癌的诊断的制作方法

专利名称：癌的诊断的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及诸如癌症等恶性疾病，特别涉及诊断某些癌症、例如卵巢癌的方法和组合物。
背景技术：
癌症包括多种疾病，影响全世界约四分之一人口。癌症不利影响的严重性是深远的，一般影响医疗政策、程序及社会。许多类型癌症的特征在于恶性细胞快速而失调的增殖，因此需要早期检测及诊断是改进癌症解决方法的突出难题。为开发诊断恶性疾病存在的准确可靠的标准，已经进行了很多努力。很多努力特别针对使用血清学定义的抗原性标志，称为肿瘤相关抗原，它由癌细胞独特表达或以显著较高的水平存在于恶性疾病的受试者中。
然而，由于肿瘤相关抗原表达具有高度不均一性，例如癌抗原差异极大，需要用于癌症诊断的另外的肿瘤标志。已知许多单克隆抗体与癌相关抗原具有反应性(参见例如Papsidero，1985 Semin.Surg.Oncol.1171，Allum等人，1986 Surg.Ann.1841)。以上及其它所述单克隆抗体可结合各种不同的癌相关抗原，包括糖蛋白、糖脂和粘蛋白(mucin)(参见例如Fink等人，1984 Prog.Clin.Pathol.9121；美国专利4,737,579；美国专利4,753,894；美国专利4,579,827；美国专利4,713,352)。很多这类单克隆抗体识别受限表达于源自特定细胞系或组织类型的某些而非其它肿瘤的肿瘤相关抗原。
只有相对较少的肿瘤相关抗原的例子似乎可用于鉴定特定类型的恶性肿瘤。例如单克隆抗体B72.3特异性结合选择性表达于很多不同癌(包括若非全部也是多数的卵巢癌以及绝大多数非小细胞肺癌、结肠癌和乳腺癌)上的高分子量(＞106Da)肿瘤相关粘蛋白抗原(参见例如Johnston，1987 Acta Cytol.1537；美国4,612,282)。然而，对于优选在积聚大量肿瘤物质之前早期检测恶性疾病的诊断性筛选而言，手术切除肿瘤后检测细胞相关的肿瘤标志(例如由B72.3识别的粘蛋白抗原)可能用处有限。
通过筛选手术切除样本的肿瘤相关抗原来诊断特定类型癌症的替代方法，将提供用于检测通过非侵害性或最小侵害性方法所获受试者样品中这类抗原的组合物和方法，通常只在检测到积聚的肿瘤物质之后才需要侵害性手术。例如卵巢和其它癌症，目前在易于获得的生物学液体、例如血清或粘膜分泌物样品中可检测到很多可溶性肿瘤相关抗原。其中标志之一是癌相关抗原CA125，它脱落到血流中，可在血清中检测到(例如Bast等人，1983 N Eng.J.Med.309883；Lloyd等人，1997 Int.J Canc.71842)。已经测定了血清及其它生物学液体中的CA125水平连同其它标志的水平，例如癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、组织多肽特异性抗原(TPS)、唾液酸TN粘蛋白(sialylTN mucin，STN)以及胎盘碱性磷酸酶(PLAP)，以便提供卵巢和其它癌症的诊断性和/或预后性特征(例如Sarandakou等人，1997 Acta Oncol.36755；Sarandakou等人，1998 Eur.J.Gynaecol.Oncol.1973；Meier等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)2945；Kudoh等人，1999 Gynecol.Obstet.Invest.4752；Ind等人，1997 Br.J.Obstet.Gynaecol.1041024；Bell等人1998 Br..1 Obstet.Gynaecol.1051136；Cioffi等人，1997Tumori 83594；Meier等人1997 Anticanc.Res.17(4B)2949；Meier等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)3019)。
然而，血清CA125单独或连同其它已知标识物的水平升高，未提供恶性肿瘤、或特定恶性肿瘤(例如卵巢癌)的明确诊断。例如，阴道分泌液和血清中CA125、CEA和SCC升高，相对于宫颈癌和生殖道癌，与良性妇科疾病中的炎症高度相关(例如Moore等人，1998 Infect.Dis.Obstet.Gynecol.6182；Sarandakou等人，1997 Acta Oncol.36755)。另一个例子，血清CA125升高可能还伴有成神经细胞瘤(例如Hirokawa等人，1998 Surg.Today 28349)，而CEA和SCC等升高可能伴有结肠直肠癌(Gebauer等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)2939)。另一标志，分化抗原mesothelin表达于正常间皮细胞表面以及某些癌细胞、包括内皮卵巢肿瘤和间皮瘤。有关mesothelin的组合物和方法(Chang等人，1992 Canc.Res.52181；Chang等人，1992 Int.J.Canc.50373；Chang等人，1992 Int.j.Canc.51548；Chang等人，1996 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93136；Chowdhury等人，1998 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95669；Yamaguchi等人，1994 J.Biol.Chem.269805；Kojima等人，1995 J.Biol.Chem.27021984)以及结构相关的mesothelin相关抗原(MRA；参见例如Scholler等人，1999 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 9611531)为本领域已知，包括在癌症检测和治疗中的用途，如WO 00/50900和美国申请09/513,597所述。因此显然迫切需要使用另外的标志，包括用于多因子诊断性筛选的标志。(参见例如Sarandakou等人，1998；Kudoh等人，1999；Ind等人，1997.)如下文详述，这类另外的标志可能由“四-二硫键核心(four-disulfide core)”蛋白质家族有效提供，其包含具有不同功能的酸或热稳定性小分子，并包括人附睾四-二硫键核心蛋白质或″HE4″(Kirchhoff等人，1991 Biol.Reprod.45350-357；Wang等人，1999 Gene229101；Schummer等人，1999 Gene 238375)。据认为四-二硫键核心家族成员多肽氨基酸序列中的八个核心半胱氨酸残基的保守性间隔指导这些分子折叠为紧密而稳定的结构。许多四-二硫键核心家族成员是蛋白酶抑制剂；但尚未明确鉴定某些家族成员、包括HE4的功能。四-二硫键核心蛋白质家族的其它成员包括Wp蛋白质、SLP-1和ps20，已经从若干物种中分离了四-二硫键核心蛋白质家族的另外成员。这些蛋白质共享若干特性，包括尺寸小以及热及酸稳定性结构，这是由四-二硫键核心稳定。这些蛋白质由分泌细胞产生，发现于粘性分泌物中，例如精浆、乳汁、腮腺及宫颈分泌物。
已经克隆了四-二硫键核心家族的原型分子Wp蛋白质，也称为乳清磷蛋白(Dandekar等人，1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 793987-3991)。乳清磷蛋白在乳汁中表达，约1-2mg/ml，但在基因超甲基化的乳癌中不表达。未发现乳清磷蛋白对蛋白酶具有抑制活性。然而，该基因在转基因动物中过表达损害了乳房小泡细胞的发育(Burdon等人，1991 Mechanisms Dev.3667-74)，提示该蛋白质在沁乳期的重要作用。从人的子宫颈克隆了另一种四-二硫键核心家族蛋白质分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLP-1)，但它也存在于其它粘性分泌物中，包括精浆和腮腺分泌物(Heinzel等人，1986 Eur.J.Biochem.16061-67)。SLP-1是12kDa的两个结构域的蛋白质，是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶G潜在的抑制剂。已经公布了SLP-1复合胰凝乳蛋白酶的晶体结构(Grutter等人，1988 EMBO J.7345-351)。上述资料表明，SLP-1结构域可以独立并同时抑制不同的蛋白酶，在结构域2中鉴定了可结合胰凝乳蛋白酶的小的(8氨基酸)活性位点。
弹力素(elafin)是四-二硫键核心家族的单结构域蛋白质成员，分离自人牛皮癣皮肤，以确定该多肽的氨基酸序列(Wiedow等人，1990 J.Biol.Chem.26514791-14795)。弹力素是弹性蛋白酶的潜在抑制剂，但对其它蛋白酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G或纤溶酶不表现明显的抑制活性。弹力素的氨基酸序列显示与SLP-1C端区(结构域1)38％的同源性。最近从平滑肌中分离了编码ps20蛋白质的基因，将该基因转染哺乳动物细胞，表达了ps20蛋白质(Larsen等人，1998J.Biol.Chem.2734574-4584)。发现ps20抑制癌细胞生长，已经将其归类为生长抑制剂；但迄今未描述该蛋白质的直接功能活性(例如抑制蛋白酶)。
如上所述，虽然已从精浆中鉴定了其它小的酸和热稳定性蛋白酶抑制剂，认为其通过结合精子并调节精子与卵细胞外基质的相互作用而在生育中具有重要作用，但尚未鉴定最初从附睾上皮细胞中鉴定的HE4具有蛋白酶抑制活性(Fitz等人，Proteases and Biological Controls，Reich，E.，Rifkin，D.，Shaw，E.(eds.)，1975 Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.737-766；Saling，1989Oxf.Rev.Reprod.Biol.11339-388)。HE4 cDNA起初分离自人的附睾(Kirchhoff等人，1991 Biol.Reprod.45350-357)，后来在构建自卵巢癌的cDNA文库中检测到很高频率的HE4 cDNA(Wang等人，1999 Gene229101；Schummer等人，1999 Gene 238375)。
由于上述原因，显然需要改进的诊断标志和治疗靶标，用于检测和治疗恶性疾病，例如癌症。本发明的组合物和方法通过使用HE4和/或HE4相关抗原的特异性抗体检测以可溶性形式和/或在细胞表面天然存在的多肽，从而提供了筛选恶性疾病存在的方法，克服了现有技术的上述局限，并带来了其它相关益处。
发明概述本发明涉及用于筛选受试者中恶性疾病存在的组合物和方法。本发明特别涉及以下意外发现，即可以在受试者的生物样品中检测以可溶性形式天然存在并具有与HE4a多肽的至少一种特异性抗体反应的抗原决定蔟的可溶性及细胞表面形式的HE4多肽，此处称作HE4a或HE4a分子。
本发明一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足以检测抗体与抗原决定簇结合的条件和时间下，使受试者生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的抗体，以确定该生物样品中存在以可溶性形式天然存在于样品中的分子、或在样品包含至少一个受试者细胞的某些实施方案中以细胞表面分子存在的分子，该分子具有与至少一种抗体反应的抗原决定蔟，从而检测恶性疾病的存在。在某些实施方案中，该生物样品是血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊髓液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜液、心包膜液、腹膜液、腹液、培养基、条件培养基和灌洗液。
在某些其它实施方案中，该HE4a多肽包含具有SEQ ID NO5、7、9或11中任一项所示氨基酸序列的多肽、或其片段或衍生物。在另一实施方案中，该HE4a抗原多肽变体是剪接变体。在本发明某些实施方案中，抗体包含多克隆抗体，其它实施方案中的抗体包含亲和纯化的抗体。在特别优选的实施方案中，该抗体包含单克隆抗体。在另一实施方案中，该抗体包含重组抗体，另一实施方案中的抗体包含嵌合抗体。在另一实施方案中，该抗体包含人源化抗体。在另一实施方案中，该抗体包含单链抗体。
在本发明某些实施方案中，检测抗体结合抗原决定簇包含检测放射性核素。在其它实施方案中，检测抗体结合抗原决定簇包含检测荧光团。在另一实施方案中，检测抗体结合抗原决定簇包含检测亲和素分子与生物素分子之间的结合事件，另一实施方案中，检测抗体结合抗原决定簇包含检测链亲和素分子与生物素分子之间的结合事件。在某些实施方案中，检测抗体结合抗原决定簇包含分光光度法检测酶反应产物。在本发明某些实施方案中，至少一种抗体被可检测性标记，而在某些其它的实施方案中，至少一种抗体未被可检测性标记，对抗体结合抗原决定簇的检测是间接的。
根据本发明某些实施方案，恶性疾病可能是腺癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌或非小细胞肺癌。
本发明另一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足以检测抗体与抗原决定簇结合的条件和时间下，使受试者生物样品接触至少一种抗体，以确定该生物样品中存在选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于样品中的分子，以及(ii)样品包含受试者细胞时的细胞表面分子，该分子具有与至少一种抗体反应的抗原决定蔟，其抗原结合位点竞争性抑制单克隆抗体2H5、3D8或4H4的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。
本发明另一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足以检测抗体与抗原决定簇结合的条件和时间下，使受试者生物样品接触至少一种抗体，以确定该生物样品中存在选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于样品中的分子，以及(ii)样品包含受试者细胞时的细胞表面分子，该分子具有与抗体反应的抗原决定蔟，其抗原结合位点竞争性抑制单克隆抗体3D8的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。
本发明另一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足以检测至少一种抗体与抗原决定簇结合的条件和时间下(其中该至少一种抗体免疫特异性结合HE4a抗原)，使受试者生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的抗体，以确定该生物样品中存在选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于样品中的分子，以及(ii)样品包含受试者的细胞时的细胞表面分子，该分子具有与抗体反应的抗原决定蔟，从而检测恶性疾病的存在。在某些实施方案中，该HE4a抗原也与单克隆抗体3D8、2H5或4H4免疫特异性反应。
本发明另一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足以检测抗体与抗原决定簇结合的条件和时间下(其中该至少一种抗体免疫特异性结合HE4a抗原)，使受试者生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的抗体，以确定该生物样品中存在选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于样品中的分子，以及(ii)样品包含受试者细胞时的细胞表面分子，该分子具有与至少一种抗体反应的抗原决定蔟，其抗原结合位点竞争性抑制单克隆抗体2H5或4H4的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。在某些实施方案中，该mesothelin相关抗原也与单克隆抗体3D8免疫特异性反应。
本发明另一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足够使至少一种固定化的第一抗体与HE4a抗原多肽特异性结合、从而形成免疫复合物的条件和时间下，使受试者生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的固定化的第一抗体，以确定该生物样品中存在以可溶性形式天然存在于样品中的分子；去除未特异性结合至少一种固定化第一抗体的样品组分，在足以检测至少一种第二抗体与HE4a抗原多肽特异性结合的条件和时间下，使免疫复合物接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的至少一种第二抗体，其中至少一种第二抗体的抗原结合位点不竞争性抑制至少一种固定化第一抗体的抗原结合位点，从而检测恶性疾病的存在。
本发明另一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足够使至少一种固定化第一抗体与HE4a抗原多肽结合、从而形成免疫复合物的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的固定化的第一抗体，以确定所述生物样品中存在以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，其中至少一种第一抗体的抗原结合位点竞争性抑制单克隆抗体3D8的免疫特异性结合；去除未特异性结合至少一种固定化第一抗体的样品组分；在足以检测至少一种第二抗体与HE4a抗原多肽特异性结合的条件和时间下，使免疫复合物接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的第二抗体，其中所述至少一种第二抗体的抗原结合位点不竞争性抑制单克隆抗体2H5的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。
本发明另一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足够至少一种固定化第一抗体与HE4a抗原多肽结合、从而形成免疫复合物的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的固定化的第一抗体，以确定所述生物样品中存在以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，其中至少一种第一抗体的抗原结合位点竞争性抑制单克隆抗体3D8的免疫特异性结合；去除未特异性结合至少一种固定化第一抗体的样品组分；在足以检测至少一种第二抗体与mesothelin相关抗原多肽特异性结合的条件和时间下，使免疫复合物接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的第二抗体，其中所述至少一种第二抗体的抗原结合位点不竞争性抑制单克隆抗体4H4的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。
在某些实施方案中，本发明方法另外包含确定所述样品中存在恶性疾病的至少一种可溶性标志，其中该标志是mesothelin相关抗原、癌胚抗原、CA125、唾液酸TN、鳞状细胞癌抗原、组织多肽抗原或胎盘碱性磷酸酶。
本发明另一方面提供了筛选受试者中恶性疾病存在的方法，其包含在足以检测抗体与抗原决定簇结合的条件和时间下，使(i)怀疑具有恶性疾病的第一位受试者的第一份生物样品以及(ii)已知没有恶性疾病的第二位受试者的第二份生物样品各接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的抗体，以确定第一份和第二份生物样品每一份中存在一种分子，该分子选自(i)以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，(ii)第一份和第二份生物样品各分别包含来自第一位和第二位受试者的细胞时的细胞表面分子，该分子具有与至少一种抗体反应的抗原决定簇，并比较该抗体与第一份及第二份生物样品中抗原决定簇的可检测性结合水平，从而检测恶性疾病的存在。
另一方面，本发明提供了筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含检测受试者生物样品中存在免疫特异性结合HE4a抗原多肽的抗体。在某些实施方案中，该mesothelin相关抗原多肽包含具有SEQ IDNO5、7、11或13中任一项所示氨基酸序列的多肽。
本发明另一方面提供HE4a抗原多肽特异性的抗体，其包含特异性结合HE4a抗原多肽的单克隆免疫球蛋白可变区，该HE4a抗原多肽包含具有SEQ ID NO5、7、11或13中任一项所示氨基酸序列。在某些实施方案中，该抗体时融合蛋白质，而某些其它实施方案的抗体是单链抗体。在某些实施方案中，该HE4a抗原多肽另外包含糖基化多肽。在其它实施方案中，该抗体特异性结合SEQ ID NO11所示HE4a抗原多肽序列、但不特异性结合SEQ ID NO9所示多肽序列，或该抗体特异性结合SEQ ID NO11所示HE4a抗原多肽序列以及SEQ ID NO9所示多肽序列。在某些实施方案中，该抗体是单克隆抗体2H5、3D8或4H4。
在另一实施方案中，本发明提供了筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测HE4a多肽结合以可溶性形式天然存在于样品中的抗体的条件和时间下，使受试者的生物样品接触可检测性标记的HE4a多肽，从而检测恶性疾病的存在。
本发明另一方面提供了分离的核酸分子，该核酸分子是编码HE4a抗原多肽的核酸分子，该多肽包含SEQ ID NO5、7、11或13所示氨基酸序列；或该核酸分子是编码HE4a抗原多肽、或融合蛋白质、或能够在中度严谨性条件下与所述编码HE4a抗原的核酸分子杂交的核酸分子，其中该分离的核酸分子不是由SEQ ID NO9所示核酸序列组成的核酸分子。在某些实施方案中，本发明提供了反义寡核苷酸，其包含与编码HE4a抗原多肽的核酸分子互补的至少15个连续核苷酸。
在其它实施方案中，本发明提供了融合蛋白质，其包含与HE4a抗原多肽融合的多肽序列。在某些另外的实施方案中，该融合结构域是免疫球蛋白或其变体或片段。在某些另外的实施方案中，该融合HE4a抗原多肽的多肽序列可由蛋白酶切割的。在另一实施方案中，该多肽序列是具有配基亲和力的亲和标记多肽。
在其它实施方案中，本发明提供了重组表达构建体，其包含至少一种与上述编码HE4a抗原多肽的核酸分子可操作性连接的启动子。在某些实施方案中，该启动子是调节启动子，在某些其它实施方案中，该HE4a多肽被表达为与另一种核酸序列的多肽产物的融合蛋白质。在另一实施方案中，所述另一种核酸序列的多肽产物是免疫球蛋白恒定区。在另一实施方案中，该表达构建体是重组病毒性表达载体。根据其它实施方案，本发明提供了包含此处提供的重组表达构建体的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞是原核细胞，而另一实施方案的宿主细胞是真核细胞。
另一方面，本发明提供了通过培养包含重组表达构建体的宿主细胞而产生重组HE4a抗原多肽的方法，该构建体包含至少一种与此处提供的编码HE4a抗原多肽的核酸分子可操作连接的启动子。在某些实施方案中，该启动子是调节型启动子。在另一实施方案中，本发明提供了通过培养利用此处提供的用于表达重组HE4a抗原多肽的重组病毒表达构建体感染的宿主细胞产生重组HE4a抗原多肽的方法。
在另一实施方案中，本发明还提供了检测样品中HE4a表达的方法，其通过使上述反义寡核苷酸接触包含编码具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽的核酸序列、或其片段或变体的样品；并检测样品中一定量的可与该反义寡核苷酸杂交的HE4a多肽编码核酸，从而检测样品中HE4a的表达。在另一实施方案中，使用聚合酶链式反应来测定可与该反义寡核苷酸杂交的HE4a多肽编码核酸的量。在另一实施方案中，使用杂交分析来测定可与该反义寡核苷酸杂交的HE4a多肽编码核酸的量。在另一实施方案中，该样品包含RNA或cDNA制备物。
根据本发明的某些其它实施方案提供了治疗恶性疾病的方法，其包含给予有此需要的患者包含HE4a抗原多肽特异性抗体的组合物，该抗体包含特异性结合具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a抗原多肽的单克隆免疫球蛋白可变区。在另一实施方案中，本发明提供了治疗恶性疾病的方法，其包含给予有此需要的患者包含具有SEQID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的组合物。在某些另外的实施方案中，该组合物诱导患者产生能够特异性结合具有SEQID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的抗体，在某些其它另外的实施方案中，该组合物诱导患者能够特异性识别具有SEQ IDNO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的T淋巴细胞。根据某些其它的实施方案提供了改变(例如以统计学显著的方式相对于合适的对照提高或降低)受孕、避孕和/或生育的组合物和方法，其包含给予HE4a多肽或其片段或变体(包括融合蛋白质)、或给予包含可特异性结合HE4a多肽、或其片段或变体的免疫球蛋白可变区的组合物。
参照以下发明详述及附图，本发明上述及其它方面将更为显而易见。此外，此处所示各种参考文献详述了本发明的某些方面，因而全文引入以供参考。
附图简述

图1显示实时PCR检测一系列人样品中的HE4a编码cDNA。
图2显示所表达的HE4a融合蛋白质的western印迹分析。
图3描述利用ELISA检测两只免疫小鼠(1605和1734)血清中与HE4a-mIg融合蛋白质反应的抗体。
图4描述使用ELISA筛选杂交瘤上清并检测HE4a特异性杂交瘤抗体的典型结果。
图5显示使用固定化HE4a特异性单克隆抗体3D8作为捕获剂、生物素化HE4a特异性单克隆抗体2H5作为检测剂，通过双测定子夹心ELISA检测HE4a-hIgG融合蛋白质。还显示检测卵巢癌细胞系4007上清液中的可溶性HE4a(A)。
图6显示利用夹心ELISA检测系列稀释的卵巢癌患者腹水中的HE4a抗原。
发明详述本发明部分涉及有关此处所述″四-二硫键核心″蛋白质家族新成员HE4a的发现，它显示高度类似但不同于HE4的序列(Kirchhoff等人，1991 Biol.Reproduct.45350-357)。如此处所述，极其意外地显示HE4a(而非HE4)在某些恶性肿瘤、例如卵巢癌以及许多其它人组织中过表达，与HE4在人附睾上皮细胞中的有限表达模式明显相反(Kirchhoff等人，1991)。本发明还部分涉及此处所述组合物和方法所获得的惊人益处，其提供了检测受试者中天然存在的细胞表面和/或可溶性形式的某些基因产物(此处即指HE4a多肽)，包括在具有某些癌症(例如卵巢癌)的受试者中水平升高的所述多肽。本发明因而提供了有用的组合物和方法，通过特异性检测该细胞表面和/或可溶性HE4a多肽来检测和诊断受试者的恶性疾病。
如下文详述，本发明的某些实施方案涉及HE4a多肽，其包括可溶性和细胞表面形式的HE4a和HE4多肽，包括HE4和HE4a多肽抗原和融合蛋白质。在某些其它的实施方案中，本发明涉及HE4a多肽的片段、衍生物和/或类似物。简言之，根据本发明的某些实施方案提供了通过使受试者的生物样品接触人HE4a多肽特异性抗体来筛选受试者中存在恶性疾病的方法。此处公开了HE4a多肽和HE4a-Ig融合蛋白质的完整氨基酸及核酸编码序列，包括意外观察到来源于卵巢癌cDNA的核酸分子编码具有不同于Kirchhoff等人(1991)所述HE4序列的表达产物，更意外观察到虽然Kirchhoff等人所述HE4表达局限于附睾上皮细胞，但很容易在卵巢癌中检测到本公开的HE4a表达。
如此处所述，提供了特异性识别HE4多肽的单克隆抗体，使本领域一般技术人员使用本说明教导连同本领域公知的方法，可能按常规无需过多实验来免疫宿主并筛选HE4a多肽特异性抗体产生。例如，此处描述了构建重组HE4a表达载体和宿主细胞、包括重组HE4a融合蛋白质，并提供了HE4a特异性抗体。
根据此处所述HE4a多肽的物理化学及免疫化学特性并使用本公开的HE4a编码核酸序列，本领域一般技术人员也可能制备重组HE4a多肽，可用于按照公知方法产生及表征特异性抗体。HE4a多肽可以在合适启动子的控制下于哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。也可以使用来源于此处所述HE4a多肽DNA编码区的RNA，利用无细胞翻译系统产生所述蛋白质。用于原核和真核宿主的合适克隆及表达载体由Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY，(1989)所述。在本发明优选实施方案中，在哺乳动物细胞中表达HE4a多肽。
本发明的核酸可能是RNA或DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA。DNA可能是双链或单链，若为单链，则可能是编码链或非编码(反义)链。本发明所用编码HE4a多肽的编码序列可能与SEQ ID NO3、4、6、10或12所示编码序列一致，或者可能是由于遗传密码的丰余性或简并性而产生的不同的编码序列编码与例如SEQ ID NO10和12的cDNA相同的HE4a多肽。本发明因而提供编码具有SEQ ID NO5、7、11或13氨基酸序列的HE4a抗原多肽的分离的核酸分子、或能够与该HE4a多肽编码核酸杂交的核酸分子、或具有与其互补的序列的核酸分子。
变体显示与编码天然He4a抗原多肽或其部分的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO10和12所示核酸序列)优选至少约70％一致性、更优选至少约80-85％一致性、最优选至少约90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。使用本领域一般技术人员公知的计算机算法、例如可在NCBI网站(http//www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)获得的Align或BLAST算法(Altschul，J.Mol.Biol.219555-565，1991；Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919，1992)进行序列比较，很容易测定一致性百分比。可使用缺省参数。
某些变体与天然基因基本同源。在中度严谨性条件下，这类多核苷酸变体能够与天然存在的编码天然HE4a抗原的DNA或RNA序列(或其互补序列)杂交。合适的中度严谨性条件包括，例如以下步骤或其等效步骤在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液中预洗；在50℃-65℃、5X SSC中杂交过夜；然后在包含0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC中65℃、20分钟各洗涤两次。另外的严谨性条件可能包括，例如在0.1X SSC和0.1％SDS中60℃洗涤15分钟或等效条件。本领域一般技术人员容易理解，可能按常规方式改变参数，以产生按某种方式选择特定目的核酸的适当严谨性杂交条件，另当进一步理解所述条件可能特别随杂交中涉及的特定核酸序列而定，例如此处公开的编码He4a多肽的SEQ ID NO10和12序列。另见，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing，1995，有关核酸杂交条件选择。
编码HE4a多肽，例如具有SEQ ID NO11氨基酸序列的人HE4a多肽、或本发明所用任何其它的HE4a多肽的核酸可能包括但不限于仅仅HE4a多肽的编码序列；HE4a多肽编码序列及另外的编码序列；HE4a多肽编码序列(并可选另外的编码序列)及非编码序列，诸如内含子或HE4a多肽编码序列的5′和/或3′非编码序列，例如可能另外包括但不必限于一种或多种调节性核酸序列，可能是受调节或可调节的启动子、增强子、其它转录调节序列、抑制子结合序列、翻译调节序列或任何其它调节性核酸序列。因此，术语″HE4a多肽的编码核酸″涵盖只包括该多肽编码序列的核酸以及包括另外的编码和/或非编码序列的核酸。
本发明另外涉及此处所述核酸的变体，其编码HE4a多肽的片段、类似物和衍生物，例如具有SEQ ID NO11推断的氨基酸序列的人HE4a多肽。编码HE4a的核酸的变体可能是该核酸天然存在的等位变体或非天然存在的变体。如本领域所知，等位变体是可能具有至少一个替换、缺失或添加一个或多个核苷酸的另一种形式的核酸序列，其中任何一种均基本不改变所编码的HE4a多肽的功能。因此，例如本发明包括编码SEQ ID NO5、7或11所示相同HE4a多肽的核酸以及所述核酸的变体，这些变体可能编码其中任何多肽的片段、衍生物或类似物。
通过HE4a多肽编码核酸序列的突变可能获得HE4a的变体和衍生物。利用多种常规方法之一，可能进行天然氨基酸序列的改变。通过合成包含突变序列的寡核苷酸，并侧接限制性位点以便连接天然序列片段，可以在特定位点引入突变。连接后得到的重构序列编码具有所需氨基酸插入、替换或缺失的类似物。
或者，可以利用寡核苷酸指导的位点特异性突变方法提供改变的基因，其中可以通过替换、缺失或插入而改变预订的密码子。进行此类改变的典型方法公开于Walder等人(Gene 42133，1986)；Bauer等人(Gene 3773，1985)；Craik(Bio Techniques，January 1985，12-19)；Smith等人(Genetic EngineeringPrinciples and Methods，PlenumPress，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488，1985)；Kunkel等人(Methods in Enzymol.154367，1987)；以及美国专利4,518,584和4,737,462。
鉴定用作反义物质的核酸分子、包括HE4a多肽或其变体或片段的编码核酸序列特异性的反义寡核苷酸和核酶；以及鉴定编码供基因治疗靶向转移的HE4a基因的DNA寡核苷酸，均涉及本领域公知的方法。例如，众所周知该寡核苷酸所需的特性、长度及其它特征。在某些优选实施方案中，这种反义寡核苷酸包含至少15-30个与此处提供的编码HE4a多肽的分离的核酸分子互补的连续核苷酸，在某些其它的实施方案中，这种反义寡核苷酸可能包含至少31-50、51-75、76-125或更多的与此处提供的编码HE4a多肽的分离的核酸分子互补的连续核苷酸。一般使用以下连接将反义寡核苷酸设计成抗内源性溶核酶降解硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、砜(sulfone)、硫酸酯(sulfate)、ketyl，二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯及其它这类连接(参见例如Agrwal等人，Tetrehedron Lett.283539-3542(1987)；Miller等人，J Am.Chem.Soc.936657-6665(1971)；Stec等人，Tetrehedron Lett.262191-2194(1985)；Moody等人，Nucl.Acids Res.124769-4782(1989)；Uznanski等人，Nucl.Acids Res.(1989)；Letsinger等人，Tetrahedron 40137-143(1984)；Eckstein，Annu.Rev.Biochem.54367-402(1985)；Eckstein，Trends Biol.Sci.1497-100(1989)；SteinInOligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of Gene Expression，Cohen，Ed，Macmillan Press，London，pp.97-117(1989)；Jager等人，Biochemistry 277237-7246(1988))。
反义核苷酸是以序列特异性方式结合核酸、例如mRNA或DNA的寡核苷酸。结合具有互补序列的mRNA时，反义序列阻止mRNA翻译(参见例如Altman等人美国专利5,168,053；Inouye的美国专利5,190,931、Burch的美国专利5,135,917；Smith的美国专利5,087,617以及Clusel等人(1993)Nucl.Acids Res.213405-3411，描述了哑铃反义寡核苷酸)。三链分子是指单链DNA分子结合双链DNA而形成共线性三链分子，从而阻止转录(参见例如Hogan等人的美国专利5,176,996，其中描述了可结合双链DNA靶位点的合成寡核苷酸的制备方法)。
根据本发明的这个实施方案，特别有用的反义核苷酸和三链分子是互补或结合可编码HE4a多肽的DNA有义链或mRNA的分子，从而抑制编码HE4a多肽的mRNA翻译。
核酶是特异性切割RNA底物例如mRNA、导致特异性抑制或干扰细胞基因表达的RNA分子。存在至少五类已知与RNA链切割和/或连接有关的核酶。核酶可以靶向到任何RNA转录本并催化切割该转录本(参见例如美国专利5,272,262；美国专利5,144,019；以及Cech等人的美国专利5,168,053、5,180,818、5,116,742和5,093,246)。根据本发明的某些实施方案，可将任何此类HE4a mRNA特异性核酶或编码这类核酶的核酸转移到宿主细胞，以实行抑制HE4a基因表达。可能因而通过与真核启动子、例如真核病毒性启动子连接的编码核酶的DNA，将核酶等转移到宿主细胞，以便在引入细胞核后直接转录核酶。
本发明也包括编码各种添加或替换氨基酸残基或序列、或缺失生物学活性非必需的末端或内部残基或序列的等效DNA构建体。例如，可以改变编码生物学活性非必需的Cys残基的序列，使Cys残基缺失或替换为其它氨基酸，防止复性时形成错误的分子内二硫键。通过修饰邻近的二碱性氨基酸残基，可以制备其它等效物，以增强在具有KEX2蛋白酶活性的酵母系统中的表达。EP 212,914公开了使用位点特异性突变来失活蛋白质中的KEX2蛋白酶加工位点。通过缺失、添加或替换残基来改变Arg-Arg、Arg-Lys和Lys-Arg对，去除存在的这些邻近碱性残基，可以失活KEX2蛋白酶加工位点。据认为Lys-Lys配对对于KEX2切割相当不敏感，将Arg-Lys或Lys-Arg转变为Lys-Lys是失活KEX2位点的保守而又优选的方法。
利用各种方法可将合适的DNA序列插入多种公知的适于所选宿主细胞的任一载体。一般利用本领域已知的方法将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。用于克隆、DNA分离、扩增及纯化的标准技术、涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶学反应以及各种分离技术，是本领域技术人员已知并常用的技术。例如Ausubel等人(1993 Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook等人(1989Molecular Cloning，Second Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)等描述了许多标准技术。
哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman，Cell 23175(1981)所述猴肾成纤维细胞COS-7系以及能够表达相容性载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体应包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酰化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列以及5’侧翼非转录序列。来自例如SV40剪接和聚腺苷酰化位点的DNA序列可能用于提供所需的非转录性遗传元件。可以通过本领域技术人员熟悉的各种方法，包括但不限于例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔(Davis等人，1986 Basic Methods in Molecular Biology)，将构建体引入宿主细胞。
本发明另外涉及HE4a多肽，特别涉及检测恶性疾病的方法。在一个优选实施方案中，通过确定生物样品中存在一种天然存在的可溶性分子、或包含细胞的样品中存在一种细胞表面分子，其具有与至少一种HE4a多肽特异性的抗体反应的抗原决定簇，从而检测恶性肿瘤。在另一优选实施方案中，通过确定生物样品中存在至少一种天然存在的HE4a多肽来检测恶性肿瘤。此处提供的″HE4a抗原多肽″或″HE4a多肽″包括具有SEQ ID NO11氨基酸序列的任何多肽，包括其任何片段、衍生物或类似物，也包括由包含SEQ ID NO10或12的核酸分子、或能够与SEQ ID NO10或12的核酸分子杂交的核酸分子、或其片段、衍生物或类似物编码的任何多肽。本发明的某些优选实施方案包括针对此处提供的HE4a序列(例如SEQ ID NO10-13)的组合物和方法，但根据结构、功能和/或细胞类型表达或组织分布等(包括抗体确定的可检测表位，也包括寡核苷酸确定的杂交检测)，显然不包括Kirchoff等人(例如1991 Biol.Reproduct.45350；SEQ ID NOS8-9)公开的HE4序列。
本发明的HE4a多肽可能是未修饰多肽，或可能是经翻译后修饰的多肽，例如糖基化、磷酸化、脂肪酰化包括糖基磷脂酰肌醇锚定修饰等、磷脂酶切割例如磷脂酰肌醇特异性磷脂酶c介导的水解等、蛋白酶切割、去磷酸化或任何其它类型的蛋白质翻译后修饰，例如涉及共价化学键形成或断裂的修饰。
论及HE4a多肽、HE4a抗原多肽或HE4a融合蛋白质时，术语″片段″、″衍生物″和″类似物″是指基本保持与该多肽相同的生物学功能和/或活性的任何HE4a多肽。因此，类似物可能包括HE4a抗原多肽同工型，例如不同翻译后修饰的HE4a多肽或变体，如剪接变体。如本领域公知，″剪接变体″包括来自于RNA转录本不同细胞内加工的变体或其它形式的多肽。例如，如果两种不同的mRNA种类的差别仅在于，其中一种mRNA包含特定外显子对应的全部或部分序列，而其它种类没有，则其互为剪接变体。熟悉本领域的人员应当理解，在一般认为是剪接变体的mRNA种类之间可以存在其它结构关系。HE4a多肽另外包括蛋白原，可通过切割蛋白原部分而活化，产生活性HE4a多肽。
HE4a多肽或HE4a抗原多肽的片段、衍生物或类似物的生物学功能和/或活性包括但不必限于该多肽在此处公开的筛选受试者中存在恶性疾病的方法中作为标志的用途。例如，通过检测受试者样品中以可溶性形式天然存在并具有与至少一种HE4a多肽特异性的抗体反应的抗原决定簇的分子，本领域技术人员可能监测HE4a多肽的生物学功能和/或活性。另外应当注意到，在某些实施方案中，本发明筛选方法涉及比较(i)怀疑具有恶性疾病的第一位受试者的第一份生物样品以及(ii)已知没有恶性疾病的另一位受试者的另一份生物样品中以可溶性形式天然存在并具有与至少一种HE4a多肽特异性的抗体反应的抗原决定簇的可检测分子的相对数量、水平和/或数量。因此，在生物样品中存在相对数量的HE4a可能是HE4a多肽的生物学功能和/或活性，尽管这种生物学功能和/或活性不应当如此局限。
HE4a多肽的片段、衍生物或类似物可能是(i)其中一个或多个氨基酸残基由保守性或非保守性氨基酸残基替换(优选保守性氨基酸残基)；(ii)其中另外的氨基酸与HE4a多肽融合，包括可能用于纯化HE4a多肽或蛋白原序列的另外氨基酸；或(iii)截短的HE4a多肽。相信这类片段、衍生物和类似物位于本领域技术人员根据此处教导的范围之内。
截短的HE4a多肽可能是包含短于全长形式HE4a多肽的HE4a多肽分子。本发明提供的截短的分子可能包括截短的生物多聚物，在本发明优选实施方案中，该截短的分子可能是截短的核酸分子或截短的多肽。截短的核酸分子短于已知或所述核酸分子的全长核苷酸序列，其中该已知或所述核酸分子可能是天然存在、合成或重组的核酸分子，只要本领域技术人员认为它是全长分子即可。因此，例如对应于基因序列的截短的核酸分子包含短于全长的基因，其中该全长基因包含编码和非编码序列、启动子、增强子和其它调节序列、侧翼序列等、以及被认为是基因部分的其它功能性和非功能性序列。在另一例子中，对应于mRNA序列的截短的核酸分子包含短于全长的mRNA转录本(其可能包括各种翻译和非翻译区以及其它功能性和非功能性序列)。在其它优选实施方案中，截短的分子是包含短于特定蛋白质全长氨基酸序列的多肽。
此处所用″缺失″具有熟悉本领域人员所理解的常用含义，可能是指相对于对应的全长分子而言、缺少来自末端或非末端区的一个或多个序列部分的分子，例如此处提供的截短的分子。作为线性生物多聚物例如核酸分子或多肽的截短的分子可能具有来自分子末端或非末端区的一个或多个缺失，这种缺失可能是缺失1-1500个连续核苷酸或氨基酸残基、优选1-500个连续核苷酸或氨基酸残基、更优选1-300个连续核苷酸或氨基酸残基。
如本领域已知，通过将该多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸替换与另一种多肽的序列作比较，来确定两种多肽之间的”相似性”。使用本领域一般技术人员公知的计算机算法、例如可在NCBI网站(http//www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-binBLAST)获得的BLAST算法(Altschul，J.Mol.Biol.219555-565，1991；Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919，1992)进行序列比较，很容易确定两种多肽或核酸序列之间的相似性、或甚而一致性百分比。可能使用缺省参数。其它有用的计算机算法的例子有Align和FASTA，例如可以在Institut de Genetique Humaine，Montpellier，France的Genestream互联网站点(www2.igh.cnrs.fr/home.eng.html)获得并使用缺省参数。本发明多肽的片段或部分可能用于通过肽的合成产生相应的全长多肽；因此，片段可能用作产生全长多肽的中间物。
术语”分离的”是指从其原始环境(例如，如果其是天然存在的，则指自然环境)中取出该物质。例如，存在于活动物中的天然存在的多肽或多核苷酸不是分离的，与自然系统中某些或全部共存物质分开的相同的多肽或多核苷酸则是分离的。这种多肽或多核苷酸可能是组合物的一部分，由于该组合物不是其自然环境的一部分，因而仍是分离的。
亲和技术可特别用于分离供本发明方法使用的HE4a多肽，并可能包括利用与HE4a多肽特异性结合的相互作用而进行分离的任何方法。例如，由于HE4a多肽可能包含共价结合的寡糖成分(参见例如实施例中所述图2)，亲和技术，例如在可使凝集素结合糖的条件下使HE4a多肽结合合适的固定化凝集素，可能是特别有用的亲和技术。其它有用的亲和技术包括分离HE4a多肽的免疫学技术，该技术有赖于抗原的抗体结合位点与复合物中存在的抗原决定簇之间的特异性结合相互作用。免疫学技术包括但不必限于免疫亲和层析、免疫沉淀、固相免疫吸附或其它免疫亲和方法。上述及其它有用的亲和技术参见例如Scopes，R.K.，Protein PurificationPrinciples and Practice，1987，Springer-Verlag，NY；Weir，D.M.，Handbook of ExperimentalImmunology，1986，Blackwell Scientific，Boston；以及Hermanson，G.T.等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques，1992，AcademicPress，Inc.，California；有关分离及鉴定复合物的细节、包括亲和技术，此处全文引入以供参考。
如此处所述，本发明提供了包含融合于HE4a的多肽的融合蛋白质。这种HE4a融合蛋白质由具有在框架内融合另外编码序列的HE4a编码序列的核酸编码，以提供与另外功能性或非功能性多肽序列融合的HE4a多肽序列的表达，例如(说明而非限制)，可以检测、分离和/或纯化HE4a融合蛋白质。这种HE4a融合蛋白质使得可以通过基于蛋白质-蛋白质亲和力、金属亲和力或电荷亲和力的多肽纯化、或通过特异性蛋白酶切割包含融合序列(可由蛋白酶切割的、以便从融合蛋白质中分离HE4a多肽)的融合蛋白质，从而检测、分离和/或纯化HE4a融合蛋白质。
因而HE4a融合蛋白质可能包含亲和标记的多肽序列，即加入HE4a的多肽或肽，以便于通过与配基的特异性亲和相互作用来检测和分离HE4a。配基可能是任何分子、受体、反受体(counterrecepter)、抗体等，亲和标记可能通过此处提供的特异性结合相互作用与其相互作用。这种肽包括例如多聚His或美国专利5,011,912以及Hopp等人(1988 Bio/Technology 61204)所述抗原性鉴定肽、或XPRESSTM表位标记(Invitrogen，Carlsbad，CA)。例如在细菌宿主的情况下，该亲和序列可能是由pBAD/His(Invitrogen)或pQE-9载体提供的6组氨酸标记，以便提供纯化融合该标志的成熟多肽，或者例如使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，该亲和序列可能是血凝素(hemagglutinin，HA)标记。HA标记对应于来自流感血凝素蛋白质的抗体确定的表位(Wilson等人，1984 Cell 37767)。
在特别优选的实施方案中并如下文详述，HE4a融合蛋白质可能另外包含加入HE4a的免疫球蛋白恒定区多肽，以便于检测、分离和/或定位HE4a。该免疫球蛋白恒定区多肽优选与HE4a多肽C端融合。根据非限制性理论，在此处提供的HE4a融合蛋白质中包含免疫球蛋白(Ig)恒定区结构域可能具有益处，例如用于特定宿主时(即“自身”较之“非自身”)与特定Ig区的免疫原性或非免疫原性特性有关的益处，或便于分离和/或检测融合蛋白质的益处。熟悉本领域的人员根据本公开内容，应当理解Ig融合蛋白质的上述及其它益处。例如Ashkenazi等人(PNAS USA 8810535，1991)和Byrn等人(Nature 344677，1990)描述了融合蛋白质的一般制备，其中包含与各种抗体来源的多肽部分(包括Fc结构域)融合的异源多肽。将编码HE4aFc融合蛋白质的基因融合物插入合适的表达载体。在本发明的某些实施方案中，可使HE4aFc融合蛋白质组装成更象抗体分子，在Fc多肽之间形成链间二硫键，产生二聚体HE4a融合蛋白质。
由于包含免疫球蛋白V区结构域(由框架内连接HE4a编码序列的DNA序列编码)的融合多肽而具有预选抗原特异性结合亲和力的HE4a融合蛋白质也位于本发明范围之内，包括此处提供的其变体和片段。例如，EP 0318554、U.S.5,132,405、U.S.5,091,513和U.S.5,476,786公开了具有免疫球蛋白V区融合多肽的融合蛋白质的一般构建策略。
本发明的核酸也可能编码融合蛋白质，该融合蛋白质包含与具有所需亲和特性、例如酶(如谷胱甘肽S转移酶)的其它多肽融合的HE4a多肽。另一例子，HE4a融合蛋白质也可能包含与金黄葡萄状球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A多肽融合的HE4a多肽；例如美国专利5,100,788一般公开了蛋白A编码核酸及其在构建具有免疫球蛋白恒定区亲和力的融合蛋白质中的用途。用于构建HE4a融合蛋白质的其它有用的亲和多肽可能包括例如WO 89/03422、U.S.5,489,528、U.S.5,672,691、WO 93/24631、U.S.5,168,049、U.S.5,272,254等公开的链亲和素融合蛋白质以及亲和素融合蛋白质(参见例如EP 511,747)。如此处及引用的参考文献所提供，HE4a多肽序列可能与融合多肽序列融合，该融合多肽可能是全长的融合多肽、或可能是其变体或片段。
本发明也包括包含多肽序列的HE4a融合蛋白质，该多肽序列指引融合蛋白质到达细胞核、位于内质网(endoplasmic reticulum，ER)腔、通过经典的ER-高尔基体途径从细胞中分泌(参见例如von Heijne，J.Membrane Biol.115195-201，1990)、掺入质膜、结合特定细胞浆成分包括跨膜细胞表面受体的胞浆结构域、或通过本领域技术人员熟悉的任何各种已知的细胞内蛋白质分选机制导向到特定的亚细胞部位(例如参见Rothman，Nature 37255-63，1994，Adrani等人，1998 J Biol.Chem.27310317以及此处引用的参考文献)。因此，涉及靶向目的多肽到达预定的细胞内、膜或细胞外定位的此处组合物及方法包括以上及相关实施方案。
本发明也涉及包括本发明核酸的载体和构建体，特别涉及包括上文提供的编码本发明HE4a多肽的任何核酸的“重组表达构建体”；涉及利用本发明载体和/或构建体遗传改造的宿主细胞，并涉及利用重组技术产生本发明HE4a多肽和融合蛋白质、或其片段或变体。HE4a蛋白质可以在合适启动子控制下表达于哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞。也可以使用来自本发明DNA构建体的RNA，利用无细胞翻译系统产生这类蛋白质。例如，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，New York，(1989)描述了用于原核和真核宿主的合适的克隆和表达载体。
重组表达载体一般应包括复制起点以及允许转化宿主细胞的选择标志、例如大肠杆菌(E.coli)氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因，以及来自高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。该启动子可来自编码糖水解酶如3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase，PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子。按翻译起始和终止序列的合适相位组装异源结构序列。可选地，异源序列可编码包括可带来所需特征(例如稳定或简化所表达重组产物的纯化)的N端鉴定肽的融合蛋白质。
在表达载体中插入编码目的蛋白质的结构性DNA序列连同位于功能性启动子有效阅读相位的合适的翻译起始和终止信号，构建供细菌使用的有用的表达构建体。构建体可能包含一种或多种表型选择标志及复制起点，以确保在宿主内维持该载体构建体，如若需要则提供扩增。供转化的合适原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞杆菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的多个品种，尽管也可能利用其它宿主以供选择。只要可在宿主中复制并存活，便可能使用任何其它质粒或载体。
作为典型但非限制性的例子，供细菌使用的有用的表达载体包含可选择性标志以及细菌复制起点，来自于包含公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件的可商品化获得的质粒。这种商品化载体包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)以及GEM1(Promega Biotec，Madison，Wisconsin，USA)。这些pBR322″主链″部分与合适启动子以及待表达的结构性序列相连。
转化合适的宿主株、宿主株生长到适当细胞密度后，如果所选启动子是此处提供的调节型启动子，则利用适当方法诱导(例如变温或化学诱导)，再培养细胞一段时间。细胞一般通过离心收集、利用物理或化学方法破坏，保留所得粗提物供进一步纯化。可以通过任何常规方法、包括冻融循环、超声、机械破碎或使用细胞裂解剂，破坏用于蛋白质表达的微生物细胞；所述方法为本领域技术人员所公知。
因此，例如此处提供的本发明核酸可能包括于多种表达载体构建体的任一种中，用作表达HE4a多肽重组表达构建体。这类载体及构建体包括染色体、非染色体以及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌型质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；来源于质粒和噬菌体DNA、病毒DNA组合的载体，例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病。然而，任何其它载体，只要可在宿主中复制并存活，均可能用来制备重组表达构建体。
可能通过多种方法将合适的DNA序列插入载体。一般利用本领域已知的方法将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。用于克隆、DNA分离、扩增及纯化的标准技术、涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶学反应以及各种分离技术，是本领域技术人员已知并常用的技术。例如Ausubel等人(1993 Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook等人(1989 Molecular Cloning，SecondEd.，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)；Maniatis等人(1982 Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)等描述了许多标准技术。
表达载体中的DNA序列有效连接至少一种合适的表达控制序列(例如启动子或调节型启动子)，以指导mRNA合成。这种表达控制序列的典型例子包括LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λPL启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒表达的其它启动子。可以使用CAT(chloramphenicol transferase，氯霉素转移酶)载体或带有可选择性标志的其它载体，从任何目的基因中选择启动子区。两种合适的载体为pKK232-8和pCM7。特别命名的细菌性启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子你包括CMV即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒LTR以及小鼠金属硫蛋白-I。本领域一般技术人员易于选择合适的载体和启动子，此处描述了制备某些特别优选的重组表达构建体，其中包含至少一个可操作连接HE4a多肽的编码核酸的启动子或调节型启动子。
如上所述，在某些实施方案中，该载体可能是病毒性载体，例如逆转录病毒载体。例如，可能从中得到逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma)、Harvey肉瘤病毒、禽类白细胞增生病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。
病毒性载体包括一种或多种启动子。可能利用的合适启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；以及Miller等人，Biotechniques 7980-990(1989)所述人巨细胞病毒(CMV)启动子，或任何其它启动子(例如，细胞启动子诸如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。可能使用的其它病毒性启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。合适启动子的选择对于根据此处教导的本领域技术人员而言显而易见，并可能选自调节型启动子或上述启动子。
利用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系，形成生产细胞系。可能转染的包装细胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2以及Miller，Human Gene Therapy，15-14(1990)所述DAN细胞系，在此全文引入以供参考。载体可能通过本领域已知的任何方法转导包装细胞。所述方法包括但不限于电穿孔、使用脂质体以及磷酸钙沉淀。在一个可选方案中，可能将逆转录病毒质粒载体包入脂质体微囊、或偶联到脂质，然后给予宿主。
生成细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，其中包括编码HE4a多肽或融合蛋白质的核酸序列。然后利用这种逆转录病毒载体颗粒体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码HE4a多肽或融合蛋白质的核酸序列。可能被转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞、支气管上皮细胞和各种其它适于培养的细胞系。
本发明使用病毒性载体制备重组HE4a表达构建体的实施方案的另一例子是，在一个优选实施方案中，利用指导HE4a多肽或融合蛋白质表达的重组病毒性构建体转导的宿主细胞，可能产生包含所表达的HE4a多肽或融合蛋白质的病毒颗粒，该HE4a多肽或融合蛋白质来自病毒出芽其间掺入病毒颗粒的宿主细胞膜部分。在另一优选实施方案中，将HE4a编码核酸序列克隆到杆状病毒穿梭载体，该载体然后与杆状病毒重组，产生用于感染例如Sf9宿主细胞的杆状病毒表达构建体，如Baculovirus Expression Protocols，Methods in MolecularBiology Vol.39，C.D.Richardson，Editor，Human Press，Totowa，NJ，1995；Piwnica-Worms，″Expression of Proteins in Insect Cells UsingBaculoviral Vectors，″Section II in Chapter 16 inShort Protocols inMolecular Biology，2nd Ed.，Ausubel等人，eds.，John Wiley & Sons，New York，New York，1992，pages 16-32至16-48所述。
另一方面，本发明涉及包含上述重组HE4a表达构建体的宿主细胞。利用本发明的载体和/或表达构建体(例如可能是克隆载体、穿梭载体或表达构建体)遗传改造(转导、转化或转染)宿主细胞。例如，该载体或构建体可能是质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。改造的宿主细胞可以在已改变为适于活化启动子、选择转化子或扩增特定基因(例如编码HE4a多肽或HE4a融合蛋白质的基因)的常规营养培养基中培养。选择用来表达的特定宿主细胞的培养条件、例如温度、pH等，对于一般熟练技术人员显而易见。
宿主细胞可以是高等真核细胞例如哺乳动物细胞、或低等真核细胞例如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞例如细菌细胞。本发明合适的宿主细胞的典型例子包括但不必限于细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞，例如果蝇S2(Drosophila S2)和夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)；动物细胞，例如CHO、COS或293细胞；腺病毒；植物细胞，或任何已经适于体外增殖或为此重新建立的合适细胞。相信合适宿主的选择属于本领域技术人员根据此处教导的范围之内。
也可以利用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白质。本发明因而部分涉及通过培养包含重组表达构建体的宿主细胞而产生重组HE4a多肽的方法，该构建体包含至少一种可操作连接HE4a编码核酸序列的启动子。在某些实施方案中，该启动子是此处提供的调节型启动子，例如四环素可阻抑型启动子。在某些实施方案中，该重组表达构建体是此处提供的重组病毒性表达构建体。哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman，Cell 23175(1981)所述猴肾成纤维细胞COS-7细胞系以及能够表达相容性载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体应包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酰化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列以及5’侧翼非转录序列，例如此处有关制备MRA表达构建体所述。来自SV40剪接和聚腺苷酰化位点的DNA序列可能用于提供所需的非转录性遗传元件。可以通过本领域技术人员熟悉的各种方法，包括但不限于例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔(Davis等人，1986 Basic Methods inMolecular Biology)，将构建体引入宿主细胞。
所表达的重组HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)或从其衍生的融合蛋白质可能以完整宿主细胞；完整细胞器例如细胞膜、细胞内囊泡或其它细胞器；或破裂细胞的制备物包括但不限于细胞匀浆物或裂解物、单层和多层膜泡或其它制备物的形式用作免疫原。或者，可以通过以下方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析包括免疫亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析，从重组细胞培养物中回收并纯化所表达的重组mesothelin相关抗原多肽(或mesothelin多肽)或融合蛋白质。在完成成熟蛋白质的构型中，必要时可以使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以利用高效液相层析(HPLC)进行最后的纯化步骤。所表达的重组HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)或融合蛋白质也可能用作本领域技术人员很容易进行的任何各种常规抗体筛选分析设置中的靶抗原。
作为产生用于本发明方法的特异性抗体的免疫原，HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)可能因而是天然的纯化产物、或化学合成过程的产物、或利用重组技术从原核或优选真核宿主中产生。如本领域已知及此处所提供，根据用于重组生产过程的宿主，本发明的多肽可能经糖基化或翻译后修饰。
根据本发明，可能在来自受试者或生物来源的生物样品中检测可溶性人HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)。生物样品可能通过获得来自于受试者或生物来源的血液样品、活检标本、组织外植体、器官培养物、生物液体或任何其它组织或细胞制备物而提供。该受试者或生物来源可能是人或非人动物、原代细胞培养物或易于培养的细胞系包括但不限于可能包含染色体整合的或附加体重组的核酸序列的遗传工程细胞系、永生化或可永生化的细胞系、体细胞杂种细胞系、分化或可分化的细胞系、转化细胞系等。在本发明的某些优选实施方案中，可能认为该受试者或生物来源具有恶性疾病或处于患有恶性疾病的危险之中，在某些另外优选的实施方案中可能是卵巢癌症例如卵巢癌，在本发明某些其它优选的实施方案中，可能已知该受试者或生物来源不存在该疾病或没有患有该疾病的危险。
在某些优选的实施方案中，该生物样品包含受试者或生物来源的至少一个细胞，在某些其它的优选实施方案中，该生物样品是包含可溶性人mesothelin相关抗原多肽的生物液体。生物液体一般是处于生理温度的液体，可能包括存在于、分离自、表达于或提取自受试者或生物来源的天然存在的液体。某些生物液体来自特定组织、器官或局部区域，而某些其它的生物液体可能更全身性或系统性位于受试者或生物样品中。生物液体的例子包括血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌性组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水液例如与非固体肿瘤有关的腹水液、胸膜、心包、腹膜、腹腔及其它体腔的液体等。生物液体还可能包括接触受试者或生物来源的液体溶液，例如细胞及器官培养基包括细胞或器官条件培养基、灌洗液等。在某些高度优选的实施方案中，该生物样品是血清，在某些其它高度优选的实施方案中，该生物样品是血浆。在其它优选的实施方案中，该生物样品是无细胞液体溶液。
在某些其它优选的实施方案中，该生物样品包含完整细胞，在某些其它优选的实施方案中，该生物样品包含细胞提取物，其中包含编码具有SEQ ID NO11或13所示氨基酸序列的HE4a抗原多肽、或其片段或变体的核酸序列。
样品中“以可溶性形式天然存在的分子”可能是可溶性蛋白质、多肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂类、脂肪酸等或其衍生物；碳水化合物、糖类等或其衍生物；核酸、核苷酸、核苷、嘌呤、嘧啶或相关分子、或其衍生物等；或其任何组合，例如糖蛋白、糖脂、脂蛋白、蛋白脂质或者是此处提供的生物样品的可溶性或无细胞组分的任何其它生物分子。“以可溶性形式天然存在的分子”另外指位于溶液中或存在于生物样品中的分子，包括此处提供的生物液体，以及未结合到完整细胞表面的分子。例如，以可溶性形式天然存在的分子可能包括但不必限于溶质；大分子复合物的组分；从细胞中脱落、分泌或输出的物质；胶体；微米颗粒或纳米颗粒或其它细小的悬浮颗粒等。
受试者中存在恶性疾病是指受试者中存在发育异常、癌性和/或转化的细胞，包括例如赘生物(neoplastic)、肿瘤、非接触抑制性或致癌性转化细胞等。
通过说明而非限制，本发明上下文中恶性疾病可能另外指受试者中存在能够分泌、脱落、输出或释放HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的癌症细胞，由此在受试者的生物样品中检测到该多肽的水平升高。在优选实施方案中，例如该癌症细胞是恶性上皮细胞、例如癌细胞，在特别优选的实施方案中，该癌症细胞是恶性间皮瘤细胞，例如是发现于胸膜、心包膜、腹膜、腹腔及其它体腔内层的鳞状细胞上皮或间皮细胞的转化变体。
在本发明最优选的实施方案中，标示存在恶性疾病的肿瘤细胞是卵巢癌细胞，包括原发及转移的卵巢癌细胞。本领域公知将恶性肿瘤归类为卵巢癌的标准(参见例如Bell等人，1998 Br.J.Obstet.Gynaecol.1051136；Meier等人，1997 Anticancer Res.17(4B)3019；Meier等人1997 Anticancer Res.17(4B)2949；Cioffi等人，1997 Tumori 83594；以及此处引用的参考文献)，以及建立并鉴定来自原发和转移肿瘤的人卵巢癌细胞系(例如OVCAR-3，美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA；Yuan等人，1997 Gynecol.Oncol.66378)。在其它实施方案中，恶性疾病可能是间皮瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌或另一形式的癌症，包括多种癌中的任一种，例如鳞状细胞癌和腺癌，也包括肉瘤和血液恶性肿瘤(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)。熟悉本领域的人员已知上述及其它恶性疾病的分类，本公开内容提供了无需过多实验而确定HE4a多肽在该恶性疾病中的存在。
如此处所提供，筛选受试者中存在恶性疾病的方法可能以使用HE4a抗原多肽特异性抗体或HE4a多肽特异性抗体为特征。
HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)特异性抗体很容易以单克隆抗体或多克隆抗血清制备，或使用本领域公知方法制备成设计为具有所需特性的遗传工程免疫球蛋白(Ig)。例如，说明而非限制，抗体可能包括重组IgG、具有来自免疫球蛋白序列嵌合的融合蛋白质或“人源化”抗体(参见例如美国专利5,693,762、5,585,089、4,816,567、5,225,539、5,530,101以及此处引用的参考文献)，均可能用于根据本发明检测人HE4a多肽。可能如此处所述制备这类抗体，包括如下文所述利用HE4a多肽进行免疫。例如，如此处所提供公开了编码HE4a多肽的核酸序列，以致本领域技术人员可能常规制备这些多肽来用作免疫原。例如，可能使用下文详述的单克隆抗体2H5、3D8和4H4来实施本发明的某些方法。
术语″抗体″包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段例如F(ab′)2和Fab片段，以及任何天然存在或重组产生的结合配偶体，即特异性结合HE4a多肽的分子。如果抗体结合HE4a多肽的亲合常数Ka大于或等于约104M-1、优选大于或等于约105M-1、更优选大于或等于约106M-1、更加优选大于或等于约107M-1，则定义为″免疫特异性″或特异性结合。使用例如Scatchard等人Ann.NY.Acad.Sci.51660(1949)所述常规技术，可以轻易确定结合配偶体或抗体的亲和力。使用任何已知方法，例如美国专利5,283,173和5,468,614所述酵母双杂交筛选系统或等效方法，鉴定并获得与其它蛋白质或多肽特异性相互作用的蛋白质，可以确定作为HE4a多肽结合配偶体的其它蛋白质。本发明也包括使用HE4a多肽以及基于HE4a多肽氨基酸序列的肽，来制备特异性结合HE4a多肽的结合配偶体和抗体。
一般可能利用任何本领域一般技术人员已知的多种技术制备抗体(例如参见Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988)。在其中一种技术中，起初将包含HE4a多肽的免疫原，例如表面上具有HE4a多肽的细胞或分离的HE4a多肽，注射到合适的动物中(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)，优选根据预定程序加入一次或多次加强免疫，并且动物定期取血。然后可能通过例如使用偶联合适固相支持物的多肽的亲和层析，从上述血清中纯化HE4a多肽特异性多克隆抗体。
例如可能使用Kohler和Milstein(1976 Eur.J Immunol.6511-519)及其改进技术，制备HE4a多肽或其变体特异性的单克隆抗体。简言之，这些方法包括制备能够产生具有所需特异性(即，与目的mesothelin多肽的反应性)的抗体的永生细胞系。例如可能从得自上述免疫动物的脾细胞中产生这种细胞系。然后例如通过融合骨髓瘤细胞融合配偶体、优选与所免疫动物同源的配偶体，使脾细胞永生化。例如，可能利用膜融合促进剂、例如聚乙二醇或非离子型活性剂使脾细胞和骨髓瘤细胞结合几分钟，然后低密度接种于支持杂交细胞、但不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基中。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择。经过足够时间，通常约1-2周，观察杂合体集落。选择单个集落，测试对该多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。本发明包括可产生特异性结合HE4a多肽的单克隆抗体的杂交瘤。
可从生长杂交瘤集落的上清中分离单克隆抗体。另外，可能利用多种技术增加生产，例如将杂交瘤细胞系注入合适脊椎动物宿主例如小鼠的腹腔。然后从腹水液或血液中收获单克隆抗体。可能利用常规方法，例如层析、凝胶过滤、沉淀或萃取，从抗体中去除污染物。例如，可能使用标准技术，通过固定化蛋白G或蛋白A的层析来纯化抗体。
在某些实施方案中，优选使用抗体的抗原结合片段。此类片段包括可能使用标准技术(例如通过木瓜蛋白酶消化产生Fab和Fc片段)制备的Fab片段。可能使用标准技术，通过亲和层析(例如固定化蛋白A的柱子)分离Fab和Fc片段。参见例如Weir，D.M.，Handbook ofExperimental Immunology，1986，Blackwell Scientific，Boston。
由于免疫球蛋白V区结构域(由框架内连接多种效应蛋白质编码序列的DNA序列编码)而具有预选抗原特异性结合亲和力的多功能性融合蛋白质为本领域已知，例如EP-Bl-0318554、美国专利5,132,405、美国专利5,091,513和美国专利5,476,786所述。这种效应蛋白质包括可能用于通过本领域技术人员熟悉的任何各种技术来检测融合蛋白质结合的多肽结构域，包括但不限于生物素模拟序列(参见例如Luo等人，1998 J.Biotechnol.65225和此处引用的参考文献)、利用可检测的标记成分直接共价修饰、非共价结合到特异性标记的报告分子、酶学修饰可检测性底物或固定化(共价或非共价)于固相支持物。
也可能通过诸如噬菌体展示的方法产生并选择用于本发明的单链抗体(参见例如美国专利5,223,409；Schlebusch等人，1997 Hybridoma1647；以及此处所述参考文献)。简言之，在此方法中将DNA序列插入丝状噬菌体例如M13的基因III或基因VIII基因。已经开发了用于插入的具有多克隆位点的若干载体(McLafferty等人，Gene 12829-36，1993；Scott和Smith，Science 249386-390，1990；Smith和Scott，Methods Enzymol.217228-257，1993)。插入的DNA序列可能随机产生，或可能是用于结合到HE4a多肽的已知结合结构域的变体。使用该方法可能很容易产生单链抗体。插入物一般编码6-20个氨基酸。由插入序列编码的肽被展示于噬菌体的表面。通过结合到固定化的HE4a多肽、例如使用本领域公知方法以及此处公开的核酸编码序列制备的重组多肽，来选择表达HE4a多肽结合结构域的噬菌体。利用一般包含10mM Tris、1mM EDTA的无盐或低盐浓度的洗液去除未结合的噬菌体。结合的噬菌体则利用例如含盐缓冲液洗脱。以逐步方式提高NaCl，直至洗脱所有噬菌体。高亲和力结合的噬菌体一般由高盐浓度释放。洗脱的噬菌体在细菌宿主中繁殖。可能进行另轮选择，以选择几种高亲和力结合的噬菌体。然后测定结合噬菌体中插入物的DNA序列。一旦已知该结合多肽的推断的氨基酸序列，便可能利用重组或合成方法制备充足的此处用作HE4a多肽特异性抗体的肽。若制备的抗体是融合蛋白质，则使用重组方法。为了使亲和力或结合达到最大，形成的肽也可能是两种或多种相似或不相似的肽的随机阵列。
为检测与HE4a多肽特异性抗体反应的抗原决定簇，检测试剂一般是如此处所述制备的抗体。本领域一般技术人员已知使用抗体检测样品中多肽的多种分析方式，包括但不限于酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫荧光分析、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散及其它技术。例如参见Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology，1986，BlackwellScientific，Boston。例如，可能以Western印迹方式进行该分析，其中将来自生物样品的蛋白质制备物进行凝胶电泳，转移到合适的膜并使其与抗体反应。然后如本领域公知及下文所述，使用合适的检测试剂检测膜上存在的抗体。
在另一实施方案中，该分析包含使用固定化于固相支持物的抗体结合HE4a靶多肽，并从样品的剩余物中移出。然后使用与不同的HE4a多肽抗原决定簇反应的第二抗体，例如包含可检测报告成分的试剂，检测所结合的HE4a多肽。根据本实施方案的一个非限制性例子是，固定化抗体和识别不同抗原决定簇的第二抗体可能是此处所述选自单克隆抗体2H5、3D8和4H4的任意两种单克隆抗体。或者可能使用竞争性分析，其中HE4a多肽由可检测性报告成分标记，使其在温育固定化抗体和样品之后，结合固定化的HE4a多肽特异性抗体。样品组分抑制标记的多肽与抗体结合的程度表示出样品与固定化抗体的反应性，从而表示样品中的HE4a水平。
固相支持物可能是本领域技术人员已知的可能附着抗体的任何物质，例如微量滴定板的测试孔、硝酸纤维素滤膜或另一种合适的膜。或者，该支持物可能是小球或圆盘，例如玻璃、纤维玻璃、乳胶或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。可能使用专利和科学文献中详述的、本领域人员已知的多种技术将抗体固定化在固相支持物上。
在某些优选实施方案中，检测样品中HE4a抗原多肽的分析是双抗体夹心分析。该分析可能如下进行，首先使固定化于固相支持物(通常是微量滴定板的孔)的HE4a多肽特异性抗体(例如单克隆抗体，如2H5、3D8或4H4)接触生物样品，以便使样品中天然存在的、具有与抗体反应的抗原决定簇的可溶性分子结合该固定化抗体(例如，室温下温育30分钟一般足够)，形成抗原-抗体复合物或免疫复合物。然后从固定化的免疫复合物中移出样品的未结合成分。然后加入HE4a抗原多肽特异性的第二抗体，其中该第二抗体的抗原结合位点不竞争性抑制固定化第一抗体的抗原结合位点与HE4a多肽的结合(例如，与固定化于固相支持物上的单克隆抗体不相同的单克隆抗体，诸如2H5、3D8或4H4)。可能如此处所述可检测性标记第二抗体，以便可以直接检测。或者，可能通过使用可检测性标记的次级(或”第二级”)抗抗体、或使用此处提供的特异性检测试剂间接检测第二抗体。熟悉免疫分析的人员应当理解，很多试剂和设置可用于在双抗体夹心免疫分析中免疫学检测特定抗原(例如mesothelin多肽)，因此本发明方法不局限于任何特定的检测方法。
本发明的某些优选实施方案使用上述双抗体夹心分析，HE4a抗原多肽特异性的固定化第一抗体是多克隆抗体，而HE4a抗原多肽特异性的第二抗体是多克隆抗体。在本发明某些其它实施方案中，HE4a抗原多肽特异性的固定化第一抗体是单克隆抗体，而HE4a抗原多肽特异性的第二抗体是多克隆抗体。在本发明某些其它实施方案中，HE4a抗原多肽特异性的固定化第一抗体是多克隆抗体，而HE4a抗原多肽特异性的第二抗体是单克隆抗体。在本发明某些其它高度优选的实施方案中，HE4a抗原多肽特异性的固定化第一抗体是单克隆抗体，而HE4a抗原多肽特异性的第二抗体是单克隆抗体。例如，在这些实施方案中应当注意到，此处提供的单克隆抗体2H5、3D8和4H4识别HE4a多肽上不同的非竞争性抗原决定簇(例如表位)，以致可能利用这些单克隆抗体的任何配对组合。在本发明其它优选实施方案中，HE4a抗原多肽特异性的固定化第一抗体和/或HE4a抗原多肽特异性的第二抗体可能是本领域已知的以及此处提及的任何种类抗体，例如为了说明而非限制，Fab片段、F(ab′)2片段、免疫球蛋白V区融合蛋白质或单链抗体。熟悉本领域的人员应当理解，本发明包括在此处公开及要求的方法中使用其它抗体形式、片段、衍生物等。
在某些特别优选的实施方案中，第二抗体可能包含可检测性报告成分或标记物，例如酶、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等。然后使用适用于特定可检测性报告成分或标记物的方法，测定保持与固相支持物结合的第二抗体的数量。放射性基团一般适用闪烁计数或放射自显影方法。可能使用多种偶联技术制备抗体-酶缀合物(综述参见例如Scouten，W.H.，Methods in Enzymology 13530-65，1987)。可能使用分光术(Spectroscopic)方法检测染料(包括例如酶反应的显色产物)、发光基团和荧光基团。可能使用偶联不同报告基团(一般是放射性或荧光基团或酶)的亲和素或链亲和素检测生物素。一般通过加入底物(通常进行特定时间)、然后利用分光术、分光光度法或其它方法分析反应产物，来检测酶报告基团。可能利用公知技术，使用标准物或标准的添加物来检测样品中mesothelin多肽的水平。
在另一实施方案中，本发明包括使用此处提供的HE4a抗原多肽、通过检测来自生物来源或受试者的生物样品中的免疫特异性反应抗体，来筛选存在的恶性疾病。根据此实施方案，HE4a抗原多肽(或其片段或变体，包括此处提供的截短的HE4a抗原多肽)被可检测性标记并与生物样品接触，以检测样品中以可溶性形式天然存在的抗体与HE4a抗原多肽的结合。例如，可能使用此处公开的序列及公知的方法(例如体外翻译期间掺入易于检测(例如放射性标记)的氨基酸)、或使用其它上述可检测的报告成分，通过生物合成来标记HE4a抗原多肽。不愿受理论限制，本发明的实施方案期望某些HE4a多肽，例如此处公开的HE4a融合多肽，可能提供具有特定免疫原性、从而产生特异性可检测抗体的肽。例如，根据该理论，某些HE4a融合多肽可能代表激发希望的免疫应答的“非自身”抗原，而缺少融合结构域的HE4a多肽可能被免疫系统看作更类似“自身”抗原而不轻易引起体液或细胞免疫。
如上所述，本发明部分涉及以下惊人发现，即在受试者中天然存在可溶性形式的HE4a抗原多肽，包括该可溶性HE4a多肽在具有某些癌症的受试者中水平升高。
通过检测受试者生物样品中一种以上的肿瘤相关标志，可能进一步加强本发明筛选恶性疾病存在的方法。因此，本发明某些实施方案提供了筛选方法，除了检测天然存在的可溶性样品组分与HE4a抗原多肽特异性抗体的反应性之外，也包括使用本领域已知的以及此处提供的既定方法来检测至少一种另外的恶性疾病的可溶性标志。如上所述，目前可以在易于获得的生物液体样本中检测到多种可溶性肿瘤相关抗原。例如，本发明某些实施方案涉及人mesothelin多肽，其包括诸如Scholler等人(1999 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 9611531)及美国申请09/513,597所述新型可溶性mesothelin多肽相关抗原(MRA)多肽等多肽。
此处提供的″mesothelin多肽″是可溶性多肽，其具有包括以下肽的氨基酸序列EVEKTACPSGKKAREIDES SEQ ID NO14并另外具有至少一种与至少一种抗体反应的抗原决定簇，该抗体具有竞争性抑制MAb K-1(Chang等人，1996 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93136；MAb K-1可得自例如Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA)或U.S.A.N.09/513,597提供的单克隆抗体OV569、4H3、3G3或1A6的免疫特异性结合的抗原结合位点。
因此，本发明使用的这些另外的可溶性肿瘤相关抗原可能包括但不必限于mesothelin和mesothelin相关抗原、CEA、CA125、唾液酸TN、SCC、TPS和PLAP(参见例如Bast等人，1983 N.Eng.J Med.309883；Lloyd等人，1997 Int.J.Canc.71842；Sarandakou等人，1997Acta Oncol.36755；Sarandakou等人，1998 Eur.J.Gynaecol.Oncol.1973；Meier等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)2945；Kudoh等人，1999Gynecol.Obstet.Invest.4752；Ind等人，1997 Br.J.Obstet.Gynaecol.1041024；Bell等人1998 Br.J.Obstet.Gynaecol.1051136；Cioffi等人，1997 Tumori 83594；Meier等人1997 Anticanc.Res.17(4B)2949；Meier等人，1997 Anticanc.Res.17(4B)3019)，并可能另外包括此处提供的任何已知的标志，其于生物样品中的存在可能与至少一种恶性疾病的存在有关。
或者，可能使用标准的杂交和/或多聚酶链式反应(PCR)技术来检测HE4a多肽的编码核酸序列。本领域一般技术人员可能根据此处提供的HE4a cDNA序列设计合适的探针和引物。一般可能使用从生物来源获得的任何一种样品进行分析，例如真核细胞、细菌、病毒、从所述生物体中制备的提取物以及在活生物体内发现的液体。
提供以下实施例以供说明、而非限制。
实施例实施例1实时PCR检测人类样本的HE4A表达根据the institutional review boards of the University ofWashington，Swedish Hospital and Fred Hutchinson Cancer ResearchCenter，all of Seattle，Washington核准的程序获得158个人体组织活检样本或活检的RNA样本。包括来自正常组织(肾上腺、骨髓、脑、结肠、子宫内膜、胃、心、肾、肝、肺、乳腺、骨骼肌、子宫肌膜、外周神经、外周血淋巴细胞制备物、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、气管、胸腺、子宫、外周血淋巴细胞培养物以及40个正常卵巢)、良性卵巢病变(13个浆液性囊腺瘤)、2个濒临恶性的卵巢肿瘤、3个I期粘质卵巢癌、3个I期浆液性卵巢癌、37个III期浆液性卵巢癌、7个IV期浆液性卵巢癌样本、转移卵巢癌组织的6个样本以及卵巢癌妇女的2管样本。所有组织样本得自治疗前的妇女，立即将每种肿瘤的一部分置于液氮中，其余样本进行常规组织学分析。只使用经组织病理学检查发现包含超过80％肿瘤细胞并且没有坏死的样本进行杂交和实时PCR实验。还包括来自卵巢表面上皮培养物(ovarian surfaceepithelial culture，OSE，得自B.Karlan，Cedars Sinai Hospital，LosAngeles，CA)以及3个另外的OSE样本(得自R.Hernandez，Universityof Washington，Seattle，WA)的RNA。总计保存了151个样本(94个非恶性组织和57个癌)进行实时定量PCR，确证目的基因、包括下述HE4a的过表达。
如下进行实时定量PCR。HE4实时PCR的引物为AGCAGAGAAGACTGGCGTGT(正向)[SEQ ID NO15]和GAAAGGGAGAAGCTGTGGTCA(反向)[SEQ ID NO16]。
这些引物产生427bp长度的PCR产物。使用oligo-dT引物和Superscript II反转录酶(Life Technologies，Inc.，Bethesda，MD)如厂家所述反转录总RNA。使用ABI7700仪器(PE Biosystems，Foster City，CA)及SYBR-Green方法进行实时定量PCR。以五份两倍系列稀释的白细胞cDNA制备物作为标准扩增的模板(S31iii125，先前实验证明它在正常和恶性组织中普遍表达，参见Schummer等人，1999 Gene1999)。
GenBank登录号U61734，正向引物CGACGCTTCTTCAAGGCCAA，SEQ ID NO17反向引物ATGGAAGCCCAAGCTGCTGA SEQ ID NO18。
阴性对照由不加酶进行反转录的卵巢癌总RNA以及包含无任何模板的所有PCR组分的孔组成。所有运行按一式两份进行。利用琼脂糖凝胶分析每次运行中存在的单一PCR条带，消除假象条带。使用PCR仪器制造商提供的软件(Sequence DetectorTM)分析每一96孔板的结果；该分析可以测定目的核酸序列(HE4a)相对于标准物的表达水平。
图1所示表达值按相对于内部标准物的任意单位进行描述，并不反映mRNA分子按标准测量单位的绝对量。根据平均HE4a表达水平的丰度(amplifude)以及这些数值与其它已知基因(特别是高表达的β肌动蛋白)的比较，图1显示编码HE4a的转录本以中度到高度的相对水平表达。
实施例2
HE4A编码核酸序列的克隆及表达从高通量HE4a cDNA克隆中扩增HE4a融合构建体cDNA最初由Kirchoff等人，(1991)发表的HE4 cDNA序列(SEQ ID NO8)保藏于GenBank登录#X63187，提供了进行寡核苷酸引物设计以克隆此处所述HE4a编码cDNA(SEQ ID NO10)的基础。将利用高通量cDNA阵列鉴定并分离的差异表达基因产物HE4a的cDNA 840bp片段克隆入pSPORT。使用该cDNA为PCR反应模板，如本实施例所述，扩增适合产生合成的融合蛋白质基因形式的HE4a。
HE4编码序列(SEQ ID NO8)的一部分似乎编码推测的分泌信号肽；因此，在起初的构建体中使用该天然前导肽，以保持尽可能多的该分子结构。另外，由于HE4a相对较小，其序列不包含任何罕见的结构特征，例如跨膜结构域或胞浆导向序列，因此设计了引入融合人IgG1 Fc结构域的完整HE4a基因产物的融合蛋白质。引物设计为编码用于克隆的合适限制位点并产生最终构建体所需的蛋白质结构域的框架内融合体。5′引物(SEQ ID NO1或HE4-5′)为39聚体(39-mer)，包括HindIII位点、提高相邻第一个ATG表达的Kozak序列以及基于先前发表的HE4序列的一部分HE4a前导肽。3′引物(SEQ ID NO2或HE4-3′-1)为36聚体，包括用于融合人-Ig后部cDNA的框架内BamHI位点以及恰好在终止密码子前截短的HE4编码序列的3′端。使用这两种引物50pmol以及作为模板的HE4/pSPORT质粒1ng进行PCR扩增反应。根据包装内说明书，50μl反应还包括2.5U(0.5ml)ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa Shuzo Biomedical，Otsu，Shiga，Japan)、稀释的缓冲液和核苷酸。反应扩增30个循环，扩增模式为94℃30秒、60℃30秒以及72℃、30秒。获得了预期全长HE4大小(约400bp)的PCR产物。
这些片段经限制性消化、纯化并连接到适当消化的已包含人IgG1插入物的哺乳动物表达质粒中。将连接产物转化DH5α细菌细胞，筛选存在HE4-hIgG1融合基因插入物的转化子。然后使用BigDyeTerminator Cycle Sequencing试剂盒(PE Biosystems，Foster City，CA)在ABI Prism 310(PE Biosystems)测序仪中测序来自若干分离物的质粒DNA。此外，还如前述(Hayde等人，1994 Ther.Immunol.13)利用DEAE-葡聚糖瞬时转染，将这些分离物的质粒DNA转染COS7细胞。72小时后收获培养上清，利用蛋白A琼脂糖免疫沉淀、还原型SDS-PAGE电泳以及Western印迹进行筛选(图2)。使用1∶5000山羊抗人IgG缀合物、然后ECL显色来探测Western印迹。
序列分析的结果表明，所获HE4a编码序列(SEQ ID NO10)及推断的氨基酸序列(SEQ ID NO11)在几个位置不同于发表的HE4编码(SEQ ID NO8)及翻译(SEQ ID NO9)序列。因而也从来自正常人附睾的cDNA以及几种肿瘤细胞系和原发肿瘤的RNA获得序列，确证了SEQ ID NO10所示HE4a编码序列以及SEQ ID NO11所示推断的编码氨基酸序列。
克隆肿瘤细胞系HE4 cDNA按照厂家说明书，使用Trizol(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)从包括4007和OVCAR3(参见例如Helistrom等人，2001 Canc.Res.612420)的几种卵巢肿瘤细胞系中制备RNA。按照厂家说明书，使用1-3μg RNA、随机六聚体以及Superscript II反转录酶(Life Technologies)制备cDNA。在包含1μgcDNA、2.5U(0.5ml)ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa Shuzo Biomedical，Otsu，Shiga，Japan)、稀释的缓冲液和根据插入方向的核苷酸以及HE4-5′和HE4-3′-1特异性引物的50μl反应物中，从随机引发(primed)的cDNA PCR扩增HE4 cDNA。反应扩增30个循环，扩增模式为94℃30秒、60℃30秒以及72℃30秒。再使用HE4-5′和HE4-3′-1寡核苷酸从肿瘤来源的cDNA中PCR扩增HE4。获得预期全长HE4大小的PCR产物，将该片段克隆到pT-AdvanTAge载体(Clontech，Palo Alto，CA)进行序列分析。如上所述测序带有插入物的克隆，发现来自肿瘤RNA样本的PCR片段编码与上述原始克隆相同的HE4a序列；这些HE4a序列不同于发表的HE4序列(Kirchhoff等人，1991)。类似地，从正常附睾(SEQ ID NO10)和原发肿瘤组织cDNA(SEQ ID NO12)获得HE4a编码序列，匹配上述新的HE4a序列，但不同于Kirchhoff等人(1991)的HE4序列(SEQ ID NO8)。
产生HE4Ig融合蛋白质。将HE4-hIgG1 cDNA构建体(SEQ IDNO7)的HindIII-XbaI片段插入哺乳动物表达载体pD18的多克隆位点，pD18是前述pCDNA 3的衍生物(Hayden等人，1996 TissueAntigens 48242)。起初利用所述DEAE-葡聚糖瞬时转染方法转染构建体(Hayden等人，1994 Ther.Immunol.13)。制备若干分离物的质粒DNA，用于瞬时转染COS7细胞。72小时后收获培养上清，利用蛋白A琼脂糖免疫沉淀、还原型SDS-PAGE电泳以及Western印迹进行筛选(图2)。
使用CHO-DG44细胞(Urlaub等人1986 Somat.Cell.Mol.Genet.1255)构建表达高水平目的融合蛋白质的稳定细胞系。利用高拷贝电穿孔pD18载体(Hayden等人，1996 Tissue Antigens 48242；Barsoum，1990 DNA Cell Biol.9293)，并通过在包含重组胰岛素(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)、丙酮酸钠(Irvine Scientific，SantaAna，CA)、谷氨酰胺(Irvine Scientific)、MEM的2X非必需氨基酸(Irvine Scientific)以及100nM氨基蝶呤(Sigma，St.Louis，MO)的Excell 302 CHO培养基(JRH Biosciences，Denver，PA)中进行有限稀释来选择氨甲喋呤抗性克隆，产生表达HE4Ig的稳定的CHO细胞系。然后利用IgG夹心ELISA分析抗性克隆的培养上清，筛选高生产细胞系。从大规模培养物中收获用尽的(Spent)上清，利用通过2-ml蛋白A琼脂糖(Repligen，Cambridge，MA)柱的蛋白A亲和层析来纯化HE4Ig。从柱中洗脱处于0.1M柠檬酸缓冲液(pH2.7)中的0.8-ml组分的融合蛋白质，并使用100μl 1M Tris碱(pH10.5)进行中和。分析洗脱部分的280nm吸光值，混合包含融合蛋白质的组分，在几升PBS(pH7.4)中透析过夜，通过0.2-μm注射器过滤单位(Millipore，Bedford，MA)进行过滤灭菌。
使用稳定转染子产生足够蛋白质来免疫BALB/c小鼠。小鼠起初间隔4周腹膜内(IP)注射10μg纯化的HE4-hIgG1融合蛋白质。使用该免疫程序进行初次注射以及两次加强之后，小鼠接着IP注射10μg蛋白质外加TiterMax Gold佐剂，然后在收集脾之前进行另外两次SC加强。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤配偶体P3-X63-Ag8-653融合，制备杂交瘤。
Western分析HE4Ig融合蛋白质。通过在10％Tris/Bis NOVEX凝胶(Invitrogen，San Diego CA)上进行SDS-PAGE电泳来分离蛋白质样品，并通过半干印迹转移到PVDF膜(Millipore)。通过在PBS/0.25％NP-40或TBS-T(50mM Tris HCl，pH7.6，0.15M NaCl和0.05％Tween-20)中的5％脱脂奶粉(Carnation)中4℃温育过夜来封闭膜，防止非特异性抗体结合。将膜与TBS-T中的HRP-山羊抗人IgG(1/10,000)或HRP-链亲和素(1∶5000)(Caltag)室温或4℃轻摇温育1小时。利用TBST漂洗两次、洗涤4次后，将膜在ECLTM(Amersham，LittleChalfont，UK)试剂中温育60秒，对放射自显影底片曝光，观察条带(图2)。从培养上清或纯化样品以及使用50μl蛋白A琼脂糖(Repligen，Cambridge，MA)沉淀蛋白A的蛋白A洗脱液中收集融合蛋白质。将免疫沉淀物洗涤并重悬于SDS-PAGE还原性样品上样缓冲液中、煮沸，然后通过10％Tris/Bis NOVEX凝胶(Invitrogen，San Diego CA)SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，并通过半干印迹转移到PVDF膜(Millipore)。通过在PBS/0.25％NP-40或TBS-T(50mM Tris HCl，pH7.6，0.15M NaCl和0.05％Tween-20)中的5％脱脂奶粉(Carnation)中4℃温育过夜来封闭膜，防止非特异性抗体结合。将膜与HRP-山羊抗人IgG(1/10,000)温育，在TBS-T中洗涤，接触ECLTM(Amersham，Little Chalfont，UK)试剂60秒。然后将ECL-印迹对放射自显影底片曝光，观察条带。图2泳道1包含来自CTLA4-hIgG1转染的COS7细胞上清的免疫沉淀样品，泳道3和4包含HE4-hIgG1融合蛋白质培养上清，泳道5包含模拟转染的COS上清。HE4-hIgG1融合蛋白质在还原胶或Western印迹中的表观分子量约48kDa，大于根据预测的氨基酸序列而预期的39kDa，提示该分子被糖基化。
HE4-mIgG2a融合蛋白质的构建及表达还进行与HE4-hIgG1融合基因类似的构建，但将人IgG Fc片段替换为小鼠-IgG2a结构域。使用另外的尾部(tail)，以致小鼠免疫不受人Ig尾部融合结构域免疫原性的影响。现有的mIgG2a尾部cDNA克隆位于上述HE4a克隆的框架之外，故从该质粒重新扩增-mIgG2a盒，以便产生框架内的融合结构域。使用的正向、有义引物为mIgG2aBAMIF5′-gttgtcggatccgagcccagagggcccacaatcaag-3′[SEQ ID NO19]，而将反向、反义引物命名为mIgG2a3′Xba+S5′-gttgtttctagattatcatttacccggagtccgggagaagctc-3′[SEQ IDNO20].
所用模板包含与小鼠IgG2a Fc结构域融合的小鼠CTLA4，在相对密码子间隔的框架外的融合物接合处带有限制性位点。新的寡核苷酸产生移框，改变了BamHI位点处的阅读框架，以致与HE4的融合基因可表达完整的HE4-mIgG2a融合蛋白质。如人融合基因所述扩增、亚克隆并处理PCR产物。如以上HE4-人IgG1融合蛋白质所述，将分子亚克隆到pD18哺乳动物表达载体，产生稳定的CHO克隆并表达融合蛋白质。
实施例3HE4A特异性单克隆抗体产生抗HE4a Mab。在起初的实验中，利用上述制备的HE4a-hIgG融合蛋白质，在有或没有佐剂的情况下免疫若干BALB/c小鼠。尽管在这些小鼠中观察到较高抗体滴度，但由于针对具有hIgG尾部(CTLA4-hIg融合物)的对照融合蛋白质观察到同样高的滴度，该抗体并非HE4a特异性。因而使用HE4a-mIgG融合蛋白质进行免疫。图3说明在两只BALB/c小鼠(1605and 1734)中产生针对HE4a的高滴度抗体的两次免疫的结果，每只小鼠利用尾部皮下给予的HE4a-mIgG外加佐剂(TiterMax，CytRx Corp.，Norcross，GA)按厂家说明书免疫两次。利用显示高HE4a特异性抗体滴度的小鼠的脾细胞通过标准方法制备HE4a特异性杂交瘤。图4显示最初利用ELISA检测使用小鼠1605的脾细胞制备的杂交瘤(其血清数据如图3所示)。3个孔显示对HE4a-hIg的高反应性。然后经有限稀释克隆，分离了3株杂交瘤2H5、3D8和4H4。根据竞争分析发现杂交瘤2H5和3D8识别不同表位。
构建并应用ELISA进行肿瘤诊断。使用上述两种MAb 2H5和3D8，运用制备测定血清及其它液体中mesothelin/MPF及相关抗原所用的类似方法(Scholler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，11531，1999)构建双决定簇(″夹心″)ELISA。图5显示使用DMEM培养基稀释的HE4a-hIgG制备的标准曲线的例子。如图所示，在1ng水平的HE4a-hIgG检测到信号。图5还显示来自卵巢癌系(4007)的未稀释培养基给出可检测信号。图6显示诊断具有卵巢癌的患者(命名为OV50)腹水液中包含在最高的测试稀释度(1∶1280)仍可检测到的HE4a抗原。
通过确定两种抗体的最佳用量来改进最初的HE4a ELISA。其中一种抗体2H5被生物素化，另一抗体3D8则通过使其结合到测试板的底部而固定化；两种单克隆抗体各自的分析剂量是2.5和100μg/ml。除了刚刚提及的不同的Mab及Mab使用剂量以外，该分析方法与所述用于mesothelin/MPF及相关分子的方法相同(Scholler等人，1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611531)。
初步测试卵巢癌患者及各种对照的血清，表明大部分卵巢癌患者、包括早期疾病患者的HE4a蛋白质升高，对照血清则不然，其背景很低。在使用上述夹心ELISA分析以及约400位患者的编码血清样本(由Swedish Hospital，Seattle，WA提供)进行的研究中，诊断具有卵巢癌的患者的所有样本均被HE4a ELISA准确计为阳性，进一步预报没有假阳性。因此不愿受理论束缚，期望分析血清及其它体液中的HE4a蛋白质可能因而为现有的卵巢癌诊断分析(例如CA125)提供临床有益的补充。此外，尽管迄今研究了ELISA帮助诊断卵巢癌的能力，但它应当同样适用于过表达HE4a编码抗原的任何肿瘤。如果未来的研究要鉴定HE4相关分子，相同的ELISA或其改进方法也应当适用于研究HE4相关分子。
HE4a蛋白质在细胞表面的表达。使用卵巢癌细胞系，以B细胞系为阴性对照，通过流式细胞术进行研究，表明HE4a编码抗原在某些卵巢癌的细胞表面表达。先前已经描述了所用细胞系及流式细胞术技术(Hellstrom等人，2001 Cancer Res.61，2420)。例如，93％的OVCAR 3细胞、卵巢癌系4010的71％细胞以及卵巢癌系HE50OV的38％细胞为阳性，而所测试的另外10株卵巢癌系中，少于20％的细胞是阳性。这提示根据非限制性理论，细胞表面的HE4a抗原可能为诸如HE4a特异性抗体介导和/或HE4a特异性T细胞介导的免疫治疗策略提供靶标。
实施例4针对HE4A表位的预防性及治疗性疫苗利用上述组合物和方法检测HE4a编码核酸序列的扩增和/或HE4a在某些肿瘤(特别是恶性卵巢肿瘤)中的过表达，并与正常组织的HE4a表达水平作比较。HE4a特异性单克隆抗体确定的表位在肿瘤中升高，提供了可用作适用于癌症治疗的预防性或防止性疫苗靶标的HE4a表位的鉴定；这种疫苗也可能用于改变(例如相对于合适的对照以统计学显著的方式升高或降低)受精(在某些实施方案中可能反应为通过使用公知用于四-二硫键核心家族成员、例如Slp-1的蛋白酶抑制分析来证明HE4a蛋白酶抑制或蛋白酶增强活性)。许多综述文章已经确认并描述了制备疫苗的大量方法(例如Hellstrom和Hellstrom，Handbook in Experimental Pharmacology，vol.″Vaccines″，Springer，Heidelberg，p.463，1999)。其中包括但不限于使用蛋白质、融合蛋白质及肽、DNA质粒、重组病毒、抗独特型抗体、体外利用肽表位脉冲的树突细胞以及抗独特型抗体。疫苗可能单独使用或与佐剂和/或淋巴因子例如GMCSF联用。根据非限制性理论，由于T细胞识别存在于细胞表面MHC分子中的表位，而不与循环中的抗原或免疫复合物反应，不应预料剂检测如上所述的循环中的可溶性HE4a蛋白质影响诱导T细胞介导免疫的疫苗的使用。
从上文应当理解，尽管此处为说明起见而描述了本发明的特定实施方案，但可能不偏离本发明实质和范围而对其进行各种修改。因此，除所附权利要求之外，本发明不受限制。
在本说明书中，″包含″意思是″包括或由...组成″，″包含着″意思是″包括着或由...组成着″。
上述说明书、或以下权利要求、或附图中公开的、以用于完成所公开功能的特定形式或方法来表达的特征，或用于获得所公开结果的方法或过程，如若合适，可能分别或组合这些特征，用于以其不同形式实现本发明。
序列表<110>Pacific Northwest Research InstituteSchummer，MichelHellstrom，IngegerdHellstrom，Karl ErikLedbetter，Jeffrey A.
Hayden-Ledbetter，Martha<120>癌的诊断<130>730033.412PC<140>PCT<141>2002-08-27<160>20<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HE4编码区的5’PCR引物。包括天然分泌信号肽。ATG上游的Hind III位点和Kozak共有序列。
<400>1gttgttaagc ttgccgccat gcctgcttgt cgcctaggc 39<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HE4编码区的3’反义PCR引物，终止密码区缺失/符合读框地替换为用于克隆的BamHI限制位点<400>2gttgttggat ccgaaattgg gagtgacaca ggacac36<210>3<211>390<212>DNA<213>人类<400>3
aagcttgccg ccatgcctgc ttgtcgccta ggcccgctag ccgccgccct cctcctcagc 60ctgctgctgt tcggcttcac cctagtctca ggcacaggag cagagaagac tggcgtgtgc 120cccgagctcc aggctgacca gaactgcacg caagagtgcg tctcggacag cgaatgcgcc 180gacaacctca agtgctgcag cgcgggctgt gccaccttct gctctctgcc caatgataag 240gagggttcct gcccccaggt gaacattaac tttccccagc tcggcctctg tcgggaccag 300tgccaggtgg acagccagtg tcctggccag atgaaatgct gccgcaatgg ctgtgggaag 360gtgtcctgtg tcactcccaa tttcggatcc 390<210>4<211>1077<212>DNA<213>人类<400>4atgcctgctt gtcgcctagg cccgctagcc gccgccctcc tcctcagcct gctgctgttc 60ggcttcaccc tagtctcagg cacaggagca gagaagactg gcgtgtgccc cgagctccag 120gctgaccaga actgcacgca agagtgcgtc tcggacagcg aatgcgccga caacctcaag 180tgctgcagcg cgggctgtgc caccttctgc tctctgccca atgataagga gggttcctgc 240ccccaggtga acattaactt tccccagctc ggcctctgtc gggaccagtg ccaggtggac 300agccagtgtc ctggccagat gaaatgctgc cgcaatggct gtgggaaggt gtcctgtgtc 360actcccaatt tcggatccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 420ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 480accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 540gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 600aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 660caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 720gcccccatcg agaaaacaat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 780accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 840aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 900aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 960ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1020gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga1077<210>5<211>358<212>PRT<213>人类<400>5Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys65 70 75 80Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln85 90 95Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn100 105 110Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe Gly Ser Glu Pro115 120 125Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu130 135 140Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp165 170 175Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly180 185 190Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn195 200 205Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp210 215 220Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro225 230 235 240Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu245 250 255Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn260 265 270Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile275 280 285Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr290 295 300Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys305 310 315 320Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys325 330 335Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu340 345 350Ser Leu Ser Pro Gly Lys355<210>6<211>1098<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人-鼠合成融合基因<400>6aagcttgccg ccatgcctgc ttgtcgccta ggcccgctag ccgccgccct cctcctcagc 60ctgctgctgt tcggcttcac cctagtctca ggcacaggag cagagaagac tggcgtgtgc 120cccgagctcc aggctgacca gaactgcacg caagagtgcg tctcggacag cgaatgcgcc 180gacaacctca agtgctgcag cgcgggctgt gccaccttct gctctctgcc caatgataag 240gagggttcct gcccccaggt gaacattaac tttccccagc tcggcctctg tcgggaccag 300tgccaggtgg acagccagtg tcctggccag atgaaatgct gccgcaatgg ctgtgggaag 360gtgtcctgtg tcactcccaa tttcggatcc gagcccagag ggcccacaat caagccctgt 420cctccatgca aatgcccagc accgaattca gctggtacct catccgtctt catcttccct 480ccaaagatca aggatgtact catgatctcc ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg 540gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta 600cacacagctc agacacaaac ccatagagag gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt 660gccctcccca tccagcacca ggactggatg agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac 720aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga 780gctccacagg tatatgtctt gcctccacca gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact 840ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac 900gggaaaacag agctaaacta caagaacact gaaccagtcc tggactctga tggttcttac 960ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc 1020tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat caccacacga ctaagagctt ctcccggact 1080ccgggtaaat gatctaga 1098
<210>7<211>359<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人-鼠融合蛋白<400>7Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys65 70 75 80Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln85 90 95Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn100 105 110Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe Gly Ser Glu Pro115 120 125Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro130 135 140Asn Ser Ala Gly Thr Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys145 150 155 160Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val165 170 175Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn180 185 190Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr195 200 205Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp210 215 220Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu225 230 235 240Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg245 250 255Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys260 265 270Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp275 280 285Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys290 295 300Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser305 310 315 320Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser325 330 335Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser340 345 350Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys355
<210>8<211>583<212>DNA<213>人类<400>8cccctgcacc ccgcccggca tagcaccatg cctgcttgtc gcctaggccc gctagccgcc 60gccctcctcc tcagcctgct gctgttcggc ttcaccctag tctcaggcac aggagcagag 120aagactggcg tgtgccccga gctccaggct gaccagaact gcacgcaaga gtgcgtctcg 180gacagcgaat gcgccgacaa cctcaagtgc tgcagcgcgg gctgtgccac cttctgcctt 240ctctgcccca atgataagga gggttcctgc ccccaggtga acattaactt tccccagctc 300ggcctctgtc gggaccagtg ccaggtggac acgcagtgtc ctggccagat gaaatgctgc 360cgcaatggct gtgggaaggt gtcctgtgtc actcccaatt tctgaggtcc agccaccacc 420aggctgagca gtgaggagag aaagtttctg cctggccctg catctggttc cagcccacct 480gccctcccct ttttcgggac tctgtattcc ctcttggggt gaccacagct tctccctttc 540ccaaccaata aagtaaccac tttcagcaaa aaaaaaaaaa aaa583<210>9<211>125<212>PRT<213>人类<400>9Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Leu Leu Cys Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser65 70 75 80Cys Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp85 90 95Gln Cys Gln Val Asp Thr Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg100 105 110Asn Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe115 120 125<210>10<211>486<212>DNA<213>人类<400>10tgagagaaag cggccgcacc ccgcccggca tagcaccatg cctgcttgtc gcctaggccc 60gctagccgcc gccctcctcc tcagcctgct gctgttcggc ttcaccctag tctcaggcac 120aggagcagag aagactggcg tgtgccccga gctccaggct gaccagaact gcacgcaaga 180gtgcgtctcg gacagcgaat gcgccgacaa cctcaagtgc tgcagcgcgg gctgtgccac 240cttctgctct ctgcccaatg ataaggaggg ttcctgcccc caggtgaaca ttaactttcc 300ccagctcggc ctctgtcggg accagtgcca ggtggacagc cagtgtcctg gccagatgaa 360atgctgccgc aatggctgtg ggaaggtgtc ctgtgtcact cccaatttct gagctccggc 420caccaccagg ctgagcagtg aagatagaaa gtttctgcct ggccctgcag cgtgttacag 480cccacc 486<210>11
<211>124<212>PRT<213>人类<400>11Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys65 70 75 80Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln85 90 95Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn100 105 110Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe115 120<210>12<211>374<212>DNA<213>人类<400>12ccatgcctgc ttgtcgccta ggcccgctag ccgccgccct cctcctcagc ctgctgctgt 60tcggcttcac cctagtctca ggcacaggag cagagaagac tggcgtgtgc cccgagctcc 120aggctgacca gaactgcacg caagagtgcg tctcggacag cgaatgcgcc gacaacctca 180agtgctgcag cgcgggctgt gccaccttct gctctctgcc caatgataag gagggttcct 240gcccccaggt gaacattaac tttccccagc tcggcctctg tcgggaccag tgccaggtgg 300acagccagtg tcctggccag atgaaatgct gccgcaatgg ctgtgggaag gtgtcctgtg 360tcactcccaa tttc374<210>13<211>124<212>PRT<213>人类<400>13Met Pro Ala Cys Arg Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Leu Val Ser Gly Thr Gly Ala Glu Lys20 25 30Thr Gly Val Cys Pro Glu Leu Gln Ala Asp Gln Asn Cys Thr Gln Glu35 40 45Cys Val Ser Asp Ser Glu Cys Ala Asp Asn Leu Lys Cys Cys Ser Ala50 55 60Gly Cys Ala Thr Phe Cys Ser Leu Pro Asn Asp Lys Glu Gly Ser Cys65 70 75 80Pro Gln Val Asn Ile Asn Phe Pro Gln Leu Gly Leu Cys Arg Asp Gln85 90 95Cys Gln Val Asp Ser Gln Cys Pro Gly Gln Met Lys Cys Cys Arg Asn100 105 110Gly Cys Gly Lys Val Ser Cys Val Thr Pro Asn Phe115 120
<210>14<211>19<212>PRT<213>人类<400>14Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile1 5 10 15Asp Glu Ser<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向HE4实-时PCR引物<400>15agcagagaag actggcgtgt20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向HE4实-时PCR引物<400>16gaaagggaga agctgtggtc a 21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>17cgacgcttct tcaaggccaa20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>18atggaagccc aagctgctga20<210>19<211>36
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向有义引物<400>19gttgtcggat ccgagcccag agggcccaca atcaag 36<210>20<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向反义引物<400>20gttgtttcta gattatcatt tacccggagt ccgggagaag ctc 4权利要求
1.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测所述抗体与所述抗原决定簇结合的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的抗体，以确定所述生物样品中存在以可溶性形式天然存在于该样品中、并具有与所述至少一种抗体反应的抗原决定簇的分子，从而检测恶性疾病的存在。
2.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测所述抗体与所述抗原决定簇结合的条件和时间下，使包含受试者细胞的生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的抗体，以确定所述生物样品中存在具有与所述至少一种抗体反应的抗原决定簇的细胞表面分子，从而检测恶性疾病的存在。
3.权利要求1或2的方法，其中所述生物样品选自血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊髓液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水液、胸膜液、心包膜液、腹膜液、腹液、培养基、条件培养基和灌洗液。
4.权利要求1的方法，其中所述生物样品是血清。
5.权利要求1或2的方法，其中所述生物样品是血浆。
6.权利要求1或2的方法，其中所述生物样品选自腹水液和胸膜液。
7.权利要求1或2的方法，其中所述生物样品是阴道分泌物。
8.权利要求1或2的方法，其中所述HE4a抗原包含具有SEQID NO11所示序列的多肽、或其片段或衍生物。
9.权利要求8的方法，其中所述HE4a抗原多肽是剪接变体。
10.权利要求1或2的方法，其中所述HE4a抗原包含具有SEQID NO5所示序列的多肽、或其片段或衍生物。
11.权利要求10的方法，其中所述HE4a抗原多肽是剪接变体。
12.权利要求1或2的方法，其中所述HE4a抗原多肽是HE4a抗原变体、或其片段或衍生物。
13.权利要求1或2的方法，其中所述抗体包含多克隆抗体。
14.权利要求1或2的方法，其中所述抗体包含亲和纯化的抗体。
15.权利要求1或2的方法，其中所述抗体包含单克隆抗体。
16.权利要求1或2的方法，其中所述抗体包含重组抗体。
17.权利要求1或2的方法，其中所述抗体包含嵌合抗体。
18.权利要求1或2的方法，其中所述抗体包含人源化抗体。
19.权利要求1或2的方法，其中所述抗体包含单链抗体。
20.权利要求1或2的方法，其中检测抗体结合抗原决定簇包含检测放射性核素。
21.权利要求1或2的方法，其中检测抗体结合抗原决定簇包含检测荧光团。
22.权利要求1或2的方法，其中检测抗体结合抗原决定簇包含检测亲合素分子与生物素分子的结合事件。
23.权利要求1或2的方法，其中检测抗体结合抗原决定簇包含检测链亲合素分子与生物素分子的结合事件。
24.权利要求1或2的方法，其中检测抗体结合抗原决定簇包含分光光度法检测酶反应产物。
25.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种抗体被可检测性标记。
26.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种抗体未被可检测性标记，并且其中对抗体结合抗原决定簇的检测是间接进行。
27.权利要求1的方法，其中所述恶性疾病选自腺癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌和非小细胞肺癌。
28.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测所述抗体与所述抗原决定簇结合的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种抗体，以确定所述生物样品中存在选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，(ii)所述样品包含受试者的细胞时的细胞表面分子，所述分子具有与所述至少一种抗体反应的抗原决定簇，其抗原结合位点竞争性抑制选自2H5、3D8和4H4的单克隆抗体的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。
29.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测所述抗体与所述抗原决定簇结合的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种抗体，以确定所述生物样品中存在选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，(ii)所述样品包含受试者的细胞时的细胞表面分子，所述分子具有与所述抗体反应的抗原决定簇，其抗原结合位点竞争性抑制单克隆抗体3D8的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。
30.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测所述至少一种抗体与所述抗原决定簇结合的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种HE4a抗原性多肽的特异抗体，以确定所述生物样品中存在选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，(ii)所述样品包含受试者的细胞时的细胞表面分子，所述分子具有与所述抗体反应的抗原决定簇，其中所述至少一种抗体免疫特异性结合HE4a抗原，从而检测恶性疾病的存在。
31.权利要求30的方法，其中HE4a抗原也与选自3D8、2H5和4H4的单克隆抗体免疫特异性反应。
32.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测所述抗体与所述抗原决定簇结合的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的抗体，以确定所述生物样品中存在选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，(ii)所述样品包含受试者的细胞时的细胞表面分子，所述分子具有与所述至少一种抗体反应的抗原决定簇，其抗原结合位点竞争性抑制选自2H5和4H4的单克隆抗体的免疫特异性结合，其中所述至少一种抗体免疫特异性结合HE4a抗原，从而检测恶性疾病的存在。
33.权利要求32的方法，其中该HE4抗原也与单克隆抗体3D8免疫特异性反应。
34.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以使所述至少一种固定化的第一抗体与所述HE4a抗原多肽特异结合、从而形成免疫复合物的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的固定化的第一抗体，以确定所述生物样品中存在可溶性形式天然存在于所述样品中的分子；去除未特异性结合所述至少一种固定化的第一抗体的样品组分；以及在足以检测所述至少一种第二抗体与所述HE4a抗原多肽特异性结合的条件和时间下，使所述免疫复合物接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的第二抗体，其中所述至少一种第二抗体的抗原结合位点不竞争性抑制所述至少一种固定化的第一抗体的抗原结合位点，从而检测恶性疾病的存在。
35.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足够使所述至少一种固定化的第一抗体与所述HE4a抗原多肽结合、从而形成免疫复合物的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的固定化的第一抗体，以确定所述生物样品中存在以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，其中所述至少一种第一抗体的抗原结合位点竞争性抑制单克隆抗体3D8的免疫特异性结合；去除未特异性结合所述至少一种固定化的第一抗体的样品组分；以及在足以检测所述至少一种第二抗体与所述HE4a抗原多肽特异性结合的条件和时间下，使所述免疫复合物接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的第二抗体，其中所述至少一种第二抗体的抗原结合位点不竞争性抑制单克隆抗体2H5的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。
36.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足够使所述至少一种固定化的第一抗体与所述mesothelin相关抗原多肽结合、从而形成免疫复合物的条件和时间下，使受试者的生物样品接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的固定化的第一抗体，以确定所述生物样品中存在以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，其中所述至少一种第一抗体的抗原结合位点竞争性抑制单克隆抗体3D8的免疫特异性结合；去除未特异性结合所述至少一种固定化的第一抗体的样品组分；以及在足以检测所述至少一种第二抗体与所述HE4a抗原多肽特异性结合的条件和时间下，使所述免疫复合物接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的第二抗体，其中所述至少一种第二抗体的抗原结合位点不竞争性抑制单克隆抗体4H4的免疫特异性结合，从而检测恶性疾病的存在。
37.权利要求1-36中任一项的方法，其另外包含确定所述样品中存在至少一种恶性疾病的可溶性标志，该标志选自mesothelin相关抗原、癌胚抗原、CA125、唾液酸TN、鳞状细胞癌抗原、组织多肽抗原和胎盘碱性磷酸酶。
38.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测所述抗体与所述抗原决定簇结合的条件和时间下，使(i)怀疑具有恶性疾病的第一位受试者的第一份生物样品以及(ii)已知没有恶性疾病的第二位受试者的第二份生物样品分别接触至少一种HE4a抗原多肽特异性的抗体，以确定所述第一份和第二份生物样品中分别存选自下列的分子(i)以可溶性形式天然存在于所述样品中的分子，(ii)所述第一份和第二份生物样品各分别包含来自所述第一位和第二位受试者的细胞时的细胞表面分子，所述分子具有与所述至少一种抗体反应的抗原决定簇，并比较所述抗体与第一份及第二份生物样品中所述抗原决定簇的可检测性结合水平，从而检测恶性疾病的存在。
39.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含检测受试者生物样品中存在免疫特异性结合HE4a抗原多肽的抗体。
40.权利要求39的方法，其中所述HE4a抗原多肽包含具有选自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13氨基酸序列的多肽。
41.HE4a抗原多肽特异性的抗体，其包含特异性结合HE4a抗原多肽的单克隆免疫球蛋白可变区，其中所述HE4a抗原多肽包含具有选自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO11和SEQ ID NO13氨基酸序列的多肽。
42.权利要求41的抗体，它是融合蛋白质。
43.权利要求41的抗体，它是单链抗体。
44.权利要求41的抗体，其中所述HE4a抗原多肽被糖基化。
45.权利要求41的抗体，其选自(i)特异性结合SEQ ID NO11所示HE4a抗原多肽序列、但不特异性结合SEQ ID NO9所示多肽序列的抗体，(ii)特异性结合SEQ ID NO9所示多肽序列、并特异性结合SEQ ID NO11所示HE4a多肽序列的抗体。
46.权利要求41的抗体，其选自单克隆抗体2H5、3D8和4H4。
47.筛选受试者中存在恶性疾病的方法，其包含在足以检测以可溶性形式天然存在于所述样品中的抗体与所述HE4a多肽结合的条件和时间下，使受试者的生物样品接触可检测性标记的HE4a多肽，从而检测恶性疾病的存在。
48.分离的核酸分子，其选自(a)编码包含HE4a抗原多肽以及至少一种融合结构域的融合蛋白质的核酸分子，该多肽包含选自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQID NO11和SEQ ID NO13所示氨基酸序列的氨基酸序列；以及(b)能够在中度严谨性条件下与(a)中核酸分子杂交、并编码HE4a多肽的核酸分子，其中该分离的核酸分子不是包含SEQ ID NO9所示核酸序列的核酸分子。
49.反义寡核苷酸，其包含与权利要求48的核酸分子互补的至少15个连续核苷酸。
50.融合蛋白质，其包含与融合结构域融合的HE4a多肽序列。
51.权利要求50的融合蛋白质，其中所述融合结构域是免疫球蛋白或其变体或片段。
52.权利要求50的融合蛋白质，其中与HE4a多肽融合的多肽序列可由蛋白酶切割。
53.权利要求50的融合蛋白质，其中所述多肽序列是具有配基亲和力的亲和标记多肽。
54.重组表达构建体，其包含至少一种与权利要求48的核酸可操作连接的启动子。
55.权利要求54的表达构建体，其中所述启动子是被调节的启动子。
56.权利要求54的表达构建体，其中所述HE4a多肽被表达为与另一种核酸序列的多肽产物的融合蛋白质。
57.权利要求56的表达构建体，其中所述另一种核酸序列的多肽产物是免疫球蛋白恒定区。
58.权利要求54的重组表达构建体，其中该表达构建体是重组病毒表达构建体。
59.包含权利要求54-58中任一项的重组表达构建体的宿主细胞。
60.权利要求59的宿主细胞，其中该宿主细胞是原核细胞。
61.权利要求59的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核细胞。
62.产生重组HE4a多肽的方法，其包含培养包含重组表达构建体的宿主细胞，该构建体包含至少一种与权利要求48的核酸序列可操作连接的启动子。
63.权利要求62的方法，其中该启动子是被调节的启动子。
64.产生重组HE4a多肽的方法，其包含培养利用权利要求58的重组病毒表达构建体感染的宿主细胞。
65.检测样品中HE4a表达的方法，其包含(a)使权利要求49的反义寡核苷酸接触包含编码具有SEQ IDNO11所示氨基酸序列的HE4a多肽的核酸序列、或其片段或变体的样品；以及(b)检测样品中可与该反义寡核苷酸杂交的HE4a多肽编码核酸的量，从而检测样品中HE4a的表达。
66.权利要求65的方法，其中使用聚合酶链式反应来测定可与该反义寡核苷酸杂交的HE4a多肽编码核酸的量。
67.权利要求65的方法，其中使用杂交分析来测定可与该反义寡核苷酸杂交的HE4a多肽编码核酸的量。
68.权利要求65的方法，其中所述样品包含RNA或cDNA制备物。
69.治疗恶性疾病的方法，其包含给予有此需要的患者包含HE4a抗原多肽特异性抗体的组合物，所述抗体包含特异性结合具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a抗原多肽的单克隆免疫球蛋白可变区。
70.治疗恶性疾病的方法，其包含给予有此需要的患者包含具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a抗原多肽、或其片段的组合物。
71.权利要求70的方法，其中所述组合物诱导患者产生能够特异性结合具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的抗体。
72.权利要求70的方法，其中所述组合物诱导患者能够特异性识别具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的HE4a多肽、或其片段的T淋巴细胞。
全文摘要
本发明涉及用于检测恶性疾病的组合物和方法，并涉及可溶性及细胞表面形式的HE4a多肽、包括卵巢癌过表达的HE4a的发现。具体而言，本发明提供了HE4a的编码核酸序列，还提供了通过检测HE4a多肽特异性抗体与以可溶性和/或细胞表面形式天然存在于受试者样品中的分子的反应性、通过使用HE4a核酸序列进行杂交筛选来筛查该受试者中存在的恶性疾病的方法、及其它相关益处。
文档编号C07K16/30GK1813188SQ02819268
公开日2006年8月2日 申请日期2002年8月29日 优先权日2001年8月29日
发明者M·舒莫尔, I·赫尔斯特龙, K·E·赫尔斯特龙, J·A·莱德贝特, M·海登-莱德贝特 申请人:太平洋西北研究院