专利名称：造血干细胞的增殖方法
技术领域：
本发明涉及一种以巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)增殖造血干细胞的方法。更精确地说，本发明涉及一种在M-CSF存在的情况下培养Lin-阴性或弱阳性细胞的方法，一种通过在M-CSF存在的情况下培养Lin-阴性或弱阳性细胞来增殖造血干细胞的方法，一种通过所述增殖方法获得的造血干细胞群，一种含有M-CSF的用于培养Lin-阴性或弱阳性细胞的试剂盒，以及一种含有M-CSF的用于增殖造血干细胞的试剂。
背景技术：
造血干细胞被定义为既有产生所有血细胞如红细胞、白细胞、血小板、T和B淋巴细胞(多能性)的能力，又有更新自身的能力(自我更新能力)的细胞。在骨髓移植中，被移植骨髓中的造血干细胞起着主要作用，因而骨髓移殖又可称为造血干细胞移植。目前，骨髓移殖已经成为许多疑难病症如各种血液病、癌症、免疫缺陷、先天性代谢障碍的根本疗法。然而在这类移植中，供体的人白细胞抗原(HLA)必须和受体的相同，并且供体短缺现在是公众关注的一个目标。
目前外周血经常用作造血干细胞源以代替骨髓。只有少量包括造血干细胞在内的CD-34阳性细胞可能存在于健康个体的外周血中，然而这类细胞中很多可以在给骨髓持续施用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)时从骨髓转移到外周血中。利用血液成分分离器，可以在这个阶段中从外周血中采集大量外周造血干细胞/造句的前体细胞，并可用于移植。但是，在造血干细胞流动至外周血的效率以及供体的安全性上存在一些问题有待解决。
作为造血干细胞的另一种来源，可以使用脐带血进行脐带血干细胞的移植。但是，由于脐带血中造血干细胞数量少，这种脐带血干细胞移植目前局限于儿童。
在这种背景下，迄今已经尝试了一系列的方法以期获得一种体外增殖造血干细胞的方法。例如，为了增殖造血干细胞，已有研究报告显示了在有细胞因子如干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-11(IL-11)、G-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、类fms酪氨酸激酶(Flt-3)配体(FL)、促血小板生成素(TPO)的情况下，细胞培养的结果。当与这些细胞因子或任何其他的生长因子一起培养时，造血前体细胞以及由它们分化而得的细胞可以得到高度增殖，但以此模式培养的造血干细胞的增殖率仅有少许几倍，没有达到令人满意的水平(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，13648-13653，1997；Matsunaga等，Blood，92，452-461，1998；Bryder等，Blood，96，1748-1755，2000)。造血前体细胞通常被定义为具有体外集落形成能力的细胞。但是，由于不进行自我更新并且不能长期产生血细胞，造血前体细胞作为移植的血细胞源是没有价值的。
此外，一种与骨髓基质细胞共培养以增殖造血干细胞的技术已被尝试，但是在这种技术中细胞的增殖率依然只有少许几倍(Moore等，Blood，89，4337-4347，1997)。
另一方面，如果可以直接把细胞因子、生长因子或其他类似物给活体施用从而显著增殖活体内的造血干细胞，那么例如脐带血或其他只含有少量造血干细胞的类似物则有可能用作移植源。但是，截止目前，没有人报道过与此有关的成功实验。
本发明的一个目的是通过在体外用细胞因子或生长因子提高造血干细胞的增殖水平，实现体外增殖的造血干细胞在临床上的应用，而截止目前其增殖水平一直是不足的。另一个目的是通过细胞因子对活体的直接施用进行造血干细胞的体内增殖。
发明内容
作为为解决上述问题而进行的广泛调查的结果，本发明人发现，当对谱系标志(Lin)呈阴性或弱阳性且可以包含造血干细胞的细胞受到巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或任何其他细胞因子的刺激时，造血干细胞的增殖水平可以得到提高，由此得以完成本发明。
也就是说，本发明涉及一种在有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的情况下培养Lin-阴性或弱阳性细胞的方法。
本发明也涉及在有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的情况下通过培养Lin-阴性或弱阳性细胞来增殖造血干细胞的方法。
另外，本发明涉及由上述方法获得的造血干细胞群。
本发明也涉及包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的用于培养Lin-阴性或弱阳性细胞的试剂盒。
另外，本发明涉及包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的用于提高造血干细胞增殖的试剂。
发明实施方式本发明的培养方法和增殖方法其特征在于在有M-CSF的情况下培养Lin-阴性或弱阳性细胞。本发明人在有M-CSF的情况下培养Lin-阴性或弱阳性细胞以研究造血干细胞能否得到增殖。结果，我们发现有M-CSF的细胞培养与缺少M-CSF的细胞培养相比，产生了造血干细胞的显著增殖。因此，本发明的培养方法可用于造血干细胞的增殖。另外，由本发明的增殖方法得到的造血干细胞群可以用作造血干细胞的移植源。
优选地，Lin-阴性或弱阳性细胞在一个用作Lin标引的细胞表面标志的基础上进行采集。Lin意为“谱系标志”，它包括例如红细胞标志Ter119、粒细胞标志Gr-1、单核细胞-巨噬细胞标志Mac-1(CD11b)以及T细胞标志Ly1。已知造血干细胞存在于Lin-阴性或弱阳性细胞部分中。
Lin-阴性或弱阳性细胞可以通过用标记过的能识别Lin的抗体处理骨髓细胞的单细胞悬液并利用细胞分选器如流式细胞仪去除标记的细胞来采集。对于小鼠细胞，例如，经过StemSepTM(StmeCellTechnologies Inc.)处理过的细胞广泛用作Lin-阴性或弱阳性细胞，所述StemSepTM包含一个用于制备造血前体细胞的抗体混合物。在实施例中，通过使用StemSepTM获得的细胞占未处理细胞的0.5％。
由此获得的细胞在有M-CSF的情况进行培养，对培养条件(包括培养基、培养周期和培养板)没有特别限定，但适当地进行选择以便所述细胞可以在所选条件下保持良好状态。在实施例中，例如，将准备的Lin-阴性或弱阳性细胞以4×104细胞/孔的量接种到一个6孔的组织培养用微板上，用含有5％FBS和10μg/ml庆大霉素(Sigma)的RPMI1640(Gibco-BRL)在5％CO2、37℃下培养6天。但是，本发明并不局限于此。
M-CSF可以从例如Pepro Tech Inc.购买，但也可以通过将M-CSF编码基因导入合适的蛋白表达载体以任何普通的遗传工程技术产生。对在此所用的M-CSF没有特别限定。最好根据此处所用动物细胞来选择M-CSF，但得自其他任何不同物种的M-CSF在可接受的活性范围内都可以使用。
更加优选地，将适合的细胞因子和生长因子加入到正在培养的细胞中。加入的细胞因子和生长因子可以是任何已报道对造血干细胞的维持、生长促进和分化诱导有效的种类(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，13648-13653，1997；Matsunaga等，Blood，92，452-461，1998；Bryder等，Blood，96，1748-1755，2000)，比如SCF、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF、FLT、TPO、白血病抑制因子(LIF)、碱性的成纤维细胞生长因子(碱性的FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、类胰岛素生长因子(IGF)，但本发明并不局限于上述因子。
如上所述，造血干细胞被定义为既有产生所有血细胞(多能性)的能力，又有自我更新能力(自我更新能力)的细胞。因此，优选一种能够确认细胞的这两种能力的方法，以确证造血干细胞是否能够得到增殖。例如，使用小鼠细胞时，它们可以通过长期的增长分析进行确认。这一方法将在实施例部分更详细地进行描述。简单地说，将包含造血干细胞的细胞移植到一动物体内，对该动物进行监控以确证来源于干细胞的血细胞是否长期存在于该动物血液中。目前，这是造血干细胞量化的最可靠方法(Harrison等，Bxp.Hematol.，21，206-219，1993)。
在使用人类细胞时，可以应用的是一种使用NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重度免疫缺陷综合病)小鼠或β2-微球蛋白缺陷型NOD/SCID小鼠作为移植用动物的方法(Larochelle等，Nat.Med.，2，1329-1337，1996；Kollet等，Blood，95，3102-3105，2000)。
加入到细胞培养用的培养基中的M-CSF浓度优选地为约0.1-100ng/ml，更加优选地为约1-50ng/ml，最为优选地为约5-20ng/ml。通过加入0、1、10或100ng/ml的M-CSF来检测造血干细胞的增殖能力，结果发现，当加入10ng/ml的M-CSF时，它可以显著提高细胞增殖能力，但是加入100ng/ml的M-CSF则阻碍了细胞增殖。这提示对于造血干细胞的增殖存在着一个优化的浓度范围。
进一步通过c-Kit和Sca-1的阳性选择从Lin-阴性或弱阳性细胞中选择的细胞并没有显示用M-CSF处理的造血干细胞的增殖，而c-Kit和Sca-1已知为造血干细胞标志。在Lin-阴性或弱阳性细胞中，发现造血干细胞在M-CSF受体(c-fms)阴性部分中。由此，认为M-CSF并非直接作用于造血干细胞，而是M-CSF对造血干细胞增殖的影响是通过对其他任何细胞比如c-fms阳性细胞的间接作用或通过源于这些细胞的一些因子而引起的。
本发明进一步提供一种包含M-CSF的用于培养Lin-阴性或弱阳性细胞的试剂盒。所述培养试剂盒包含M-CSF以及合适的细胞因子、培养基等，因而可用于体外培养Lin-阴性或弱阳性细胞。
此外，如上所述由于M-CSF提高包含造血干细胞的细胞增殖，它可以用作提高造血干细胞增殖的试剂。所述含有M-CSF的用于提高造血干细胞增殖的试剂可以包含与M-CSF一起使用的合适细胞因子和生长因子。如果为提高造血干细胞而加入此试剂的细胞培养物能够产生足够的造血干细胞体外增殖，那么从少量体外骨髓、外周血或脐带血增殖而来的细胞即可用作造血干细胞源。另外，如果直接在活体内施用M-CSF能够带来显著的造血干细胞体内增殖，那么在移植中即使是少量的造血干细胞亦是足够的，而且如果是这样的话，则脐带血移植不仅能够用于儿童也可能用于成人。
附图简述
图1显示利用StemSepTM进行抗Lin抗体混合物标记的从小鼠骨髓得到的细胞群的流式血细胞计数图。图注“柱处理前”表示没有通过MACS LS+柱处理的细胞群的分析数据；图注“柱处理后”显示通过该柱处理的细胞群的分析数据。可以理解StemSepTM的处理提供了谱系标志(Lin)-阴性或弱阳性细胞。
图2显示M-CSF促进细胞增殖的活性。图中，“供体细胞百分比”一栏表示源于Ly5.1小鼠的Lin-阴性或弱阳性细胞在Ly5.2小鼠外周血中的比例，将源于Ly5.1小鼠的Lin-阴性或弱阳性细胞用不同类型的细胞因子进行处理，随后将其与源于Ly5.2小鼠的细胞一起移植到经致死辐照的Ly5.2小鼠体内，移植后6个月对Ly5.2小鼠的外周血进行分析。“新鲜的”代表未用细胞处理；“SCF+IL-11+FLT”代表含有M-CSF以及SCF、IL-11和Flt-3的细胞培养物；“SCF+IL-11+TPO”代表含有M-CSF以及SCF、IL-11和TPO的细胞培养物。
图3显示小鼠外周血白细胞的各种分化标志的表达，为此，将Lin-阴性或弱阳性细胞用SCF、IL-11和Flt-3与10ng/ml的M-CSF一起进行培养，将得到的细胞移植入小鼠体内并且在移植6个月之后对小鼠外周血进行分析。简单地说，用生物素化的各种分化标志的抗体和PE标记的链霉抗生物素蛋白进行外周血白细胞的染色，随后用FITC标记的抗小鼠Ly5.1抗体进行复染色，以流式细胞仪对此进行分析。图中，垂直轴代表分化标志Mac-1、Gr-1、B220或CD3e的表达强度；水平轴代表Ly5.1(源于移植细胞)的表达强度。
本发明的最佳实施方式参照下列实施例对本发明进行具体描述，但本发明并不局限于所述实施例1(骨髓细胞的采集)从C57BL/6J-Ly5.1小鼠(杰克逊实验宣)的大腿骨和胫骨中采集骨髓细胞，悬浮于包含5％小牛血清(FBS，ImmunbiologicalLaboratory)的Hunks平衡盐溶液(Gibco-BRL)(下文称为HBSS)中，使用配有22号针头的1ml注射器制成浮游有细胞的悬浮液。使用40μm孔径的尼龙网(Falcon)对浮游有细胞的悬浮液进行过滤以去除细胞团聚体。通过以1,100转/分的转速离心5分钟进行清洗，随后再次悬浮于HBSS中，形成骨髓细胞的单细胞浮游悬浮液。
(Lin-阴性或弱阳性细胞的制备)使用StemSepTM(StemCell Technologies INC.)进行小鼠造血前体细胞的制备，根据该试剂盒所附手册制备分化抗原-阴性或弱阳性(Lin＜弱阳性)的细胞。首先，将抗分化抗原的生物素化的抗体混合物加到单细胞悬浮液中，在冰上反应20分钟，随后以HBSS洗涤，以1,100转/分离心5分钟。再次将细胞悬浮于HBSS中，加入一种用于与生物素化的抗体结合的四聚抗体复合物混和物，在冰上反应40分钟，随后加入磁性胶质进一步反应40分钟。让细胞悬浮液通过MACS LS+柱(Miltenyi Biotec.)以吸附被标记的细胞，收集未标记的细胞。将藻红蛋白(PE)标记的链霉抗生物素蛋白(Pharmingen)加入到一部分收集的细胞中，并用EPICS-XL流式细胞仪(Beckman Coulter)进行分析。如图1所示，收集的细胞为Lin＜弱阳性的原始细胞群。
(培养)将由此获得的Lin＜弱阳性细胞以4×104细胞/孔的量接种至一个组织培养用的6孔微板中，用包含5％FBS和10μg/ml庆大霉素(Sigma)的RPMI 1640(Gibco-BRL)在5％CO2、37℃下培养6天。将SCF、IL-11、FLT和TPO作为细胞因子加入到培养物中，其浓度为100ng/ml。加入M-CSF以证实效果，其终浓度为1、10或100ng/ml。在此所用的全部细胞因子都从Pepro Tech.Inc购得。
(将培养细胞移植到小鼠中)在有细胞因子的情况下培养6天后，用移液管从微板收集细胞。将细胞悬浮在HBSS中，加入106个从C57BL/6J-Ly5.2小鼠(NipponClea)中制备的新鲜骨髓细胞，以1,100转/分离心5分钟。最后，将细胞悬浮在400μl 1mM含HEPES的HBSS中，并将其通过尾静脉移植入经致死辐照(800伦琴)的C57BL/6J-Ly5.2小鼠体内。
(移植细胞衍生的白细胞的检测)细胞移植6个月后，用涂有肝素的毛细管从每只小鼠的尾尖采集25μl的外周血，随后立即悬浮在含有10单位/ml的肝素的500μl磷酸缓冲液(PBS(-)；Gibco-BRL)中。通过以1,100转/分离心5分钟去除上清液，将细胞悬浮在500μlHBSS中。随后，加入10μl用PBS(-)稀释10倍的FITC标记的抗小鼠Ly5.1(Pharmingen)，在冰上暗反应30分钟。通过以1,100转/分离心5分钟收集细胞，随后于室温下悬浮在含有155mM氯化铵(NH4Cl)、10mM碳酸氢钾(KHCO3)和0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的500μl溶血溶液中。重复溶血处理两次。以HBSS洗涤细胞，通过以1,100转/分离心5分钟收集细胞，随后悬浮在含有2μg/ml 7-氨基放线菌素D、0.2％牛血清白蛋白、0.05％叠氮化钠和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的HBSS中，并用EPICS-XL流式细胞仪进行分析。
如图2中所示，移植细胞衍生的白细胞比例依赖于M-CSF的浓度而增长。这可以反映在培养周期过程中造血干细胞自我更新的增长。但是，M-CSF在高浓度时出现了对造血干细胞更新的抑制作用，这可以理解为M-CSF对造血干细胞更新的促进作用严格受其浓度的控制(图2)。
如表1所示，将结果量化。将等于106个骨髓细胞的骨髓重建活性(种群重建单位，RU)定义为1个单位。在表1中所示计算公式的基础上，对在有细胞因子存在的情况下在培养前与培养后的造血干细胞的活性按照种群重建单位进行比较。由于加入10ng/ml的M-CSF使得RU进一步增长了两倍多，因此已从试验上证实M-CSF可用于造血干细胞的增殖。
如果造血干细胞能够像上述那样高度增殖，就有可能减少用于造血干细胞移植所要收集的干细胞数量。对于这一效应，从保证供体安全性的角度来看本发明是有价值的。
表1 M-CSF对造血干细胞增殖的影响
RU＝％Ly5.1(100-％Ly5.1)(对移植细胞衍生的白细胞的分化抗原的检测)在细胞移植6个月后，用涂有肝素的毛细管从每只小鼠的尾尖采集100μl的外周血，立即悬浮在含有10单位/ml的肝素的2ml磷酸缓冲液(PBS(-)；Gibco-BRL)中，随后分成4份用于抗体染色。洗涤细胞并悬浮在500μl HBSS中，每管加入2μl生物素化的抗小鼠Mac-1、抗小鼠Gr-1、抗小鼠B220或抗小鼠CD3e(Pharmingen小鼠谱系组)作为抗分化抗原的抗体，在冰上进行抗体反应20分钟。反应后，以HBSS洗涤细胞两次，并再次悬浮在500μl的HBSS中。另外，加入0.5μl PE标记的链霉抗生物素蛋白(Pharmingen)和1μl FITC标记的抗小鼠Ly5.1(Pharmingen)，在冰上暗反应20分钟。随后，通过以1,100转/分离心5分钟来收集细胞，随后于室温下悬浮在含有155mM氯化铵(NH4Cl)、10mM碳酸氢钾(KHCO3)和0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的500μl溶血溶液中。重复溶血处理两次。以HBSS洗涤细胞，通过以1,100转/分离心5分钟收集细胞，随后悬浮在含有2μg/ml 7-氨基放线菌素D、0.2％牛血清白蛋白、0.05％叠氮化钠和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的HBSS中，并用EPICS-XL流式细胞仪进行分析。
如上所述，造血干细胞既有自我更新的能力，又有分化成所有血细胞的能力。如果造血干细胞不存在，移植细胞衍生的血细胞将于细胞移植3个月后消失。如图3所示，移植后6个月，表达髓细胞和淋巴细胞的分化抗原的移植细胞衍生的(Ly5.1小鼠骨髓源)细胞在移殖后的小鼠中被检测出来。这证实了移植细胞群包含造血干细胞(图3)。
尽管详细地并参考特定的实施方式对本发明进行了描述，然而对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神和保护范围的前提下能够进行各种的改变和改良是显而易见的。
本申请建立在申请日为2001年10月30日(申请号2001-331940)的日本申请基础上，此处引用其内容作为参考。
工业实用性本发明所述的培养方法、增殖方法、由所述方法获得的造血干细胞群、培养用的试剂盒以及用于促进增殖的试剂使得造血干细胞的体外增殖成为可能，这些可以应用于造血干细胞的移植。此外，增殖试剂的直接施用使得利用少量的造血干细胞进行细胞移植成为可能。
权利要求
1.一种用于在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的存在下培养Lin-阴性或弱阳性细胞的方法。
2.一种通过在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的存在下培养Lin-阴性或弱阳性细胞来增殖造血干细胞的方法。
3.一种由权利要求2所述的方法获得的造血干细胞群。
4.一种含有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的用于培养Lin-阴性或弱阳性细胞的试剂盒。
5.一种含有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的用于促进造血干细胞增殖的试剂。
全文摘要
一种用于在巨噬细胞集落刺激因子(M－CSF)的存在下培养Lin－阴性或弱阳性细胞的方法；一种通过在M－CSF的存在下培养Lin－阴性或弱阳性细胞来增殖造血干细胞的方法；由所述的增殖方法获得的造血干细胞群；一种含有M－CSF的用于培养Lin－阴性或弱阳性细胞的试剂盒；以及一种含有M－CSF的用于增殖造血干细胞的试剂。
文档编号C07K14/435GK1606615SQ02825620
公开日2005年4月13日 申请日期2002年10月30日 优先权日2001年10月30日
发明者名和克彦, 莲村麻衣, 今田千晴 申请人:第一制药株式会社