肽基多聚体靶向的造影介质的制作方法

专利名称：肽基多聚体靶向的造影介质的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断成像的造影介质，根据涉及肽靶向的多聚体造影介质，其中，肽的作用是寻靶基团以及是一个或多个螯合物在肽的氨基和羧基末端的连接点。
背景技术：
诊断成像技术如磁共振成像(MRI)、X-射线、核放射性药物成像、紫外-可见-红外线光成像和超声，已多年用于医学诊断。人们用添加的造影介质来改善或增加成像的分辨率或提供特定的诊断信息。
为了有效，造影介质必须与成像技术中所用的电磁辐射的波长相干涉，改变组织的物理特性来得到改变了的信号或在放射性药物的情况中自身提供放射源。MRI和光学成像方法是独特的成像技术，因为它们产生对化学环境敏感的复杂信号。虽然无论这些试剂在血浆中是游离的、或是结合于蛋白质或其它靶点、或被捕获于骨骼中，从X-射线或放射性核素试剂得到的信号都是保持相同的，但一些MRI和光学成像的造影介质在不同的生理环境中有不同的信号特性。一种光学染料在结合时可表现出其吸光度、反射率、荧光、磷光、化学发光、散射或其它光学特性的变化。重要的是，造影介质必须充分灵敏且存在的浓度足够高，从而能够观察到信号的变化。
钆或其它顺磁性离子和有机配体形成的络合物被广泛用于增强和改善MRI对比度。钆络合物通过增加在MRI过程中能与造影介质接触的水分子中的氢核的核磁驰豫速率提高对比度(Caravan，P.等，R.B.Chem.Rev.99，2293(1999))。相对未与造影介质接触的其它水分子中的氢核，这些水分子中氢核的驰豫速率增加了。驰豫速率的这一改变导致改进了影像的对比度。此外，在特定水分子氢核群中驰豫率(relaxivity)的这一增加可导致在给定的时间内收集更多影像数据的能力。这反过来改善了信噪比。
还可用光进行成像，在该情况下选择光学染料来提供信号。特别地，600-1300nm(可见到近红外)范围内的光相对容易通过生物组织，并可被用于成像目的。透过的、被散射的、被反射的或被再发射(荧光)的光被检测并产生影像。染料吸光度、反射系数或荧光特性的变化，包括吸收峰数目的增加或减少或其最大波长的变化，可在与生物靶标的结合时发生，因此提供了额外的组织对比度。一些情况下，例如诊断接近身体表面的疾病，也可使用UV或可见光。
需要可将足够浓度的成像部分输送到靶标以改善成像过程的灵敏度的造影介质，以及在体内有足够的半衰期的造影介质。
概述本发明基于用于MR、光学和放射性核素成像的肽和肽靶向的多聚体造影介质，其中单独的肽的作用是寻靶基团以及是一个或多个螯合物在肽的N-和C-末端的连接点，连接是直接的或通过任选的中间连接基。意想不到的是，本发明的造影介质对生物靶标如血纤蛋白保持结合亲和性和高驰豫率。本发明的试剂在体内施用后有足够的半衰期，这样就可进行有效的成像研究。
一方面，本发明以纯化的肽为特征，该肽含有氨基酸序列P*-Y*-X1*-L*(SEQ IDNO1)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1*是G或D或G或D的非天然衍生物；L*是亮氨酸或其非天然衍生物；且其中至少P*、Y*、X1*和L*之一是各个氨基酸的非天然衍生物。X1*可以是G或D和L*可以是亮氨酸。在一些实施方案中，P*是脯氨酸或4-羟脯氨酸和Y*是酪氨酸或在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。本发明的化合物可包括与溶血栓剂结合的这种肽。
在另一方面，本发明以纯化的肽为特征，所述肽含有氨基酸序列X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(SEQ ID NO2)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1选自W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)和Y(3*)，其中F(3/4*)是在3或4位被选自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸，且其中Y(3*)是在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸；X2选自E、H、dE、S、H(Bzl)、2-Pal、Dpr和Th；X3选自G和D；X4选自H、F、Y和W；X5选自I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal和F(3/4*)，其中F(3/4*)是在3或4位被选自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸；X6选自N、Q、I、L和V或X6不存在；其中至少X1，X2，X5，P*和Y*之一是氨基酸的非天然衍生物。例如，P*可以是脯氨酸或4-羟脯氨酸和Y*可以是酪氨酸或在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。所述纯化的肽能够在非还原条件下形成二硫键和对血纤蛋白有特异的结合亲和性。在一些实施方案中，所述肽含有二硫键。本发明的化合物可包括与溶血栓剂结合的这种肽。
本发明还以纯化的肽为特征，所述肽含有选自W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO4)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO5)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO6)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO7)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO8)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO9)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO10)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ IDNO11)、F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO12)、Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO13)、W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO14)、W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO15)和F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO16)的氨基酸序列。所述肽能够在非还原条件下形成二硫键和在一些实施方案中，所述肽含有二硫键。这些肽可对血纤蛋白有特异的结合亲和性。本发明的化合物可包括与溶血栓剂结合的这种肽。
在一些实施方案中，P*是脯氨酸；Y*是酪氨酸；X1选自W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)和Y(3*)，其中F3/4*是在3或4位被选自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸，且其中Y3*是在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸；X2选自dE，H(Bzl)，2-Pal，Dpr和Th；X3选自G和D；X4选自H、F、Y和W；X5选自I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal和F(3/4*)，其中F3/4*是在3或4位被选自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸，其中至少X1，X2或X5之一是非天然氨基酸衍生物；和X6选自N、Q、I、L和V或X6不存在。这种肽能够在非还原条件下形成二硫键，在一些实施方案中，所述肽含有二硫键。所述肽可对血纤蛋白有特异的结合亲和性。
在其它实施方案中，本发明以纯化的肽为特征，所述肽含有氨基酸序列C-P*-Y*-X1-L-C(SEQ ID NO3)，其中X1是G或D，P*是脯氨酸或其非天然衍生物4-羟脯氨酸；Y*是酪氨酸或在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物；条件是，至少P*或Y*之一是各个氨基酸的非天然衍生物。所述纯化的肽能够在非还原条件下形成二硫键并可对血纤蛋白有特异的结合亲和性。在一些实施方案中，所述肽含有二硫键。本发明的化合物可包括与溶血栓剂结合的这种肽。
本发明还以纯化的肽为特征，所述肽含有氨基酸序列C-D-Y-Y-G-T-C-X10(SEQ ID.NO17)，其中X10选自n(癸基)G、n(4-PhBu)G、MeL、Bpa、Bip、Me-Bip、F(4*)、F(3-Me)、F(3，4-二氟)、Amh、Hfe、Y(3，5-二-碘)、Pff、1Nal、d1Nal和MeL，其中F(4*)是在4位被选自Et、CF3、I和iPr的部分取代的苯丙氨酸。纯化的肽可包含氨基酸序列C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(SEQ ID.NO18)，其中X11选自D、dD、βD、Inp、Nip、Me-D、dC、Cop和Cmp。例如，所述肽可有以下氨基酸序列L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-dD(SEQ ID NO19)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-D(SEQ ID NO20)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D(SEQ ID NO21)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD(SEQ ID NO22)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Inp(SEQ ID NO23)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp(SEQ IDNO24)或L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D(SEQ ID NO25)。所述纯化的肽能够在非还原条件下形成二硫键并可对血纤蛋白有特异的结合亲和性。在一些实施方案中，所述肽含有二硫键。本发明的化合物可包括与溶血栓剂结合的这种肽。
在另一方面，本发明以制造MR显影剂的方法为特征。所述方法包括使带有N-末端胺官能团的肽与连接基-亚单元部分反应以形成含有C-末端胺官能团和N-末端胺官能团的修饰的肽；使连接基部分共价结合到C-末端胺官能团和N-末端胺官能团以形成前体MR显影剂；和将前体MR显影剂转变成MR显影剂。所述连接基-亚单元部分可以选自 和 其中，n是1-4的整数；m是选自1-12的整数；R是脂肪基或芳基。所述连接基部分可以选自
其中，m是1-4的整数；n是0-4的整数；LG是离去基团；R’和R”独立选自氢和化学保护基。
所述连接基部分也可选自 其中，LG是离去基团；和R1和R2独立选自氢和化学保护基。所述LG可以选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐。所述活性酯可以选自五氟苯酚(Pfp)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰钠盐(NHSS)、2-硫代噻唑烷-1-基和羟基苯并三唑(OBT)。所述卤化物可以选自F，Cl，Br和I。所述化学保护基可以选自Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、苄基和烯丙基。
将前体MR显影剂转变成MR显影剂可包括使前体显影剂与前体螯合部分反应以在前体螯合部分和前体MR显影剂的连接基部分之间形成共价键，所述前体螯合部分含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分；将结合的前体螯合部分的多个羧酸盐前体基团转化成多个羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。所述前体螯合部分可以选自
和 其中，Y是能够能够与所述连接的连接基部分形成共价键的合成部分，且其中每个X分别是O-或O-前体，这样，在X转变成O-后就能够与其邻近的羰基形成羧酸盐部分，R1是不带电荷的化学部分、脂肪基烷基或环烷基或其不带电荷的取代的形式。所述合成部分选自羧酸、活性酯、酸酰卤、酸酐、卤代烷、异氰酸酯和异硫氰酸酯，其中O-前体选自-OH、-OMe、OEt、OtBu、O苄基和O-烯丙基。所述前体螯合部分也可选自 和 其中，LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团，且其中每个R分别是选自OH，-O-Me，O-Et，O-tBu，O-苄基和O-烯丙基的O-或O-前体，这样，在R转变成O-后就能够与其邻近的羰基形成羧酸盐部分。
所述前体螯合部分还可选自 其中，n是1-4的整数；R选自负电荷和能够转化成负电荷的带有负电荷的前体；和X是选自-Cl，-Br，-I，-MsO，-TsO和-TfO的化学离去基团。
所述前体螯合部分还可选自
其中，R选自负电荷和能够转化成负电荷的带有负电荷的前体；X是选自-Cl，-Br，-I，-MsO，-TsO和-TfO的化学离去基团。所述带有负电荷的前体选自-H，-Me，-Et，-t-Bu，-苄基和-烯丙基。
在一些实施方案中，所述连接基部分可与前体螯合部分共价缀合，所述共价缀合物含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分。将前体MRI显影剂转变成MR显影剂可包括将多个共价缀合物的羧酸盐前体基团转化成羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。所述顺磁性金属离子可以选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。Gd(III)是特别有用的顺磁性离子。
所述共价缀合物选自
和 其中，n是1-4的整数；LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团；和R1，R2，R3，R4和R5独立选自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保护的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
所述共价缀合物选自 其中，LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团；R1，R2，R3和R4选自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保护的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
所述共价缀合物选自合成子1
和合成子2 所述共价缀合物选自 其中，R是-tBu基，LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团。
本发明的方法还可包括，在将连接基部分共价附到C-和N-末端胺官能团之前，使连接基-亚单元与肽的N-末端胺官能团反应以得到肽的衍生的N-末端胺官能团。
所述连接基-亚单元选自 和 其中，碱基选自腺苷、鸟苷、胸腺嘧啶和胞嘧啶；LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团；R是脂肪或芳香部分。所述连接基-亚单元选自 其中，n分别为0-3的整数；R是脂肪基或芳基；LG是选自OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团。
所述连接基-亚单元也可选自 和 其中，n分别是1或2；R是脂肪基或芳基；LG是选自OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团。
在另一方面，本发明以制造MR显影剂的方法为特征。所述方法包括使氨基酸残基共价结合到连接基-亚单元部分以形成肽的C-末端，其中所述连接基-亚单元部分共价连接到树脂上；在树脂上从共价结合的C-末端到肽的N-末端残基合成肽，所述N-末端残基包括N-末端胺官能团；从树脂上切下肽以产生带有C-末端胺官能团的肽；将连接基部分共连接到肽的C-末端胺官能团和N-末端胺官能团以形成前体MR显影剂；和将所述前体MR显影剂转化成MR显影剂。所述方法还包括在从树脂上切下肽之前使连接基-亚单元附到共价缀合到N-末端胺官能团以制造衍生的N-末端胺官能团。所述连接基部分可共价结合到前体螯合部分，所述共价缀合物含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分将前体MR显影剂转变成MR显影剂可包括使前体显影剂与前体螯合部分反应以在前体螯合部分和前体MR显影剂的连接基部分之间形成共价键，所述前体螯合部分含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分；将结合的前体螯合部分的多个羧酸盐前体基团转化成多个羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。
将前体MRI显影剂转变成MR显影剂还可包括将多个共价缀合物的羧酸盐前体基团转化成羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。所述顺磁性金属离子可以选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。Gd(III)是特别有用的顺磁性金属离子。
在另一方面，本发明以制造MR显影剂的方法为特征，所述方法包括使带有C-末端羧酸盐官能团的肽与连接基-亚单元部分反应以形成具有C-末端羧酸盐官能团和N-末端羧酸盐官能团的修饰的肽；使连接基部分共价结合到修饰的肽的C-末端和N-末端羧酸盐官能团以形成前体MR显影剂；和将前体MR显影剂转变成MR显影剂。所述连接基-亚单元部分可以选自 和 其中，LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团；R为脂肪基或芳基。所述连接基部分可以选自
其中，m是1-4的整数；n是0-4的整数；R独立选自-H，-Me，-Et，-Bz和-tBu；和R1和R2独立选自氢或化学保护基。
所述连接基部分选自 其中，R1和R2独立选自氢和化学保护基，所述化学保护基选自Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、苄基和烯丙基。
将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂还包括使前体MR显影剂与前体螯合部分反应以在前体螯合部分和前体MR显影剂的连接基部分之间形成共价键，所述前体螯合部分包括多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分；将结合的前体螯合部分的多个羧酸盐前体基团转化成多个羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。所述连接基部分共价结合到前体螯合部分，所述共价缀合物含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够被转化成羧酸盐部分。
将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂还包括将多个共价缀合物的羧酸盐前体基团转化成羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。
所述共价缀合物可选自
和 其中，n是1-4的整数；R1，R2，R3，R4和R5独立选自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保护的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。所述共价缀合物是 将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂还包括使前体显影剂与螯合部分反应，其中所述螯合部分含有顺磁性金属离子，以在螯合部分和前体MR显影剂的连接基部分之间形成共价键以制造MR显影剂。合适的顺磁性金属离子如上所述。
在另一方面，本发明以造影介质为特征，所述造影介质在生物高分子(如肽)的-CO2R和NHR末端含有金属螯合物的造影介质，其中，R独立选自氢，烷基，脂肪基和离去基团。所述造影介质可在生物高分子的CO2R和NHR末端含有两个金属螯合物。所述生物高分子对血纤蛋白有特异的结合亲合性。所述肽能够在非还原条件下形成二硫键，在一些实施方案中，包括二硫键。所述造影介质可含有以下结构
其中，螯合物代表金属螯合物；连接基代表连接基部分；连接基-亚单元代表连接基-亚单元部分；m独立为1-10的整数；p独立为0-5的整数；s独立是0或1；R1是氨基酸侧链或其衍生物；R2独立是氢或脂肪基。该造影介质也可具有结构4-55中任一所述的结构。
在另一方面，本发明以改变肽的稳定性的方法为特征，所述肽带有N-末端胺官能团的肽。所述方法包括使所述肽与连接基-亚单元部分反应以形成具有C-末端胺官能团的肽；和使连接基部分共连接到肽的C-末端胺官能团和N-末端胺官能团以形成修饰的肽。所述方法还包括使修饰的肽与帽化部分反应以在帽化部分和修饰的肽的连接基部分之间形成共价键。所述方法还包括使修饰的肽与前体螯合部分反应以在前体螯合部分和修饰的肽的连接基部分之间形成共价键，所述前体螯合部分含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分。在将结合的前体螯合部分的多个羧酸盐前体基团转化成多个羧酸盐部分后，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；顺磁性金属离子可与多个羧酸盐部分配位。所述的方法还包括测定所述修饰的肽的稳定性或测定所述未修饰的肽的稳定性和比较所述修饰的肽的稳定性与所述未修饰的肽的稳定性。修饰的肽的稳定性相对于未修饰的肽的稳定性有所改进(如相对于未修饰的肽的稳定性增加了10倍、20倍或30倍)。所述稳定性采用大鼠肝脏匀浆测定进行。
在另一方面，本发明以具有以下结构的修饰的肽为特征 其中，螯合物前体代表螯合物前体部分；连接基代表连接基部分；连接基-亚单元代表连接基-亚单元部分；m独立为1-10的整数；p独立为1-5整数；s独立是0或1；R1是氨基酸侧链或其衍生物；R2选自H和脂肪基。
再在另一方面，本发明以具有以下结构的修饰的肽为特征 其中，连接基代表连接基部分；连接基-亚单元代表连接基-亚单元部分；p独立为0-5的整数；s独立是0或1；R1是氨基酸侧链或其衍生物；R2选自H和脂肪基。
一种制造MR显影剂的方法的特征还在于，使带有N-末端胺官能团的肽与连接基-亚单元部分反应以形成在其N-末端和C-末端都有胺官能团的修饰的肽或使带有C-末端羧酸盐官能团的肽与连接基-亚单元部分反应以形成在其C-末端和N-末端都有羧酸盐官能团的修饰的肽；和将修饰的肽转变成MR显影剂。将修饰的肽转变成MR显影剂包括使螯合部分共价缀合到修饰的肽，其中所述螯合部分含有顺磁性金属离子，以制造MR显影剂。将修饰的肽转变成MR显影剂还包括使连接基部分共价缀合到螯合物部分以形成共价缀合物，其中所述螯合部分含有顺磁性金属离子；以及使共价缀合物与修饰的肽反应以形成MR显影剂。合适的顺磁性金属离子如上所述。
在另一方面，本发明以制造MR显影剂的方法为特征，所述方法包括使氨基酸残基共价结合到连接基-亚单元部分以形成肽的C-末端，其中所述连接基-亚单元部分共价结合到树脂；在树脂上从肽的共价结合的C-末端到N-末端残基合成肽，所述N-末端残基包括N-末端胺官能团；从树脂上切下肽以制造带有C-末端胺官能团的肽；将修饰的肽转变成MR显影剂。将修饰的肽转变成MR显影剂包括使螯合部分共价结合到修饰的肽，其中所述螯合部分含有顺磁性金属离子，以制造MR显影剂。将修饰的肽转变成MR显影剂还包括使连接基部分共价结合到螯合物部分以形成共价缀合物，其中所述螯合部分含有顺磁性金属离子；以及使共价缀合物与修饰的肽反应以形成MR显影剂。合适的顺磁性金属离子如上所述。
除非另有说明，这里所用的所有技术和科学术语与本发明所述技术领域的一般技术人员的常规理解有着同样的含义。尽管可用与这里所述方法类似或等价的方法和材料来实践本发明，但下面还是描述了合适的方法和材料。这里提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料在此全文并入以供参考。当发生冲突时，本说明书，包括定义，将进行控制。此外，这些材料、方法和实施例仅是为了举例而不是进行限制。
通过以下详细描述和权利要求将显见本发明的其它特征和优点。
附图简述

图1提供了非天然氨基酸的化学结构。
图2显示了20MHz 35℃下，在Tris缓冲的盐水(TBS)或溶于TBS的10mg/ml血纤蛋白中每Gd的驰豫率。
图3显示了血栓中造影介质的积累。
图4A是血栓的影像。图4B是带有淤血的血栓的影像。
详细描述定义在本文中没有明显定义的常用化学缩写可以在“美国化学协会文体指南(TheAmerican Chemical Society Style Guide)”第二版；American Chemical Society，华盛顿特区(1997)，“作者指南2001(2001 Guidelines to Authors)”J.Org.Chem.66(1)，24A(2001)，“肽类科学中的缩写速览及其应用(A Short Guide toAbbreviations and Their Use in Peptide Science)”J.Peptide.Sci.5，465-471(1999)。
出于本申请的目的，术语“化学保护基”或“保护基”是指任何通过一个或多个按反应顺序进行的合成化学步骤与分子临时共价结合以防止不希望的反应发生的化学部分。通常的保护基策略描述在“有机合成中的保护基(Protecting Groups in OrganicSynthesis)，第三版”，P.Wuts和T.Greene，_1999 John Wiley & Sons公司。
出于本申请的目的，术语“离去基团”是指任何在亲核取代或加成-消除反应顺序中被亲核体取代的化学部分。含有离去基团的分子可在化学反应中被分离或可在原位作为暂的中间体形成。
出于本申请的目的，术语“脂肪基”描述了任何无环或环状的、饱和或不饱和、分支或不分支的碳化合物，不包括芳香化合物。
术语“烷基”包括饱和的脂肪基，包括直链烷基(如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)，支链烷基(异丙基，叔丁基，异丁基等)，环烷基(脂环族)基团(环丙基，环戊基，环己基，环庚基、环辛基)，烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。术语烷基还包括烷基，所述烷基的烃主链的一个或多个碳原子被氧原子、氮原子、硫原子或磷原子替代。在一些实施方案中，直链或支链烷基的主链含有6个或6个以下碳原子(如直链为C1-C6，支链为C3-C6)，更优选是有4个或4个以下。同样，优选的环烷基的环结构中含有3-8个碳原子，更优选是环结构中有5或6个碳。术语C1-C6包括含有1-6个碳原子的烷基。
此外，术语“烷基”包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者是指烷基部分烃主链的一个或多个碳原子上的氢被取代基取代。这种取代基可以包括，例如，链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸盐、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸盐、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳基部分或杂芳基部分。环烷基可进一步被取代，例如被上述取代基取代。“芳基烷基”部分是被芳基取代的烷基(如苯基甲基(苄基))。术语“烷基”还包括天然和非天然氨基酸的侧链。术语“n-烷基”是指直链(即未分支的)未取代的烷基。
术语“链烯基”包括像上述烷基那样被取代或未被取代的含有至少一个双键和至少两个碳原子的脂肪基。例如，术语“链烯基”包括直链链烯基(如乙烯基(ethylenyl)、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)，支链链烯基，环链烯基(脂环族)基团(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)，烷基或链烯基取代的环链烯基和环烷基或环链烯基取代的链烯基。术语链烯基还包括烃主链的一个或多个碳原子被氧原子、氮原子、硫原子或磷原子替代的链烯基。在一些实施方案中，直链或支链链烯基的主链有6个或6个以下碳原子(如直链为C2-C6，支链为C3-C6)。同样，环链烯基的环结构中可有3-8个碳原子，优选在其环结构中有5或6个碳。术语C2-C6包括含有2-6个碳原子的链烯基。
此外，术语链烯基包括“未取代的链烯基”和“取代的链烯基”，后者是指烃主链的一个或多个碳上的氢被取代基取代的链烯基部分。这种取代基包括，例如，烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸盐、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸盐、硫酸酯、烷基亚磺酰基，磺基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基，叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳基部分或杂芳基部分。
术语“炔基”包括在长度和可能的取代上与上述烷基类似的不饱和的脂肪基，但含有至少一个三键和两个碳原子。例如，术语“炔基”包括直链炔基(如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)，支链炔基和环烷基或环链烯基取代的炔基。术语炔基还包括烃主链的一个或多个碳原子被氧原子、氮原子、硫原子或磷原子替代的炔基。在一些实施方案中，直链或支链炔基的主链有6个或6个以下碳原子(如直链为C2-C6，支链为C3-C6)。术语C2-C6包括含有2-6个碳原子的炔基。
通常，术语“芳基”包括5元和6元单环芳香基，它可以含有0-4个杂原子，例如苯、苯基、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、异噁唑、吡啶、哌嗪、哒嗪和嘧啶等。此外，术语“芳基”包括多环芳基，如三环、二环，如萘、苯并噁唑、苯并二噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亚甲二氧苯基、喹啉、异喹啉、萘啶(napthridine)，吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、去氮杂嘌呤(deaza嘌呤)或吲哚嗪。那些在环结构中含有杂原子的芳基也被称为“芳基杂环”、“杂环”、“杂芳基”或“杂芳族化合物”。芳基可在一个或多个环位置上被取代基取代。
出于本申请的目的，“DTPA”是指含有二亚乙基三胺构成的亚结构的化合物，其中，两个伯胺分别共价连接到两个乙酰基，仲胺带有一个共价连接的乙酰基，结构如下 其中，X是能够与金属阳离子配位的杂原子电子供体基团，优选是O-、OH、NH2、OPO32-或NHR或OR，其中R是任何脂肪基。当每个X基都是叔-丁氧基(tBu)时，此结构可被称为“DTPE”(“E”表示酯)。
出于本申请的目的，“DOTA”是指含有1，4，7，11-四氮杂环十二烷亚结构的化合物，其中，每个胺都带有一个共价连接的乙酰基，有以下结构 其中，X如上述定义。
出于本申请的目的，“NOTA”是指含有1，4，7-三氮杂环壬烷亚结构的化合物，其中，每个胺都带有一个共价连接的乙酰基，有以下结构 其中，X如上述定义。
出于本申请的目的，“DO3A”是指含有1，4，7，11-四氮杂环十二烷亚结构的化合物，其中，四个胺中有三个分别带有一个共价连接的乙酰基，其余的胺具有不带电荷的取代基，结构如下
其中，X如上述定义，R1是不带电荷的化学部分，优选是氢、任何脂肪基、烷基或环烷基及其不带电荷的衍生物。优选的螯合物“HP”-DO3A中，R1＝-CH2(CHOH)CH3。
在上述四个结构中，所指出的次乙基上的碳被称为“主链”碳。可用“bbDTPA”来表示DTPA分子中化学键的位置(“bb”表示“主链”)。注意，当用在这里时，bb(CO)DTPA-Gd表示C＝O部分与DTPA的次乙基主链碳原子结合。
术语“螯合配体”、“螯合部分”和“螯合物部分”可以指任何能够与金属离子配位的多配位基的配体，包括DTPA(和DTPE)、DOTA、DO3A或NOTA分子或如这里进一步定义的任何其它合适的多配位基的螯合配体，它与金属离子配位或能够直接或在除去保护基后与金属离子配位，或是用于合成造影介质的试剂，所述试剂带有或不带有合适的保护基，并包括几乎所有最终将与最后的金属络合物的金属离子配位的原子。术语“螯合物”实际上是指金属-配体络合物，应该知道多配位基的配体最终将与在医学上有用的金属离子配位。
术语“特异的结合亲和性”在这里是指造影介质能够被特定的生物组分以大于其它组分的程度被摄入、保留或结合的能力。有此特性的造影介质被称为“靶向”“目标”组分。没有此特性的造影介质被称为“非特异性”或“非靶向”试剂。结合基团对目标的特异结合亲和性以平衡离解常数“Kd”表示。
术语“驰豫率”在这里是指每毫摩(mM)浓度的顺磁性离子或造影介质MRI量1/T1或1/T2的增加，如果造影介质含有多种顺磁性离子则这些量可以不同，其中T1是纵向或自旋点阵驰豫时间，T2是水的氢核或其它成像或光谱核的横向或自旋-自旋驰豫时间，包括水以外分子中的氢核。驰豫率的单位是mM-1s-1。
术语“开放配位位点”在这里是指通常被水或溶剂分子占据的金属离子上的位点。
当用在这里时，术语“纯化的”是指已经与它通常结合的天然产生的有机分子分离的肽，或者，当提到化学合成的肽时，是指已经与化学合成中出现的任何其它有机分子分离的肽。通常，当多肽干重的至少70％(如70％，80％，90％，95％或99％)不含任何其它蛋白质或有机分子时该多肽被认为是“纯化的”。
当用在这里时，术语″肽″是指含有约2-75个氨基酸长度的氨基酸链(如3-50个氨基酸)。
当用在这里时，术语“生物高分子”是指在生物系统中天然形成的聚合物。一些生物高分子可由一组确定的构成亚单元和连接这些亚单元的常规的官能度构成，例如肽通常是由一组氨基酸(天然和非天然氨基酸)由连接此亚单元的酰胺键构成的。
术语“多聚体”在这里是指造影介质或其含有至少两个共价结合的螯合物的亚单元或其合成前体。
当用在这里时，术语“天然”或“天然产生的”氨基酸是指20种最常见的氨基酸之一。经过修饰的提供检测标记(如放射性标记、光学标记或染料)的天然氨基酸被认为是天然氨基酸。天然氨基酸用它们的标准一个字母或三个字母的缩写表示。
术语“非天然氨基酸”或“非天然”是指天然氨基酸(包括D构型)的任何衍生物和β和γ氨基酸衍生物。某些氨基酸，如羟脯氨酸，在这里被归为非天然氨基酸，可在自然界的一些生物体或特定蛋白质中找到。
术语“稳定的”在这里是指具有足以进行制造的稳定性并能将化合物的完整性保持足够长的时间的化合物，在这段时间内该化合物对这里详细描述的目的是安全有效的。代表性地，这种化合物在40℃或更低温度下，在没有水蒸气或其它化学反应条件下至少可稳定一周。取代基和本发明可想像到的变化的组合只是能产生稳定化合物的那些。
术语“靶结合”和“结合”在这里是指造影介质与靶点的非共价相互作用。这些非共价相互作用相互无关，可以是疏水的、亲水的、偶极-偶极、π-重叠、氢键、静电相互作用或路易斯酸-碱作用。
术语“帽化部分”是指螯合物、有机染料、造影介质、溶血栓剂或稳定化处理部分。合适的稳定化处理部分是生物惰性的，即不具有生物活性。
造影介质通常，本发明涉及MRI、光学和放射性核造影介质，包括寻靶聚合物(如肽)，其中N-和C-末端氨基酸都直接或通过任选的间隔连接基-亚单元和连接基头与至少一个顺磁性(用于核磁共振成像)或放射性(用于放射性核素成像)金属离子螯合物或光学染料(用于光学成像)缀合。如这里进一步举例的，所述连接基或连接基-亚单元可以分支，因此肽的各个末端可有多个螯合物或染料连接，即形成多聚体。本发明的化合物可含有一个或多个不对称碳原子，因此可产生外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、非对映混合物和各个非对映体。这些化合物所有的这些异构形式都包括在本发明之内。除非另有说明，每个立构的碳可以是R或S构型的。尽管本申请中特别例举的化合物有特定的立体化学构型，但在任何给定的手性中心有相反立体化学的化合物或它们的混合物也包括在内。应该理解，本发明的化合物在溶液中、药物组合物中和体内可以有各种构象和离子形式。尽管这里描述的特别优选的本发明的化合物有着特定的构象和离子形式，但本发明不限于此。
本发明的新型肽基多聚体作为靶向造影介质有以下优点。
1.所述化合物可通过一个寻靶肽将两个或多个帽化部分(如螯合物、有机染料或溶血栓剂)输送到靶点，这样就可以观察到足够强的组织对比，这一部分是由于靶点周围成像部分的浓度较高。
2.本发明的这种MRI造影介质在与靶点结合时还有较高的驰豫率，这是由于当与靶点结合时受体诱导的磁性增强(RIME)效应以及这种肽限制各个螯合物局部运动的能力。
3.所述化合物对一个或多个靶点有高亲和性。
4.由于这种化合物相对较容易用这里所述的方法合成，且每个分子只需要一个肽，所以可以更经济地将多个金属离子或有机染料输送到靶点。
5.由于减少了酶的代谢作用(如被肽酶切割除去)本发明的化合物可具有较高的体内稳定性(即较长的半衰期)。
本发明肽基多聚体的这些优点使它们成为有效的靶向造影介质。
下式可说明本发明所预期的MRI和放射性核素造影介质的化学结构 其中，各个m分别满足1≤m≤10，螯合物代表金属螯合物，p独立为0-5的整数；s独立是1或0；R1是包括非天然氨基酸侧链在内的任何氨基酸侧链；R2是任何脂肪基或氢；n是3-50之间的整数(包括3和50)。或者，R1和R2可以一起形成一个环结构(包括脯氨酸及其取代形式)。连接基，如果有的话，可以是不同的。
MRI优选的金属离子的原子序数为21-29，39-47或57-83，更加优选的是原子序数为21-29，42，44或57-83的金属离子的顺磁性形式。特别优选的顺磁性金属离子选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)和Eu(II和III)。Gd(III)特别有用。需要注意的是，当用在这里时，术语“Gd”包括金属钆的离子形式；这种离子形式可写作GD(III)、GD3+、gado等，与所预期的离子形式没有不同。
对于放射性核素显影剂，放射性核素90Y、99mTc、111In、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、167Tm、97Ru、188Re、177Lu、199Au、203Pb和141Ce特别有用。还描述了具有有用光学特性的金属络合物。见Murru等，J.Chem.Soc.Chem.Comm.1993，1116-1118。用于光学成像螯合物、镧系螯合物如La(III)、Ce(III)、Pr(III)、Nd(III)、Pn(III)、Sm(III)、Eu(III)、Gd(III)、Tb(III)、Dy(III)、Ho(III)、Er(III)、Tm(III)、Yb(III)和Ln(III)是合适的。Eu(III)和Tb(III)特别有效。
在显影剂通过身体包括与靶组织结合时，金属螯合物不应解离到任何显著程度(significant degree)。游离的金属离子的显著释放会导致中毒，这通常是无法接受的。
在一个实施方案中，当提及造影介质的上述结构时，m是2，n，s，R1和R2如上述定义，所述连接基部分含有 “螯合物”优选是bb(CO)DTPA·Gd。
在另一个实施方案中，当提及造影介质的上述结构时，m是2，n、s、R1和R2如上述定义，所述连接基部分含有 “螯合物”部分可以是bb(CO)DTPA·Gd。
出于阐述的目的，本发明预期的造影介质如下，其中指出了各个亚单位
其中，R＝氨基酸侧链，这样所述肽对生物靶点有亲和性，m＝金属离子(对MRI为顺磁性，对放射性核素成像为反射性核素，对光学成像为荧光、冷光或吸收)。
本发明光学造影介质的化学结构如下 其中，1≤m≤10，p独立为0-5的整数，n是3-50，R1是包括非天然氨基酸侧链在内的任何氨基酸侧链，R2是任何脂肪基或氢。或者R1和R2一起形成环结构(包括脯氨酸及其衍生物。肽的N-和C-末端氨基酸直接或通过任选的连接基(如p＝0或1)与光学染料结合。所述连接基部分可以是不同的。
所述光学染料可以是有机染料或合适的金属螯合物。已经描述了适合光学成像的有机染料，其中包括，例如，荧光卟啉和荧光酞菁染料[例如参见美国专利No.5,641,878]、颗粒物质[例如参见WO 96/23524]和聚甲炔染料[例如参见WO 97/13490]。通常使用的光学有机染料有荧光素、若丹明[例如参见Kojima H等，Anal.Chem.73，1967-1973(2001)]、四甲基若丹明[如Anal.Biochem.223，39(1994)]和得克萨斯红[如Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，3546(1988)]。荧光素和冷光镧系螯合物特别有效。
靶点和靶结合肽本发明造影介质的肽部分对生物靶标显示特异性结合，其每一末端都可作为一个或多个螯合物的连接点。通常，生物靶点以低浓度(如微摩或更少)存在且无法用现有的单节显性钆络合物MRI造影介质有效成像。然而，本发明的肽基多聚体MRI造影介质在靶位点提供了较高的试剂浓度以及高驰豫率以使这些靶点可以成像。类似地，本发明的肽基多聚体放射性核素造影介质可将多个放射性核素输送到靶点，这样就可有效改善成像。虽然未局限于任何特定机制，人们认为寻靶使显影剂在要成像的靶位点上浓度增加，并通过RIME效应使MRI造影介质在结合阶段的驰豫率增加，同时通过使结合的肽刚性化而限制了局部螯合物的运动。
造影介质的靶点可存在于任何身体区室、细胞、器官或组织或它们的组成成份。优选的靶点是与诊断和治疗有关的位点，即与疾病状态有关的位点。特别优选的靶点是与体液有关的位点，尤其是与血液、血浆、淋巴液和中枢神经系统的液体有关的位点。其它优选的靶点是以高浓度存在的蛋白质和受体或有大量配体结合位点的受体。这些靶蛋白质包括酶和糖蛋白。
人血清白蛋白(HSA)和血纤蛋白是MRI造影介质的有效靶点。为进行血管郁血(blood pool)成像，血清白蛋白是优选的靶点。由于HSA以高浓度存在于血清中(约0.6mM)并与许多分子以高亲和性结合，因此是血池造影介质优选的靶血浆蛋白质。HSA是心血管成像优选的靶点；参见1997年7月24日提交的美国专利申请No.08/875,365和WO 96/23526。
为对血栓进行成像，血纤蛋白是优选的靶点，因为它存在于所有的血凝块中，且它无需用常规的溶血栓剂处理即可成为靶点。为了解与包括血纤蛋白结合肽的靶结合部分有关的细节可参见PCT专利申请WO 01/09188。
其它蛋白质靶点包括但不限于α酸糖蛋白、血纤蛋白原、骨胶原、血小板GPIIb/IIIa受体、趋化肽受体、促生长素抑制素受体、血管活性肠肽(VIP)受体、铃蟾肽/胃泌素释放肽受体等整联蛋白受体。
用于本发明的合适的肽包括能够特异性结合上述靶点的那些。其中包括进行血栓成像的靶向血小板GPIIb/IIIa受体的含有RGD的肽，进行感染/炎症成像的靶向白细胞的趋化肽，进行肿瘤成像的靶向somastatin受体的奥曲肽和P-829肽，进行肿瘤成像的靶向VIP受体的血管活性肠肽(VIP)，进行肿瘤成像的靶向铃蟾肽/胃泌素释放肽受体的铃蟾肽类似物，和进行肿瘤成像的靶向整联蛋白v3(玻连蛋白受体)的含有RGD的肽。
原则上，任何对生物靶点具有亲和性的肽都可用作本发明的造影介质。所述肽可以是线性或环状的。通常，不可溶的亲脂性肽不适合药理学应用，但由于在肽的两个末端加入亲水的金属螯合物可增加溶解度所以这种肽是适合本发明的。为易于合成和降低费用，优选这种肽有3-50个氨基酸(如3-30个、3-20个、3-15个、5-30个、5-20个、5-15个、10-12个氨基酸)。
在本发明的寻靶肽中，可使用各种氨基酸。合适的氨基酸包括天然和非天然氨基酸。带有许多不同保护基适合直接用于固相肽合成的氨基酸是商业上可获得的。除了20中最常见的天然氨基酸，以下非天然氨基酸或氨基酸衍生物也可作来构成本发明的寻靶肽(括号里为常用的缩写，见图1)-丙氨酸(-Ala)、γ-氨基丁酸(GABA)、2-氨基丁酸(2-Abu)、α，β-二氢-2-氨基丁酸(-Abu)、1-氨基环戊烷-1-羧酸(ACPC)、氨基异丁酸(Aib)、2-氨基-噻唑啉-4-羧酸，5-氨基缬草酸(5-Ava)、6-氨基己酸(6-Ahx)、8-氨基辛酸(8-Aoc)、11-氨基十一烷酸(11-Aun)、12-氨基月桂酸(12-Ado)、2-氨基苯甲酸(2-Abz)、3-氨基苯甲酸(3-Abz)、4-氨基苯甲酸(4-Abz)、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Statine，Sta)、氨基羟基乙酸(Aoa)、2-氨基-1，2，3，4-四氢化萘-2-羧酸(Atc)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、对-氨基苯丙氨酸(4-NH2-Phe)、二苯丙氨酸(Bip)、对-溴代苯丙氨酸(4-Br-Phe)、邻-氯代苯丙氨酸(2-Cl-Phe)、间-氯代苯丙氨酸(3-Cl-Phe)、对-氯代苯丙氨酸(4-Cl-Phe)、间-氯代酪氨酸(3-Cl-Tyr)、对-苯甲酰苯丙氨酸(Bpa)、叔丁基甘氨酸(Tle)、环己基丙氨酸(Cha)、环己基甘氨酸(Chg)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、2，4-二氨基丁酸(Dbu)、3，4-二氯代苯丙氨酸(3，4-Cl2-Phe)、3，4-二氟代苯丙氨酸(3，4-F2-Phe)、3，5-二碘代酪氨酸(3，5-I2-Tyr)、邻-氟代苯丙氨酸(2-F-Phe)、间-氟代苯丙氨酸(3-F-Phe)、对-氟代苯丙氨酸(4-F-Phe)、间-氟代酪氨酸(3-F-Tyr)、高丝氨酸(Hse)、高苯丙氨酸(Hfe)、高酪氨酸(Htyr)、5-羟基色氨酸(5-OH-Trp)、羟脯氨酸(Hyp)、对-碘代苯丙氨酸(4-I-Phe)、3-碘代酪氨酸(3-I-Tyr)、二氢吲哚-2-羧酸(Idc)、异哌啶酸(Inp)、间-甲基酪氨酸(3-Me-Tyr)、1-萘基丙氨酸(1-Nal)、2萘基丙氨酸(2-Nal)、对-硝基苯丙氨酸(4-NO2-Phe)、3-硝基酪氨酸(3-NO2-Tyr)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、邻-磷酪氨酸(H2PO3-Tyr)、八水吲哚-2-羧酸(Oic)、青霉胺(Pen)、五氟苯丙氨酸(F5-Phe)、苯基甘氨酸(Phg)、2-哌啶酸(Pip)、炔丙基甘氨酸(Pra)、焦谷氨酸(pGlu)、肌氨酸(Sar)、四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)和噻唑烷-4-羧酸(硫代脯氨酸，Th)。氨基酸的立体化学可在名称或缩写之前用“D”或“d”或“L”或“l”表示。此外，可使用αN-烷基化氨基酸，以及带有含胺侧链的氨基酸(如Lys和Orn)，其中的胺已被酰化或烷基化。
本发明的肽可含有通式P*-Y*-X1*-L*(SEQ ID NO1)，其中P*是脯氨酸或脯氨酸的非天然衍生物，Y*是酪氨酸或其非天然衍生物，X1*是甘氨酸或天冬氨酸或甘氨酸或天冬氨酸的非天然衍生物，L*是亮氨酸或其非天然衍生物。代表性地，至少P*、Y*、X1*或L*之一是各个氨基酸的非天然衍生物。例如，X1*可以是甘氨酸或天冬氨酸，L*可以是亮氨酸，且至少P*或Y*之一可以是非天然衍生物，如羟脯氨酸或在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸。
本发明的肽还可含有通式X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(SEQ ID NO2)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1is W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)或Y(3*)。F(3/4*)可以是在3或4位被选自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸。Y(3*)可以是a在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸。X2可以是E、H、dE、S、H(Bzl)、2-Pal、Dpr或Th；X3可以是G或D；X4可以是H、F、Y或W；X5可以是I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal或F(3/4*)，其中F(3/4*)是在3或4位被选自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸；X6可以是N、Q、I、L或V或不存在。代表性地，至少X1，X2，X5，P*和Y*之一是氨基酸的非天然衍生物。例如，P*可以是脯氨酸，Y*是在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。或者P*可以是脯氨酸的非天然衍生物，如4-羟脯氨酸和Y*可以是酪氨酸。这种肽可在非还原条件下形成二硫键。
可与血纤蛋白结合的肽的另一个例子含有通式C-P*-Y*-X1-L-C(SEQ ID NO3)，其中X1是G或D，P*是脯氨酸或其非天然衍生物4-羟脯氨酸；Y*是酪氨酸或在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。代表性地，至少P*或Y*之一是各个氨基酸的非天然衍生物。例如，所述肽可包括以下序列W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO4)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO5)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO6)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO7)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO8)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO9)、Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO10)、W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO11)、F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO12)、Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO13)、W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO14)、W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q(SEQ IDNO15)或F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO16)。这种肽可在非还原条件下形成二硫键。
根据WO 01/09188或WO 01/08712中所述的标准合成方法，合成了具有表1所示序列的肽(通过质谱确定其结构)、环化并测定其对血纤蛋白DD(E)片段的亲和性。每个肽的Kd≤10μM(“-”表示平截)。
表1Kd(μM)X1X2C P(4-OH) Y* X3L C X4X5X6相比DD(E)≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-Cl) D L C H IL≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-Cl) D L C H I≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H Bpa≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Hfe≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Bpa≤0.1 Y(3-Cl)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Y D-EC Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ
Kd(μM)X1X2C P(4-OH) Y* X3L C X4X5X6相比DD(E)≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H IL≤0.1 F(4-OMe) H(Bzl) C Hyp Y(3-Cl) D L C H Bpa≤0.1 F H C Hyp Y(3-Cl) D L C H I≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 3Pal H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 4Pal H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-F) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Y(3-I) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H IL≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-Cl) D L C H Bpa L≤0.1 F(4-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H Bpa L≤0.1 F H(Bzl) C Hyp Y(3-Cl) D L C H IL≤0.1 1Nal H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 MTyr H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-OMe) H(Bzl) C Hyp Y(3-I) D L C H Bpa≤0.1 F(4-OMe) H(Bzl) C Hyp Y(3-Cl) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C 3Pal I≤0.1 F(4-I) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-Br)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-Me)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-CF3) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-CN)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Y(3-NO2) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Y(2-F) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-CH2NH2) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(4-NH2) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(34-F2) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 DopaMe2H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(2-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(3-Me)H C Hyp Y(3-I) D L C H I
Kd(μM)X1X2C P(4-OH) Y* X3L C X4X5X6相比DD(E)≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(3-CF3)≤0.1 F(3-CF3) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F(3-OMe)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 Hfe H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 nTyrH C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 W E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H I L≤0.1 F H C Hyp Y(3-Cl) D L C H I L≤0.1 F(4-OMe)H(Bzl) C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Nle≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Tle≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(4-CF3)≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Bip≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(4-Et)≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(4-OMe)≤0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(3-OMe)≤0.1 F(F5) H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.1 F H C Hyp Y(3-F) D L C H I L≤0.1 W E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.2 T D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.2 F H C PY(3-Cl) D L C H I L≤0.2 Y(26-Me)H C Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.2 W E C Hyp Y(3-Cl) G L C H I Q≤0.2 D-F D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.2 Y E C Hyp Y(3-Cl) G L C Y I Q≤0.2 W E C Hyp Y(3-Cl) G L C F I Q≤0.2 H D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W I Q≤0.2 F H C Hyp Y(3-I) D L C H I L≤0.2 W E C PYG L C W I Q
Kd(μM)X1X2C P(4-OH) Y* X3L C X4X5X6相比DD(E)≤0.2 F HC Hyp Y(3-I) D L C H nVal≤0.2 F HC Hyp Y(3-I) D L C H Phg≤0.2 F HC Hyp Y(3-I) D L C H F(3-Me)≤0.2 F HC Hyp Y(3-I) D L C 4Pal I≤0.2 S D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ≤0.3 W EC Hyp Y(3-Cl) G L C Y IQ≤0.3 Y EC Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ≤0.3 F D-E C Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ≤0.3 F HC PYD L C H IL≤0.3 F HC Hyp Y(3-I) D L C H IL≤0.3 F HC Hyp YD L C H Bpa≤0.4 F HC Hyp Y(3-Cl) G L C H IL≤0.4 S(Bzl)HC PYD L C H IL≤0.4 H EC Hyp Y(3-Cl) G L C H IQ≤0.4 F(4-OMe) HC Hyp YD L C H IL≤0.4 F HC Hyp Y(3-I) D L C Bpa I≤0.4 AdHC Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.5 F HC Hyp Y(3-Cl) F L C H IL≤0.5 F EC Hyp Y(3-Cl) G L C W IQ≤0.5 F HC Hyp Y(3-Cl) 2-Nal L C H IL≤0.5 F HC Hyp YD L C H IL≤0.5 Hfe HC Hyp YD L C H IL≤0.5 Bip HC Hyp YD L C H IL≤0.5 W EC PYG L C W IQ≤0.5 F(4-OMe) WC Hyp Y(3-I) D L C H I≤0.5 F HC Hyp Y(3-I) D L C 2Pal I≤0.5 F HC Hyp Y(3-I) D L C Taz I≤0.5 F HC Hyp Y(3-I) D L C Dht I≤0.5 GuHC Hyp Y(3-I) D L C H I
肽还可有通式C-D-Y-Y-G-T-C-X10(SEQ ID.NO17)，其中X10是n(癸基)G、n(4-PhBu)G、MeL、Bpa、Bip、Me-Bip、F(4*)、F(3-Me)、F(3，4-二氟)、Amh、Hfe、Y(3，5-二-碘)、Pff、1Nal、d1Nal或MeL，其中F(4*)是在4位被选自Et、CF3、I或iPr的部分取代的苯丙氨酸。在一些实施方案中，肽可包括额外的残基，X1、P*和/或X11，以得到通式C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(SEQ ID.NO18)或X1-P*-C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(SEQ ID.NO26)，其中X1是任何天然或非天然氨基酸，P*是脯氨酸或其非天然衍生物，X11是D，dD，βD，Inp，Nip，Me-D，Cop或Cmp。例如，肽可含有序列L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-dD(SEQ ID NO19)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-D(SEQID NO20)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D(SEQ ID NO21)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD(SEQ ID NO22)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Inp(SEQ ID NO23)、L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp(SEQ ID NO24)或L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D(SEQ ID NO25)。
用标准合成方法合成了具有SEQ ID NO26所示结构的肽(通过质谱确定结构)，合成方法如WO 01/09188或WO 01/08712中提到的方法，并测定了它们对血纤蛋白DD(E)片段的亲和性。各个肽的Kd≤10μM(表2)。
表2X01X10X11L n(癸基)GdDL n(癸基)GDL MeL InpL Bip DL Bip dDL Me-Bip DL MeL CmpL Bip DL L DChaBip D可用已知方法测定肽与如HSA或血纤蛋白等靶点的亲和性。例如，可用血纤蛋白DD(E)片段评定肽对血纤蛋白的亲和性，血纤蛋白含有55kD(片段E)和190kD(片段DD)的亚基。DD(E)片段可被生物素化并通过抗生物素蛋白固定到固体基质(如多孔平板)。所述肽可与固定的DD(E)片段一起培养在合适的缓冲液中，并用已知的方法进行检测这种结合。例如参见WO 01/09188。
N-和C-末端连接基-亚单元和连接基如果存在的话，连接基-亚单元和连接基被用于共价结合帽化部分，帽化部分如螯合物、溶血栓剂以及肽两个端点的其它基团。连接基-亚单元部分可以(i)将C-末端羧酸盐官能度转化成胺官能团或将N-末端胺官能度转化成羧酸盐官能团；或(ii)在肽末端和连接基(如果存在的话)或或帽化基团之间提供间隔部分或基团。在一个实施方案中，肽可以与连接基-亚单元反应形成修饰的具有C-末端胺官能团和N-末端胺官能团的肽。在另一个实施方案中，肽可以与连接基-亚单元反应形成修饰的具有N-末端羧酸盐官能团和C-末端羧酸盐官能团的肽。在另一个实施方案中，肽可以由与树脂结合的C-末端连接基-亚单元合成，将肽从树脂切下后，就制得了带有C-末端胺官能团的肽。在另一个实施方案中，连接基-亚单元可被用作间隔基团而不改变末端官能团。连接基-亚单元可以是多个官能团以与连接基部分或帽化部分结合。可采用多种反应类型，包括酰化、还原性胺化、亲核置换反应、尿素形成、硫脲形成和化学选择结合，以将所述连接基-亚单元与肽、连接基和/或帽化部分化学结合。采用连接基-亚单元的一个优点是在肽上产生了类似的官能团，因此利于以后的合成。
所述连接基部分可用来将一个或多个帽化部分结合到肽末端。所述连接基可分支或不分支，并可包含多个共前体螯合物和螯合物结合的官能团。所述连接基的化学结构可能会影像造影介质的物理和药理特性，如亲和力、稳定性、血液半衰期、驰豫率和血浆蛋白质结合。所述连接基可被烷基、芳基、链烯基或炔基取代。如果在各个末端存在连接基，则它通常是相对较小且刚性的MRI造影介质。例如，连接基的分子量可小于约350(如小于约200)。
C-末端连接基-亚单元部分和C-和N-末端连接基的一个例子有如下结构 可用连接基-亚单元(如二胺合成子)将肽的C-末端羧酸盐转变成胺官能团以形成在肽的各个末端具有胺官能团的肽，该肽上可结合其余的连接基部分。这种经过修饰而具有C-末端胺官能团的肽的例子是
其中，n＝1-4。
许多二胺C-末端连接基-亚单元可方便地来自固相树脂 以下树脂(R)是商业上从Nova Biochem获得的
一些情况下，以下连接基-亚单元可被用作N-末端胺官能团的间隔基团 和 其中，“碱基”是嘌呤或嘧啶碱基(“Ad”＝腺苷，“Gu”＝鸟苷，“Th”＝胸腺嘧啶，“Cy”＝胞嘧啶)，“LG”是离去基团，如OH、活性酯、卤化物或酸酐。
此外，可使用αN-烷基化氨基酸以及带有含有氨基的侧链的氨基酸(如Lys和Orn)，其中的肽分子已被酰化或烷基化，如下所示 其中，n分别为0-3的整数；R是脂肪基或芳基；LG是选自OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团。
更多的连接基-亚单元包括
和 其中，n分别是1或2；R是脂肪基或芳基；LG是选自OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团。
当采用酰胺键构成策略时，其中一个肽分子有两个末端氨基，有用的连接基部分的例子包括 其中，每个m独立为1-4的整数，n独立为0-4的整数，LG是离去基团，R’或R”独立为氢或化学保护基。
连接基部分还可以有分支点以结合两个以上的螯合物。例如，当采用酰胺键构成策略时，包含带有离去基团LG的羰基(例如，羧酸或活性酯)和三个或多个被保护的胺的连接基可与肽的胺反应以生成带有三个或多个末端胺的分子。以下基于羰基的连接基试剂可以含有三个或多个胺官能团
其中，LG是离去基团(如-OH，活性酯如五氟苯酚(Pfp)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰钠盐(NHSS)、2-硫氧代噻唑烷-1-基和羟基苯并三唑(HBT)和R1和R2优选独立为氢或化学保护基(如Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、苄基或烯丙基)。
在其它实施方案中，肽N-末端的胺官能团可通过与环状酸酐(连接基-亚单元部分)反应被转换成N-末端羧酸盐官能团，从而用N-末端羧酸盐官能团制得了修饰的肽 用来将N-末端胺转化成羧酸盐官能团的其它连接基-亚单元的例子包括 其中R是任何脂肪基或芳基。
然后，上述例子中的两个末端羧酸盐可同时与下面所示的连接基部分的氨基反应形成前体MR显影剂。在这里实施例中，所述前体MR显影剂是在两个末端通过酰胺键都衍生有连接基的肽分子
对于制造前体MR显影剂有用的其它以两个羧酸盐结束的连接基部分的特例是 其中每个m独立是1-4(包括1和4)，n独立是0-4(包括1和4)(如n＝1或2)，R是氢或合适的化学保护基，如甲基、乙基、苄基或叔丁基。在这些例子中，在结合所述连接基-亚单元后，所述保护基可被除去，并可用标准方法，例如酰胺键形成，连接螯合部分或前体螯合部分。
当采用酰胺键形成策略时，其中所述肽分子以两个羧酸盐结束，以下连接基适合引入三个或多个胺官能团 其中R1和R2独立为氢或化学保护基如OS、Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、苄基或烯丙基。
包括酰胺键形成的连接基策略是有效的，因为它们通常和肽上的保护基兼容。如上所述，肽、连接基和连接基-亚单元可通过形成其它类型的键(例如亲核取代、还原氨基化和硫脲形成)相互共价连接。
连接基还会影像造影介质的特性，如亲和性、药代动力学特性、体内稳定性和驰豫率。
或者，包括连接基部分和螯合或螯合前体部分的共价缀合物可与带有合适的末端官能度的肽直接反应。能够与末端羧酸盐基团反应的这种共价缀合物的一个例子是 其中，n＝1-4，R1，R2，R3，R4和R5独立是乙酸酯基团、乙酰胺基团或乙酰氧基团。
这种共价缀合物的另一个例子具有如下结构 其中R1，R2，R3，R4和R5独立是乙酸酯基团、乙酰胺基团或乙酰氧基团。
可有效将两个末端都带有羧酸盐官能团的修饰的肽转化成前体显影剂的共价缀合物的一个例子具有如下结构
能够与修饰的肽上的胺官能团反应的共价缀合物的例子有 其中，LG是离去基团，n＝1-4，R1，R2，R3，R4和R5独立是乙酸酯基团、乙酰胺基团或乙酰氧基团，和 其中，LG是离去基团，其中R1，R2，R3，R4和R5独立是乙酸酯基团、乙酰胺基团或乙酰氧基团。
特别有用的合成多聚体造影介质的共价缀合物具有如下结构，下文称为“合成子#1” 另一种有效的合成多聚体的共价缀合物具有如下结构，下文称为“合成子#2” 在以下含有上述肽的本发明的MRI造影介质的例子中，阐述了N-末端连接基对MRI造影介质的驰豫率的影像
在这里例子中，“螯合物”被称为bb-DTPA-Gd(III)。
上述“连接基-亚单元”有以下结果(每个Gd(III)离子的驰豫率是在20MHz和35℃下测定的，单位是mM-1s-1)
如上所述，结构15和16与结构32类似，除了N-末端连接基-亚单元不同。实验结果显示，连接基可影响驰豫率以及本发明的造影介质的其它特征。
螯合部分和试剂螯合部分是与金属离子络合的螯合配体。这些螯合部分包括能够形成连接基、连接基-亚单元和/或修饰的肽的结合点的合成部分。一个或多个螯合部分可共价缀合修饰的肽各个末端的官能团。在一个实施方案中，所述螯合物结合连接基-亚单元。在另一个实施方案中，所述螯合物结合连接基部分。在其它实施方案中，所述螯合物可与连接基部分结合以在共价缀合物与修饰的肽结合之前形成共价缀合物。
前体螯合部分是尚未与金属离子络合的螯合配体。螯合配体可以有保护基或者可以是螯合配体的前体。前体螯合部分包括形成连接基、连接基-亚单元和/或修饰的肽的结合点的合成部分。前体螯合部分可通过与金属离子络合转变成螯合部分。一个或多个前体螯合物部分可共价结合修饰的肽各个末端的官能团。在一个实施方案中，所述前体螯合物结合连接基-亚单元。在另一个实施方案中，所述前体螯合物结合连接基部分。在其它实施方案中，所述前体螯合物可与连接基部分结合以在共价缀合物与修饰的肽结合之前形成共价缀合物。
本发明的前体螯合物部分和螯合物部分可具有任何以下结构 或
其中X是能够与金属阳离子配位的杂原子电子供体基团，如O-、OH、NH2、OPO32-、NHR或OR，其中R是任何脂肪基；R1是不带电荷的化学部分，选自氢、任何脂肪基、烷基或环烷基或其不带电荷的取代形式(如醇类)；Y是合成部分(如能够形成结合点或就是结合点，修饰的肽、连接基和/或连接基-亚单元的官能团可直接结合或通过羰基、亚甲基、亚甲基-氧基、硫代羰基结合)。可使用带有配位金属离子的部分(螯合部分)或不带有配位金属离子的部分(前体螯合部分)。
多种螯合配体可用于本发明的造影介质。这种螯合配体包括但不限于DTPA、DOTA、NOTA和DO3A的衍生物。对于MRI，金属螯合物如二亚乙基三胺五乙酸钆(DTPA·Gd)，四胺1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N_-四乙酸钆(DOTA·Gd)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸钆(DO3A·Gd)特别有效。特别有用的螯合物包括bb(CO)DTPA·Gd。在应用MRI时可用其它金属取代Gd(III)。
已经合成的用来制造多聚体螯合物的功能性螯合物的例子包括pNCS-Bz-DTPA[Martin，V.等，Bioconjugate Chem.6，616-23，1995]和Gd(4-NCS-苯基)-氨基-羰基甲基-DO3A[Ramachandran，R.等，Invest.Rad.1998，33(11)，779-797]。为在与靶结合时驰豫率最优，经常需要使螯合物的运动最小，因此需要最小数目的将靶与螯合配体结合的共价键。以下是试剂的例子，包括用来与胺官能团或连接基-亚单元或连接基结合的具有主链羰基的螯合配体，其中“LG”是离去基团(如活性酯)，R代表容易被除去以形成O-的基团(-OtBu，如羧酸盐)，从而与邻近的羰基形成羧酸盐与螯合配体主链结合的羰基 人们发现与螯合配体最接近的羰基的化学基序构成了一类高驰豫率的MRI造影介质。
本发明还涉及对于合成以下结构的MRI造影介质有用的中间体 和 其中，R1，R2，R3，R4和R5可以是任何被保护的或不被保护的乙酰基配体，它适合形成具有合适形成常数的顺磁性金属的螯合物，包括 和 其中P是任何保护基，包括苄基和叔丁基。LG是“离去基团”，代表-OH和其酯的形式，包括NHS酯、五氟苯酚和其它活性酯。
在特别有用的实施方案中，LG是-OH，R1，R2，R3，R4和R5是CH2CO2OtBu，下文称为“合成子#3”，其结构如下 或者，可用以下试剂来合成本发明的造影介质 (参阅Syn.Comm.30，3755(2000))本发明还提供了制造化合物的方法。尤其是一种可简化合成子#3的制备的新型氧化反应，合成子#3是螯合配体的优选实施方案。合成子#3的合成可通过两种不同的合成途径实现，这两种途径都从羟基甲基-二亚乙基三胺开始。一种途径包括两个合成步骤(烷基化然后再氧化)，另一种途径包括六个步骤(保护、氧化、酯化、去保护、烷基化和水解)。这两种途径都能制得高化学纯度和光学纯度的合成子#3(参阅以下实施例)。
美国专利No.5,637,759揭示了通过用硫代苯氧基钠选择性水解从2，3-二氨基丙酸和氮杂-赖氨酸合成合成子#1。本发明描述的方法可避免使用这种有毒的试剂。
造影介质的合成肽基造影介质的合成包括以下步骤。首先可合成有或没有C-末端连接基-亚单元的寻靶肽，通常采用固相肽合成法。对于这里所描述的环肽，受保护的线性肽可在溶液中或树脂上环化。未受保护的肽也可在溶液中或树脂上环化。C-末端连接基-亚单元可方便地来自固相合成树脂，N-末端连接基或N-末端连接基-亚单元可在固相合成时与肽结合。通常，在环化后，所述连接基-亚单元-螯合物前体部分就与所述肽结合。保护基被除去以得到配体前体，然后制备螯合物。本发明的放射性核素化合物是用市售的放射性核素(例如，Nycomed Amersham Boston的99mTc，产品编号#RX-290195，NEN Life Science产物的111In，产品编号#NEZ304或NEN Life Science产物的153Gd，产品编号#NEZ142)，通过在含水介质中反应，通常在pH4-6反应1小时，从配体前体制备的。如果是光学造影介质，可用有机染料代替螯合物前体。
造影介质的结构 [合成与32类似]









造影介质的特性与母体的肽(即没有结合任何螯合物的肽)、有一个或多个螯合物与N-末端结合的肽或有一个或多个螯合物与C-末端结合的肽相比，本发明的化合物对内源性酶的降解作用更加稳定。为评估体内稳定性，将实验化合物与大鼠肝脏匀浆一起培养。一段时间后，将反应物淬火并离心，通过液相色谱-质谱法分析上清液以定量剩余的化合物的量。
本发明的化合物也可结合人血清白蛋白或血纤蛋白等靶。例如，至少10％(如至少50％、80％、90％、92％、94％或96％)的造影介质可以生理相关浓度的药物和寻靶结合所需的靶。造影介质与靶如HSA或血纤蛋白结合的程度可用各种平衡结合方法估算。例如，与HSA的结合可通过超滤测定。为测量与血纤蛋白的结合，可在微量滴定板的孔中形成血纤蛋白凝块并与靶基团接触。在培养足以建立平衡的时间后，吸取上清液(不溶的血纤蛋白结合成孔底部凝胶状的凝块)。然后测定上清液中未结合的靶基团的浓度。在这两种方法中，结合的造影介质的浓度是作为开始的总靶基团浓度与结合测定后未结合的靶基团浓度之差测定的。结合比例是结合的靶基团的浓度与总靶基团浓度之比。
作为寻靶结合(如与血纤蛋白结合)的结果，本发明的化合物可具有较高的驰豫率，这就可以得到较好的图象分辨率。结合驰豫率的升高通常有1.5-倍或更多(如驰豫率至少升高2、3、4、5、6、7、8、9或10倍)。通常使用驰豫率升高7-8倍、9-10倍或者甚至10倍以上的寻靶造影介质。代表性地，驰豫率是用NMR分光计测定的。20MHz 37℃下，MRI造影介质的驰豫率优选为至少10mM-1s-1/顺磁性金属离子(如至少15、20、25、30、35、40或60mM-1s-1/顺磁性金属离子。20MHz 37℃下，造影介质的驰豫率大于60mM-1s-1特别有效。
如这里所述，靶向造影介质可显示升高的凝块摄取。可通过比较血液凝块和血液对试剂的摄取来确定血纤蛋白-靶向试剂摄取的特异性。参见实施例11可了解更多细节。血纤蛋白-靶向造影介质的特异性也可用MRI和观察凝块信号的增强来证实。
本发明的肽和造影介质的应用本发明的肽可用来改善血栓栓塞疾病治疗的疗效。目前使用的溶血栓剂治疗的缺点包括出血风险大、无法恢复血流、停止治疗后血栓重新形成、治疗开始和凝块溶解之间有滞后。将本发明的血纤蛋白寻靶肽与溶血栓剂(如蛋白质溶血栓剂，例如人或细菌来源的纤溶酶原激活物)缀合可得到改善的治疗指数。这种缀合可局部活化纤溶酶原或增加tPA的内源水平。例如，血纤蛋白寻靶肽可与人纤溶酶原激活物，其中包括重组组织类型的纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶原和尿激酶(都有单链和双链形式)，细菌衍生的纤溶酶原激活物，包括链激酶、葡萄球菌激酶，以及动物衍生的纤溶酶原激活物，包括吸血蝙蝠纤溶酶原激活物缀合。此外，血纤蛋白寻靶肽可与纤维溶解酶如铜斑蛇纤溶酶(copperhead snake fibrolase)缀合，这种酶具有直接的纤溶活性。这种酶和蛋白质可在商业领域获得、从天然来源或组织提取或用重组方法制备。
根据MRI造影介质的结构，可用已知方法用上述同种类型的连接基连接或融合本发明的组合物。与蛋白质的缀合可通过标准化学技术实现，包括形成酰胺键、酯键、二硫键和硫酯键。例如，血纤蛋白结合肽可通过在血纤蛋白结合肽或连接基和蛋白质表面的赖氨酸残基之间形成酰胺键而直接或通过连接基与蛋白质结合。这些表面赖氨酸残基通常远离酶的催化位点。因此，连接部分不会影像酶的催化活性。在一个步骤中可达到多重连接。血纤蛋白寻靶肽与溶血栓剂或纤溶剂的比例可通过调节连接化学的化学计量加以控制。多重连接对于适当调节强血纤蛋白结合配体特别有效，因为可通过所谓的“亲和力”获得较高的结合亲和性。特别地，可用偶联剂或活性酯在赖氨酸和血纤蛋白结合部分或连接基之间形成酰胺键。以下流程显示了尿激酶通过连接基部分和多个血纤蛋白结合肽化学连接形成的杂交分子的一个例子。表面赖氨酸残基的数目和血纤蛋白结合分子的数目是说明性的。或者，可用重组DNA技术将血纤蛋白寻靶肽引入杂交分子。
在一些实施方案中，本发明的肽可与带有连接基的溶血栓剂结合，所述连接基包含酶切割位点，例如通常在凝固级联中被酶切割的酶切割位点，如Xa因子、凝血酶或纤溶酶切割位点等。在凝块位置上将其从结合有本发明组合物的凝块上切下之前，所述溶血栓剂不会被活化，因此在远离凝块的位置上发生的不希望的出血事件的风险可被最小化。此外，溶血栓剂部分可与靶向肽的多聚体造影介质结合，这样就可鉴定、成像并溶解凝块。
用这里所述方法制造的造影介质可以同样的方式用作常规的MRI造影介质，且它可用来有效诊断深层血管血栓形成、肺栓子、冠状动脉血栓形成、颈动脉和和颅骨内血栓形成、心房和心室血栓症、主动脉弓血栓症和高危斑块。当将血栓成像时，某些MR技术和脉冲序列是优选的以提高血栓和背景血液以及组织的对比度。这些技术包括但不限于用来制造黑色背景的黑色血液血管造影术序列，如快速自旋回声序列(fast spin echo sequence)和和流量残缺梯度回声序列(flow-spoiled gradientecho sequence)。这些方法还包括独立流量(flow independent)技术，该技术可增强对比度的差异，这是由于增强对比的血栓和血液以及组织之间的T1差异，比如反向回收(inversion-recovery)制备的序列或饱和-回收(saturation-recovery)制备的序列，它可提高血栓和背景组织之间的对比度。T2技术的制备方法被证明也是有效的。最后，磁化强度转移技术被证明也可用本发明试剂提高对比度。
本发明的组合物，包括肽、与溶血栓剂缀合的肽和肽靶向的多聚体造影介质，可用常规方法制成药物组合物。当用在这里时，本发明的化合物可包括其药学上可接受的衍生物。“药学上可接受的”是指可用于动物而没有不可接受的不良影响的化合物或组合物。“药学上可接受的衍生物”是指任何药学上可接受的本发明化合物的盐、酯、酯的盐或其它衍生物，在用于接受者后，它能够提供(直接或间接)本发明的化合物或其活性代谢物或残基。其它衍生物是指那些当将这种化合物施用给哺乳动物时可提高本发明化合物的生物利用度的物质(如使口服给药的化合物更容易被吸收进血液)，或是可提高母体化合物到生物区室(如大脑或淋巴系统)的运输从而增加对母体化合物的接触量的物质。药学上可接受的本发明化合物的盐包括衍生自此领域已知的药学上可接受的无机和有机酸和碱的抗衡离子。
本发明的药物组合物可用任何途径施用，包括口服和非消化道给药。非消化道给药包括但不限于皮下、静脉内、动脉内、间质内、鞘内和腔内给药。当静脉内给药时，药物组合物可以推注形式给予，每次两个或多个剂量，或恒量或非线性流注。因此，本发明的组合物可被制成适合任何途径施用的制剂。
代表性地，静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，所述这还包括增溶剂、稳定剂和局部麻醉剂如利多卡因以减轻注射位点的疼痛。通常，这些成分可分别提供，如装在试剂盒中，或混合在一起成为单位剂型，如冻干粉末或无水浓缩物。所述组合物可保存在密封容器中，如以活性单位标明活性剂的量的安瓿或小袋，它可用含有无菌药用级“注射用水”、盐水或其它合适的静脉内液体的灌输瓶来分配。当通过注射施用组合物时，可提供装有注射用无菌水或盐水的安瓿，从而可在给药前将成分混合。本发明的药物组合物含有本发明的化合物和其药学上可接受的盐以及任何药学上可接受的成分、赋形剂、载体、佐剂或媒介物。
造影介质优选以可注射组合物的形式给予患者。给予造影介质的方法优选是肠道外给药，即静脉内、动脉内、鞘内、间质内或腔内给药。可用与其它诊断剂或治疗剂类似的方式将本发明的药物组合物用于哺乳动物，包括人。用药剂量以及用药模式取决于各种因素，包括年龄、体重、性别、患者的状况和遗传因素，并最终由医生根据不同剂量的实验加以决定，然后如这里述进行成像。通常，诊断灵敏度或治疗有效性所需的剂量约为0.001-50,000μg/kg，优选在0.01-25.0μg/kg体重之间。最佳剂量将根据这里的描述凭经验确定。
至于溶血栓剂的治疗状况，施用的物质的量将取决于血栓症状的严重性和凝块的位置和大小。将采用的精确剂量和用药模式可根据情况有主治医生确定。通常，合并的组合物/溶血栓剂结合物的剂量将按照单独溶血栓剂的常规剂量，尽管加入这里所述的组合物可提高血纤蛋白/凝块结合物的亲和性，从而可降低标准溶血栓剂的剂量。预计可用于这种治疗的特定的溶血栓剂(用实施例的剂量和给药方法)如下链激酶 100-300万国际单位，30分钟-3小时阿尼普酶 30单位；2-5分钟 注射tPA(野生型) 50-150mg；灌输，最多6小时双链尿激酶(40-100mg)；灌输，最多6小时单链尿激酶(scuPA) 300-1200万国际单位(30-100mg；灌输，最多5小时杂交纤溶酶原激活物和衍生物 20-100mg；注射或灌输纤溶酶原激活物的突变蛋白10-100mg；注射或灌输以下实施例将进一步描述本发明，这些实施例不是要限制本发明的范围，该范围如权利要求书所述。
实施例以下实施例将进一步阐述本发明的几种高驰豫率造影介质的合成、鉴定性和使用。以下实施例中所述的特定参数是为了阐述本发明的实践，它们不以任何方式限制本发明的范围。那些精通此领域的技术人员将了解或能够知道使用这里所述的多种常规实验方法、与特定实施方案等价的实施方案和方法。这种实施方案被认为包括在权利要求书的范围之内。
实施例1-肽基MR显影剂的合成C-末端结合了连接基-亚单元部分的肽(P-[连接基-亚单元部分])。用标准Fmoc法和二氨基三苯甲基树脂制备了二氨基未被保护的肽。在树脂或溶液中用三氟乙酸铊将该肽环化。从树脂上切下后，通过RP-HPLC(C-18柱，H2O/CH3CN/TFA)纯化未被保护的肽。
连接基部分在Boc-Dpr(Boc)-OH.DCHA(1当量)和五氟苯酚(1.2当量)的二氯甲烷溶液中加入PS-碳二亚胺(1.2-1.5当量)。将混合物在室温下振荡3-5h。当LC-质量结果证实反应完全后，过滤除去树脂并减压蒸发溶剂以得到粗制的白色泡沫状的连接基部分(Boc-Dpr(Boc)-OPft(N-α-Boc-N-β-Boc-L-二氨基丙酸五氟苯酯，356-128)。
前体MR显影剂在P-[连接基-亚单元部分](1当量)和所述连接基部分{Boc-Dpr(Boc)-Opft}(2.2当量)的DMF溶液中加入DIPEA(4-6当量)。将混合物在室温下搅拌。当LC-质量结果证实反应完全后，减压除去溶剂。然后在室温下将粗产物在TFA、水和苯甲醚的混合物(90％/5％/5％)中搅拌3h。加入二乙醚并形成白色沉淀，通过RP-HPLC(C-18柱，H2O/CH3CN/TFA)纯化该沉淀以得到白色固体状的前体MR显影剂(四氨基-肽(？)。
前体螯合部分DOTAGA-Opft。在DOTAGA-OH(1当量)和五氟苯酚(1.2当量)的二氯甲烷溶液中加入PS-碳二亚胺(1.2-1.5当量)。将混合物在室温下振荡3-5h。当LC-质量结果证实反应完全后，过滤除去树脂并减压蒸发溶剂以得到白色泡沫状的粗制前体螯合部分。
MR显影剂.在前体MR显影剂(1当量)和前体螯合部分(4.0当量)的DMF溶液中加入DIPEA(4.0当量)。将混合物在室温下搅拌。当LC-质量结果证实反应完全后，减压除去溶剂。
然后在室温下将粗产物在TFA、苯酚、甲磺酸、苯甲醚和二氯甲烷的混合物(90％/2.5％/2.5％/2.5％/2.5％)中搅拌15分钟。加入二乙醚并有白色沉淀形成，收集作为粗产物。
将粗产物与溶于去离子水的GdCl3·H2O反应以形成粗制的MR显影剂，用RP-HPLC(C-18柱，乙醇/50mmol AcONH4)将其纯化。将适当的级分合并，并减压除去乙醇，然后用乙酸钠处理合并的级分以进行盐交换。冻干后，在Waters Sep-Pak_C-18柱上，以水和乙醇∶水(50∶50)洗脱，通过反相色谱除去过量的盐。合并合适的级分，减压除去乙醇，然后将溶液冻干以得到白色固体状的所需的肽MR显影剂。
用类似的方法来合成其它MR显影剂。
实施例2-合成螯合物前体部分(合成子#3)的方法
合成合成子#3的方法A 将具有指定立体化学结构的三盐酸羟基甲基-二亚乙基三胺(25.15g)(光学纯起始物料Syn.Comm.29(14)，2377-2391(1999)，外消旋起始物料Coll.Czech.Chem.Comm.34，630-634(1969))溶于去离子水/1，4-二噁烷的混合物，用氢氧化钠水溶液将溶液的pH调至8-9。将二-叔丁基二碳酸酯(3.5当量)溶于二噁烷并在10-20℃之间加入。将反应混合物在室温下搅拌12-20小时。然后用水稀释反应混合物并用乙酸乙酯提取。然后用水、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液提取有机提取物。用硫酸钠干燥有机提取物，过滤并在真空下浓缩以得到油状物，通过硅胶色谱用乙酸乙酯∶己烷的混合物纯化该物质。纯化产物的总产量为30.11g。1HNMR(300MHz)5.18(d，J＝7.9Hz，1H)，4.76(bs，1H)，3.8-3.0(m，10H)，1.47-1.42(2s，27H)。MS(m/Z)456.4[M+Na]+。
步骤b-羟基的氧化[基于Zhao等在J.Org.Chem.64，2564-2566(1999)中描述的氧化过程]
将BOC-保护的三胺(29.94g)溶于乙腈。加入磷酸盐缓冲液(300mL)，其中含有21.6g NaH2PO4，21.6g Na2HPO4和足量的去离子水至500mL体积，然后加入2，2，6，6-四甲基哌啶基-1-氧(TEMPO)(0.07当量)。剧烈振荡此混合物并加热至35℃。将亚氯酸钠(2.0当量)溶于去离子水(100mg/ml)。加入亚氯酸钠溶液和漂白水(0.02当量，约0.25％的次氯酸钠水溶液)同时保持恒温。加入氧化剂后，将反应物搅拌24小时。在加入TEMPO(0.07当量)并将反应混合物搅拌24小时。将反应物冷却至室温。加入水并用2.0N的NaOH水溶液将pH调至8。加入冷的亚硫酸钠水溶液(300mL)同时保持恒定的pH。用小量甲基叔丁基醚提取该溶液并静置。用2.0N的HCl水溶液将含水层酸化至pH3-4，并用小体积的甲基叔丁基醚提取两次。将有机提取物与上述经过静置的提取物合并并在真空下浓缩。所得产物无需纯化即可用于下面的步骤3。1HNMR(300MHz)5.8(bs，1H)，5.3(m，1H)，4.4(M，1H)，3.6-3.2(m，6H)，1.47-1.43(2s，27H)。MS(m/Z)470.2[M+Na]+。
步骤c-羧酸的苄基-保护 将羧酸起始物料(178g)溶于无水DMF。加入碳酸铯(2.0当量)并将溶液搅拌30分钟。在室温下逐滴加入苄基溴(1.1当量)。将反应混合物在惰性气体下搅拌18小时。用水稀释反应混合物并用乙酸乙酯提取两次。合并有机层并依次用饱和碳酸氢钠和氯化钠溶液洗涤。将有机层浓缩成油状(270g)，通过硅胶色谱用乙酸乙酯∶己烷纯化。1H NMR(300MHz)7.3(s，5H)，5.6和5.15(2bs，1H)，5.1(s，2H)，4.5(bs，1H)，4.0-4.1(m，1H)，3.5-3.2(m，6H)，1.45和1.4(2s，27H)。MS(m/Z)560.3[M+Na]+。
步骤d和e-胺的去保护和烷基化
在1∶1乙腈∶4N HCl水溶液中搅拌BOC-保护的三胺(250g)约2.0小时。在真空下除去乙腈并将剩下的溶液冻干以得到残余物，将此残余物立即溶于DMF和二异丙基胺(足量以使pH升至8)。加入叔丁基溴乙酸酯(12.0当量)。加入完成后将反应混合物加热至50℃并搅拌18小时。反应结束后加入水使反应混合物的体积增加一倍，然后用乙酸乙酯提取两次。将有机提取物合并并依次用水、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗涤。在真空下将有机溶液浓缩成油状并通过硅胶色谱用乙酸乙酯∶己烷纯化。纯化产物的总产量为190g。MS(m/Z)809.5[M+Na]+。
步骤f-羧酸盐的去保护 在不锈钢反应器中加入苄酯(157g)、10％钯/碳(19.8g)和乙酸乙酯，在45psi下氢化12小时。通过Celite_过滤并在真空下浓缩以得到油状物。将该油状物溶于乙酸乙酯/己烷并通过硅胶色谱纯化以得到DTP羧酸戊-叔丁酯(产率82％)。MS(m/Z)719.5[MH]+。当将此试剂用于用其它手性元素合成造影介质时，未观察到非对映异构体，因此可知这种物质被光学纯化至用普通质子NMR进行检测的最小限度。
合成合成子#3的方法B 将醇(参见Syn.Comm.29(14)，2377-2391(1999)，用于从羟基甲基-二亚乙基三胺开始合成)起始物料(105.0g)、乙腈(1.0L)、磷酸盐缓冲液(1.0L，将100mg NaH2PO4和10mg Na2HPO4溶于1.0mL水然后用H3PO4将pH调至4.5)和TEMPO(7.0g)合并并加热至45-50℃。在此溶液中加入亚氯酸钠(29.8g溶于298mL水)和次氯酸钠(744μL)溶液并将温度保持在45-50℃。剧烈搅拌反应混合物4-10小时。将反应混合物冷却至室温，分离成两层。分离有机层，将其与饱和氯化钠水溶液合并并搅拌15分钟。分离有机层，在真空下浓缩以得到油状物(171g)，通过柱层析，用己烷∶异丙醇(加有0.1％三乙胺乙胺)纯化该油状物，总共得到81g油状产物。MS(m/Z)719.5[MH]+。用此方法制得的物质的光学纯度和上面相同。
实施例3-用于固相合成具有C-末端胺官能团的修饰肽的树脂所述肽通过固相合成方法来制备。在所述固相合成方法中，根据要合成的肽的类型(如C-末端处需要的官能团，所述保护或未保护的的肽)以及所用的合成方法(例如Fmoc或BOC化学、手动或自动合成，连续流反应器或间歇反应器)选择所述连接基和树脂。例如，在合成C-末端有羧基的肽时，将保护氨基酸连接到不同的树脂如HMPB树脂、2-氯代三苯甲基氯树脂和SUSRIN树脂。另一方面，在合成C-末端具有氨基的肽时，将二胺连接到三苯甲基树脂上。可以使用所述聚苯乙烯(PS)树脂进行间歇合成，而聚乙二醇(PEG)改性树脂适于连续流合成及间歇合成。许多三苯甲基PS树脂，包括1，3-二-(氨基甲基)-苯三苯甲基PS树脂可以从市场购得。若所需三苯甲基PS树脂不能购得，则可以使用和用于PEG树脂类似的步骤将二胺连接到三苯甲基PS树脂上。
在实施例中说明了1，3-二-(氨基甲基)-苯三苯甲基树脂的合成。其它二胺可以以类似方式连接到三苯甲基树脂上。
制备1，3-二-(氨基甲基)-苯三苯甲基PEG树脂。
首先，三苯甲基醇树脂(25g，NovaSyn TGT树脂，NovaBiochem)置于漏斗中，并用DMF、CH2Cl2和甲苯洗涤。在除去所有溶剂之后，将所述材料转移到装有回流冷凝器的烧瓶中。加入甲苯(250mL)和乙酰氯(25mL)，并将所述浆液加热至70℃，并搅拌1.0小时。再加入一部分乙酰氯(25ml)，并在70℃下将所述浆液搅拌2.0小时。过滤所述浆液，随后用甲苯和CH2Cl2洗涤所述树脂。
其次，将刚制备的三苯甲基氯树脂和THF(250mL)置于烧瓶中。往所述浆液中加入1，3-二-(氨基甲基)-苯(10当量，以0.23mmol/g的树脂取代度计)，并在室温下搅拌所述混合物18.0小时。过滤所述浆液，依次用水、DMF、CH2Cl2、甲醇和CH2Cl2洗涤树脂。在真空条件(室温，1-5mmHg)下将所述树脂干燥至恒重(25.4g)。使用定量茚三酮步骤进行所述取代化学计量法。
实施例4-合成共价缀合物(合成子#1，#2，#4和#5)合成合成子#1的方法 2，3-二-叔-丁氧基羰基氨基丙酸苄酯往2，3-二-叔-丁氧基羰基氨基丙酸(3.04g)的乙腈(25ml)溶液中加入碳酸铯溶液(6.5g)和水。在室温下搅拌所述混合物40分钟。在真空条件下除去所述溶剂。往所述固体残留物中加入DMF(50ml)。在室温下，在15分钟内加入苄基溴(1.43ml)和DMF(5.0ml)的溶液。将所述混合物搅拌18小时，然后用乙酸乙酯(100ml)和水(50ml)稀释所述混合物，并搅拌15分钟。分离所述各层，并经过硫酸钠干燥所述有机层。过滤所述混合物，并在真空条件下浓缩滤液，制得油状物(3.6g)。通过用乙酸乙酯/己烷进行柱色谱分离纯化所述油状物，制得油状物(1.8g)。MS(m/Z)[M+Na]+＝417.1HNMR(300MHz)1.4(s，9H)，2.4(m，2H)，4.4(m，1H)，4.8(m，1H)，6.5(m，1H)，7.3(m，5H)。
2，3-二氨基-丙酸三盐酸盐在室温下搅拌2，3-二-叔-丁氧基羰基氨基丙酸苄酯(1.8g)、4N盐酸水溶液(40ml)和乙腈(50ml)的溶液18小时。在真空条件下除去所述溶剂，并用乙酸乙酯(100ml)和水(50ml)稀释所述混合物，搅拌15分钟。分离各层，并将所述水层蒸干(1.23g泡沫/浆液)。1HNMR(300MHz)3.2-3.5(m，2H)，4.2-4.35(m，1H)，5.13-5.25(q，2H，J＝11.8，3.1Hz)。
2，3-二-羧基-DTPA丙酸苄酯将2，3-二氨基-丙酸三盐酸盐(6.65g)、bb(CO)DTPE(40.0g，“合成子3”)、HOBt(8.5g)、DIC(9.0ml)、二异丙基乙基胺(15.0ml)、CH2Cl2(400ml)和DMF(200ml)的溶液搅拌48小时。用二氯甲烷(500ml)和水(250ml)稀释所述混合物，然后搅拌15分钟。分离各层，用饱和碳酸钠(250ml)、饱和氯化钠(250ml)洗涤所述有机层，并经过硫酸钠干燥。过滤所述混合物，并在真空条件下浓缩所述滤液，制得油状物。使用乙酸乙酯和己烷通过硅胶色谱法将所述油状物纯化，制得28.0g材料。MS(m/Z)[M+2]+＝798；[M+1]+＝1595。
2，3-二-羧基-DTPA丙酸在50psi下，在乙酸乙酯/三乙胺(10∶3)中，使用10％钯/碳(6.0g)催化剂进行2，3-二-羧基-DTPA丙酸苄酯(17.0g)的氢化反应24小时。用氮气冲洗所述反应器，并通过硅藻土_过滤所述混合物，在减压条件下浓缩制得16.0g油状物。MS(m/Z)[M+2]+＝753；[M+1]+＝1504。
合成合成子#2的方法 N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-二亚乙基三胺在室温下，往二亚乙基三胺(3.16ml)、乙腈(700ml)和二异丙基乙基胺(10.4ml)溶液中加入溶于乙腈中的预反应的(30min)bb(CO)DTPE(42.0g，“合成子3”)、HOBt(7.9g)、EDC(11.2g)和二异丙基乙基胺(10ml)。搅拌所述反应物16.0小时，然后在减压条件下浓缩。将所述油状物和乙酸乙酯混合，用水和饱和氯化钠水溶液提取，然后浓缩。使用己烷/异丙醇/三乙胺通过硅胶色谱法将所述油状物纯化，制得22.5产物。MS(m/Z)[M+H]+＝1503。
N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-N2-(苄氧基羰基甲基)-二亚乙基三胺将2-溴乙酸苄酯(2.54g)加入上述胺化合物(13.5g)、乙腈(200ml)和碳酸钠(1.18g)的溶液中。将所述混合物升温至60℃，并搅拌15小时。将所述反应混合物冷却至室温，并在减压条件下浓缩。加入乙酸乙酯和水，分离各层。用饱和氯化钠水溶液洗涤所述有机层，然后下减压条件下浓缩，制得油状物(14.5g)。MS(m/Z)[M]+＝1651。
N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-N2-(乙酸)-二亚乙基三胺在50psi下，在乙酸乙酯/三乙胺(49∶1)中，在10％钯/碳(3.5g)存在下进行苄酯(14g)的氢化反应16.0小时。通过硅藻土_过滤所得混合物，并在真空中浓缩制得12.08g油状物。MS(m/Z)[M+H]+＝1561。
合成合成子#4 N1，N3-二-丁氧基羰基-二亚乙基三胺在室温下往二亚乙基三胺(2.12g，20.6mmol)和三乙胺(30.0g，41.3mmol)的THF(100mL)溶液中加入Boc-ON(10.65g，43.3mmol)。将所述混合物搅拌过夜。往所述混合物中加入700mL乙醚，然后用磷酸盐缓冲剂(pH＝3，100mmol)提取。将所述水溶液碱化至pH＝11，并用二氯甲烷提取。分离所述有机层，并经过无水硫酸钠干燥。过滤所述盐，并在减压条件下除去所述溶剂，制得所示无色油状化合物(5.55g)。MS(m/Z)[M+H]+＝304.1。
N1，N3-二-丁氧基羰基-N2-(苄氧基羰基乙基)-二亚乙基三胺在室温下，往上述化合物(1.0g，3.30mmol)的甲醇(40mL)溶液中加入丙烯酸苄酯(1.07g，6.59mmol)。将所述混合物回流3天。在减压条件下除去所述溶剂，制得黄色液体，它包含所示化合物和丙烯酸苄酯。MS(m/Z)[M+H]+＝466.1。
N2-(苄氧基羰基乙基)-二亚乙基三胺在室温下，往上述化合物和丙烯酸苄酯(1.0g)在二氯甲烷(25mL)中的混合物中加入TFA(13.8mL)。在室温下搅拌所述混合物3小时，然后往所述混合物中加入1N HCl和水。分离所述水层，并冻干，制得所示化合物(420mg)，为粘性固体。MS[m/Z][M+H]+＝266.2。
N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-N2-(苄氧基羰基乙基)-二亚乙基三胺往上述化合物、“合成子3”、HOBt和二异丙基乙基胺的CH2Cl2和DMF溶液中加入DIC。在室温下搅拌所述混合物48小时。用二氯甲烷和水稀释所述混合物，然后搅拌15分钟。分离各层，用饱和碳酸钠，饱和氯化钠洗涤所述有机层，并经过硫酸钠干燥。过滤所述混合物，并在真空中浓缩所述滤液，制得油状物。使用乙酸乙酯和己烷通过硅胶色谱法将所述油状物纯化，制得所示化合物。
N1，N3-二[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-3-{[2-(二-叔-丁氧基羰基甲基-氨基)-乙基]-(叔-丁氧基羰基甲基)-氨基}-丙酰胺]-N2-(丙酸)-二亚乙基三胺将上述化合物、10％钯/碳、乙酸乙酯和三乙胺加入所述氢化反应器中。用氮气然后用氢气冲洗所述反应器。在氢气(50psi)条件下振荡所述混合物24小时。用氮气冲洗所述反应器，并通过硅藻土_过滤所述混合物，在减压条件下浓缩所述滤液，制得油状产物。
合成合成子#5 甲基3-(苄基氨基)-2-((苄基氨基)甲基)-丙酸酯在室温下搅拌过程中，将溶于乙腈(20mL)中的甲基-2-(溴甲基)-丙烯酸酯(1.00g，5.6mmol，1.0当量)滴加到苄基胺(1.83mL，16.8mmol，1.5当量)的无水乙腈(10mL)溶液中。16小时后，加入乙醚(100mL)，过滤所述白色固体(氢溴酸苄基胺)。在减压条件下浓缩所述滤液，制得1.90g粗油。将所述油溶于乙酸乙酯(150mL)中，并用H2O和NaCl盐水洗涤。干燥所述有机层(MgSO4)，并在减压条件下蒸发。通过快速色谱法(己烷∶乙酸乙酯)将所得透明油纯化制得1.38g(79％)产物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.68(s，2H)，2.79-2.90(m，5H)，3.68(s，3H)，3.75(s，3H)，7.21-7.32(m，10H)。
3-(氨基)-2-(氨基甲基)-丙酸甲酯将3-(苄基氨基)-2-((苄基氨基)甲基)-丙酸甲酯(2.27g，7.3mmol，1.0eq)溶于二氯甲烷(20mL)，并加入4.0mL4M HCl在二噁烷中的溶液。在室温下搅拌所述溶液20分钟，并在减压条件下蒸发溶剂，制得白色粉末，将所述白色粉末溶于50ml MeOH中。在氩气条件下，在0℃下加入催化剂(10％钯/碳催化剂，750mg)，并在45psi H2条件下振荡所述混合物18小时，然后通过硅藻土_进行过滤。在分离所述MeOH之后，分离所述产物(1.47g)，在减压条件下蒸发。1HNMR(300MHz，D2O)δ3.25-3.43(m，5H)，3.82(s，3H)。
3-(BOC-氨基)-2-(BOC-氨基甲基)-丙酸甲酯在0℃下，在二噁烷/Na2CO3水溶液中使二胺(1.44g)和二碳酸二叔丁酯(3.22g，14.8mmol，1.05当量)反应1小时，然后在室温下反应18小时。然后用0.5N KHSO4将所述混合物酸化(pH＝4)，并在减压条件下蒸发二噁烷。用乙酸乙酯提取所述水性部分，用MgSO4干燥，并在减压条件下浓缩，制得粗油，它通过快速色谱法(己烷∶乙酸乙酯)进行纯化，制得1.86g(80％)所需产物。NMR(300MHz，CDCl3)δ1.41(s，18H)，2.66-2.78(m，1H)，3.10-3.27(m，2H)，3.50-3.62(m，2H)，3.68(s，3H)，5.17-5.27(bt，2H)。
3-(BOC-氨基)-2-(BOC-氨基甲基)-丙酸将甲酯(1.50g)溶于15mLTHF/H2O的2∶1混合物中。在0℃下加入LiOH·H2O(0.95g)。在0℃到室温之间搅拌所述混合物44小时。在减压条件下蒸发THF，并用EtOAc提取所述水溶液。使用0.5M KHSO4水溶液将所述水层酸化至pH＝3，并用EtOAc提取。用30mL H2O洗涤所述混合的有机部分，并干燥(MgSO4)。在减压条件下蒸发所述溶剂，制得1.32g(92％)产物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.40(s，18H)，2.66(s，1H)，3.27-3.47(m，4H)，5.42(s，1H)。
3-(BOC-氨基)-2-(BOC-氨基甲基)-丙酸苄酯在室温下，在包含Cs2CO3(2.07g)的无水DMF中使酸(1.01g)和苄基溴(0.45mL)反应。在减压条件下蒸发DMF，在H2O和EtOAc之间分离所述残留物。用盐水洗涤所述有机层，并干燥(MgSO4)。在减压条件下蒸发所述溶剂，并通过在硅胶上进行快速色谱法(己烷/EtOAc 95∶5到9∶1-85∶15)，将所述残留物纯化。产率1.16g(90％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.42(s，18H)，2.79(定量，1H，5.6Hz)，3.1-3.3(m，2H)，3.5-3.65(m，2H)，5.13(s，2H)，5.15-5.28(m，1H)，7.30-7.40(m，5H)。MS431.15(M+1)。
3-氨基-2-氨基甲基-丙酸苄酯二盐酸盐将3-(BOC-氨基)-2-(BOC-氨基甲基)-丙酸苄酯(1.15g)溶于5mL 4M HCl的二噁烷溶液。在0℃下搅拌所述混合物6小时，并在减压条件下蒸发所述二噁烷。用乙醚研磨所述残留物，并过滤制得未纯化的二胺二盐酸盐(0.81g)。1HNMR(300MHz，MeOD)δ3.1-3.3(m，5H+CHD2OD)，3.55(s，二噁烷)，5.19(s，2H)，5.15-5.28(m，1H)，7.20-7.40(m，5H)MS209.00(M+1)。
3-(N-BB(CO)DTPE甲酰胺)-2-(NBB(CO)DTPE甲酰胺)甲基-丙酸苄酯在0℃下，将酸(2.00g，2.8mmol，1.5当量)溶于5mL无水二氯甲烷。使所述二胺(0.26g)、HOAt(0.32g)和二异丙基乙基胺(0.65mL)和HATU(0.88g)反应2小时。加入三胺树脂(0.5g)、异氰酸酯树脂(0.5g)和HATU(0.42g)，并在室温下搅拌所述反应混合物16小时。过滤所述树脂，并蒸发所述滤液。在H2O和EtOAc之间分离所述残留物。用水、饱和NaHCO3和盐水(20mL)洗涤所述有机层，并干燥(MgSO4)。在减压条件下蒸发所述溶剂，并通过在硅胶上进行快速色谱法(己烷/丙酮/Et3N)，将所述残留物纯化。制得产物(1.13g)。MS1607.95(M+1)和1629.95(M+Na)。
3-(N-BB(CO)DTPE甲酰胺)-2-(N-BB(CO)DTPE甲酰胺)甲基-丙酸将苄酯(0.90g，0.56mmol)溶于30mL EtOAc中，加入Et3N(1mL)。加入10％钯/碳催化剂，在45psi氢气下振荡所述混合物15小时。过滤所述催化剂，并蒸发所述溶剂，制得产物(0.82g)。MS759.55(M+2H/2)。
实施例5-合成结合血纤蛋白的MR显影剂

肽的构成将3.39g 1，3-二-(氨基甲基)-苯三苯甲基NovaSyn TGT树脂(所测取代度＝0.59mmol)置于标准肽柱上，并加到肽合成器上。使用标准Fmoc步骤进行所述合成方法。在使用DMF中的乙酸酐、6％二异丙基乙基胺偶合所述第一氨基酸之后，进行封端。当完成所述合成时，从所述柱上取出所述树脂，并置于反应器中。用CH2Cl2清洗所述树脂一次，并过滤。然后，用1％三氟乙酸的CH2Cl2溶液处理所述树脂，并置于机械振荡器上10分钟。通过所述反应容器过滤所述混合物，并收集所述滤液。用三乙胺将所述混合滤液的pH调至约8，并在真空条件下浓缩所述溶液，形成油状物。在用水沉积之后，过滤所述白色固体，并用水和二乙醚清洗。通过抽滤干燥所述固体、在DMF中提取，并用乙腈稀释。在冰浴中冷却所述溶液，并用1.5g三氟乙酸铊处理2.0小时。使用三乙胺将所述溶液的pH调至8，然后在真空条件下浓缩。往所述油状物中加入水，通过抽滤收集所得沉积物。用水和二乙醚洗涤所述固体，制得2.7g粗制的具有C-末端胺官能团的修饰的肽。通过观察为1792.8[M+Na]+An的m/Z，证实H2N-Leu-Pro-Cys-Asp-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Cys-Bip-Asp-CO-NHCH2C6H4CH2NH2(SEQ ID NO21)的合成实施例。通过制备HPLC来纯化所述修饰的肽。混合类似纯度(98-100％)的级分，并无需中和进行冻干。
将修饰的肽(3.2g)和共价缀合物(上述合成子#2)(3.95g)溶于二氯甲烷中。滴加二异丙基乙胺，直到pH9，并且同时往所述混合物中加入二异丙基碳酰亚胺(2当量)和HOBt(2当量)。搅拌2分钟之后，滴加二异丙基乙胺，直到pH9。在室温下搅拌所述混合物2小时。再一次性加入预先活化的合成子#2(同时加入二异丙基碳酰亚胺，二异丙基乙胺，和HOBt)。在真空条件下除去所述溶剂，并将残留物溶于乙酸乙酯中，依次用0.1N盐酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠水溶液洗涤。经过硫酸钠干燥所述有机层，过滤，并在减压条件下浓缩，制得淡黄色泡沫材料(7.8g)。将所述泡沫材料溶于二氯甲烷，并通过快速色谱法(二氯甲烷∶甲醇洗提液)进行纯化，制得白色固体(5.6g)。在室温下，在TFA、水和三乙基硅烷(90％/5％/5％，30ml)的混合物中搅拌所述白色固体。将所述混合物加热至40℃，并搅拌2小时。将所述溶液浓缩至体积为3-5ml，然后冷却至室温。加入二乙醚，形成白色沉淀。搅拌所述混合物10分钟，过滤收集所述固体，并用二乙醚洗涤。在真空条件下干燥所述固体，形成白色固体T(4.0g)。将所述固体溶于水∶乙腈(20ml，4∶1比例)的混合物中，并通过制备HPLC纯化，制得白色固体，前体MR显影剂(1.6g)。
在蒸馏去离子水中，在加入1MNaOH将所述pH调至约6的条件下，使前体MR显影剂(1g)和1当量的GdCl3·6H2O反应。使用蒸馏去离子水和50∶50(v∶v)甲醇∶水洗提液，通过反相色谱法(Waters Sep-Pak_C-18)纯化所述钆络合物。将合适的级分混合，并在50℃下，在减压条件下除去所述甲醇，并冻干形成811mg的MR显影剂。
作为上述合成方法32的替代方法，所述肽可以如以下所述的流程在树脂上环化
可任选用耐胃膜例如异丁烯酸聚合物(Eudragit)或纤维素衍生物例如纤维素乙酰邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素对依据本发明获得的口服固体剂型例如片剂、胶囊、基质颗粒或小型基体进行常规包衣加工。
本发明组合物保证了肝素或肝素衍生物控制释放到最后一部分小肠和结肠内，其中肝素对肠粘膜和粘膜下层的抗血栓形成、抗炎、免疫调节和内皮调节活性为活动期和复发的溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、乙状结肠炎、直肠炎和非特异性肠炎性疾病提供了有效治疗。
对于所涉及的治疗应用，肝素的合适剂量可以为每单次给药5-1000mg，每天给药1-3次，日剂量优选为5-1000mg。
下列实施例更详细地举例说明本发明。
实施例1-7用于在结肠中控制释放的肝素片剂每个片剂的定性-定量组成


实施例7-合成血结纤蛋白的光学造影介质以上述类似的方法合成以下各光学造影介质。流程X显示了一般实施例，其中往相同的肽中加入两个相同的光学燃料。
包含5-羧基四甲基若丹明的化合物(3A)将所述肽1(177mg，0.10mmol)和5-羧基四甲基若丹明琥珀酰亚胺基酯A(111mg，0.21mmol)溶于二氯甲烷(20mL)和DMF(20mL)中。滴加二异丙基乙基胺，直到pH9。搅拌所述混合物过夜，然后，在减压条件下除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法(洗提液二氯甲烷/甲醇)纯化所述残留物，制得化合物2A。
往化合物2A中加入TFA、H2O和三乙基硅烷(比例90/5/5，5mL)的溶液。在室温下振荡所述混合物3小时，然后将所述反应混合物溶液倾倒到50mL乙醚中，沉积所述粗产物。通过离心分离将所述溶剂分离之后，收集所述粗产物，然后使用反相HPLC进行纯化，制得化合物3A。

包含5-羧基荧光素-的化合物(3B)以类似于合成3A的步骤，使用肽1(177mg，0.10mmol)和5-羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯B(99.4mg，0.21mmol)合成3B。
包含Texas Red_-x的化合物(3C)以类似于合成3A的步骤，使用肽1(177mg，0.10mmol)和Texas Red_-X琥珀酰亚胺基酯C(172mg，0.21mmol)合成3C。
实施例8-测量造影介质和目标物的结合性通过各种平衡结合方法，评价本发明造影介质和目标物如HSA或血纤蛋白的结合程度。例如，可以通过超滤测量对HAS的结合性。在使用超滤进行的典型结合性测量方法中，在pH7.4的缓冲剂中将造影介质和4.5％重量/体积HAS混合。将所述样品加入装有30kDa分子量截止过滤器(Millipore Ultrafree MC Low BindingRegeneratedCellulose 30KDa分子量截止过滤器产品编号UFC3 LTK00)的市售离心分离设备中，所述过滤器可以渗透所述寻靶基团，但是不能渗透HSA。通过在截止过滤器上进行2000xg离心分离20分钟，过滤少量(5-10％)样品体积，测量滤液中所述样品中的未结合的目标组分的浓度。
为了测量对血纤蛋白的结合性，可以在微量滴定板的小孔中形成血纤蛋白凝块，并和所述目标组分接触。在孵化足够时间以建立平衡之后，通过抽吸除去上层清液(所述不溶的血纤蛋白仍旧作为胶粘的凝块结在小孔的底部)。然后测量上层清液中未结合的目标组分的浓度。
在两种方法中，确定结合的造影介质浓度，作为起始存在的总目标组分浓度和结合试验之后所述未结合目标组分浓度的差。所述结合的分数是所述结合的目标组分的浓度除以总目标组分的浓度。
如上所述，检查造影介质对可溶血纤蛋白DD(E)片段的亲合性，并记录在表4中。表4中化合物编号是指在详细说明中所述的结构。在生物试验中，在多次测量中的数据存在不超过20％的差错频率。
表4化合物对血纤蛋白的亲和性化合物 Kd，DD(E)，μM

化合物 Kd，DD(E)，μM

实施例9-造影介质的稳定性使用大鼠肝脏匀浆评价其稳定性，所述均浆包含细胞内和细胞外酶，并且表示对肽键来说尤其苛刻的化学环境。将刚制备的大鼠肝脏匀浆(630μL)置于玻璃试管中，并在37℃的水浴中孵化4分钟。在37℃下，往所述大鼠肝脏匀浆中加入70μL 1mM的试验化合物溶液。在时间点0、5、15、30和60分钟时，取出100μL等份反应混合物，并在微量管中和100μL甲醇混合，来停止所述反应。以10,000rpm速度将所述停止反应的混合物离心分离3分钟，形成沉积蛋白质小丸。通过LC-MS分析所述上层清液，通过将单离子MS峰的面积和一系列标准比较，确定残留试验化合物的量。通过绘出信号残留百分数的对数对时间的图来确定半衰期(T1/2)。使用指数曲线拟合法将所述数据拟合，其中T1/2＝ln2/斜度。
测试了以下化合物的稳定性数据。化合物5在肽的C-和N-末端处均具有螯合物，由于耐受肽链端解酶的水解，其半衰期显著增大。通过用螯合物将一端改性，不能使半衰期出现可比较的增加，即使当其另一末端用非天然有机部分封端时，例如在化合物3(在N-末端处包含联苯基)。
结构1半衰期＝＜2min，游离N-和酰胺化C-末端 结构2半衰期＝10min，缀合到螯合物上的N-末端和酰胺化C-末端。
结构3半衰期＝9min，缀合到螯合物上的C-末端和用对-(苯基)苯甲酸酰化的N-末端。
结构5半衰期＝65min，N-和C-末端均缀合到螯合物上。
令人惊奇的是，以上数值说明，通过将钆螯合物缀合到C-和N-末端上可以最显著地增大肽的半衰期。
实施例10-造影介质的驰豫率使用在0.47 Tesla(20MHz H-1 Larmor频率)和37℃下操作的BrukerNMS-120Minispec NMR光谱仪或在35℃下操作的Konig-Brown应力松弛计(20MHz，H-1Larmor频率)测量本发明MRI造影介质的驰豫率。使用仪器软件，通过反向恢复脉冲序列测量水质子的T1。通过测量分别包含0、20、30和40μM Gd(III)的目标物的多溶剂溶液(例如，刚聚合的血纤蛋白原的均匀分散的凝胶，10mg/mL)的T1来确定驰豫率。在37℃下孵化所述样品至少15分钟，确保在进行T1测量前温度保持平衡。通过诱导耦合等离子体-质谱仪(ICP-MS)确定所述样品的Gd(III)含量。通过绘制驰豫速率(1/T1)(以s-1计)对Gd(III)浓度(以mM计)的图，可以确定所述驰豫率(每个Gd(III)离子)。线性数据拟合的斜率就是驰豫率。在没有目标物存在下也按类似的方式测量所述化合物的的驰豫率，只是没有存在目标物。
相比没有生物目标物存在下的驰豫率，本发明的化合物显示出在结合血纤蛋白时驰豫率增大(图2)。
实施例11-造影介质的凝块摄取按照以下所述方法确定血栓(血凝块)的造影介质吸收麻醉600g豚鼠(Hartley雄性)。在腹部打开一切口，并分离所述下腔静脉(IVC)，并使所述脉管恢复10分钟。夹住1cm的IVC，并将人类凝血酶(50μL，4单位)注入所述脉管中，促进血栓形成。打开下面的夹钳并关闭，使部分血液流到该段中。2-3分钟后，移走夹子。使所述血栓在动物中老化30分钟。这时，通过颈静脉注入所述造影介质，剂量为2μmol/kg的化合物32，并用70μCi111In进行放射性同位素示踪。在注入试剂化合物32之后立即通过颈静脉注入非特异对照物，它包含剂量为2μmol/kg的Gd(DTPA)，并混有70μCi99mTcDTPA。30分钟后，进行抽血，处死该动物，并除去所述血栓。将所述血液样品称重，并使用PackardCobra IIγ计数器进行计数。也将所述血栓称重并计数。在128-165keV检测由99mTc产生的计数，而在390-500keV探测由111In的衰变产生的计数。仅具有99mTc或111In的对照物实验证实了来自99mTc的放射性在用于111In的探测能量下可以忽略，反之亦然。将所述反射性衰变数据转化为每克组织的起始剂量％，％ID/g，并且用图表示三个实验的平均值。预先进行111In的放射性同位素标记将合适放射化学量的111In Cl3(New England Nuclear)加入血纤蛋白靶向造影介质中。通过加入1M HCl，将pH调至4。在45℃下将所述样品加热1小时。通过加入1MNaOH将pH调至中性。通过γ-检测的HPLC可知，所述标记试剂化合物32的纯度＞95％。
血纤蛋白-特异试剂显示出凝块吸收显著增大。图3显示了一种试剂，即化合物32在血栓中的积聚。相比较99mTcDTPA，存在特异的凝块吸收，在血栓中所述试剂的浓度比周围血液中的浓度高。
可以使用MRI来实证凝块吸收的特异性。在活的有机体内用试剂对血栓进行成像的步骤如下麻醉600g豚鼠(Hartley雄性)。在咽喉处打开一切口，并分离出一条颈静脉。用血管钳分离出一端1cm的颈静脉。将刚刚从动物上抽出的血液(50μL)和人类的血栓(50μL，4单位)混合，并注入到夹住的脉管段中。注入之后4分钟，移走所述夹钳，使所述血栓老化30分钟。以6μmol/kg的剂量将试剂，即化合物32注入，并使用残缺倾斜方法(TR＝36，TE＝5，翻转角＝30°)在1.5T时将豚鼠的咽喉区域成像。相对于血液来说，所述血栓显得明亮。
实施例12-在有黑色血液以及没有黑色血液的条件下用靶向造影介质获得血栓的MR成像用克他命(50mg/kg)，乙酰丙嗪(2.5mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)试剂的混合液麻醉2.5kg雌性New Zealand白鼠并用巴比妥钠(约35mg/kg，按所需的)维持麻醉。将i.v.导尿管(24g)置于耳静脉和耳动脉中。分离所述颈静脉和颈动脉。通过将18g的针置于脉管的上部，在颈动脉中形成器官狭窄效果，然后，缝合3-0针。然后将针移走。然后，用微脉管夹子将5mm的动脉部分末梢截断，形成器官狭窄效果。然后沿5mm部分辗压所述动脉两次。释放所述最接近的脉管夹子，使血液流入所述片段中约3秒。重新加上夹子，再次沿5mm的部分辗压所述动脉两次。4分钟后，移走夹子。用微脉管夹子分离5mm颈静脉片段。通过注入100μL 3.7单位的凝血酶、0.06 MCaCl2、兔子全血的混合物，形成血栓。4分钟后移走夹子。
将血栓老化50分钟。通过耳静脉注入1.0mL血栓钯向试剂(结构III，5mM，2μmol/kg)的溶液。10分钟后，将该动物置于General Electric Signa LxCVi 1.5 teslascanner中，并使用3D RF残缺倾斜响应序列(SPGRTR＝39ms，TE＝3.1ms，翻转角＝40°，视野＝8Cm，获得频带宽＝31.25kH)获得第一MRI数据。施加化学脂肪饱和以及40mm空间下级和上级饱和带。这一扫描之后(8分钟之后)立即使用具有40mm空间下级和上级饱和带的相同参数获得第二MRI数据，形成“黑血”成像。
图4A显示了第一数据最大的强度投影(MIP)。由投影长对时间的影响部分提高所述血管。图4B显示了第二数据的MIP，其中通过使用上级和下级饱和带抑制来自内流血液的信号。在图4A和4B中，通过使用寻靶造影介质识别固定钯(血栓)明显很方便。
实施例13-合成光学造影介质用NMP/乙醚/NMP洗涤所述NovaSyn TGR树脂(0.20mmol/g，100mg，20μmol)。使用PyBOP/HOBt/DIEA活化剂，通过标准固相方法组装所述肽。偶合所述最后氨基酸残基之后，使用哌啶的DMF(20体积％，2.0mL)的溶液处理所述结合树脂的肽10分钟，除去Fmoc保护基。使用NMP/乙醚/NMP彻底地洗涤所述树脂，并用荧光素-5-异硫氰酸酯(23.4mg，60μmol)和二异丙基乙基胺(11.6mg，15.7μL，90μmol)的DMF(1.5mL)溶液处理12小时。使用NMP/乙醚/NMP彻底地洗涤所述树脂，并在4℃下用T1(TFA)3(18.7mg，34.5μmol)的DMF(1.5mL)溶液处理3小时。这一处理之后，洗涤所述树脂，并用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5，2.0mL)的混合液处理2小时。通过往清除混合液中加入乙醚来沉积所述粗制的肽，并使用VydacC-18柱通过制备HPLC进行纯化。以这种方式形成结构A-N，并确定它们血纤蛋白DD(E)片段的亲合性(表5)。
结构

表5光学靶向造影介质对血纤蛋白的亲和性。
ID Kd(μM)对比DD(E) 氟 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13D 0.061 氟 Ahx W F H C Hyp Y(3-I) D L CHIJ 0.055 氟 QW E C P YG L C WIQK 0.06 氟 WF H C P YD L C HIL
E 0.09 氟 Ahx G G F HC Hyp Y(3-I) D L C H IC 0.097氟 Ahx G F H CHyp Y(3-I) D L C H IB 0.099氟 Ahx F H C Hyp Y(3-I) D L C H IH 0.119氟 K W F H CHyp Y(3-I) D L C H IG 0.124氟 K G F H CHyp Y(3-I) D L C H II 0.127氟 K G G F HC Hyp Y(3-I) D L C H IA 0.136氟 β-A F H C Hyp Y(3-I) D L C H IF 0.212氟 K F H C Hyp Y(3-I) D L C H I具有光学探头的肽的N-末端标记可以调节所述光学造影介质的结合亲和性。例如，当和肽的荧光素、4-甲氧基香豆素和四甲基若丹明衍生物(QWECPYGLCWIQ(SEQIDNO27)；Kd＝3μM)比较时，观察到以下的Kd’s(表6)表6

实施例14-血纤蛋白钯向的尿激酶按照以下所述步骤制备血纤蛋白钯向的尿激酶。按照固相步骤制备所述具有Gly-Gly二肽连接基的血纤蛋白结合肽。用乙酰基将所述肽的N-末端封端，并将C-末端羧酸转化成琥珀酰亚胺活性酯。通过在水性缓冲剂中以合适比例混合尿激酶和所述活化肽来获得直接化学结合，并缓慢搅拌所述溶液30分钟。
可通过HPLC纯化血纤蛋白钯向的尿激酶。评价对血纤蛋白的结合性。相对血纤蛋白原，化合物1选择性结合血纤蛋白。
使用Collen等(J.Clin.Invest.1983，71，368-376)中兔子的颈静脉模型进行溶解血栓试验。通过在1分钟内注入丸剂(由20％的总剂量组成)以及肝素丸剂(300单位/kg)来给予化合物(2mg/kg)。在接着的60分钟内连续注入剩余的剂量，并且在接着的180分钟内连续注入肝素(60单位/kg/小时)。在3小时时，处死该动物，并分析凝块。化合物1比单独的scuPA在凝块溶解中效力更强。在3小时时，在具有2mg/kg化合物1的条件下，相比相等剂量的单独scuPA，消耗更少的血纤蛋白原和α2-抗纤维蛋白溶酶，证实化合物1比单独的scuPA具有更强的血纤蛋白特异性。
其它实施方案可以理解，由于已经详细描述了本发明，上面的描述只是为了阐述而不是要限制本发明的范围，其范围由权利要求书确定。其它方面、优点和修改在以下权利要求范围之内。
权利要求
1.制造MR显影剂的方法，其特征在于，所述方法包括a)使带有N-末端胺官能团的肽与连接基-亚单元部分反应以形成带有C-末端胺官能团和所述N-末端胺官能团的修饰的肽；b)使连接基部分共价连接到C-末端胺官能团和N-末端胺官能团以形成前体MR显影剂；和c)将前体MR显影剂转变成MR显影剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接基-亚单元部分选自 和 其中n是1-4的整数；m是1-12的整数；和R是脂肪基或芳基。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接基部分选自 其中m是1-4的整数；n是0-4的整数；LG是离去基团；和R’和R”独立选自氢和化学保护基。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接基部分选自 其中LG是离去基团；和R1和R2独立选自氢和化学保护基。
5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中，LG选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐，且其中所述化学保护基选自Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、苄基和烯丙基。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述活性酯选自五氟苯酚(Pfp)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)、2-硫代噻唑烷-1-基和羟基苯并三唑(OBT)。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述卤化物选自F，Cl，Br和I。
8.如权利要求1所述的方法，其中，将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂包括(a)使前体显影剂与前体螯合部分反应以在前体螯合部分和前体MR显影剂的连接基部分之间形成共价键，所述前体螯合部分包括多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分；(b)将结合的前体螯合部分的多个羧酸盐前体基团转化成多个羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和(c)将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述前体螯合部分选自 和 其中，Y是能够能够与所述已连接的连接基部分形成共价键的合成部分，且其中每个X分别是O-或O-前体，这样，在X转变成O-后就能够与其邻近的羰基形成羧酸盐部分，R1是不带电荷的化学部分、脂肪基烷基或环烷基或其不带电荷的取代的形式。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述合成部分选自羧酸、活性酯、酸酰卤、酸酐、卤代烷、异氰酸酯和异硫氰酸酯，其中O-前体选自-OH、-OMe、OEt、OtBu、O苄基和O-烯丙基。
11.如权利要求8所述的方法，其中，前体螯合部分选自 和 其中，LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团，且其中每个R分别是选自OH，-O-Me，O-Et，O-tBu，O-苄基和O-烯丙基的O-或O-前体，这样，在转变成O-后R就能够与其邻近的羰基形成羧酸盐部分。
12.如权利要求8所述的方法，其中，所述前体螯合部分选自 其中n是1-4的整数；R选自负电荷和能够转化成负电荷的带有负电荷的前体；和X是选自-Cl，-Br，-I，-MsO，-TsO和-TfO的化学离去基团。
13.如权利要求8所述的方法，其中，所述前体螯合部分选自 其中R选自负电荷和能够转化成负电荷的带有负电荷的前体；和X是选自-Cl，-Br，-I，-MsO，-TsO和-TfO的化学离去基团。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中，所述带有负电荷的前体选自-H，-Me，-Et，-t-Bu，-苄基和-烯丙基。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接基部分与前体螯合部分共价缀合，所述共价缀合物含有多个含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述共价缀合物选自 和 其中，n是1-4的整数；LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团；和R1，R2，R3，R4和R5独立选自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保护的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述共价缀合物选自 其中LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团；和R1，R2，R3和R4选自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保护的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
18.如权利要求15所述的方法，其中，所述共价缀合物选自合成子1 和合成子2
19.如权利要求15所述的方法，其中，所述共价缀合物选自 其中R是-tBu基，LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团。
20.如权利要求15所述的方法，其中，将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂包括a)将多个共价缀合物的羧酸盐前体基团转化成羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和b)将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。
21.如权利要求8或权利要求20所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子是Gd(III)。
23.如权利要求1所述的方法，还包括在步骤b)之前使连接基-亚单元与肽的N-末端胺官能团反应以得到肽的衍生的N-末端胺官能团。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述连接基-亚单元选自 和 其中碱基选自腺苷、鸟苷、胸腺嘧啶和胞嘧啶；LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团；和R是脂肪或芳香部分。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述连接基-亚单元选自 其中n分别为0-3的整数；R是脂肪基或芳基；和LG是选自OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团。
26.如权利要求23所述的方法，其中，所述连接基-亚单元选自 和 其中，n分别是1或2；R是脂肪基或芳基；和LG是选自OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团。
27.制造MR显影剂的方法，其特征在于，所述方法包括a)将氨基酸残基共价结合到连接基-亚单元部分以形成肽的C-末端，其中所述连接基-亚单元部分共价连接到树脂上；b)在树脂上从一肽的共价结合的C-末端到N-末端残基合成肽，所述N-末端残基包括N-末端胺官能团；c)从树脂上切下肽以制造带有C-末端胺官能团的肽；d)将连接基部分共价结合到肽的C-末端胺官能团和N-末端胺官能团以形成前体MR显影剂；和e)将所述前体MR显影剂转化成MR显影剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤c)之前使连接基-亚单元附到共价连接到N-末端胺官能团以制造衍生的N-末端胺官能团。
29.如权利要求27所述的方法，其中，将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂包括a)使前体MR显影剂与前体螯合部分反应以在前体螯合部分和前体MR显影剂的连接基部分之间形成共价键，所述前体螯合部分包括多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分；b)将结合的前体螯合部分的多个羧酸盐前体基团转化成多个羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和c)将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。
30.如权利要求27所述的方法，其中，所述连接基部分共价缀合到前体螯合部分，所述共价缀合物含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂包括a)将多个共价缀合物的羧酸盐前体基团转化成羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和b)将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
33.如权利要求31所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子是Gd(III)。
34.制造MR显影剂的方法，其特征在于，所述方法包括a)使带有C-末端羧酸盐官能团的肽与连接基-亚单元部分反应以形成具有C-末端羧酸盐官能团和N-末端羧酸盐官能团的修饰的肽；b)使连接基部分共价连接到修饰的肽的C-末端和N-末端羧酸盐官能团以形成前体MR显影剂；和c)将前体MR显影剂转变成MR显影剂。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述连接基-亚单元部分选自 和 其中LG是选自-OH、活性酯、卤化物和酸酐的离去基团；和R是脂肪基或芳基。
36.如权利要求34所述的方法，其中，所述连接基部分选自 其中m是1-4的整数；n是0-4的整数；R独立选自-H，-Me，-Et，-Bz和-tBu；和R1和R2独立选自氢或化学保护基。
37.如权利要求34所述的方法，其中，所述连接基部分选自 其中，R1和R2独立选自氢和化学保护基，所述化学保护基选自Boc、Fmoc、CBZ、叔丁基、苄基和烯丙基。
38.如权利要求34所述的方法，其中，将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂包括a)使前体MR显影剂与前体螯合部分反应以在前体螯合部分和前体MR显影剂的连接基部分之间形成共价键，所述前体螯合部分包括多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分；b)将结合的前体螯合部分的多个羧酸盐前体基团转化成多个羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和c)将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。
39.如权利要求34所述的方法，其中，所述连接基部分共价缀合到前体螯合部分，所述共价缀合物含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够被转化成羧酸盐部分。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂包括a)将多个共价缀合物的羧酸盐前体基团转化成羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和b)将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位以制造MR显影剂。
41.如权利要求39所述的方法，其中，所述共价缀合物选自 和 其中n是1-4的整数；和R1，R2，R3，R4和R5独立选自乙酸酯部分、-Me、-Et或-t-Bu保护的乙酸酯部分，乙酰胺部分和乙酰氧部分。
42.如权利要求39所述的方法，其中，所述共价缀合物是
43.如权利要求1、27或34所述的方法，其中，将所述前体MR显影剂转变成MR显影剂包括(a)使前体显影剂与螯合部分反应，其中所述螯合部分含有顺磁性金属离子，以在螯合部分和前体MR显影剂的连接基部分之间形成共价键以制造MR显影剂。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子是Gd(III)。
46.在生物高分子的-CO2R和NHR末端含有金属螯合物的造影介质，其特征在于，R独立选自氢，烷基，脂肪基和离去基团。
47.如权利要求46所述的造影介质，在生物高分子的CO2R和NHR末端含有两个金属螯合物。
48.如权利要求46所述的造影介质，其中，所述生物高分子对血纤蛋白有特异的结合亲合性。
49.如权利要求46所述的造影介质，其中，所述生物高分子是肽。
50.如权利要求49所述的造影介质，其中，所述肽能够在非还原条件下形成二硫键。
51.如权利要求50所述的造影介质，其中，所述肽含有二硫键。
52.如权利要求46所述的造影介质，所述造影介质有以下结构 其中螯合物代表金属螯合物；连接基代表连接基部分；连接基-亚单元代表连接基-亚单元部分；m独立为1-10的整数；p独立为0-5的整数；s独立是0或1；R1是氨基酸侧链或其衍生物；和R2独立是氢或脂肪基。
53.如权利要求52所述的造影介质，所述造影介质具有选自以下的结构结构4 结构5 结构6 结构7 结构8 结构9 结构10 结构11 结构12 结构13 结构14 结构15 结构16 结构17 结构18 结构19 结构20 结构21 结构22 结构23 结构24 结构25 结构26 结构27 结构28 结构29 结构30 结构31 和结构32 其中，Gd是顺磁性金属离子Gd(III)，其中Gd(III)配位到DTPA部分；且其中DTPA部分在DTPA部分的次乙基碳或乙酸基碳上共价连接到含有C(＝O)基的部分。
54.如权利要求52所述的造影介质，所述造影介质具有选自以下的结构结构33 结构34 结构35 结构36 结构37 结构38 结构39 结构40 和结构41
55.如权利要求52所述的造影介质，所述造影介质具有选自以下的结构结构42 结构43 结构44 结构45 结构46 结构47 结构48 结构49 和结构50
56.改变肽的稳定性的方法，所述肽带有N-末端胺官能团，其特征在于，所述方法包括a)使所述肽与连接基-亚单元部分反应以形成具有C-末端胺官能团的肽；和b)使连接基部分共连接到肽的C-末端胺官能团和N-末端胺官能团以形成修饰的肽。
57.如权利要求56所述的方法，还包括使修饰的肽与前体螯合部分反应以在前体螯合部分和修饰的肽的连接基部分之间形成共价键，所述前体螯合部分含有多个羧酸盐前体基团，所述羧酸盐前体基团能够转化成羧酸盐部分。
58.如权利要求57所述的方法，所述方法还包括(a)将结合的前体螯合部分的多个羧酸盐前体基团转化成多个羧酸盐部分，所述羧酸盐部分能够与顺磁性金属离子配位；和(b)将顺磁性金属离子与多个羧酸盐部分配位。
59.如权利要求57所述的方法，还包括测定所述修饰的肽的稳定性。
60.如权利要求57所述的方法，还包括a)测定所述未修饰的肽的稳定性；和b)比较所述修饰的肽的稳定性与所述未修饰的肽的稳定性。
61.如权利要求60所述的方法，其中，所述修饰的肽的稳定性相对于未修饰的肽的稳定性有所提高。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述修饰的肽的稳定性相对于未修饰的肽的稳定性增加了10倍。
63.如权利要求61所述的方法，其中，所述修饰的肽的稳定性相对于未修饰的肽的稳定性增加了20倍。
64.如权利要求61所述的方法，其中，所述修饰的肽的稳定性相对于未修饰的肽的稳定性增加了30倍。
65.如权利要求59或权利要求60所述的方法，其中，所述稳定性采用大鼠肝脏匀浆测定进行。
66.一种具有以下结构的修饰的肽 其中螯合物前体代表螯合物前体部分；连接基代表连接基部分；连接基-亚单元代表连接基-亚单元部分；m独立为1-10的整数；p独立为1-5整数；s独立是0或1；R1是氨基酸侧链或其衍生物；和R2选自H和脂肪基。
67.一种具有以下结构的修饰的肽 其中连接基代表连接基部分；连接基-亚单元代表连接基-亚单元部分；p独立为0-5的整数；s独立是0或1；R1是氨基酸侧链或其衍生物；和R2选自H和脂肪基。
68.一种制造MR显影剂的方法，其特征在于，所述方法包括a)使带有N-末端胺官能团的肽与连接基-亚单元部分反应以形成在其N-末端和C-末端都有胺官能团的修饰的肽；和b)将修饰的肽转变成MR显影剂。
69.制造MR显影剂的方法，其特征在于，所述方法包括a)使带有C-末端羧酸盐官能团的肽与连接基-亚单元部分反应以形成在其C-末端和N-末端都有羧酸盐官能团的修饰的肽；和b)将修饰的肽转变成MR显影剂。
70.制造MR显影剂的方法，其特征在于，所述方法包括a)使氨基酸残基共价结合到连接基-亚单元部分以形成肽的C-末端，其中所述连接基-亚单元部分共价结合到树脂；b)在树脂上从肽的共价结合的C-末端到N-末端残基合成肽，所述N-末端残基包括N-末端胺官能团；c)从树脂上切下肽以制造带有C-末端胺官能团的肽；d)将修饰的肽转变成MR显影剂。
71.如权利要求68、权利要求69或权利要求70所述的方法，其中，将修饰的肽转变成MR显影剂包括使螯合部分共价结合到修饰的肽，其中所述螯合部分含有顺磁性金属离子，以制造MR显影剂。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
73.如权利要求71所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子是Gd(III)。
74.如权利要求68、权利要求69或权利要求70所述的方法，其中，将修饰的肽转变成MR显影剂包括a)使连接基部分共价结合到螯合部分以形成共价缀合物，其中所述螯合部分含有顺磁性金属离子；和b)使共价缀合物与修饰的肽反应以形成MR显影剂。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)、Eu(II)和Eu(III)。
76.如权利要求74所述的方法，其中，所述顺磁性金属离子是Gd(III)。
77.如权利要求56所述的方法，还包括使修饰的肽与帽化部分反应以在帽化部分和修饰的肽的连接基部分之间形成共价键。
78.一种纯化的肽，所述肽含有氨基酸序列P*-Y*-X1*-L*(SEQ ID NO1)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1*是G或D或G或D的非天然衍生物；L*是亮氨酸或其非天然衍生物；和其中，至少P*、Y*、X1*和L*之一是各个氨基酸的非天然衍生物。
79.如权利要求78所述的纯化的肽，其中，X1*是G或D，其中L*是亮氨酸。
80.如权利要求79所述的纯化的肽，其中，P*是脯氨酸或4-羟脯氨酸，且其中Y*是酪氨酸或在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。
81.一种纯化的肽，所述肽含有氨基酸序列X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(SEQ ID NO2)，其中P*是脯氨酸或其非天然衍生物；Y*是酪氨酸或其非天然衍生物；X1选自W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)和Y(3*)，其中F(3/4*)是在3或4位被选自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸，且其中Y(3*)是在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸；X2选自E、H、dE、S、H(Bzl)、2-Pal、Dpr和Th；X3选自G和D；X4选自H、F、Y和W；X5选自I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal和F(3/4*)，其中F(3/4*)是在3或4位被选自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸；X6选自N、Q、I、L和V或X6不存在；且其中至少X1，X2，X5，P*和Y*之一是氨基酸的非天然衍生物。
82.如权利要求81所述的纯化的肽，其中，P*是脯氨酸或4-羟脯氨酸，且Y*是酪氨酸或在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物。
83.如权利要求80或81所述的纯化的肽，所述肽还能够在非还原条件下形成二硫键。
84.如权利要求83所述的纯化的肽，所述肽含有二硫键。
85.如权利要求84所述的纯化的肽，所述肽对血纤蛋白有特异的结合亲和性。
86.如权利要求82所述的纯化的肽，包含选自以下的氨基酸序列W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO4)Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO5)Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO6)W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO7)W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO8)Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO9)Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO10)W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(SEQ ID NO11)F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO12)Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO13)W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO14)W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q(SEQ ID NO15)，和F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(SEQ ID NO16)。
87.如权利要求86所述的纯化的肽，所述肽还能够在非还原条件下形成二硫键。
88.如权利要求87所述的纯化的肽，所述肽含有二硫键。
89.如权利要求86所述的纯化的肽，所述肽对血纤蛋白有特异的结合亲和性。
90.如权利要求81所述的纯化的肽，其中P*是脯氨酸；Y*是酪氨酸；X1选自W、Y、F、S、Bip、Hx、Dpr、Cy、Gu、Ad、Hfe、3-Pal、4-Pal、DopaMe2、nTyr、dW、dF、F(3/4*)和Y(3*)，其中F3/4*是在3或4位被选自CH3、CF3、NH2、CH2NH2、CN、F、Cl、Br、I、Et和OMe的部分取代的苯丙氨酸，且其中Y3*是在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸；X2选自dE，H(Bzl)，2-Pal，Dpr和Th；X3选自G和D；X4选自H、F、Y和W；X5选自I、L、V、N、Bpa、Bal、Hfe、Nle、Tle、Nval、Phg、Cha、Taz、Fua、Th、4-Pal和F(3/4*)，其中F3/4*是在3或4位被选自CF3、Et、iPr和OMe的部分取代的苯丙氨酸，其中至少X1，X2或X5之一是非天然氨基酸衍生物；和X6选自N、Q、I、L和V或X6不存在。
91.如权利要求90所述的纯化的肽，所述肽还能够在非还原条件下形成二硫键。
92.如权利要求90所述的纯化的肽，所述肽包含二硫键。
93.如权利要求91所述的纯化的肽，所述肽对血纤蛋白有特异的结合亲和性。
94.一种化合物，所述化合物含有与溶血栓剂结合的如权利要求78所述的肽。
95.一种纯化的肽，所述肽含有氨基酸序列C-P*-Y*-X1-L-C(SEQ ID NO3)，其中X1是G或D，P*是脯氨酸或其非天然衍生物4-羟脯氨酸；Y*是酪氨酸或在3位被选自F、Cl、Br、I和NO2的部分取代的酪氨酸的非天然衍生物；和条件是，至少P*或Y*之一是各个氨基酸的非天然衍生物。
96.如权利要求95所述的纯化的肽，其特征在于，所述肽还能够在非还原条件下形成二硫键。
97.如权利要求95所述的纯化的肽，其特征在于，所述肽含有二硫键。
98.如权利要求96所述的纯化的肽，其特征在于，所述肽对血纤蛋白有特异的结合亲和性。
99.一种化合物，所述化合物含有与溶血栓剂结合的如权利要求95所述的肽。
100.一种纯化的肽，所述肽含有氨基酸序列C-D-Y-Y-G-T-C-X10(SEQ ID.NO17)，其中X10选自n(癸基)G、n(4-PhBu)G、MeL、Bpa、Bip、Me-Bip、F(4*)、F(3-Me)、F(3，4-二氟)、Amh、Hfe、Y(3，5-二-碘)、Pff、1Nal、d1Nal和MeL，其中F(4*)是在4位被选自Et、CF3、I和iPr的部分取代的苯丙氨酸。
101.一种纯化的肽，所述肽含有氨基酸序列C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(SEQ ID.NO18)，其中X11选自D、dD、βD、Inp、Nip、Me-D、dC、Cop和Cmp。
102.如权利要求101所述的纯化的肽，所述肽含有选自以下的氨基酸序列L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-dD(SEQ ID NO19)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(癸基)G-D(SEQ ID NO20)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D(SEQ ID NO21)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD(SEQ ID NO22)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Inp(SEQ ID NO23)L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp(SEQ ID NO24)，和L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D(SEQ ID NO25)。
103.如权利要求101或权利要求102所述的纯化的肽，所述肽还能够在非还原条件下形成二硫键。
104.如权利要求103所述的纯化的肽，所述肽含有二硫键。
105.如权利要求101所述的纯化的肽，所述肽对血纤蛋白有特异的结合亲和性。
106.一种化合物，所述化合物含有与溶血栓剂结合的如权利要求101所述的肽。
全文摘要
描述了肽和肽靶向的多聚体造影介质，以及制造和使用造影介质的方法。
文档编号C07K5/117GK1599577SQ02819255
公开日2005年3月23日 申请日期2002年7月30日 优先权日2001年7月30日
发明者Z·张, P·D·卡拉凡, T·J·麦克姆利, A·科罗德泽吉, S·纳尔, J·C·阿梅迪奥, S·杜马斯, X·王, W·－C·孙, A·L·尼弗罗斯金, S·K·科尼尔 申请人:埃匹克斯医疗股份有限公司