专利名称：一种嵌合基因的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及基因工程中一种嵌合基因的构建方法，其氨基酸序列连接的方向有一部分和传统的方向相反，有更多的自由氨基端，类似生物体内天然存在的状况，促进构建全新的分子的研究。
利用现有的方法只能将受体的亚单位通过链接区将第1部分的羧基端和第2部分的氨基端相连，而在人体内受体的亚单位的氨基端是自由结合的，没有任何的限制。同样利用现有的方法构建重组抗体的过程中，只能将一种蛋白的某一段基因片段，称为第一链的羧基端通过链接区与同种或另一种蛋白的某一段基因片段，称为第二链的氨基端相连，而使形成的人工分子的氨基端区域受到限制；而利用现有的方法构建的核苷酸序列如图2所示即第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的氨基端→羧基端，其氨基端是自由的，没有任何的限制。
为了实现本发明的目的采取的方案1、一种嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时第一(或第二)链的方向为氨基端到羧基端通过链接区链接第二(或第一)链，其特征是所述的第一链和第二链在合成时都以羧基端和链接区相连，所述的第二(或第一)链方向为羧基端到氨基端；形成一条完整的DNA链的嵌合基因序列的方向为第一(或第二)链的氨基端—羧基端—链接区一第二(或第一)链的羧基端—氨基端这样的序列。
2、所述的第一链和第二链构建成嵌合基因的基因片段，是同种蛋白基因的全部基因或部分基因或是来自不同蛋白的基因片段，是来自生物体内或是人工合成的基因片段；是确切的核苷酸序列，或是随机的核苷酸序列。
3、所述的链接区由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列，一般为苷氨酸和丝氨酸组成的链接序列。
4、所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以使嵌合基因表达产物纯化。
5、所述的琥珀终止密码子UAG的后面通过链接区连接噬菌体的基因片段，使其与外源性基因片段融合，并表达于噬菌体的表面，利于蛋白之间互相作用的深入研究。
6、一种嵌合基因的构建方法的应用，通过逆转录一聚合酶链反应、拼接、测序和人工合成常见的分子生物学方法，证明用本发明的嵌合基因的构建方法所构成的嵌合基因，其特征是和生物体内天然存在的状况类似，有更多的自由氨基端，有利于其与受体和配基的自由结合，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有利于细胞蛋白的合成，促进构建全新的分子的研究。
通过对基因的人工合成，不仅可以根据所用细胞的兼并密码子的使用频率来调整基因的序列，以提高蛋白的翻译水平，同时也可以根据氨基酸的序列，利用分子生物学的手段，来构建编码蛋白分子的基因。传统的人工合成蛋白的基因片段具有方向性，即在细胞内复制、转录和翻译时，合成的方向只能从氨基的5’端到羧基的3’端，遵循这一原则，方能得到具有活性的产物。
本发明所述的一种嵌合基因的构建方法，第一链和第二链都以羧基端和链接区相连，第二链的编码羧基端氨基酸的密码子位于传统人工合成基因的5’端，而编码氨基端氨基酸的密码子位于传统人工合成基因的3’端，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，利用细胞的蛋白合成机制来合成全新的分子，因为这种结构有更多的自由氨基端，使其与受体或配基结合时，充分自由结合，便于构建二聚体或多聚体，筛选到在体内具有高度活性的药物的深入研究。在本发明的嵌合基因构建的方法中，所述的链接区可以是任何氨基酸序列，由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列；所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以利于嵌合基因表达产物的纯化。
丝状噬菌体是一种细菌的病毒，它可以借助细菌的DNA和蛋白质合成机制，来完成自身的复制，并且不引起细菌的死亡。最常见和常用的丝状噬菌体为M13，fd等，其外形呈棒状。M13的基因组为一条单链DNA，其为10个基因编码。这10个基因编码的蛋白质，组成了包被单链DNA的外衣。整个噬菌体的分子量为1.63×107Da，其中88％为蛋白质，12％为DNA。整个包衣有大约2700份的主要包衣蛋白pVIII。在噬菌体的一端，有各为5个拷贝的基因VII和VI编码的蛋白，参与和细菌的结合以及结束噬菌体的装配过程。噬菌体的另一端为各为5个拷贝的基因VII和IX编码的分别为33个和32个氨基酸的蛋白，参与噬菌体装配的起始和噬菌体稳定性的维持。目前已经报道了分别用基因III，VI，VII，VIII和IX来显示抗体于噬菌体表面的报道。利用噬菌体的基因III，VI，VII， VIII或IX基因与外源性基因片段融合，可以使外源性基因编码的蛋白产物显示在噬菌体的表面，这样达到了基因型与表现型的统一。特别是利用体内外的筛选技术所获得的与受体或配基结合的噬菌体，直接可以从中分离出编码的基因片段，用于更进一步的研究。
重组噬菌体抗体系统利用了M13噬菌体独特的生活周期，特别是在噬菌体表面表达的几个噬菌体蛋白的独特特性。丝状噬菌体M13长度约为895nm，直径为9nm。其为单链DNA，共有6407个碱基，为10个蛋白质编码。与其它的大多数细菌噬菌体不同的是，M13并不产生溶菌性的感染，而是在保持宿主存活的状态下，利用宿主的基因复制和蛋白合成机制来复制产生大量的噬菌体。在感染宿主的过程中蛋白III起着至关重要的作用，因为通过蛋白III与宿主细菌菌毛的结合，而使得噬菌体可以进入大肠杆菌体内。利用分子生物学方法，将抗体的相关基因片段通过与蛋白III或蛋白VIII等的融合，利用噬菌体的基因与外源性基因片段融合，使外源性基因编码的蛋白产物，表达于噬菌体的表面，而达到基因与功能的偶联，为研究蛋白之间的相互作用，开辟了一条新的途径。
除了噬菌体以外，还有许多动物和人类的病毒、细菌、酵母和细胞被用来在其表面显示外源性的蛋白质。如葡萄球菌的蛋白A，脊髓灰质炎病毒，酵母的α因子等，用来与外源性的蛋白质组成融合蛋白，使外源性的蛋白质表达在其表面，同样可以通过筛选技术，达到基因型和表现型的统一。
本发明的优点及应用本发明的嵌合基因的构建方法所构建的嵌合基因的表达产物，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有更多的自由氨基端，有利于其与受体或配基的自由结合，和生物体内天然存在的结构相似，不受传统氨基酸序列方向的限制，有利于细胞蛋白的合成，促进构建全新的分子的研究。
箭头为体内蛋白质合成的方向；1、2、椭圆为嵌合基因的第一链与第二链；3、基因片段的羧基端；4、7、线条为链接区；5、基因片段的氨基端；6、矩形为琥珀终止密码子；8、三角形为噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。
图1表示体内嵌合基因构建方向为第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的羧基端→氨基端→琥珀终止密码子→链接区→噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。
图2表示传统人工方法基因的构建方向为第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的氨基端→羧基端→琥珀终止密码子→链接区→噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。
2)用等量的磷酸缓冲液稀释外周血。
3)为了分离血中的淋巴细胞，首先在各试管中加入3毫升淋巴细胞分离液(上海生化试剂厂)，然后在每个试管中从管壁轻轻加入5毫升稀释后的血液。
4)置低速离心机，2500转/分钟，离心20分钟。
5)此时可见试管中不同组分的条带，从上至下分别为血浆层(黄色)，淋巴细胞层(白色)，分离液(无色)和红细胞层(红色)，用毛细吸管轻轻吸取淋巴细胞层，置于另一10至15毫升的离心管中。
6)用磷酸缓冲液作等量稀释，1000转/分离心10分钟。
7)小心弃上清，照步骤6用磷酸缓冲液洗两遍。
8)用磷酸缓冲液按每10毫升血液悬1毫升的比例重选沉淀。1.4.2总细胞RNA的提取1)将1毫升变性的溶液D(4摩尔的异硫氢酸胍，25毫摩尔的二水柠檬酸钠，0.5％月桂酰基肌氨酸钠(重量/体积)，0.1摩尔的二巯基乙醇，加入沉淀的细胞中(约107细胞)，悬起沉淀，使细胞碎片裂解。
2)加入0.1毫升2摩尔pH4.0的醋酸钠，混匀，分成两小管。
3)每管中加入0.5毫升水饱和酚，充分混匀。
4)每管加入1毫升氯仿—异戊醇溶液，混匀约10秒钟。置冰浴15分钟，如果未形成两层，另加入0.5毫升氯仿—异戊醇溶液。
5)置摄氏4度12000转/分钟离心20分钟。
6)上层水相转移至一新鲜离心管中，加等量异丙醇，置负摄氏20度沉淀1小时；弃上清，用75％的乙醇洗一遍。
7)室温自然干燥沉淀的RNA，重悬于50微升无RNA酶的纯水中。1.4.3 cDNA的合成1)将上述1.4.2所获得的总RNA取44微升加入一个无RNA酶的离心管中。加入4微升(0.5微克/微升)的人工合成的下游引物，分成两个离心管。下游引物的序列为5’AGA ACC ACCACC ACC ACC TTG AGA CAT TTG TGG CAA GGT3’(其中黑体为链接区序列)。
2)每管置入摄氏70度水浴中10分钟。然后置冰浴中3分钟。
3)制备以下混合液10X PCR缓冲液 8微升15毫摩尔/升的氯化镁 8微升10毫摩尔/升的dNTP 4微升100毫摩尔/升的二巯基苏硫醇8微升4)加14微升上述混合液到每个RNA引物混合管中，轻轻混合，短暂离心。置室温5分钟。
5)每管加入2微升(200单位)反转录酶Superscript II RT，置摄氏42度60分钟。
6)置摄氏70度15分钟终止反应，置冰浴中。
7)瞬时离心，加2微升RNAase H于每个反应管，摄氏37度20分钟。1.4.4生长激素受体细胞外区域的PCR扩增1)先合成生长激素受体细胞外区域的上游引物，其序列为5’GTCCTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCCATG CAA CCA GACCCA CCA ATC3’(带下划线的序列为限制性内切酶SfiI的酶切位点)。生长激素受体细胞外区域的下游引物，其序列为5’ TTG AGA CAT TTG TGG CAAGGT3’(黑体字为链接区序列)。
2)在500微升的PCR反应管中加入1.4.3制得的cDNA 2微升2微摩尔的上游引物 10微升2微摩尔的下游引物 0.5微升去离子水 67.5微升置摄氏94度5分钟后，立即置于冰上，瞬时离心，在管中加入10X Vent DNA聚合酶缓冲液 10微升2毫摩尔的dNTP 10微升Vent DNA聚合酶(2单位/微升)1.0微升混匀后，加入2滴液体石蜡覆盖液面后，瞬时离心。
于下列条件下反应3)摄氏94度1分钟，摄氏55度1分钟，摄氏72度2分钟，反应35个循环，摄氏72度延伸10分钟，置于摄氏4度。
1.5人工合成步骤1.3所列的本发明所提出的新的DNA片段。
1.5.1人工合成下列DNA片段，其中片段1，3，5，7为正链，片段2，4，6，8为反链，按1.5.2到1.6.5的方法构建。
片段15’ CAA TCT ATG CAA CCA TTG ACCGTC TAC CTG GTA GAA TCC TTT GAA GGT TAC AAC GGT TCT AAC AGA CAAAAG TCC AGA GTC 3’(黑体字为链接区序列)片段25’AGT AGA AAC TGG AAC GTA AGA AAG CTT AAC GTC CTT TTCGTA TTC AAC TCT GAC TCT GGA CTT TTG TCT GTT AGA ACC GTT GTA ACCTTC AAA GGA TTC3’片段35’AGA GTT GAA TAC GAA AAG GAC GTT AAG CTT TCT TAC GTTCCA GTT TCT ACT ACC TTG ATC CCA GAT ATG ATG AAG TGG AAA ACT GAAAAC GTC GAA AAG TAC 3’片段45’GTT GGC GTC AAT TTG TTT GCC CCA CAT AAC TAG TTC GTA TTCCAA TTG GTA CTTTTC GAC GTT TTC AGT TTT CCA CTT CAT CAT ATC TGGGAT CAA GGT3’片段55’CAA TTG GAA TAC GAA CTA GTT ATG TGG GGC AAA CAA ATTGAC GCC AAC AGA CCA GCT GAA TGG AGA GTT CAA ATC GAT GCT CAC ATTGGT ACT TTG 3’
片段65’TTG TGG GTC TGG TGG GAT AGC TAA GTT CCA AGT CAA CAA GTTGAC AGA CAA AGT ACC AAT GTG AGC ATC GAT TTG AAC TCT CCA TTC AGC TGGTCT 3’片段75’TCT GTC AAC TTG TTG ACT TGG AAC TTA GCT ATC CCA CCA GACCCA CAA 3’片段8片段85’GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTG TGG GTC TGG TGG GAT AGC TAA GTT CCA AGT CAA CAAGTT GAC AGA CAA AGT ACC AAT GTG AGC ATC GAT GTT3’(带下划线的序列为NotI的酶切位点，黑体字为链接区序列，斜黑体字为琥珀终止密码子。)下面为上述1-8 DNA片段以及PCR上下游引物在人工合成的DNA双链中的位置上 游 引物5’GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG CAA CCA GAC CCA CCA3’CAG GAG CGT TGA CGC CGG GTC GGC CGG TAC GTT GGT CTG GGT GGTATCGCT TTA AAC TGG ACT TTG TTG AAC GTC TCT TTG ACT GGT ATTTAG CGA AAT TTG ACC TGA AAC AAC TTG CAG AGA AAC TGA CCA TAACAC GCT GAT ATC CAA GTT AGA TGG GAA GCT CCA AGA AAC GCC GAC ATTGTG CGA CTA TAG GTT CAA TCT ACC CTT CGA GGT TCT TTG CGG CTG TAACAA AAA GGC TGG ATG GTT CTA GAA TAC GAA TTG CAA TAC AAG GAA GTCGTT TTT CCG ACC TAC CAA GAT CTT ATG CTT AAC GTT ATG TTC CTT CAGAAC GAA ACT AAA TGG AAG ATG ATG GAT CCA ATC TTG ACC ACT TCTTTG CTT TGA TTT ACC TTC TAC TAC CTA GGT TAG AAC TGG TGA AGAGTT CCA GTT TAC TCT CTT AAG GTT GAC AAG GAA TAC GAA GTT AGA GTCCAA GGT CAA ATG AGA GAA TTC CAA CTG TTC CTT ATG CTT CAA TCT CAGAGA TCC AAG CAA AGA AAC TCT GGT AAC TAC GGT GAA TTT TCC GAA GTATCT AGG TTC GTT TCT TTG AGA CCA TTG ATG CCA CTT AAA AGG CTT CAT片段 1CTG TAC GTC ACC TTG CCA CAA ATG TCT CAA GAC ATG CAG 下 游引物片 段 1 GTT AGA TAC GTT GGT AAC TGG CAG ATG GAC CAT 片 段2片 段 1 片 段 3 片 段 2片 段3GAA AAG GAC GTT AAG CTT TCT TAC GTT CCA GTT TCT ACT ACC TTG 片 段 2 片段4片 段 3ATC CCA GAT ATG ATG AAG TGG AAA ACT GAA AAC GTC GAA AAG TAC 片 段4片 段5 片 段 4片 段 5 片 段 6片 段 8片 段 5GTC AAC TTG TTG ACT TGG AAC TTA GCT ATC CCA CCA GAC CCA CAA3’CAG TTG AAC AAC TGA ACC TTG AAT CGA TAG GGT GGT CTG GGT GTT片 段6片 段8 片 段 81．5．2人工合成的DNA片段的5’端磷酸化制备下列反应液合成的DNA片段1-7(0.5微克/微升)各 1微升IOXT4DNA多核苷酸激酶缓冲液7微升10毫摩尔的ATP 7微升噬菌体T4多核苷酸激酶(10单位／微升)2微升加水 53微升瞬时离心，置摄氏37度水浴1小时。然后，取30微升于摄氏95度变性10分钟，然后缓慢冷却到室温。
1.5.3人工合成的5’端磷酸化的DNA片段的连接经变性后缓慢冷却到室温的DNA片段 30微升5X T4 DNA连接酶缓冲液 9微升10毫摩尔的ATP 4微升T4 DNA连接酶 4魏氏单位加水至45微升将连接产物在摄氏16度反应16小时。然后于摄氏65度反应15分钟。
1.5.4人工连接的DNA片段的纯化向1.5.3所制得的反应液中加入4.5微升的3摩尔的pH5.2的醋酸钠，然后在加入90微升的无水乙醇，于负摄氏20度放置16个小时。然后离心收集沉淀，再用75％的酒精洗一遍。于室温下自然干燥。然后溶于50微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。
1.5.5 DNA片段1的5’磷酸化合成的DNA片段1(0.5微克/微升) 1微升10XT4DNA多核苷酸激酶缓冲液 1微升10毫摩尔的ATP1微升噬菌体T4多核苷酸激酶(10单位/微升)0.5微升加水 6.5微升瞬时离心，置摄氏37度水浴1小时。然后于摄氏65度反应15分钟。置于摄氏4度保存。
1.5.6人工连接的纯化的DNA片段的不对称PCR扩增制备下列反应液10X Vent DNA聚合酶缓冲液 10微升2毫摩尔的dNTP 10微升2微摩尔5’磷酸化的DNA片段10.5微升2微摩尔的DNA片段8 10微升1.5.4所制得的DNA片段 2微升Vent DNA聚合酶(2单位/微升)1微升去离子水 67.5微升然后先于摄氏72度反应10分钟，然后摄氏94度1分钟，摄氏62度1分钟，摄氏72度2分钟，35个循环。然后再在摄氏72度反应10分钟，于摄氏4度保存。
1.6本发明所描述的嵌合基因的制备1.6.1.嵌合基因的PCR扩增制备下列反应液10X Vent DNA聚合酶缓冲液 10微升2毫摩尔的dNTP 10微升步骤1.4.4制得的DNA片段2微升步骤1.5.6制得的DNA片段2微升2微摩尔的步骤1.4.4制得的上游引物 10微升2微摩尔的步骤1.5.1制得的DNA片段8 10微升Vent DNA聚合酶(2单位/微升)1微升去离子水55微升先于摄氏94度反应5分钟，摄氏72度反应10分钟后，再在摄氏94度1分钟，摄氏62度1分钟，摄氏72度2分钟，35个循环。然后再在摄氏72度反应10分钟，于摄氏4度保存。
1.6.2.嵌合基因的纯化用pH8.0的三羟基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液配制1.5％的低熔点琼脂糖凝胶。加入1.6.1.制备的PCR产物后，在紫外灯下回收750碱基对的DNA片段。溶于100微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。
1.6.3.嵌合基因的限制性内切酶消化将回收的PCR产物先后用SfiI和NotI进行酶切。
SfiI酶切反应纯化的PCR产物(0.25-1微克) 70微升10X酶切缓冲液 8.5微升SfiI(10单位/微升) 5微升去离子水 1.5微升加入85微升的液体石蜡，于摄氏50度进行4小时酶切反应。反应完毕后，置室温平衡，瞬时离心，将管壁上的液体甩下。然后进行NotI酶切。
NotI酶切反应于上述酶切反应液中加入3摩尔的氯化钠 3.6微升10X酶切缓冲液 1.5微升NotI(10单位/微升) 6微升去离子水3.9微升摄氏37度酶切反应4小时后，加入100微升酚—氯仿—异戊醇(25∶24∶1)，振荡混合1分钟，离心5分钟。移上清至新的离心管中，加入10微升的3摩尔的pH5.2的醋酸钠，然后在加入200微升的无水乙醇，于负摄氏20度放置16个小时。然后离心收集沉淀，再用75％的酒精洗一遍。于室温下自然干燥。然后溶于50微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。
1.6.4.嵌合基因与pCANTAB-5-E的连接酶切的嵌合基因片段(150毫微克) 5微升10XT4DNA连接酶缓冲液 5微升酶切的pCANTAB-5-E(250毫微克) 5微升T4 DNA连接酶(1魏氏单位/微升) 3微升去离子水 31微升同时设一对照管，即仅有载体，无嵌合基因DNA片段。在摄氏16度连接1小时，置摄氏70度10分钟灭活连接酶，乙醇沉淀，最后溶于20微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。于摄氏负20度保存。
1.6.5.嵌合基因与pCANTAB-5-E连接产物的转化及表达产物的纯化见Amersham Biosciences(目录号27-9401-01和27-9402-01)的说明。
权利要求
1.一种嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时第一(或第二)链的方向为氨基端到羧基端通过链接区链接第二(或第一)链，其特征是所述的第一链和第二链在合成时都以羧基端和链接区相连，所述的第二(或第一)链方向为羧基端到氨基端；形成一条完整的DNA链的嵌合基因序列的方向为第一(或第二)链的氨基端→羧基端→链接区→第二(或第一)链的羧基端→氨基端。
2.根据权利要求1所述的一种嵌合基因的构建方法，所述的第一链和第二链构建成嵌合基因的基因片段，其特征是所述的基因片段是同种蛋白基因的全部基因或部分基因或是来自不同蛋白的基因片段，是来自生物体内或是人工合成的基因片段；是确切的核苷酸序列，或是随机的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种嵌合基因的构建方法，其特征是所述的链接区由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列，一般为苷氨酸和丝氨酸组成的链接序列。
4.根据权利要求1所述的一种嵌合基因的构建方法，其特征是所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以使嵌合基因表达产物纯化。
5.根据权利要求4所述的一种嵌合基因的构建方法，其特征是在所述的琥珀终止密码子UAG，的后面通过链接区连接噬菌体的基因片段，使其与外源性基因片段融合，并表达于噬菌体的表面，利于蛋白之间互相作用的深入研究。
6.一种嵌合基因的构建方法的应用，通过逆转录、聚合酶链反应、拼接、测序和人工合成常见的分子生物学方法，证明用本发明的嵌合基因的构建方法所构成的嵌合基因，其特征是有更多的自由氨基端，有利于其与受体和配基的自由结合，和生物体内天然存在的状况类似，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有利于细胞蛋白的合成，促进构建全新的分子的研究。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种嵌合基因的构建方法，其氨基酸序列的连接方向为第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的羧基端→氨基端，其中的一条链和传统人工合成蛋白的方向相反，传统方法的方向为第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的氨基端→羧基端的序列，本发明序列的连接方式类似生物体内天然存在的状况，有更多的自由氨基端，有利于与受体和配基的自由组合，促进构建全新分子的研究。
文档编号C07H21/04GK1445371SQ0310061
公开日2003年10月1日 申请日期2003年1月17日 优先权日2003年1月17日
发明者刘吉荣, 迟云发 申请人:北京神洲天才科技发展有限公司