直接靶定的结合蛋白的制作方法

专利名称：直接靶定的结合蛋白的制作方法
技术领域：
总体来说，本发明涉及多价的、单特异性结合蛋白。具体说来，本发明涉及单特异性双体(diabodies)、三体(triabodies)和四体(tetrabodies)的组合物，以及它们的使用方法，还涉及用于在微生物宿主中表达这些功能结合蛋白的重组载体。
背景技术：
提供以下描述是为了便于读者理解。所有提供的信息或引入的参考均不作为本发明的现有技术。人工结合蛋白，特别是单克隆抗体和工程化抗体或抗体片段已经过广泛地检验，其在治疗多种人类疾病，包括癌症、自身免疫疾病、传染性的疾病、炎症和心血管疾病中起作用已得到证实(Filpula和McGuire，Exp. Opin. Ther. Patents 9231-245(1999))。例如，将用放射性同位素标记的抗体注射到患者体内后，可通过本领域已知的检测器观察肿瘤。抗体或由抗体衍生的试剂的临床应用主要依赖于其与靶抗原的特异结合能力。选择能力对将诊断或治疗剂(比如药物、毒素、细胞因子、激素、生长因子、共轭物、放射性核素或金属)有效递送到靶位点，用来检测和/或治疗人类病症阶段很重要，特别是在所述的诊断或治疗剂对机体的正常组织有毒性的时候。
抗体系统的潜在限制是本领域已知的(参见例如，Goldenberg，Am.J.Med.94297-312(1993))。检测和治疗技术中的重要参数包括，例如特异地定位在包含靶抗原的细胞位点处的注射剂量值和摄取率，即特异结合的抗体与存在于周围正常组织的游离的抗体的比率(通过放射性检测)。将抗体注射到血流中后，随着抗体的代谢和分泌其可穿透许多生理间隔。最佳地，该抗体能定位并结合于靶细胞抗原，而穿过机体的其余部分。控制抗原靶定的因素包括，例如抗原的位置和大小，抗原密度，抗原可接近性，靶组织的细胞组合物和靶定抗体的药物动力学。其他特异影响抗体靶定肿瘤的因素包括，靶抗原在肿瘤和正常组织中的表达水平和放射性标记的抗体缓慢血液清除所引起的骨髓毒性。
由被靶定肿瘤细胞增积的靶向抗体数值受下列因素的影响，即肿瘤的血管化、肿瘤的抗体穿越屏障和肿瘤内压力。非靶器官(如肝、肾或骨髓)的非特异的摄入是上述技术，尤其是放射性免疫治疗的另一个潜在的限制，其中骨髓照射经常引起剂量限制毒性。
所设计的称作直接靶定的方法是利用携带诊断或治疗用放射性同位素的抗体靶定肿瘤抗原。直接靶定方法需要可特异识别定位于肿瘤上或肿瘤内的、放射性标记的抗肿瘤单特异性抗体。这种技术通常包括将经标记的单特异性抗体注射到病人体内，使所述抗体定位于肿瘤以获得诊断或治疗效果，而未结合的抗体从体内清楚。然而，所述的放射性标记抗体并不与靶抗原形成非常稳定的复合物，因此并不长期停留在肿瘤位点处。
因此，本领域仍需要应用于直接靶定系统的多价的、单特异性抗体组合物，以及利用DNA重组技术生产上述抗体的方法。特别地、还需要表现提高的抗体摄入和与靶抗原结合的抗体，以在循环中遗留较少的游离抗体，并且理想地保护正常组织和细胞不受与所述抗体结合的毒性试剂的影响。
发明简述本发明涉及多价的、单特异性结合蛋白。
这些结合蛋白包含两个或多个结合位点，其中，每个结合位点均特异地与相同类型的靶细胞结合，优选地与上述靶细胞上的相同抗原结合。本发明进一步涉及单特异性双体、三体和四体的组合物，以及用于在微生物宿主中表达这些功能结合蛋白重组载体。本发明还提供利用本发明的组合物治疗和/或诊断肿瘤的方法。本发明的一个特定的目的在于提供一种具有提高了抗体摄入和靶抗原结合的抗体，用于肿瘤的诊断治疗。
本发明一方面提供多价的、单特异性结合蛋白，其具有两个或多个特异于相同靶抗原的结合位点。各结合位点都是由两个或多个单链Fv(scFv)片段缔合而成的，每个scFv包含由人源化或人单克隆抗体衍生出的至少两个可变结构域。在多种可备选的优选实施方案中，所述多价的、单特异性结合蛋白可以是单特异性双体，单特异性三体、或单特异性四体。在优选的实施方案中，所述的人源化或人单克隆抗体特异于肿瘤关联抗原，最优选地是癌胚抗原(CEA)。
根据本发明的另一方面，所述多价的、单特异性结合蛋白还可以包含诊断试剂、治疗剂和/或这些试剂中的两种或多种的组合。在不同的实施方案中，所述的诊断试剂可以是共轭物、放射性核素、金属、造影剂、示踪剂、检测剂或其组合。在不同的实施方案中，所述的治疗剂可以是放射性核素、化疗药物、细胞因子、激素、生长因子、毒素、免疫调节剂或其组合。
根据另一方面，本发明还提供包含编码不同多价的、单特异性结合蛋白的核苷酸序列的表达载体，以及经这些表达载体转化以生产所述结合蛋白的宿主细胞。
本发明进一步提供诊断肿瘤存在的方法和利用本发明的结合蛋白治疗肿瘤的方法。本发明的结合蛋白还可用作在受试者体内将一种或多种诊断试剂，一种或多种治疗剂、或上述两种或多种试剂的组合递送到肿瘤的有效方式，也可作为治疗的和/或诊断试剂盒提供，以便于从业人员使用。
附图的简要描述

图1是在大肠杆菌中由hMN-14-scFv-L5表达质粒合成hMN-14scFv多肽，以及形成hMN-14双体的示意图。编码未加工的多肽的核酸构建体包含编码pelB信号肽的序列，通过5个氨基酸的接头连接的hMN-14VH和hMN-14VK编码序列，以及羧基末端的组氨酸亲和标记。该图还显示由蛋白水解去除了pelB信号肽之后的成熟多肽的点状图，和包括CEA结合位点的hMN-14双体的点状图。
图2集中显示出hMN-14双体纯化的大小排阻高效液相色谱(HPLC)分析的结果。图2A是IMAC-纯化的hMN-14双体的HPLC洗脱分布图。hMN-14双体在图2A和2B中的HPLC洗脱峰用箭头指示。图2B是经WI2抗-特异基因型亲和色谱纯化的hMN-14双体HPLC洗脱分布图。在图BX轴上指示出的*9.75是对照hMN-14-Fab′-S-NEM(MW~50kDa)的HPLC保留时间(9.75分钟)。
图3集中显示hMN-14scFv多肽的蛋白质分析结果。图3A是经考马斯蓝染色的还原SDS-PAGE凝胶图，其说明hMN-14双体样品经IMAC纯化和WI2抗特异基因型亲和纯化后的纯度。用箭头指示分子量标准和hMN-14scFv多肽的位置。图3B是等电点聚焦(IEF)凝胶图。用箭头指示pI标准和hMN-14scFv多肽的位置。图3B中1道包含hMN-14Fab′-S-NEM用作标准。该图中的2道包含WI2纯化的hMN-14双体。3道包含来自WI2亲和层析柱的未结合的流出组分，由此显示出hMN-14scFv双体在这一过程中得到有效地纯化。
图4显示在肿瘤和血样中监控的注射了所述双体后的头96小时131I-hMN-14双体的水平。画出以每克组织的注射剂量(％ID/g)测定的131I-hMN-14双体的量对时间的曲线。实心方块表示肿瘤样品的数据点，空心方块表示血样的数据点。
图5显示131I-hMN-14双体在注射后48小时的生物分布。样品是从肿瘤和正常组织，包括肝、脾、肾、肺、血、胃、小肠和大肠中获取的。131I-hMN-14双体的量以每克组织的注射剂量(％ID/g)的百分比表示。
图6是在大肠杆菌中由hMN-14-0表达质粒合成hMN-14-0多肽，以及形成hMN-14三体的示意图。编码未加工的多肽的核酸构建体包含编码pelB信号肽的序列，hMN-14VH和hMN-14VK编码序列和羧基末端的组氨酸亲和标记。该图还显示由蛋白水解去除了pelB信号肽之后的成熟多肽的点状图和包括CEA结合位点的hMN-14三体的点状图。
图7集中显示出hMN-14三体纯化的大小排阻HPLC分析的结果。hMN-14三体的HPLC洗脱峰出现在第9.01分钟。可溶蛋白质在经Q-琼脂糖凝胶阴离子交换色层分离后由Ni-NTA IMAC纯化。将Q琼脂糖凝胶柱的流出组分用于HPLC分析。用箭头指示hMN-14双体和hMN-14F(ab′)2的保留时间。
图8集中显示注射后头96小时hMN-14双体(图8A)、hMN-14三体(图8B)和hMN-14四体(图8C)的肿瘤摄取和血液清除率比较。画出以每克组织的注射剂量(％ID/g)测定的125I-标记的蛋白的量对时间的曲线。
图9是在大肠杆菌中由hMN-14-1G表达质粒合成hMN-14-1G多肽，以及形成hMN-14四体的示意图。编码未加工的多肽的核酸构建体包含编码pelB信号肽的序列，和通过单一的甘氨酸残基连接的hMN-14VH和VK的编码序列，以及羧基末端的组氨酸亲和标记。该图还显示由蛋白水解去除了pelB信号肽之后的成熟多肽的点状图，和包括CEA结合位点的hMN-14四体的点状图。
图10集中显示出hMN-14-1G多肽纯化的大小排阻高效液相色谱(HPLC)分析的结果。可溶蛋白质在经Q-琼脂糖凝胶阴离子交换色层分离后由Ni-NTA IMAC纯化。将Q琼脂糖凝胶柱的流出组分用于HPLC分析。用箭头指示双体、三体和四体的HPLC洗脱峰。
图11是hMN-14-scFv-L5的核酸序列(SEQ ID NO1)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。核酸碱基1-66编码pelB信号肽；70-423编码hMN-14VH；424-438编码该接头肽(GGGGS)；439-759编码hMN-14VK；766-783编码组氨酸亲和标记。
图12是hMN-14VH(SEQ ID NO3)和hMN-14VK(SEQ ID NO4)的推定氨基酸序列。
图13是hMN-14-0的核酸序列(SEQ ID NO5)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。核酸碱基1-66编码pelB信号肽；70-423编码hMN-14VH；424-744编码hMN-14VK；751-78编码组氨酸亲和标记。
图14是hMN-14-1G的核酸序列(SEQ ID NO7)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。核酸碱基1-66编码pelB信号肽；70-423编码hMN-14VH；424-427编码该接头肽(G)；427-747编码hMN-14VK；754-771编码组氨酸亲和标记。
优选实施方案的详细描述除非另作说明、″某″或″某个″指″一或多个″。
本发明的一个实施方案涉及多价的、单特异性结合蛋白。这些结合蛋白包括两个或多个结合位点，各结合位点均对相同的单个靶抗原具有亲和力。各结合位点都是由两个或多个单链Fv(scFv)片段结合形成。各scFv包含至少两个来源于人源化或人单克隆抗体的可变结构域。本发明进一步涉及单特异性的双体、三体和四体，其可进一步包括诊断或治疗剂，或其两个或多个的组合。
由此，本发明提供包含两个或多个对相同的单个靶抗原具有亲和性的结合位点的多价的、单特异性结合蛋白，其中所述的结合位点由两个或多个单链Fv(scFv)片段结合形成，每个scFv片段包含至少两个来源与人源化或人单克隆抗体的可变结构域。在确定的实施方案中，所述的单克隆抗体特异于肿瘤相关抗原。
在结构上，完整的抗体由一个或多个Y形单位组成，所述的Y形单位包含四条多肽链。两条相同拷贝的多肽链称为重链，两条相同拷贝的多肽链称作轻链。各条多肽由单独的DNA或相连接的DNA所编码。两条重链由一个或多个二硫键连接在一起，每条轻链通过一个二硫键与一条重链相连。每条链都具有N-末端可变结构域，相对于重链和轻链分别称作VH和VL，称作Fv片段的非共价结合的一对VH和VL形成一个抗原结合位点。
分离的Fv片段在低蛋白浓度和生理条件下易于分解(Glockshuber等，Biochemistry 291362-1367(1990))，因此使用受到限制。为了改善稳定性和提高潜在效用，广泛地研究并生产出重组单链Fv(scFv)，其中VH结构域(或VL)的C末端通过可变长度的肽接头与VL结构域(或VH)的N末端相连(最近的综述参见Hudson和Kortt，J.Immunol.Meth.231177-189(1999))。
带有大于12个氨基酸残基长度接头的(例如15或18个残基的接头)的ScFvs可使同一多肽链的VH和VL区域之间相互作用，形成单体、二聚体(称作双体)和少量的高分子多聚体的混合物(Kortt等，Eur.J.Biochem.221151-157(1994))。带有由5个或更少氨基酸残基的接头的ScFvs抑制同一多肽链VH和VL区域的分子内的连接，迫使其与不同多肽链上的VH和VL结构域配对。具有3-12个氨基酸残基的接头主要形成二聚体(Atwell等，Prot.Eng.12597-604(1999))。具有0-2个氨基酸残基的接头的ScFvs形成三聚体(称作三体)、四聚体(称作四体)或更高级的寡聚体结构；然而除接头长度之外，寡聚体的确切型式还取决于组合物以及V-结构域的方向。例如，抗-神经氨糖酸苷酶抗体NC10的scFvs与0氨基酸残基接头主要形成三聚体(VH到VL方向)或四聚体(VL到VH方向)(Dolezal等，Prot.Etig.13565-574(2000))。由NC10构建的ScFvs与1到两个氨基酸残基的接头以VH到VL方向主要形成双体(Atwell等，出处同上)；相反，VL到VH方向形成四聚体、三聚体、二聚物和更高分子量多聚体的混合物(Dolezal等，出处同上)。由抗-CD19抗体HD37构建的ScFvs与0氨基酸残基接头以VH到VL方向形成单独地三聚体，而相同的构建体与1个氨基酸残基的接头形成单独地四聚体(Le Gall等，FEBS Lett.453164-168(1999))。
两个或多个scFv分子非共价的相连可以形成功能性双体、三体和四体，它们是多价的但是单特异性的。单特异性双体是相同scFv的同型二聚体，其中，每个scFv包含所选择抗体的VH结构域，并通过一短接头与相同抗体的VL结构域相连。双体是由两个scFv通过非共价相连形成的二价二聚体，形成两个Fv结合位点。三体是由三个scFv形成的三价三聚体，形成三个结合位点，四体由四个scFv形成的四价四聚体，形成四个结合位点。已利用包含带有VH1-接头-VL1的重组基因构建体的表达载体制备出几个单特异性双体(参见Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)；Atwell等，Mol.Immunol.331301-1312(1996)；Holliger等，Nature Biotechnol.15632-636(1997)；Helfrich等，Vint.J.Cancer 76232-239(1998)；Kipriyanov等，Vint.J.Cancer 77763-772(1998)；Holliger等，Cancer Res.592909-2916(1999))。在美国专利U.S.Patent Nos.4,946,778和5,132,405中公开了构建scFv的方法。在美国专利U.S.Patent Nos.5,837,242和5,844,094以及PCT申请WO98/44001中公开了生产基于scFv的多价单特异性结合蛋白的方法。
人源化抗体是一种重组蛋白，其中来自一个物种，例如啮齿动物抗体的CDRs从该啮齿动物抗体重链和轻链可变链转移到了人重链和轻链可变结构域。该抗体分子的恒定结构域来自人抗体。
本发明的一个实施方案利用一个单克隆抗体hMN-14生产抗原特异的双体、三体和四体。hMN-14是与CEA特异结合的人源化单克隆抗体(MAb)(Shevitz等，J.Nucl.Med.534217(1993)；和美国专利U.S.Patent No.6,254,868)。尽管起始的MAbs是鼠源的，现在使用人源化抗体试剂减少人抗小鼠的抗体应答。如实施例1所述，这一抗体的可变区构建到了表达构建体(hMN-14-scFv-L5)中。如图1所示，表达hMN-14双体的核酸构建体(hMN-14-scFv-L5)编码的多肽具有下述的特征(i)VH的羧基末端通过肽接头Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)与VK的氨基末端相连(利用G4S肽接头使分泌的多肽二聚体化形成双体，形成两个CEA结合位点))；(ii)VH基因之前的pelB信号肽序列使所述多肽于大肠杆菌的壁膜间隙合成；和(iii)将六个组氨酸(6His)氨基酸残基加到羧基末端以便于用IMAC纯化。
hMN-14-scFv-L5的核酸(SEQ ID NO1)的编码序列和相应推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO2)如图11所示。图1还显示出通过蛋白水解除去了pelB信号肽所得成熟多肽的点状图，和包括CEA结合位点的hMN-14双体的点状图。
人抗体是从经“工程化”成针对抗原刺激产生特异的人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在这一技术中，人重链和轻链位点的元件被引入到小鼠品系中，所述小鼠来源于包含内源性重链和轻链的靶定破坏位点的胚胎干细胞系。该转基因的小鼠可以合成特异于人抗原的人抗体，并且所述的小鼠可用于生产分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法参见Green等，Nature Genet.713(1994)，Lonberg等，Nature368856(1994)，和Taylor等，Iyat.Immun.6579(1994)。
完整的人抗体也可以通过遗传的或染色体转染的方法，以及噬菌体显示技术构建，所有这些都是本领域已知的。参见例如，McCafferty等，348552-553(1990)公开了由未经免疫的供体免疫球蛋白可变结构域的所有基因组成成分，在体外生产的人抗体及其片段。这一技术中，将抗体可变结构域框内克隆到丝状噬菌体主要或次要外壳蛋白基因中，作为功能性抗体片段在所述噬菌体颗粒表面展示。由于丝状的颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于该抗体功能特性的选择也影响编码表现所述性质的抗体的基因的选择。通过这种方式，所述的噬菌体模仿B细胞的一些特性。噬菌体展示可通过多种形式进行，关于它们的综述参见，例如Johnson和Chiswell，Curr.Opin.Struct.Biol.35564-571(1993)。
人抗体也可以通过在体外激活B细胞来产生。参见美国专利U.S.Patent Nos.5,567,610和5,229,275，它们皆在此引入作为参考。
因此，本发明提供包含对相同靶抗原具有亲合力的结合位点的多价的、单特异性结合蛋白(称作单特异性双体)，其中，所述的结合位点都是由两个单链Fv(scFv)片段结合形成的，每个scFv包含至少两个来源于人源化或人单克隆抗体的可变结构域。在特定的实施方案中，所述的单克隆抗体特异于肿瘤相关抗原。优选地，所述的肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。
在又一实施方案中，所述的单特异性双体的人源化单克隆抗体是hMN-14。在该实施方案中，各scFv优选地包含hMN-14的VH和VK区域。选择性地、各scFv进一步包含连接hMN-14VH和VK区域的氨基酸接头。在优选的实施方案中各scFv包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
表达载体是通过如图1和实施例2中描述的一系列亚克隆程序构建的。图1中以图解的方式显示出单特异性hMN-14结合蛋白的表达盒。该表达盒可包含在质粒中，所述的质粒是在宿主细胞内形成染色体外自我复制的遗传元件的一种小的双链DNA。克隆载体是可以在微生物宿主细胞中进行自我复制的DNA分子。本发明描述了表达单特异性双体、三体和四体的载体。寄主细胞接受载体复制，所述载体在每次宿主细胞分裂时进行复制。
因此，本发明也提供包含编码所述单特异性双体的核苷酸序列的表达载体。
通常所用的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)，但其他宿主细胞也是本领域所公知的，例如多种细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞。在酵母中有多种本领域技术人员已知的载体可用于将构建体引入到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包酵母)，非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)(甲基营养酵母)并使其表达。此外有多种哺乳动物表达载体是可商购的。另外，还可以使用多种基于病毒的表达体系，例如腺病毒和反转录病毒。应用这些表达体系，通过本发明的方法可以生产大量的重组抗体，将其用作可行的递送系统。
因此，本发明也提供包含编码所述的单特异性双体表达载体的宿主细胞。
当如图1所示的表达盒在大肠杆菌中表达时，一些多肽折叠并自然地形成可溶性单特异性双体。图1所示的单特异性双体具有两条多肽链，它们之间相互作用形成对CEA抗原具有亲合性的两个CEA结合位点。抗原与特异性抗体结合形成抗原抗体复合物，其中的抗原抗体分子通过非共价相互作用结合在一起。
在这一实施方案中是利用五个氨基酸残基的接头将含hMN-14MAb的VH区域的两条多肽与hMN-14MAb的VK区域连接。每条多肽形成hMN-14双体的一半。编码每条多肽的核酸(SEQ ID NO1)的编码序列和相应推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO2)如图11所示。
就三体而言，当如图6所示的表达盒在大肠杆菌中表达时，一些多肽自然地形成可溶性单特异性三体。如图6所示该单特异性三体具有三条多肽链，它们之间相互作用形成三个对CEA抗原具有高亲合性的CEA结合位点。三条多肽的任何一条均包含与hMN-14MAb无接头相连的hMN-14MAb的VH区域。每条多肽形成hMN-14三体的三分之一。编码每条多肽的核酸(SEQ ID NO5)的编码序列和相应推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO6)如图13所示。
由此，本发明提供包含对同一单个靶抗原具有亲合性的三个结合位点的多价的，单特异性结合蛋白(称作单特异性三体)，在其中所述的结合位点是由三条单链Fv(scFv)片段相连形成的，每个scFv片段包含至少两个来源于人源化或人单克隆抗体的可变结构域。在特定的实施方案中，所述的单克隆抗体特异于肿瘤相关抗原。优选地，所述的肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。
在又一实施方案中，所述的单特异性三体的人源化单克隆抗体是hMN-14。在该实施方案中，各scFv优选地包含hMN-14的VH和VK区域。在特定的实施方案中，各scFv包含SEQ ID NO6的氨基酸序列。本发明也提供包含编码该单特异性三体的核苷酸序列的表达载体和包含这些表达载体的宿主细胞。
就四体而言，当如图9所示的表达盒在大肠杆菌中表达时，一些多肽自然地形成可溶性单特异性四体。如图9所示该单特异性四体具有4条多肽链，它们之间相互作用形成四个对CEA抗原具有高亲合性的CEA结合位点。四条多肽中的每一条均包含通过单个氨基酸残基接头与hMN-14MAb的VK多肽相连的hMN-14MAb的VH多肽。每条多肽形成hMN-14四体的四分之一。编码每条多肽的核酸(SEQ ID NO7)的编码序列和相应推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO8)如图14所示。
由此，本发明提供包含对同一单个靶抗原具有亲合性的四个结合位点的多价单特异性结合蛋白(称作单特异性四体)，在其中所述的结合位点是由4条单链Fv(scFv)片段相连形成的，每个scFv片段包含至少两个来源于人源化或人单克隆抗体的可变结构域。在特定的实施方案中，所述的单克隆抗体特异于肿瘤相关抗原。优选地，所述的肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。
在另一实施方案中，该人源化单克隆抗体是hMN-14。在该实施方案中，各scFv优选地包含hMN-14的VH和VK区域。选择性地、各scFv进一步包含连接hMN-14VH和VK区域的氨基酸接头。在特定的实施方案中，各scFv包含SEQ ID NO8的氨基酸序列。本发明也提供包含编码该单特异性四体的核苷酸序列的表达载体和包含这些表达载体的宿主细胞。
在优选的实施方案中、本发明的单特异性双体、三体和四体用作直接靶定CEA阳性肿瘤的诊断或治疗剂。也可以靶定其他的肿瘤相关抗原，例如A3，A33，BrE3，CD1，CD1a，CD3，CD5，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD45，CD74，CD79a，CEA，CSAp，EGFR，EGP-1，EGP-2，Ep-CAM，Ba733，HER2/neu，KC4，KS-1，KS1-4，Le-Y，MAGE，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PAM-4，PSA，PSMA，RS5，S100，TAG-72，粘蛋白、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、17-1A、血管生成标记、细胞因子、免疫调节剂、致癌基因标记和致癌基因产物。该单特异性分子选择性地与靶抗原结合，随着该分子上的结合位点数目增多，对靶细胞的亲合性也随之提高。强的亲合性使本发明的组合物长时间停留在包含该靶抗原的预定位置。此外，游离的未结合分子很快从身体中清除出去，从而使正常组织暴露于有害物剂的可能性最小化。
Herberman对肿瘤相关标记进行了分类(参见例如，癌症的免疫诊断、癌症的该临床生物化学、Fleisher版、American Association ofClinical Chemists，1979)将其分成许多种类，包括胎性癌抗原、胎盘抗原、致癌的或肿瘤病毒结合抗原、组织结合抗原、器官结合抗原、异位激素和正常抗原或其变体。如美国专利U.S.Patent Nos.4,361,644和4,444、744中所描述的，有时可方便地利用肿瘤结合标记的亚-单位，例如人绒毛膜促性腺激素(HCG)的β-亚基或癌胚抗原CEA的γ区域增加具有高肿瘤特异性的抗体，所述的亚单位刺激了对非肿瘤物质的交叉反应大大降低的抗体产生。肿瘤脉管系统(例如VEGF)、肿瘤坏死、膜受体(例如、叶酸受体、EGFR)、横跨膜抗原(例如PSMA)，以及致癌基因产物的标记还可以用作抗体或抗体片段的适当的肿瘤-结合靶。在肿瘤细胞上过表达的正常细胞成分的标记，例如B细胞复合抗原和由特定肿瘤细胞表达的细胞因子(例如T-细胞恶性肿瘤中的IL-2受体)也是本发明的抗体和抗体片段的适当的靶子。
在Couto等，Cancer Res.555973s-5977s(1995)中描述了BrE3抗体。美国在先申请No.60/360,229中描述了EGP-1抗体，Staib等，Int.J.Cancer 9279-87(2001)，Schwartzberg等，Crit.Rev.Oncol.Hemato.4017-24(2001)中引述了一些EGP-2抗体。Koda等，A4f2ticancer Res.21621-627(2001)中引述了KS-1抗体；Ritter等，Cancer Res.616854-6859(2001)中引述了A33抗体；Di Carlo等，Oncol.Rep.8387-392(2001)中描述了Le(y)抗体B3；Tordsson等，Int.J.Cancer 87559-568(2000)中描述了A3抗体。
还可以应用针对致癌基因标记或产物的抗体、或针对血管生成因子，如VEGF的抗体。在美国专利U.S.Patent Nos.6,342、221,5、965,132和6,004、554中描述了VEGF抗体，所述文献均在此完全引入作为参考。Todryk等，J.Immunol.Meth.248139-147(2001)和Turner等，J.Immunol.16689-94(2001)中描述了针对特定免疫反应调节剂的抗体，例如针对CD40的抗体。其他适合于联合治疗的抗体包括抗坏死抗体，参见Epstein等U.S.Patent Nos.5,019,368；5,882,626；and 6,017,514。
因此，本发明提供所述的多价的、单特异性结合蛋白，其包含至少两个来源于对与下述疾病状态相关的肿瘤相关抗原特异的人源化或人单克隆抗体的可变结构域，所述的疾病状态选自恶性肿瘤、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、白血病、神经胶质瘤、淋巴瘤和骨髓瘤。所述的肿瘤相关抗原可与选自下述的一种癌症相关，所述的癌症选自急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、胆的、胸部的、颈的慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠的、子宫内膜的、食管的、胃的、头和颈的Hodgkin淋巴瘤、肺、骨髓的，甲状腺的非Hodgkin淋巴瘤、卵巢的、胰腺的、衰竭的和膀胱的癌症。所述的肿瘤相关抗原可以选自A3，A33，BrE3，CD1，CD1a，CD3，CD5，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD45，CD74，CD79a，CEA，CSAp，EGFR，EGP-1，EGP-2，Ep-CAM，Ba733，HER2/neu，KC4，KS-1，KS1-4，Le-Y，MAGE，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PAM-4，PSA，PSMA，RS5，S100，TAG-72，粘蛋白、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、17-1A、血管生成标记、细胞因子、免疫调节剂、致癌基因标记和致癌基因产物。在优选的实施方案中，所述的肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。在优选的实施方案中，该人源化单克隆抗体是hMN-14。
本发明的又一实施方案包括利用本发明的抗体或抗体片段检测、诊断和/或治疗患病组织(例如，癌症)，其包括施用有效量的二价、三价或四价的抗体或抗体片段，所述的抗体或抗体片段包含至少两个与靶组织特异结合的臂。
因此，本发明提供所述的多价的、单特异性结合蛋白，进一步包含选自下述的至少一种试剂，即诊断试剂、治疗剂以及它们当中的两种或多种的组合。所述的诊断试剂可以选自共轭物、放射性核素、金属、造影剂、示踪试剂、检测剂，以及它们当中两种或多种的组合。
在特定的实施方案中包含诊断放射性核素，所述的放射性核素选自11C，13N，15O，18F，32P，51Mn，52Fe，52mMn，55Co，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，68Ga，72As，75Br，76Br，82mRb，83Sr，86Y，89Zr，90Y，94mTc，94Tc，99mTc，110In，111In，120I，123I，124I，125I，131I，154-158Gd，177Lu，186Re，188Re，γ-发射器、β-发射器、正电子发射器以及它们当中两个或多个的组合。在其他的特定实施方案中，所述的放射性核素选自51Cr，57Co，58Co，59Fe，67Cu，67Ga，75Se，97Ru，99mTc，111In，114mIn，123I，125I，131I，169Yb，197Hg，201Tl，以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含金属，所述的金属选自钆、铁、铬、铜、钴、镍、镝、铼、铕、铽、钬、钕以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含造影剂、所述的造影剂可以是核磁共振成像造影剂、CT造影剂，或超声造影剂。造影剂可以选自钆离子、镧离子、锰离子、铁、铬、铜、钴、镍、镝、铼、铕、铽、钬、钕、另一种类似的造影剂以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含示踪试剂、所述的示踪试剂选自碘化物、钡化合物、镓化合物、铊化合物、钡、泛影葡胺、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡明酸、碘酸胺酸、碘达酸、胆影酸、碘沙酸、iogulamide、iohexol、碘异肽醇、碘番酸、ioprocemicacid、碘西法酸、碘丝酸、iosulamidemeglumine、iosemeticacid、iotasul、iotetricacid、iothalamicacid、碘托西酸、ioxaglic acid、ioxotrizoic acid、ipodate、甲基葡胺、碘葡酰胺非离子型造影剂、甲泛影钠、丙碘酮、氯化亚铊、以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含检测剂、所述的检测剂选自酶、荧光化合物、化学发光的化合物、生物发光的化合物、放射性同位素、以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含治疗剂、所述的治疗剂选自放射性核素、化学治疗的药、细胞因子、激素、生长因子、毒素、免疫调节剂、以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含治疗性的放射性核素，其选自32P，33P，47Sc，59Fe，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，75Se，77As，89Sr，90Y，99Mo，105Rh，109Pd，111Ag，111In，125I，131I，142Pr，143Pr，149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，169Er，177Lu，186Re，188Re，189Re，194Ir，198Au，199Au，211At，211Pb，212Bi，212Pb，213Bi，223RA，225Ac，以及它们当中两个或多个的组合。在其他的特定实施方案中，所述的放射性核素选自58Co，67Ga，80mBr，99mTc，103mRh，109Pt，111In，119Sb，125I，161Ho，189mOs和192Ir，152Dy，211At，211Bi，212Bi，213Bi，215Po，217At，219Rn，221Fr，223Ra，225Ac，255Fm，以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含化疗药物，所述的化疗药物选自长春花生物碱、anthracyclines、epidophyllotoxins、taxanes、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂的、抗血管生成试剂、编程性细胞死亡试剂(apoptotoic agents)、阿霉素、氨甲蝶呤、红豆杉醇、CPT-11、喜树碱(camptothecans)、氮芥类、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素、以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含毒素、所述的毒素选自蓖麻毒、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、金黄色葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素毒素、假单胞菌属外毒素、假单胞菌属内毒素、以及它们当中两个或多个的组合。
在特定的实施方案中包含免疫调节剂，所述的免疫调节剂选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、生血的因子、集落刺激因子、干扰素、干细胞生长因子、促红细胞生成素、促血小板生成素、以及它们当中两个或多个的组合。
多种诊断和治疗试剂可以方便地与本发明的抗体共轭结合。此处所述的治疗剂是那些可分别与本发明所描述的多价结合蛋白一起施用的试剂。治疗剂包括，例如，化疗药物，如长春花生物碱、anthracyclines、epidophyllotoxins、taxanes、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂的、抗血管生成和编程性细胞死亡试剂、特别阿霉素、氨甲蝶呤、红豆杉醇、CPT-11、喜树碱，以及由此及其他类型抗癌剂而来的治疗剂等等。其他对免疫共轭和抗体融合蛋白有用的癌症化疗药物包括氮芥类、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素、等等。有用的治疗组合物可以包含通常用于治疗CEA-产生的癌症的其他试剂、抗-HER2抗体(例如Herceptin)和抗-EGF抗体。用于与本发明的多价结合蛋白结合的抗体可以是单克隆的、多克隆的或人源化抗体。其他合适的化疗剂参见REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.1995)，和GOODMAN AND GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)，以及这些出版物的修订版。其他合适的治疗剂包括本领域技术人员已知的实验药物和在进行临床试验的药物。
毒素，如假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、也可与本发明的抗体免疫共轭物络合或形成所述治疗剂的一部分。其他适合用于所述共轭物制剂或其他融合蛋白的毒素包括蓖麻毒、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNase)、脱氧核糖核酸酶I、葡萄球菌的肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌属内毒素(参见，例如Pastan等，Cell 47641-648(1986)，和Goldenberg，CA Cancer J.Clin.4443964(1994))。此外适用于本发明的毒素是本领域的技术人员已知的参见美国专利U.S.Patent No.6,077,499，其在此全部引入作为参考。
所述的诊断和治疗剂可以包括药物、毒素、细胞因子、带有细胞因子的共轭物、激素、生长因子、共轭物、放射性核素、造影剂、金属、细胞毒类药物和免疫的调节剂。例如，钆金属用于磁共振成象，偶联荧光染料可用于在光力学治疗。此外、造影剂可以是核磁共振成像造影剂、比如钆离子、镧离子、锰离子、铁、铬、铜、钴、镍、镝、铼、铕、铽、钬、钕或其他的可比较的标记物、CT造影剂和超声造影剂。
在本发明的方法中，可进行靶定的构建体可以包含一种或多种用于检测患病组织的放射性同位素。特别有用的诊断放射性核素包括、但不限于11C，13N，15O，18F，32P，51Mn，52Fe，52mMn，55Co，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，68GA，72As，75Br，76Br，82mRb，83SR，86Y，89Zr，90Y，94mTc，94Tc，99mTc，110In，111In，120I，123I，124I，15I，131I，154-158Gd，177Lu，186Re，188Re，或其他γ-、-β或正电子发射器，优选在20到4,000keV衰变能量范围内，更优选在25到4,000keV范围内，更优选在20到1,000keV范围内更优选地在70到700keV范围内。有用的正电子发射的放射性核素总衰变能量优选地＜2,000keV、更优选低于1,000keV，最优选＜700keV。
用作适合利用γ射线探测的诊断试剂的放射性核素包括但不限于51Cr，57Co，58Co，59Fe，57Cu，67Ga，75SE，97Ru，99mTc，111In，114mIn，123I，125I，131I，169Yb，197Hg，和201Tl。发射γ-射线的有用的放射性核素衰变的能量优选地是20-2000keV、更优选是60-600keV，最优选是100-300keV。
在本发明的方法中，可进行靶定的构建体可以包含一种或多种用于治疗患病组织的放射性同位素。特别有用的治疗的放射性核素包括、但不限于32P，33P，47Sc，59Fe，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，75Se，77As，89Sr，90Y，99Mo，105Rh，109Pd，111Ag，111In，125I，131I，142Pr，143Pr149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，169Er，177Lu，186Re，188Re，189Re，194Ir，198Au，199Au，211At211Pb，212Bi，212Pb，213Bi，223Ra和225Ac。所述的治疗性放射性核素的衰变能量优选在20到6,000keV范围内，优选地对于螺旋推运器发射器在60到200keV范围内，对于β发射体在100-2,500keV范围内，对于α发射体在4,000-6,000keV范围内。
还优选的是基本上随螺旋推运器放射颗粒衰变的放射性核素。上述的放射性核素包括但不限于58Co，67Ga，80mBr，99mTc，103mRh，109Pt，111In，119Sb，125I，161Ho，189Os and192Ir。还优选的是基本上随α颗粒的产生而衰变的放射性核素。上述的放射性核素包括但不限于152Dy，211At，211Bi，212Bi，213Bi，215Po，217At，219Rn，221Fr，223Ra，225Ac和255Fm。有用的发射α颗粒的放射性核素的衰变能量优选在2,000-9,000keV，更优选3,000-8,000keV，最优选4,000-7,000keV。
本发明的抗体及其片段可以包括附加的示踪试剂。不透射线的和对照材料用于增强X-射线和计算层析成象，其包括碘化物、钡化合物、镓化合物、铊化合物、等等。特异的化合物包括钡、泛影葡胺、乙碘油、镓柠檬酸盐、碘卡明酸、碘酸胺酸、碘达酸、胆影酸、碘沙酸、iogulamide、iohexol、碘异肽醇、碘番酸、ioprocemic acid、碘西法酸、碘丝酸、iosulamide meglumine、iosemeticacid、iotasul、iotetric acid、iothalamic acid、碘托西酸、ioxaglic acid、ioxotrizoic acid、ipodate、甲基葡胺、碘葡酰胺非离子型造影剂、甲泛影钠、丙碘酮和氯化亚铊。
本发明的抗体及其片段也可以用荧光化合物标记。通过将靶抗原结合蛋白暴露于适当波长的光确定荧光标记的MAb的存在并检测所得的荧光。荧光标记物化合物包括异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、o-phthaldehyde和荧光胺。荧光标记的抗原结合蛋白对流式细胞光度术分析特别有用。
换句话说，可通过将所述结合蛋白与化学发光的化合物偶联使抗体及其片段成为可检测的标记物。通过检测在化学反应的过程中发生的荧光确定化学发光的-标记的MAb的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、acridinium盐和草酸酯。
类似地，生物发光的化合物可用于标记抗体及其片段。生物发光是在生物系统发现的一种化学发光，其中催化蛋白提高了化学发光反应的效率。通过检测荧光的存在来确定生物发光的蛋白的存在。可用于标记的生物发光的化合物包括萤光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
换句话说，可通过将所述抗体与酶连接使抗体及其片段成为可检测的标记物。当在适当的底物存在下孵化抗体-酶共轭物时，酶组分与底物反应生成可由例如，分光光度法、荧光的或直观的方式检测的化学组分。用于形成可检测的标记抗体的酶的实例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌的核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
免疫调节剂，如细胞因子、也可以与本发明的嵌合的、人源化的或人抗体或其片段偶联，或形成抗体免疫共轭物的治疗剂部分，再或以非偶联的方式施用。此处所用的术语″免疫调节剂″包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、比如肿瘤坏死因子(TNF)和生血的因子、比如白细胞间介素(例如、白细胞间介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12和IL-18)、集落刺激因子(例如、粒性白细胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒性白细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如、干扰素-α、-(β和γ)、所述的干细胞生长因子指定为″S1因子、″促红细胞生成素和促血小板生成素。适当的免疫调节剂元件的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、干扰素-γ、TNF-α等等。换句话说，受试者可以承受裸抗体和在所述裸抗体施用之前、同时或之后单独施用的细胞因子。所述抗体也可以与免疫调节剂相偶联。该免疫调节剂也可以与由和不同抗原结合的一种或多种抗体组成的杂合抗体相偶联。
通过形成二硫键治疗或诊断试剂可以附着于经简化的抗体组分的铰链区。作为一种替代，上述的肽可以利用异源双功能交联接头，如N-琥珀酰3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)附着于抗体组分(Yu等，Int.J.Cancer 56244-248(1994))。这种偶联的常规技术是本领域已知的，参见，例如，Wong，蛋白结合和交联化学(CRC Press 1991)；Upeslacis等，″通过化学法修饰抗体，″单克隆抗体原理与应用，Birch等(编)，187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″合成肽衍生的抗体的生产与表征，″单克隆抗体生产、工程化与临床应用，Ritter等(编)，60-84页(Cambridge University Press1995)。换句话说，治疗或诊断试剂可以通过碳水化物元件在抗体的Fc区域与之偶联。该碳水化合物基团可用于增加与硫醇基结合的相同的肽，或者所述的碳水化合物组分可用于结合不同的肽。
这些试剂用来诊断和/或治疗哺乳动物病症。哺乳动物可以包括人、家畜和宠物、比如猫和狗。哺乳动物病症可以包括癌症、比如恶性肿瘤、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、白血病、神经胶质瘤与骨髓瘤。癌症的类型包括、但不局限于、胆汁的、胸部、颈的、结肠直肠的、子宫内膜的、食管的、胃的、头和颈、肺、骨髓的甲状腺、卵巢的、胰腺的、衰竭的(prostrate)和膀胱癌症。
因此、本发明提供诊断肿瘤存在的方法，该方法包括对怀疑患有肿瘤的受试者施用可检测量的上述多价的、单特异性结合蛋白，该结合蛋白包含上述的诊断试剂，监控受试者以检测任何结合蛋白与肿瘤的结合。
本发明进一步提供治疗肿瘤的方法，该方法包括对所需受试者使用有效剂量的上述多价的、单特异性结合蛋白，所述结合蛋白包含上述的诊断试剂。
本发明进一步提供诊断肿瘤存在的方法，该方法包括对怀疑患有肿瘤的受试者施用可检测量的上述多价的、单特异性结合蛋白的同时，施用可与上述结合蛋白结合的可检测元件，监控受试者以检测任何结合蛋白与肿瘤的结合。
本发明进一步提供治疗肿瘤的方法，该方法包括对所需受试者使用有效剂量的上述多价的、单特异性结合蛋白的同时施用治疗剂。在优选实施方案中，所述的治疗剂选自化疗药物、毒素、外辐射、短程治疗辐射试剂、放射性标记的蛋白、抗癌药和抗癌抗体。
本发明进一步提供将一种或多种诊断试剂、一种或多种治疗剂或其两种或多种的组合递送到肿瘤的方法，该方法包括，对所需受试者施用上述的多价的、单特异性结合蛋白，以及选自诊断试剂、治疗剂、以及它们当中两个或多个的组合的至少一种的试剂。
向靶递送本发明的诊断或治疗剂包括，提供带有诊断或治疗剂的结合蛋白，对所需受试者施用所述结合蛋白。诊断进一步的要求利用已知的技术检测结合蛋白的步骤。
将本发明的带有诊断或治疗剂的结合蛋白施用于哺乳动物的方法可以是静脉内的、动脉内的、腹膜内的、肌内的、皮下的、胸膜内的、鞘内的、通过局部导管灌注或通过直接的损害注射。当通过注射施用所述结合蛋白时可以通过连续地灌注或通过单一的或多重的丸剂施用。
所述的带有诊断或治疗剂的结合蛋白可与药学上可接受的注射载体一起作为试剂盒用于人或哺乳动物的治疗或诊断，所述的载体优选地是在生理pH和浓度下的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述的制剂优选地是无菌的，尤其是在应用于人时。该试剂盒的可任选组分包括稳定剂、缓冲液、标记试剂、放射性同位素、顺磁化合物、用于增强清除作用的第二抗体和常规的注射器、柱、小瓶等等。
因此、本发明也提供诊断和治疗用试剂盒，所述的试剂盒包含至少一个上述的多价的、单特异性结合蛋白，至少一项选自诊断试剂、治疗剂、以及它们当中两个或多个的组合的试剂，以及附加的试剂、设备与使用说明。
实施例下述的实施例是用于说明本发明的实施方案，不应将其以任何形式作为对本发明保护范围的限制。
实施例1-在大肠杆菌中表达hMN-14双体的质粒的构建如下所示利用标准的重组DNA方法获得hMN-14-scFv-L5。应用Pfu聚合酶通过聚合酶链式反应(PCR)由构建用于表达hMN-14Fab′的载体(Leung等，Cancer Res.555968s-5972s(1995))扩增hMN-14VK和VK序列。用下述的寡核苷酸引物扩增hmn-14VH序列hMN-14VH-左5′-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3′(SEQ ID NO9)hMN-14VH-右(G4S)5′-CATAGGATCCACCGCCTCCGGAGACGGTGACCGGGGT-3′(SEQ ID NO10)。
左侧的PCR引物包含5′NcoI限制酶切位点。右侧的PCR引物包含5个氨基酸残基的接头(G4S)和BamHI限制酶切位点。将PCR产物用NcoI和BamHI消化并与pelB信号肽序列框内连接，插入到NcoI/BamHI消化的pET-26b载体以生产hMN-14VHL5-pET26。用下述的寡核苷酸引物扩增hMN-14VK序列hMN-14VK-左5′-CTGAGGATCCGACATCCAGCTGACCCAGAG-3′(SEQ IDNO11)hMN-14VK-右5′-GCTACTCGAGACGTTTGATTTCCACCTTGG-3′(SEQ IDNO12)。
左侧和右侧的PCR引物分别包含BamHI和XhoI限制酶切位点。该PCR产物用XhoI和BamHI消化，与hMN-14VH，G4S接头和6His序列框内连接，插入到经XhoI/BamHI消化的hMN-14VHL5-pET26构建体中以形成表达构建体hMN-14-scFv-L5。该构建体的DNA序列经自动DNA测序仪验证，列于图11中。核酸构建体hMN-14-scFv-L5列于图1。
实施例2-hMN-14双体在大肠杆菌中的表达用hMN-14-scFv-L5构建体转化BL21(P-LysS)大肠杆菌。培养物条件、诱导和纯化按如下方式进行。以标准的方法用hMN-14-scFv-L5转化感受态的E.coli BL21(P-Lys-S)。培养物在添加了100μg/ml卡那霉素硫酸盐和34μg/ml氯霉素的2xYT培养基中，于37℃下振荡培养至OD600值为1.6-1.8。室温下向培养物中加入等量的添加了抗生素和0.8M蔗糖的2xYT培养基，然后转移到20℃。20℃下30分钟后，添加40μMIPTG诱导表达，再继续在20℃下培养15-18小时。
在下述物质中检测hMN-14双体的表达(1)细胞培养物条件培养基；(2)在非变性条件下从离心所得的细胞颗粒中抽提可溶性蛋白；和(3)经过几轮的抽提和离心后保留在颗粒中的不溶物质。
如下所述从细菌细胞颗粒中提取可溶性蛋白。冻融细胞颗粒，然后用相当于培养物体积1％的裂解缓冲液(2％Triton X-100；300mMNaCl；10mM咪唑；5mM MgSO4；25单位/ml benzonase；50mMNaH2PO4(pH8.0))将其重悬。将所述悬液通过超声处理搅匀，通过离心作用澄清，加载到Ni-NTA IMAC柱。用含20mM咪唑的缓冲液洗柱后，用100mM咪唑缓冲液(100mM咪唑；50mM NaCl；25mM Tris(pH7.5))洗脱，洗脱物进一步的通过亲和层析与固定于Affi-凝胶上的抗-id抗体结合来纯化。
不溶性的颗粒物质在变性Ni-NTA结合缓冲液(8M尿素；10mM咪唑；0.1M NaH2PO4；10mM Tris(8.0))中溶解，并与1ml Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Inc.)混合。将所述混合物在室温下摇动1小时，然后将树脂用50毫升同样的缓冲液洗一次后上柱。该柱用20ml同样缓冲液洗后再用20ml洗涤缓冲液(8M尿素；20mM咪唑；0.1M NaH2PO4；10mM Tris(pH8.0))洗。结合蛋白用5毫升的变性洗脱缓冲液(8M尿素；250mM咪唑；0.1M NaH2PO4；10mM Tris(pH8.0))洗脱。
结合的可溶性蛋白从Ni-NTA树脂上洗脱并加载到WI2抗-特异基因型亲和层析柱上。该柱用PBS洗，用0.1M甘氨酸；0.1M NaCl(pH2.5)洗脱结合多肽并立即中和。
虽然表达的大多数hMN-14scfv是不溶蛋白，但是仍从可溶组分中纯化出约1.5mg/L的可溶性hMN-14scFv培养物。如大小排阻高效液相色谱法(HPLC)所示，IMAC纯化和亲合纯化材料的主要的峰出现在第9.8分钟(参见图2A和2B)。如图2BX轴所示，分子量大约50kDa的hMN-14Fab′的保留时间是9.75分钟。由于单体的hMN-14scFv的推算分子量是26kDa，所以hMN-14scFv的非常类似的保留时间表明它作为二聚体或双体存在于溶液中。SDS-PAGE凝胶分析(参见图3a)显示出预计大小在26kDa的单一带，等电点聚焦(IEP)凝胶分析(参见图3B)得到一条pI8.2的带，接近计算出的pI7.9。竞争酶联免疫吸附显示hMN-14双体是功能性的并表现出优异的结合性质。
用131I-标记的hMN-14双体注射带有CEA阳性GW-39肿瘤的裸鼠，在注射后不同的时间分析其生物分布。如图4所示一方面大量的双体保持与肿瘤结合超过96小时，另一方面游离的双体迅速地从血液中清除。图5显示在注射后48小时与肿瘤和正常组织例如肝、脾、肾、肺、血液、胃、小肠和大肠结合的注射剂量百分比。与肿瘤中的数量相比，在每一正常组织中的注射剂量数值都极低。表1总结了在24，48和72小时肿瘤中超过所列出的正常组织中的活性提高量(例如，在24小时，肿瘤中的放射性是肝脏中的22.47倍)。
表1.肿瘤与非肿瘤的比率
实施例3-表达hMN-14三体的质粒的构建设计、生产并检验了hMN-14scFv质粒构建体。大肠杆菌表达质粒指导具有以下特点的单一多肽合成(1)在没有任何附加的氨基酸的情况下hMN-14VH的羧基末端直接与hMN-14VIc的氨基末端相连(利用零接头使所分泌的多肽形成称作三体的三聚体结构，以形成三个CEA结合位点)；(2)VH基因之前的pelB信号肽序列使所述多肽于大肠杆菌的壁膜间隙合成；和(3)六个组氨酸(6His)氨基酸残基加到羧基末端以便于用IMAC纯化。该多肽和三体的略图如图6所示。
利用标准的重组DNA方法获得hMN-14-0构建体。利用Pfu聚合酶通过PCR从hMN-14scFv-L5构建体扩增hMN-14VH和VK序列。用下述的寡核苷酸引物扩增hMN-14VH序列hMN-14VH-左5′-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3′(SEQ IDNO13)hMN-14VH-0-右5′-GATATCGGAGACGGTGACCGGG-3′(SEQ ID NO14)原先用来构建hMN-14scFv-L5的左侧PCR引物包含一5′NcoI限制酶切位点。右侧PCR引物包含EcoRV限制酶切位点。将PCR产物克隆到PCR克隆载体pGemT(promega)。
用下述的寡核苷酸引物扩增hMN-14VK序列hMN-14VK-0左5′-GATATCCAGCTGACCCAGAGCC-3′(SEQ ID NO15)hMN-14Vx-右5′-GCTACTCGAGACGTTTGATTTCCACCTTGG-3′(SEQ IDNO16)左侧PCR引物包含EcoRV限制酶切位点。原先用来构建hMN-14scFv-L5的右侧PCR引物包含XhoI限制酶切位点。将PCR产物克隆到pGemT载体。用EcoRV和SalI从Vx-0-pGemT构建体中切下VK-0序列，将其连接到VH-0-pGemT构建体的相同位点上以在pGemT中产生hMN-14-0。用NcoI和XhoI将VH-VK序列切下，转移到pET26b以产生hMN-14三体表达构建体hMN-14-0。该构建体的DNA序列经自动DNA测序仪验证，列于图13中。核酸构建体hMN-14scFv-0列于图6。
实例4-hMN-14三体在大肠杆菌中的表达用hMN-14-0构建体转化BL21(P-LysS)大肠杆菌。除hMN-14-0三体是用Q-Sepharose阴离子交换色谱法而非亲和层析纯化外，培养物条件、诱导和纯化均按类似于实施例2中对hMN-14双体的描述进行。如期望的那样，hMN-14-0主要形成三体(~80kda)。
从诱导培养物的可溶性细胞组分中纯化出大约2.4mg/l可溶性hMN-14三体培养物。如大小排阻高效液相层析法(参见图7)所示，利用IMAC和mono-Q阴离子交换色谱法纯化，主要的峰出现在在9.01分钟。相比之下，hMN-14双体(~52kDa)和hMN-14F(ab′)2(~100kDa)的保留时间分别为9.6分钟和8.44分钟。事实上，由于计算的单体hMN-14-0多肽的分子量是～26kDa，而hMN-14-0的保留时间刚好在52kDa和100kDa蛋白的保留时间之间，表明它作为三聚体或三体存在于溶液中。
用131I标记的hMN-14三体注射带有CEA阳性的GW-39肿瘤的裸鼠，在注射后不同的时间分析其生物分布。图8显示hMN-14三体的肿瘤摄入和保持显著地高于hMN-14双体。一个小时以后，三体在肿瘤中积累到在双体水平的大约60％。然而一个小时以后，在双体稳定减少的时候、三体肿瘤摄入增多至在24到48小时之间所达到的最大值。三体肿瘤摄入最大值(24-48小时)是双体(1小时)摄入量的2倍多。由于三体利用全部三个CEA结合位点表现为三价肿瘤结合，所以与双体相比三体的肿瘤保持时间显著延长。其他可能对肿瘤摄入有显著影响的因素是分子大小。如图8所示，与54kDa的双体相比，80kDa三体的血液清除速度要慢得多。这可使三体有更长的时间与肿瘤发生相互作用，可比双体实现更高水平的肿瘤摄入。三体的血液清除延迟无疑有助于其优势的肿瘤驻留。但也对其他的因素，包括由于多价产生的增加的亲合力或改进的体内稳定性起作用。对所有的组织肿瘤对非肿瘤的比率均随时间而提高(表2)。所述的比率基本上是在其后的时间点。
表2肿瘤相对于非肿瘤的hMN-14三体比率
实施例5-表达hMN-14四体的质粒的构建设计、生产并检验了hMN-14 1G质粒构建体。大肠杆菌表达质粒指导具有以下特点的单一多肽合成(1)hMN-14VH的羧基末端通过单个甘氨酸残基与hMN-14VK氨基末端相连(通过利用1G接头使一些分泌的多肽形成称作四体的四聚体结构，形成四个CEA结合位点)；(2)VH基因之前的pelB信号肽序列使所述多肽于大肠杆菌的壁膜间隙合成；和(3)六个组氨酸(6His)氨基酸残基加到羧基末端以便于用IMAC纯化。该多肽和四体的略图如图9所示。
利用标准的重组DNA方法获得hMN-14-1G构建体。利用Pfu聚合酶通过PCR从hMN-14scFv-L5构建体扩增hMN-14VH和VK序列。用下述的寡核苷酸引物扩增hMN-14VH序列hMN-14VH-左5′-CGTACCATGGAGGTCCAACTGGTGGAGA-3′(SEQ IDNO17)hMN-14VH-1G右5′-GCTGGATATCACCGGAGACGGTGACCGGGGTCC-3′(SEQID NO18)原先用来构建hMN-14scFv-L5的左侧PCR引物包含一5′NcoI限制酶切位点。右侧PCR引物包含单个甘氨酸的编码序列和EcoRV限制酶切位点。将PCR产物克隆到PCR克隆载体pGemT(Promega)。用EcoRV和SalI从hMN-14VK-0-pGemT构建体中切下hMN-14VK-0序列(参见实施例3)序列，将其连接到hMN-14VH-1C-pGemT构建体的相同位点上以在pGemT中产生hMN-14-1G。用NcoI和XhoI将VH-1G-VK序列切下，转移到pET26b以产生hMN-14四体表达构建体hMN hMN-14 hMN-14-1G。该构建体的DNA序列经自动DNA测序仪验证，列于图14中。核酸构建体hMN-14scFv-1G列于图9。
实例6 hMN-14四体在大肠杆菌中的表达用hMN-14-1G构建体转化BL21(P-LysS)大肠杆菌。除hMN-14-0四体是用Q-Sepharose阴离子交换色谱法而非亲和层析纯化外，培养物条件、诱导和纯化均按类似于实施例2中对hMN-14双体的描述进行。可溶性表达水平高，每升培养物可分离出多于2mg的可溶性产物。大小排阻高效液相层析法分析(参见图10)显示hMN-14-1G是以双体(53kDa)、三体(80kDa)和四体(105-120kDa)的混合物形式存在的。通过凝胶过滤色谱法可将四体以相对纯的形式分离出来。然而在2-8℃下几天以后、类似于图10所示，其逐渐恢复成双体、三体和四体的混合物。
实例7 hMN-14双体、三体和四体的肿瘤摄入利用放射性碘标记的样品在带有CEA-阳性的人结肠肿瘤异种移植的小鼠中评价肿瘤靶定。在24小时，在肿瘤中的双体(由hMN-14-15获得)显示出2.7％的注射剂量每克(ID/g)，0.3％在血液中，0.1到0.4％在其他所有的器官中。对于三体(由hMN-14-0获得)，在24、48、72和96小时，肿瘤摄入分别是12.0、12.2、11.1和7.1％ID/g，肿瘤对血液的比率从第24小时的3.4提高到第48小时的12.4，直到第96小时的55。四体(由hMN-14-1G获得)在三者中表现出最高的肿瘤摄入量，在第24小时达到25.4％ID/g，肿瘤对血液比率为3.9，在第72小时降低到17.1％肿瘤对血液比率为29.3。这些生物分布结果与三个新的基于scFv的试剂各自的分子大小和多价性相一致，所有的，特别是hMN-14三体对造影和治疗用途非常有用。
虽然本发明已对本领域的技术人员进行了描述并充分详细地举例说明如何制造和使用本发明，多种替代、修饰、和改进均显然不超出本发明的精神和范围。除了其所固有的，本发明已恰当地实现了所述的目的并获得了所述的结果和效果。此处提供的实施例代表优选实施方案，它们是示例性的，并非试图对本发明的范围进行限定。其中的修饰和其他应用是本领域的技术人员可以想见的。这些修饰均包含在本发明的范围内，由权利要求的范围所定义。
上述引用的所有出版物的内容均明确地引入此处作为参考，其引入程度与它们各自分别被引入一样。
序列表<110>ROSSI，EDMUND<120>直接靶定的结合蛋白<130>042418/0113<140>PCT/US02/32718<141>2002-10-15<150>60/328,835<151>2001-10-15<150>60/341,881<151>2001-12-21<150>60/345,641<151>2002-01-08<150>60/404,919<151>2002-08-22<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>786<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14scFv-L5核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(783)<400>1atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15
gcc cag ccg gcg atg gcc atg gag gtc caa ctg gtg gag agc ggt gga 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30ggt gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc gca tct 144Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45ggc ttc gat ttc acc aca tat tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct 192Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60gga aaa ggt ctt gag tgg att gga gaa att cat cca gat agc agt acg 240Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80att aac tat gcg ccg tct cta aag gat aga ttt aca ata tcg cga gac 288Ile Ash Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95aac gcc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa 336Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110gac acc ggg gtc tat ttt tgt gca agc ctt tac ttc ggc ttc ccc tgg 384Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125ttt gct tat tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtc tcc gga ggc ggt 432Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Gly Gly130 135 140gga tcc gac atc cag ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc 480Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser145 150 155 160gtg ggt gac aga gtg acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat gtg ggt 528Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly165 170 175act tct gta gcc tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg 576Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu180 185 190
ctg atc tac tgg aca tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc aga ttc 624Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe195 200 205agc ggt agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc 672Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu210 215 220cag cca gag gac atc gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc ctc tat 720Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr225 230 235 240cgg tcg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt ctc gag cac 768Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His245 250 255cac cac cac cac cac tga 786His His His His His260<210>2<211>261<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14scFv-L5氨基酸序列<400>2Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Gly Gly130 135 140Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser145 150 155 160Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly165 170 175Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu180 185 190Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe195 200 205Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu210 215 220Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr225 230 235 240Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His245 250 255His His His His His260<210>3<211>118<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14VH推定的氨基酸序列<400>3Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr20 25 30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu50 55 60Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Pro Val Thr Val Ser115<210>4<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14VK推定的氨基酸序列<400>4Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His100 105 110His His His115<210>5<211>768<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14-0核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(768)<400>5atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15gcc cag ccg gcg atg gcc atg gag gtc caa ctg gtg gag agc ggt gga96Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30
ggt gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc gca tct144Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45ggc ttc gat ttc acc aca tat tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct192Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60gga aaa ggt ctt gag tgg att gga gaa att cat cca gat agc agt acg240Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80att aac tat gcg ccg tct cta aag gat aga ttt aca ata tcg cga gac288Ile Ash Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95aac gcc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa336Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110gac acc ggg gtc tat ttt tgt gca agc ctt tacttc ggc ttc ccc tgg 384Asp Thr Gly ValTyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115120 125ttt gct tat tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtc tcc gat atc cag432Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Asp Ile Gln130 135 140ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga gtg480Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val145 150 155 160acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat gtg ggt act tct gta gct tgg528Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp165 170 175tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg ctg atc tac tgg aca576Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr180 185 190tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc aga ttc agc ggt agc ggt agc624Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser195 200 205
ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc cag cca gag gac atc 672Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile210 215 220gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc ctc tat cgg tcg ttc ggc caa 720Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln225 230 235 240ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt ctc gag cac cac cgc cac cac cac 768Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His His245 250 255<210>6<211>256<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14-0氨基酸序列<400>6Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95Asn Ala Lys Ash Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110
Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Asp Ile Gln130 135 140Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val145 150 155 160Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp165 170 175Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr180 185 190Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser195 200 205Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile210 215 220Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln225 230 235 240Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His His245 250 255<210>7<211>774<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14-1G核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(771)<400>7atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15gcc cag ccg gcg atg gcc atg gag gtc caa ctg gtg gag agc ggt gga 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30ggt gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc gca tct 144Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45ggc ttc gat ttc acc aca tat tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct 192Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60gga aaa ggt ctt gag tgg att gga gaa att cat cca gat agc agt acg 240Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80att aac tat gcg ccg tct cta aag gat aga ttt aca ata tcg cga gac 288Ile Ash Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95aac gcc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa 336Ash Ala Lys Ash Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110gac acc ggg gtc tat ttt tgt gca agc ctt tac ttc ggc ttc ccc tgg 384Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125ttt gct tat tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtc tcc ggt gat atc 432Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Asp Ile130135 140cag ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc gtg ggt gac aga 480Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg145 150 155 160gtg acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat gtg ggt act tct gta gcc 528Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala165 170 175tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg ctg atc tac tgg 576Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp
180 185 190aca tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc aga ttc agc ggt agc ggt 624Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly195 200 205agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc cag cca gag gac 672Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp210 215 220atc gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc ctc tat cgg tcg ttc ggc 720Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly225 230 235 240caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt ctc gag cac cac cac cac cac 768Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His245 250 255cac tga 774His<210>8<211>257<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的hMN-14-1G氨基酸序列<400>8Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly20 25 30Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser35 40 45Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr65 70 75 80Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp85 90 95Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu100 105 110Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp115 120 125Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Asp Ile130 135 140Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg145 150 155 160Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala165 170 175Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp180 185 190Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly195 200 205Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp210 215 220Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly225 230 235 240Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His His His His His245 250 255His<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；引物<400>9cgtaccatgg aggtccaact ggtggaga 28<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10cataggatcc accgcctccg gagacggtga ccggggt37<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11ctgaggatcc gacatccagc tgacccagag30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12gctactcgag acgtttgatt tccaccttgg30<210>13
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13cgtaccatgg aggtccaact ggtggaga28<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14gatatcggag acggtgaccg gg 22<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>15gatatccagc tgacccagag cc 22<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>16
gctactcgag acgtttgatt tccaccttgg30<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>17cgtaccatgg aggtccaact ggtggaga 28<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>18gctggatatc accggagacg gtgaccgggg tcc33<210>19<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的Gly-Ser接头<400>19Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>20<211>6<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的6X-His tag<400>20His His His His His His1 权利要求
1.多价的单特异性结合蛋白，其具有两个或多个对相同的单个靶抗原具有亲和力的结合位点，其中，所述的结合位点由两个或多个单链Fv(scFv)片段结合而成，每个scFv包含至少两个来自人源化或人单克隆抗体的可变结构域。
2.如权利要求1所述的结合蛋白，其中，所述的单克隆抗体特异于肿瘤相关抗原。
3.如权利要求2所述的结合蛋白，其中，所述的肿瘤相关抗原与下述疾病状态相关，所述的疾病状态选自恶性肿瘤、黑素瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、白血病、神经胶质瘤、淋巴瘤和骨髓瘤。
4.如权利要求2所述的结合蛋白，其中，所述的肿瘤相关抗原可与选自下述的一种类型的癌症相关，所述的癌症选自急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、胆的、胸部的、颈的慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠的、子宫内膜的、食管的、胃的、头和颈的Hodgkin淋巴瘤、肺、骨髓的，甲状腺的非Hodgkin淋巴瘤、卵巢的、胰腺的、衰竭的和膀胱的癌症。
5.如权利要求2所述的结合蛋白，其中，所述的肿瘤相关抗原选自A3，A33，BrE3，CD1，CD1a，CD3，CD5，CD15，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD45，CD74，CD79a，CEA，CSAp，EGFR，EGP-1，EGP-2，Ep-CAM，Ba 733，HER2/neu，KC4，KS-1，KS1-4，Le-Y，MAGE，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，PAM-4，PSA，PSMA，RS5，S100，T101，TAG-72，粘蛋白、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、17-1A、血管生成标记、细胞因子、免疫调节剂、致癌基因标记和致癌基因产物。
6.如权利要求2所述的结合蛋白、其中，所述的肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。
7.如权利要求6所述的结合蛋白，其中，所述的人源化单克隆抗体是hMN-14。
8.如权利要求1所述的结合蛋白，进一步包含至少一种选自诊断试剂、治疗剂、以及它们当中两个或多个的组合的试剂。
9.如权利要求8所述的结合蛋白，其中，所述的诊断试剂选自共轭物、放射性核素、金属、造影剂、示踪试剂、检测剂，以及它们当中两种或多种的组合。
10.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的放射性核素选自11C，13N，15O，18F，32P，51Mn，52Fe，52mMn，55Co，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，68Ga，72As，75Br，76Br，82mRb，83Sr，86Y，89Zr，90Y，94mTc，94Tc，99MTc，110In，111In，120I，123I，124I，125I，131I，154-158Gd，177Lu，186Re，188Re，γ-发射器、β-发射器、正电子-发射器、以及它们当中两个或多个的组合。
11.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的放射性核素选自51Cr，57Co，58Co，59Fe，67Cu，67Ga，75Se，97Ru，99mTc，111In，114mIn，123I，125I，131I，169Yb，197Hg，201Tl，以及它们当中两个或多个的组合。
12.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的金属选自钆、铁、铬、铜、钴、镍、镝、铼、铕、铽、钬、钕、以及它们当中两个或多个的组合。
13.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的造影剂是核磁共振成像MRI造影剂。
14.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的造影剂是CT造影剂。
15.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的造影剂是超声造影剂。
16.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的造影剂选自钆离子、镧离子、锰离子、铁、铬、铜、钴、镍、镝、铼、铕、铽、钬、钕、另一个可比较的造影剂、以及它们当中两个或多个的组合。
17.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的示踪试剂选自碘化物、钡化合物、镓化合物、铊化合物、钡、泛影葡胺、乙碘油、镓柠檬酸盐、碘卡明酸、碘酸胺酸、碘达酸、胆影酸、碘沙酸、iogulamide、iohexol、碘异肽醇、碘番酸、ioprocemic acid、碘西法酸、碘丝酸、iosulamide meglumine、iosemeticacid、iotasul、iotetric acid、iothalamic acid、碘托西酸、ioxaglic acid、ioxotrizoic acid、ipodate、甲基葡胺、碘葡酰胺非离子型造影剂、甲泛影钠、丙碘酮和氯化亚铊、以及它们当中两个或多个的组合。
18.如权利要求9所述的结合蛋白，其中，所述的检测剂选自酶、荧光化合物、化学发光的化合物、生物发光的化合物、放射性同位素、以及它们当中两个或多个的组合。
19.如权利要求8所述的结合蛋白，其中，所述的治疗剂选自放射性核素、化学治疗的药、细胞因子、激素、生长因子、毒素、免疫调节剂、以及它们当中两个或多个的组合。
20.如权利要求19所述的结合蛋白，其中，所述的放射性核素选自32P，33P，47Sc，59Fe，62Cu，64Cu，67Cu，67Ga，75Se，77As，89Sr，90Y，99Mo，105Rh，109Pd，111Ag，111In，125I，131I，142Pr，143Pr149Pm，153Sm，161Tb，166Dy，166Ho，169Er，177Lu，186Re，188Re，189Re，194Ir，198Au，199Au，211At，211Pb，212Bi，212Pb，213Bi，223Ra，225Ac，以及它们当中两个或多个的组合。
21.如权利要求19所述的结合蛋白，其中，所述的放射性核素选自58Co，67Ga，80mBr，99mTc，103mRh，109Pt，111In，119Sb，125I，161Ho，189mOs和192Ir，152Dy，211At，211Bi，212Bi，213Bi，215Po，217At，219Rn，221Fr，223Ra，225Ac，255Fm，以及它们当中两个或多个的组合。
22.如权利要求19所述的结合蛋白，其中，所述的化疗药物选自长春花生物碱、anthracyclines、epidophyllotoxins、taxanes、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂的、抗血管生成试剂、编程性细胞死亡试剂、阿霉素、氨甲蝶呤、红豆杉醇、CPT-11、喜树碱、氮芥类、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素、以及它们当中两个或多个的组合。
23.如权利要求19所述的结合蛋白，其中，所述的毒素选自蓖麻毒、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、葡萄球菌的肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素毒素、假单胞菌属外毒素、假单胞菌属内毒素、以及它们当中两个或多个的组合。
24.如权利要求19所述的结合蛋白，其中，所述的免疫调节剂选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、生血的因子、集落刺激因子、干扰素、干细胞生长因子、促红细胞生成素、促血小板生成素、以及它们当中两个或多个的组合。
25.多价的单特异性结合蛋白，其包含对同一单个靶抗原具有亲合性的二个结合位点(称作单特异性双体)，其中所述的结合位点由两个单链Fv(scFv)片段相连形成，其中每个scFv片段包含至少两个来源于人源化或人单克隆抗体的可变结构域。
26.如权利要求25所述的单特异性双体，其中，所述的单克隆抗体特异于肿瘤相关抗原。
27.如权利要求26所述的单特异性双体，其中，所述的肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。
28.如权利要求25所述的单特异性双体，其中，所述的人源化单克隆抗体是hMN-14。
29.如权利要求28所述的单特异性双体，其中每个scFv包含hMN-14的VH和VK区域。
3 0.如权利要求29所述的单特异性双体，其中每个scFv进一步包含连接hMN-14的VH和VK区域的氨基酸接头。
31.如权利要求30所述的单特异性双体，其中每个scFv包含SEQID NO2的氨基酸序列。
32.表达载体，其包含编码如权利要求25所述的单特异性双体的核苷酸序列。
33.宿主细胞，其包含如权利要求32所述的表达载体。
34.多价的单特异性结合蛋白，其包含对同一单个靶抗原具有亲合性的三个结合位点(称作单特异性三体)，其中所述的结合位点由三个单链Fv(scFv)片段相连形成，其中每个scFv片段包含至少两个来源于人源化或人单克隆抗体的可变结构域。
35.如权利要求34所述的单特异性三体，其中，所述的单克隆抗体特异于肿瘤相关抗原。
36.如权利要求35所述的单特异性三体，其中，所述的肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。
37.如权利要求34所述的单特异性三体，其中，所述的人源化单克隆抗体是hMN-14。
38.如权利要求37所述的单特异性三体，其中每个scFv包含hMN-14的VH和VK区域。
39.如权利要求38所述的单特异性三体，其中每个scFv包含SEQID NO6的氨基酸序列。
40.表达载体，其包含编码如权利要求34所述的单特异性三体的核苷酸序列。
41.宿主细胞，其包含如权利要求40所述的表达载体。
42.多价的单特异性结合蛋白，其包含对同一单个靶抗原具有亲合性的四个结合位点(称作单特异性四体)，其中所述的结合位点由4条单链Fv(scFv)片段相连形成，其中每个scFv片段包含至少两个来源于人源化或人单克隆抗体的可变结构域。
43.如权利要求42所述的单特异性四体，其中，所述的单克隆抗体特异于肿瘤相关抗原。
44.如权利要求43所述的单特异性四体，其中，所述的肿瘤相关抗原是癌胚抗原(CEA)。
45.如权利要求42所述的单特异性四体，其中，所述的人源化单克隆抗体是hMN-14。
46.如权利要求45所述的单特异性四体，其中每个scFv包含hMN-14的VH和VK区域。
47.如权利要求46所述的单特异性四体，其中每个scFv进一步包含连接的hMN-14的VH和VK区域的氨基酸接头。
48.如权利要求47所述的单特异性四体，其中每个scFv包含SEQID NO8的氨基酸序列。
49.表达载体，其包含编码如权利要求42所述的单特异性四体的核苷酸序列。
50.宿主细胞，其包含如权利要求49所述的表达载体。
51.诊断肿瘤存在的方法，该方法包括对怀疑患有肿瘤的受试者施用可检测数量的如权利要求9所述的结合蛋白，监控受试者并检测任何结合蛋白对肿瘤的结合。
52.治疗肿瘤的方法，所述的方法包括对所需受试者施用有效量的如权利要求19所述的结合蛋白。
53.诊断肿瘤存在的方法，该方法包括对怀疑患有肿瘤的受试者施用可检测量的如权利要求1所述的结合蛋白，并联合施用可与所述结合蛋白结合的可检测部分，监控受试者以检测任何结合蛋白与肿瘤的结合。
54.治疗肿瘤的方法，所述的方法包括对所需受试者施用有效量的如权利要求1所述的结合蛋白和治疗剂。
55.如权利要求54所述的方法，其中，所述的治疗剂选自化疗药物、毒素、外辐射、短程治疗辐射试剂、放射性标记的蛋白、抗癌药和抗癌抗体。
56.向肿瘤递送一种或多种诊断试剂、一种或多种治疗剂、或其两个或多个的组合的方法，所述的方法包括对所需受试者施用如权利要求8所述的结合蛋白。
57.治疗和/或诊断用试剂盒，所述的试剂盒包含至少一种如权利要求8所述的结合蛋白，以及附加的试剂、设备和使用说明。
全文摘要
本发明涉及多价的、单特异性结合蛋白。这些结合蛋白包含两个或多个结合位点，每个结合位点均特异地与相同类型的靶细胞结合，优选地与上述靶细胞上的相同的抗原结合。本发明进一步涉及单特异性双体、三体和四体的组合物和用于在微生物宿主中表达这些功能结合蛋白的重组载体。本发明还提供利用本发明的组合物治疗和/或诊断肿瘤的方法。
文档编号C07K19/00GK1604966SQ02825068
公开日2005年4月6日 申请日期2002年10月15日 优先权日2001年10月15日
发明者埃德蒙·罗西, C－H·K·常, D·M·戈登博格 申请人:免疫医疗公司, Ibc药品公司