表达时，在A600值为0.5-0.6的指数生长培养物中加入0.3mM IPTG，27℃下200rpm摇动2小时。细菌培养、提取物制备和纯化条件和所用的缓冲液根据制造商(New England Biolab)的推荐使用。简单说来，将1.5升体积细菌培养物(A600＝0.5-0.6)离心，用超声波破碎细胞。离心使提取物澄清并加到平衡后的几丁质珠(颗粒大小为50-100μm)的柱上。经过清洗，将柱用含有50mM DTT的缓冲液填满，在室温下在柱上温育40小时，使带有intein(内切子)的融合肽进行自我剪切。将Flo洗脱并用凝胶电泳验证其存在。最后，用剥离缓冲液洗脱前体蛋白，使柱再生。
总细胞蛋白质提取物使用10％SDS-Page凝胶(Laemmli，1970)进行分析。为进行蛋白质定量分析，凝胶用cypro-orange染色并使用扫描软件(STORM 840，Pharmacia Amersham biotech.)分析。通过该方法可以直接与平行加入的不同量的牛血清白蛋白(BSA)进行比较来估计融合蛋白在总提取物中的比例。由于洗脱下的Flo多肽分子小，因而使用N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)钠十二烷基硫酸聚丙稀酰胺凝胶电泳(Schagger等人，1987)分析。之后使用适合小分子量碱性蛋白质的方案进行凝胶固定和染色(Steck等人，1980)。
化学合成蛋白质本发明的一些重组蛋白和E蛋白质根据标准程序通过合成得到。
E蛋白质-实施例1从辣木种子中制备粗的油脂体蛋白质提取物辣木的干种子用手工去壳，最大功率下使用Polytron，在4倍体积的冷(4℃)匀浆缓冲液(含有1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl2、2mM二硫苏糖醇和0.6M蔗糖的0.15MN-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液)中工作40秒使种子成为匀浆。用尼龙膜(20μm孔径)过滤匀浆除去大颗粒以及种子碎屑。澄清的匀浆用1体积浮选缓冲液稀释(含有0.4M蔗糖、1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl2和2mM二硫苏糖醇的0.15MN-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液)并且在10,000g离心30分钟。从离心后的悬浮液表面收集得到油脂体，并加到0.5体积含有2M NaCl的匀浆缓冲液进行再悬浮。再向油脂体悬浮液表面加入的0.5体积匀浆缓冲液，含有2M NaCl和0.25M蔗糖而不是0.6M蔗糖，随即在10,000g离心30分钟。从离心悬浮液表面收集油脂体并且在0.5体积的匀浆缓冲液中再悬浮，并在10,000g再离心30分钟。重复清洗程序至匀浆缓冲液中再悬浮所得的油脂体终浓度为100mg每升(通常通过在油脂体中加入额外20体积的匀浆缓冲液得到并在4℃储存)。
通过该方法制备的粗的油脂体蛋白质提取物在加入SDS后进行SDS凝胶电泳分析。
E蛋白质-实施例2从辣木种子中制备纯化油脂体蛋白质提取物
在最终的离心步骤后加入例如丙酮、正己烷或者其他有机溶剂以去除结合的三酰甘油酯，然后将油脂体从缓冲液表面回收，从而将根据实施例1制备的粗制油脂体蛋白质纯化。溶剂处理后的油脂体蛋白质通过在13,500g条件下离心2分钟得以回收。油脂体蛋白质回收自离心样品的表面，经有机溶剂清洗(丙酮、正己烷或其他溶剂)并且在相同条件下再离心。下一次清洗步骤则通过在乙醚中再悬浮以及13,500g再离心2分钟而完成。油脂体蛋白质通过最后一步离心回收，并在含有1.5体积氯仿和甲醇2∶1混和液的超高纯水中再悬浮。之后在10,000g离心4分钟并在水和溶剂的界面处分离得到纯化的油脂体蛋白质。分离所得蛋白质随后用水/氯仿/甲醇溶液清洗两次，在10,000g离心4分钟。然后将纯化的油脂体蛋白质从水-溶剂界面回收，并且在氮气氛围下使有机溶剂挥发制得干蛋白质制备物。通过本方法制备的纯化油脂体蛋白质可以在4℃永久保存。
通过本方法制备的纯化的油脂体蛋白质提取物加入SDS后进行SDS凝胶电泳分析。
E蛋白质-实施例3从辣木种子中制备粗的种子蛋白质提取物辣木的干种子用手工去壳，最大功率下使用Polytron，在4倍体积的冷(4℃)匀浆缓冲液(含有1mM EDTA、10mM KCl、1mM MgCl2、和0.6M蔗糖的0.15MN-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液)中工作40秒使种子成为匀浆。用尼龙膜(20μm孔径)过滤匀浆除去甘油三酯和油脂体。收集剩余固体原料并称之为压饼(presscake)。通过在5倍体积盐溶液中重悬浮压饼并搅拌1小时提取种子蛋白质。1,500g下离心5分钟，然后通过精细棉布倾析将提取的种子蛋白质回收。倾析后的种子蛋白质提取物加热至85℃，同时小心搅拌，随后冷却至室温，再在1,500g离心5分钟。收集上清液并可在室温保存。
通过本方法制备的粗的种子蛋白质提取物加入SDS后进行SDS凝胶电泳分析。
E蛋白质-实施例4从辣木种子中制备纯化的种子蛋白质提取物按照实施例3中的程序，但是在提取用的盐溶液中加入还原剂，比如1％的二流苏糖醇(DTT)。通过本方法维持多种多聚和单体蛋白质构象的二硫键被还原，并在随后的离心和过滤步骤中除去。
通过本方法制备的种子蛋白质提取物加入SDS后进行SDS凝胶电泳分析。
E蛋白质序列对E蛋白质测序表明该蛋白质的一个末端以RGPAFRR序列起始。
凝聚检测在2ml体积的分光光度计比色杯(104QS/HELLMA)中进行测量。为测量凝聚活性，将3.5-7μm直径玻璃珠(Sherlglass 5000，Potters-Ballotini)的100mg/ml悬浮液用pH7.0浓度50mM的磷酸盐缓冲液稀释成模拟混浊水系。以800rmp的速度保持连续搅拌，并且在Perkin-Elmer 552分光光度计中每秒测定一次OD 500nm的值(LabVIEW software/National Instruments Corporation)。经过5分钟连续搅拌后，加入待测化合物至终浓度为20μg/ml，并连续搅拌15分钟。活性化合物在进行检测前使用pH7.0浓度50mM的磷酸盐缓冲液稀释(E蛋白质、PHYTOFLOC以及细菌生产的Flo)，或者用蒸馏水稀释(合成的Flo)。
分析方法为了定量凝聚效率，对加入凝聚制剂前4分钟(基础沉淀)、加入凝聚制剂后4分钟(凝聚介导的沉淀)所对应的时间点进行线性回归。凝聚介导和基础沉淀之间的差异通过扣除每分钟的OD值进行计算，并乘以系数1000(Δ斜率)。
抗生素效应如前所述，37℃下在LB培养基中培养大肠杆菌ER2566至指数期(A600＝0.5-0.6)。将培养物离心并在相同体积pH7.0浓度10mM的磷酸缓冲液中重新悬浮，并加入E蛋白质、PHYTOFLOC(2mg/ml)、合成的Flo(0.1mg/ml至2mg/ml)、载体(缓冲液)或者牛血清白蛋白(BSA)(2mg/ml)。在37℃下温育2小时后，向细菌培养物中加入LB培养基至A600＝0.1。所有培养物均在37℃200rpm温育，并通过A600值测量跟踪培养物生长情况。
检测了多种其他微生物包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，化脓性链球菌(Streptococcus pyrogenes)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，以及另一检测组还包括嗜肺军团菌(Legionellapneumophilia)，脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)/龟分枝杆菌(M.chelonae)和偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)。
Flo的结构此外对Flo的结构进行了分析。
结果前言以前关于其他辣木种子提取物凝聚活性的研究工作表明该活性伴随小分子量蛋白质纯化。其中一个已经检测出为带正电荷、分子量6KDa的多肽(Tauscher，1994)。然而，以前进行该蛋白质重组形式的表达以及为证明相关凝聚活性的尝试未能成功。
蛋白质克隆、表达和纯化利用蛋白质序列，我们重新构建了一个最适于在大肠杆菌中表达的重组辣木种子蛋白质的合成基因，并将其命名为Flo。考虑到Flo高正电荷的特性，从而选择表达融合蛋白。所设计的表达载体可将Flo与含有内切子序列以及几丁质结合区域的异源多肽融合表达(图.1A)。使用含几丁质的层析树脂，利用几丁质结合区域可使融合蛋白易于与其他细菌蛋白质分离。内切子为可在前体蛋白质上产生翻译后切割的氨基酸序列，当加入含硫醇的化合物时通过受调控的自我催化过程发生作用(参见Perler，2000年综述，图.1B)。
IMPACT表达系统的pTYB载体使用了lac阻遏蛋白调控(阻遏调控)的T7启动子起始系统，从而可在大肠杆菌中获得高水平表达和严格的转录调控。加入lac阻遏蛋白抑制剂后，lac阻遏蛋白系统解除阻遏，而使T7 RNA聚合酶得以表达，并释放了T7启动子下游的lac操纵子。在诱导条件下可以在菌褶(bacteria frown)提取物中特定地获得预期大小、过量表达的融合蛋白(图.2A，1道，数据未出示)。对总蛋白质和特定蛋白质含量的定量表明诱导细胞中大约30％的蛋白质为Flo融合蛋白。将该制备物上样到含几丁质珠的柱上。将细菌杂质蛋白质清洗掉，融合蛋白则在含硫醇的还原性化合物温育下进行剪切。这样可以洗脱并回收得到天然的细菌表达的Flo多肽(图.2B)，使之脱离融合蛋白上仍然与层析树脂相连的几丁质结合部分。最后，将含有内切子和几丁质结合区域的前体蛋白质洗脱(图2A，3道)。细菌生产的Flo多肽通过与凝胶上已知量的化学合成Flo多肽比较进行定量。每升细菌培养物大约能纯化得到1mg Flo蛋白质。
E蛋白质图5出示来自辣木的种子蛋白质提取物、油脂体蛋白质以及合成肽的SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)结果。
1道标准蛋白质(Sigma)；2道还原条件下提取的种子蛋白质；3道还原条件下提取的总油脂体蛋白质(未稀释)；4道还原条件下提取的总油脂体蛋白质(10倍稀释)；5道还原条件下提取的总油脂体蛋白质(100倍稀释)；6道空；7道非还原条件下提取的种子蛋白质；8道非还原条件下提取的总油脂体蛋白质(未稀释)；9道非还原条件下提取的总油脂体蛋白质(10倍稀释)；10道非还原条件下提取的总油脂体蛋白质(100倍稀释)。
凝胶表明辣木的种子蛋白质提取物和油脂体蛋白质提取物包含相似的蛋白质。非还原条件下的蛋白质提取物含有一条主要蛋白质片断，分子量大小约17kDa，而还原条件下的蛋白质提取物含有两条主要蛋白质片断，分子量为约6.5和5.5kDa。
图6出示还原条件下辣木的种子蛋白质提取物和合成肽SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝胶电泳)结果。
1道脱脂种子(压饼)的种子蛋白质提取物；
2道合成肽(根据Gassenschmidt等人，1995所得序列)；3道完整被碾种子的种子蛋白质提取物；4道经过水透析的脱脂种子(压饼)的种子蛋白质提取物；5道超低分子量标准蛋白质(Sigma)；6道脱脂种子(压饼)的种子蛋白质提取物；7道合成肽(根据Gassenschmidt等人，1995所得序列)；8道完整被碾种子的种子蛋白质提取物；9道经过水透析的脱脂种子(压饼)的种子蛋白质提取物。所有提取物以总蛋白质量2.5μg上样到胶上。
结果表明根据从辣木中提取的一种蛋白质所报导序列合成的合成肽在SDS-PAGE上的迁移位置对应分子量(2道和7道)约为6.0kDa，并且与本专利申请报导的提取方法所得的任何片断均无对应关系。所有提取物的所有蛋白质级分都具有絮凝活性。
凝聚活性为评定Flo的颗粒凝聚活性，在连续混和条件下的玻璃珠悬浮液用于模拟混浊水系。通过由悬浮液中玻璃珠散射光线产生的光密度值的减少来估算沉淀量。在对颗粒沉淀基础速率进行5分钟记录后，加入待检测的化合物并且按如下式计算斜率的差异Δ斜率＝(加入絮凝剂后的斜率值-加入絮凝剂前的斜率值)×1000。小沉淀会在加入缓冲液之前或之后产生(图.3A)。然而，记录的有效凝聚在使用PHYTOFLOC时产生(图.3B)。在使用相似量的化学合成的Flo(图.3C)、细菌生产的Flo(图.3D)或者E蛋白质时均观察到类似的沉淀速率。
有趣的是，在这些测试条件下，合成的、重组的Flo或者E蛋白质的特异凝聚活性比使用PHYTOFLOC所测评的更高。由于后者包含几种主要多肽，与其他蛋白质制剂相比有可能其中表现出凝聚效应的成分的含量不具有代表性。另一个解释是该种子提取物可能含有絮凝抑制剂。事实上，重组的或合成的Flo同PHYTOFLOC的直接分子大小比较表明其与PHYTOFLOC中检测到的多肽不吻合，而且Flo更有可能性由天然发生的多肽片断组成。无论如何，这些结果都表明Flo在凝聚分析中具有高活性。
抗生效应在此之前辣木种子提取物已表明可凝聚细菌并具有抗菌活性(Eilert等人，1981；Madsen等人，1987年)。凝聚活性的活性物质并未得到确定，不过抗菌活性则归结于植物合成的苄基异硫氰酸衍生物，该物质为已知的抗菌化合物。然而，我们着手描述Flo多肽和E蛋白质对于大肠杆菌的潜在功效。为此将本发明的肽与培养基中指数生长的细菌一起温育。光学检测显示肽确实使细菌聚集，表现为出现清楚的颗粒或絮状物，并且体积随时间而增长。在没有搅拌时，和肽一起温育的细菌迅速沉淀，而只和缓冲液温育的细菌仍保持悬浮状态。与对照培养物相比，在固体生长培养基上和本发明中的肽一起温育的涂板培养物产生的可见克隆少。该结果表明本发明中的肽可以像凝集玻璃珠一样使细菌凝集。
为检测Flo是否对大肠杆菌生长或存活产生影响，将与肽一起温育的细菌放入培养基中并且振荡温育。图.4A显示在2mg/ml浓度的PHYTOFLOC或Flo存在或不存在时温育细菌培养物的生长情况。在任何一种所述加入成分存在时，可观察到对细菌培养物生长的强烈抑制现象。图.4B中对合成的Flo潜在的抗菌功效进行了更详细的研究，该结果显示有剂量依赖的抗菌生长反应出现。在IC50约为100μg/ml的低Flo浓度下，将细菌温育就已经出现了可检测的抑制效应。用高浓度的牛血清白蛋白温育作为负对照，结果表明抗菌功效特异于Flo蛋白质。
在延长培养物温育时间后，细菌生长重新开始，说明或者是小部分细菌表现出对Flo杀菌活性的抗性，或者是Flo作为一种细菌抑制剂，并且有部分细菌最终逃脱了这种作用。为了区分这两种可能性，收集与肽一起温育经过两轮生长的且逃脱生长抑制效应的细菌培养物。针对是否已达到细菌的抗性状态，向这些细胞中再加入Flo进行验证(图.4C)。肽再次抑制细胞生长，并且该效应无法与在从未经过肽温育选择的细胞中产生的效应区分。这说明对Flo抗菌效应产生的细菌抗性并未达到可观测的水平。因此，在延长时间的温育中出现的细菌生长不是由于细菌对Flo内在的抗性产生的，而更可能是因为一些细菌逃脱了其作用，比如由于发生肽降解所致。
为了确定大肠杆菌培养物的生长确实受到Flo的抑制，并且观察到的效应并不单纯来自于凝聚效应，将对应不同时间点的细胞提取物用SDS-PAGE电泳进行分析。在几个点可观察到加入肽之后出现了少量大肠杆菌蛋白质量的减少(图.4D，数据未给出)，这可能说明了Flo的杀菌效应。然而，根据在细菌沉淀中残留的蛋白质含量水平，至少在这些分析条件下许多细胞可以在处理中存活下来。当再在生长培养基中进行温育时，用Flo处理过的细菌不再合成更多的蛋白质，形成对比的是对照细胞中蛋白质的含量随培养物光密度值的增加显著增加(图.4C和D)。这说明Flo阻遏了大肠杆菌的新陈代谢并具有抗菌活性。所有这些结果共同证明了Flo的抗生效应。
我们的结果表明可以从大肠杆菌中以融合蛋白形式获得高产量的Flo蛋白质。
凝聚检测结果表明了合成的和细菌产生的Flo多肽高效的凝聚活性，甚至比使用PHYTOFLOC获得的活性更高。该效应通过水净化的两种模型观察到，一种是玻璃珠凝聚而一种是大肠杆菌细菌絮凝。这些发现表明Flo肽，无论是合成还是重组产物，都具有有效对水进行纯化的特征。
检测Flo多肽序列发现其带有高正电荷。这使人想起在动物和植物中发现的所谓肽抗生素，它们为带正电荷的肽并表现出抑制细菌或杀菌活性(Schroeder，J.-M.(1999).Epithelial peptideantibiotics.Biochem.Pharmacol.57，121-134.)。加上前面对辣木种子提取物抗菌活性的证明，这些促使我们对Flo可能的抗菌活性进行检测。我们发现合成的Flo多肽不仅凝聚细菌而且还能阻止细菌培养物生长。这意味着Flo发挥了抑制细菌或者杀菌的活性。
前面已经提到还对其他微生物进行了检测，在此对该研究详细说明。该研究的目的是测定PHYTOFLOC和Flo针对一组有代表性的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌效应。大部分抗菌分析测量的是给定药物防止细菌生长使液态基质混浊的能力。按照惯例，抑制生长形成“可见”混浊的最低药物浓度被称之为最小抑制浓度，或MIC(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2000)。该参数提供关于药物阻遏细菌分裂的能效的信息。不过，PHYTOFLOC和Flo都另外具有沉淀大分子甚至微生物的能力。这可以引起可见聚集物的形成，甚至不存在细菌生长时导致培养基混浊。因此对PHYTOFLOC和Flo抗菌效应的检测必须采用其他方案。
另一选择包括将细菌置于液体培养基用待测药物处理，然后将细菌在营养琼脂平板上传代培养。产生克隆的细菌数目(克隆形成单位或CFU)代表了存活的细菌个体，并可与接种到管内细菌的初始数目进行比较。通常在含有营养肉汤以及两次系列稀释的待测药物的一系列管中接种细菌(终浓度为105-106CFU/ml)，温育24小时，然后按前面所述涂平板测定存活细菌的数目。在无药物对照培养基中的细菌在这段时间内会生长到3-4log10CFU/ml。在含有抑制浓度的药物的管中，预期细菌或者不生长，或者存活数量上有一定减少。在含有杀菌浓度的药物的管中，预期细菌存活数量与原接种量相比减少≥3log10 CFU。造成这种效应的最低药物浓度被称为最小杀菌浓度(MBC)(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2000)。
尽管通过细菌传代测定MIC和MBC是一个恰当的选择，还必须考虑到PHYTOFLOC和Flo的另外两个缺陷。首先，化合物可能聚集细菌，从而导致平板上克隆数目不真实的低。实际上，当单个细菌细胞能在琼脂平板上产生一个克隆时，10到100个细菌的聚集体同样能产生一个单个克隆。这就可能导致对抗菌效应的高估(尽管有大量存活细菌但只有少数的克隆)，不过可以通过光学显微镜进行适当的监控。
另外，培养基中大分子的沉淀可能导致细菌的营养受限。因此，抗菌效应有可能错误地归因于待测化合物，而实际上该效应是能源缺乏的间接表现。本实验中这种可能性不太可能发生，因为实验用生长培养基以小分子可溶形式提供碳水化合物以及NH4+(例如葡萄糖和氨基酸)，显然不可能因为待测化合物产生聚集。作为对照，在缺乏营养的缓冲液中对加入或者不加入这些化合物检测PHYTOFLOC和Flo自身产生的效应。
微生物生长条件和化学药品表1中总结了所检测的细菌。它们包括几种代表性的革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌。细菌在37℃不通风条件下，或在Mueller Hinton肉汤中(MHB；Difco Laboratories，Detroit，Mich.)，或者在加有4％血液的Columbia琼脂平板上(BectonDickinson Microbiology Systems，Cockeysville，Md.)培养。在某些实验中，使用胰胨豆胨琼脂培养基(TSA；Difco)和心脑浸液(BHI；Difco)来研究可能的培养基效应。细菌储藏株在加有10％(体积/体积)甘油的培养基中-70℃冻存。
表格1本研究所用细菌株系
所提供的PHYTOFLOC为浓度300mg/ml蛋白质提取物的贮液。按照制造商的推荐可将其在4℃保存。另一贮液分装后保存在-20℃。冻存贮液使用前需要解冻并且只能一次使用。冻存样品的PHYTOFLOC抗菌活性稳定。所提供的Flo为干粉。保存在4℃，使用前用灭菌水配制现用。所有其他化学药品为试剂级别的市售产品。
抗菌敏感性检测将两次系列稀释的PHYTOFLOC或Flo分装到含有适当缓冲液或者营养培养基(对PHYTOFLOC为1ml，Flo为0.2ml)的聚苯乙烯管中。同时还在聚苯乙烯管中进行一项实验。在管中接种待测细菌至终浓度为ca.5×105CFU/ml，并在37℃温育。经24小时温育后每个管中分别取0.01和0.1ml体积培养液涂布在前述营养琼脂培养基上，并将平板在37℃再温育24小时后清点克隆数。MIC的定义是同原始接种体比较PHYTOFLOC或Flo抑制细菌生长的最低浓度。MBC的定义是同原始接种体比较造成生存数量减少99.9％以上的最低药物浓度。从不含药物的管中和接近MIC的管中取出的细菌通过相差显微镜观察细菌聚集情况和总体形态上的改变情况。
时间-杀灭(Time-kill)实验对具代表性的金黄色葡萄球菌和一种大肠杆菌(表格1)使用已记述过的方法(Entenza等人，1997)来研究Flo对细菌杀灭作用的动力学。简单说来，将过夜培养的细菌接种到含预热的新鲜培养基的10ml玻璃管中，终浓度为106CFU/ml。接种完毕立即加入Flo，浓度分别为2和20mg/ml。该浓度对应于金黄色葡萄球菌的MIC值(2mg/ml)和4×MBC值(20mg/ml)，并且对应于大肠杆菌的亚MIC值(2mg/ml)和2×MIC值(20mg/ml)。在加入药物前后的不同时刻取培养物样品，连续稀释，如上所述在营养琼脂培养基上涂板进行克隆计数。
PHYTOFLOC对缓冲液中细菌生长和生存的影响为检测PHYTOFLOC的影响是否取决于溶液中营养物的存在，将金黄色葡萄球菌P8和大肠杆菌ATCC 25922置于浓度逐级增加的PHYTOFLOC中，PHYTOFLOC用50mM pH值为6、7或者8磷酸钾缓冲液稀释。按描述24小时后从管中进行传代培养，并测定存活克隆的数目。图7所示为pH7时所得结果。由于使用纯净缓冲液悬浮，在PHYTOFLOC不存在时对照管中的细菌并不生长。在PHYTOFLOC存在时微生物的存活浓度在金黄色葡萄球菌为0.75mg/ml，大肠杆菌为50mg/ml，并在更高的浓度被杀灭(损失≥3log10CFU/ml)。pH为6时PHYTOFLOC活性略低(图7中曲线向右移动一个稀释度)而pH为8时活性略高(图7中曲线向左移动一个稀释度)。重要的是，相差显微镜对细菌的检测表明细菌存活力的减少不是由于聚集造成(细菌团在处理和未处理管中均相同)，而是与个别的形态学上的改变有关，在金黄色葡萄球菌中表现为可见的细菌膨胀形式。
因此，排除了营养依赖的假象，在缓冲液中PHYTOFLOC表现出真正的杀菌功效。此外，PHYTOFLOC敏感性检测中对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌使用TsB或BHI时没有出现明显的培养基效应。
PHYTOFLOC对营养肉汤中细菌生长和生存的影响图8所示为类似实验的结果，实验在MHB营养肉汤中进行而不是磷酸钾缓冲液。可以看到细菌在大多数管中都能生长，并且需要较大的PHYTOFLOC浓度才能实现抑制和杀灭功效。金黄色葡萄球菌在PHYTOFLOC浓度为12mg/ml时同时被抑制和杀灭。相比之下，大肠杆菌在浓度高达100mg/ml时仍不受抑制。由于这说明了在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌之间可能存在敏感度差异，因而对更多的细菌进行检测。
对不同细菌PHYTOFLOC和Flo的抗菌效应表格2给出了这两种被测化合物对一些革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的MIC和MBC值。对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌都重复观察到了PHYTOFLOC的抗菌活性。另外，对粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和一组革兰氏阴性细菌PHYTOFLOC不具有活性(在所检测浓度下)。
更有趣的是，和PHYTOFLOC相比Flo对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的能效高出前者10倍，并在10mg/l时有效抑制大肠杆菌。这表明Flo及其潜在的衍生物可能克服粗的PHYTOFLOC中观察到的谱系限制。
表格2PHYTOFLOC和Flo对所检测微生物的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度
*指定为mg/mlND＝未确定时间-杀灭实验图9出示了在50mM浓度pH为7的磷酸钾或者MHB中将金黄色葡萄球菌暴露于2和20mg/ml Flo浓度下的杀灭反应动力学。在2mg/ml时，Flo几乎不能产生抑制作用。相反在20mg/ml时在两个实验条件下Flo清楚的表现出杀菌功效。在本检测中对大肠杆菌使用相同的浓度无效(数据未给出)。
总之，上面所列出的实验清楚地确定了PHYTOFLOC和Flo都具有抗菌活性。尽管抗菌谱受限制，对于两种主要致病菌即金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌，观察到可重复的抑制细菌和杀菌效应。
株系特异性可用于处理特定的条件，保持正常的细菌群落，并避免在共生生物中多细菌抗性的选择。举例来说，tRNA合成酶抑制剂莫匹罗星主要对有限的一些革兰氏阳性致病菌产生活性(包括葡萄球菌和化脓性链球菌)，它已成为根除来自慢性携带者的未知多抗性葡萄球菌的主要药物，同时也是对皮肤表面感染的主要药物。类似的例子有蛋白质抑制剂梭链孢酸，它特异性地针对葡萄球菌引起的感染。对于多药物抗性生物，包括甲氧基苯青霉素抗性以及新出现的糖肽抗性葡萄球菌，此类化合物在减少其传播上的价值无法估量(请注意这里检测的金黄色葡萄球菌P8具有甲氧基苯青霉素抗性)。
需要强调一下PHYTOFLOC和Flo的另外两方面。一个是观察到它们的杀菌效应不仅对活跃生长的细菌(在营养肉汤中)，也针对非生长的细菌(在磷酸钾缓冲液中)。对于只有受限的免疫保护的解剖学部位(一种在皮肤和粘膜集群中常见的情况)，杀灭细菌是抗菌试剂的关键性质。而且，很少有药物可以杀灭缓慢生长或者不生长的细菌，而这种新陈代谢状态在体内普遍存在。大多数现有抗菌药在这种情况下不能单独根除细菌。因此这种情况下Flo独特的杀菌效应显得不同凡响。
另一方面是对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，Flo与粗PHYTOFLOC相比具有改良的活性。对该肽更深程度的纯化有可能使之活性增强，可针对更多的细菌，而不止是在这些筛选检测中研究的细菌。这方面的一个突出例子就是β-内酰胺抗生素的开发。青霉素G对革兰氏阳性菌的活性很强，但对大肠杆菌无效。然而，仅仅加上一个简单的NH2基团形成ampicillin(氨苄青霉素)，就产生了对许多革兰氏阴性菌有效的化合物。
总之，PHYTOFLOC以及由其衍生的阳离子化的Flo均具有抑制和杀灭金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的活性，但对于革兰氏阴性菌活性较低。这种菌种限制性可能与实验用化合物的作用模式有关。从生物医学的观点来看谱系限制并不妨碍其临床有效性(例如，莫匹罗星可针对多抗性葡萄球菌)。另外，PHYTOFLOC和Flo证明了它们对于非生长微生物独特的杀菌活性，这是一项潜在的极其重要的性质。
对细菌的检测已经扩展到革兰氏阴性菌军团菌属以及更进一步至分枝杆菌属。
军团菌和分枝杆菌对Flo的敏感性通过如下方式检验细菌来源细菌分离自Ticino医院的饮用水，患者菌株获自CHUV的微生物学实验室。
MIC(最小抑制浓度)MIC测量借助于96孔微板完成，每个微孔容积为100μl。对于嗜肺军团菌生长培养基为BYEα，对于分枝杆菌为TSB，培养基中均含有一定浓度的肽或者抗生素。
随后向培养基加入两次稀释的稀释液(将1μl浓度为5×108CFU/ml的细菌悬浮液稀释至5×106CFU/ml)。
嗜肺军团菌培养物在35℃温育，分别取48和96小时后的结果。分枝杆菌培养物在30℃温育至7天。
MIC值对应第一个出现生长的微孔。
MBC(最小杀菌浓度)取50μl上述悬浮液并在BYEα固体培养基或者加入血液的琼脂平板上涂板。嗜肺军团菌培养物在35℃温育48小时，而分枝杆菌培养物温育至7天。
MBC值对应第一个不出现生长的平板。
表格3和4出示了结果。表格3出示嗜肺军团菌的结果而表格4为脓肿分枝杆菌/龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌的结果。
表格3嗜肺军团菌的结果
表格4脓肿分枝杆菌/龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌的结果
可以断定嗜肺军团菌对Flo和PHYTOFLOC敏感，在相对低的浓度时就表现出了抑制和杀菌活性。
表格4的结果表明Flo的抑制和杀菌活性作用于分枝杆菌的浓度为12.5mg/ml。
总而言之，我们的结果表明根据本发明将肽(Flo，E蛋白质)用于水的净化以及水的消毒是切实可行的。这表明该方法可能成为常用化学药品重要的替代物。特别是本发明的肽通常不会有伴随用化学药品进行水处理可能产生的毒害影响，而且辣木种子目前不仅仅用于传统的水处理，而且还用来制造多种食品。使用多肽进行水处理的另一个优点是它们良好的生物降解性，而不会像例如铝盐那样，残留在处理后的水中形成杂质以及沉淀物质。最后，根据本发明100μg/ml剂量的肽即可作为抗菌试剂，这和诸如β-内酰胺以及其他常用抗生素所用的浓度相似。
Flo的结构生物信息学方法预测了推知的α-螺旋结构的存在，圆二色性光谱表明二级结构主要为卷曲。分别被称为H1、H2和H3的序列代表了从Flo一级结构推测出的三个结构域。
图10出示了H1、H2和H3的DNA和对应的肽序列。
附1.Flo表达和纯化的图示A.Flo融合蛋白表达载体的结构。Flo编码序列(阴影框)插入到编码自我剪切的内切子蛋白质区域(条纹框)的序列下游，内切子区域与几丁质结合区域(CBD，星点框)融合，处在受调控的T7噬菌体启动子的调控之下。从内切子序列上经自我剪切释放的Flo多肽序列如下面所示。
B.纯化程序图解。含有融合蛋白的细菌提取物上样到与几丁质交联(封闭椭圆)的珠粒柱，融合蛋白通过其几丁质结合区域保留在柱上。用硫醇温育柱，导致内切子发生特异性自我剪切释放出Flo多肽。用去垢剂缓冲液洗脱融合蛋白的剩余部分使柱再生。
图2.Flo蛋白质的表达A.细菌提取物的SDS-PAGE分析。纯化中间物的相同级分按如下方法上样IPTG诱导细胞的粗提取物(1道)，几丁质柱流出液(2道)，自我剪切后，融合蛋白剩余部分的洗脱液(内切子和几丁质结合区域，3道)，蛋白质分子量标记(4道)。左边上面的箭头指示融合蛋白(61.5kDa)，下面的箭头指示在切割和洗脱Flo之后的融合蛋白(55kDa)。
B.N-三(羟甲基)甲基甘氨酸PAGE分析Flo洗脱级分。1道和2道分别上样1和2μg化学合成的Flo；3道至8道Flo洗脱液的连续级分。右边分子量标记蛋白质的位置如图所示，单位为kDa。箭头指示Flo多肽的位置。有时可在高浓度级分中注意到迁移率对应Flo二聚体的痕量多肽(2至6道)。
图3.Flo凝聚活性分析按照材料和方法部分所述，在分光光度计比色杯中进行玻璃珠悬浮液沉淀分析。经过5分钟搅拌后，如箭头所示，分别加入PHYTOFLOC(B图)、合成的Flo(C图)或者细菌表达并纯化的Flo(D图)至终浓度为20μg/ml。A图中，只加入相似量的缓冲液。间隔1秒进行500nm光密度值的测量。15分钟后停止搅拌。待测化合物加入前和加入后沉淀曲线的斜率通过材料和方法部分所述的线性回归计算，图中所示为直线。
图4.Flo对大肠杆菌培养物生长的影响A.PHYTOFLOC种子提取物和细菌Flo蛋白质的效应。将指数生长期大肠杆菌培养物进行离心并在仅有磷酸盐缓冲液条件下37℃温育两小时(◆)，或者在磷酸盐缓冲液中加入PHYTOFLOC提取物(σ)或者是合成的Flo(ν)，终浓度为2mg/ml。将细菌在LB生长培养基中稀释至A600＝0.1，37℃振荡温育。然后按照在600nm所示光密度值记录。
B.如(A)中所示处理指数生长的大肠杆菌培养物，但是细菌用合成的Flo在不同浓度(mg/ml)下与之温育0(ν)、0.1(σ)、0.25(o)、0.5(∑)、1(λ)或者2(B)。使用2mg/ml的牛血清白蛋白作为非特异性蛋白质对照(◆)。
C.对Flo抗生效应可能获得抗性的分析。大肠杆菌培养物为细菌新鲜培养物(未处理细菌)，或事先在肽存在时进行温育的培养物，经过了连续两轮培养，如图A所示，收集其中最终生长的细菌(处理过的细菌)。未处理的细胞随即用缓冲液(0mg/ml Flo，◆)或Flo(2mg/ml，λ)温育。处理过的细胞进行第三轮温育，与缓冲液(σ)温育，或者与2mg/ml Flo(ν)平行温育。
D.以有或无合成的Flo的条件下温育的细菌的蛋白质合成。
图C所示相似体积的处理后细胞的培养物，或者与缓冲液温育(减号)或与2mg/ml Flo温育(加号)，在指定时刻收集培养物，将细菌沉淀，用SDS-PAGE分离总细胞蛋白质并用考马斯亮蓝染色。
权利要求
1.根据重组方法获得的蛋白质，该方法包含以下步骤- 使用已知的辣木蛋白质序列，- 重新构建最适在大肠杆菌中表达的合成基因，- 设计表达蛋白质的表达载体，优选作为与由内切子序列以及几丁质结合结构域组成的异源多肽的融合形式，- 用IPTG诱导表达，- 将制备物上样到柱上，优选上样到含几丁质珠的柱上，- 洗脱并回收天然的细菌表达的蛋白质，优选通过用含硫醇的还原化合物温育来切割融合蛋白后进行。
2.根据在E蛋白质-实施例1中公开的方法获得的蛋白质家族。
3.根据在E蛋白质-实施例2中公开的方法获得的蛋白质家族。
4.根据在E蛋白质-实施例3中公开的方法获得的蛋白质家族。
5.根据在E蛋白质-实施例4中公开的方法获得的蛋白质家族。
6.其末端之一以RGPAFRR序列起始的辣木种子蛋白质家族。
7.部分由图10中公开的α螺旋H1定义的蛋白质。
8.部分由图10中公开的α螺旋H2、或者由α螺旋H1和α螺旋H2定义的蛋白质。
9.部分由图10中公开的α螺旋H3、或由H1和H3、或由H2和H3、或由H1和H2以及H3定义的蛋白质。
10.根据权利要求2至5中任意一项的蛋白质家族，其末端之一以RGPAFRR序列起始。
11.根据上述任意一权利要求的蛋白质家族，其中蛋白质为化学合成的。
12.获得蛋白质家族的方法，其包含下列步骤- 使用已知的辣木蛋白质序列，- 重新构建最适在大肠杆菌中表达的合成基因，- 设计表达蛋白质的表达载体，优选作为与由内切子序列以及几丁质结合结构域组成的异源多肽的融合形式，- 用IPTG诱导表达- 将制备物上样到柱上，优选上样到含几丁质珠的柱上，- 洗脱并回收天然的细菌表达的蛋白质，优选通过用含硫醇的还原化合物温育来切割融合蛋白后进行。
13.E蛋白质-实施例1中公开的获得蛋白质家族的方法。
14.E蛋白质-实施例2中公开的获得蛋白质或蛋白质家族的方法。
15.E蛋白质-实施例3中公开的获得蛋白质或蛋白质家族的方法。
16.E蛋白质-实施例4中公开的获得蛋白质或蛋白质家族的方法。
17.根据权利要求1至11中任意一项的蛋白质或蛋白质家族作为流体凝聚剂的用途。
18.根据权利要求17的蛋白质或蛋白质家族的用途，其中流体为水。
19.根据前面的权利要求1至11中任意一项或者17或者18的蛋白质或者蛋白质家族在生产抗生剂中的用途。
20.来自辣木的重组或者合成的蛋白质或者蛋白质家族在生产抗生剂中的用途。
21.来自辣木的天然蛋白质或者提取物在生产抗生剂中的用途。
22.根据权利要求20或21的蛋白质或蛋白质家族的口服用途。
23.根据权利要求20或21的蛋白质或蛋白质家族的局部用途。
全文摘要
本发明涉及一种从辣木(Moringa)种子中获取的或衍生于辣木种子蛋白质的蛋白质新家族。该族蛋白质可用于多种用途，比如作为水处理的凝聚剂以及/或作为抗生剂。该新蛋白质家族包含至少5个亚家族A首先根据重组方法获得。其他亚家族根据特定的提取方法获得。本文中将根据本发明中提取方法获得的蛋白质称为E蛋白质。
文档编号C07K14/415GK1541221SQ02815722
公开日2004年10月27日 申请日期2002年7月19日 优先权日2001年7月19日
发明者N·默莫德, I·W·马里森, S·C·多里斯, E·迈耶, M·苏里兹, N 默莫德, 多里斯, 镒, 马里森 申请人:最佳环境股份有限公司