一种具有抗肿瘤作用的蛋白质及其体外高效表达方法

文档序号:3552444阅读:232来源:国知局
专利名称:一种具有抗肿瘤作用的蛋白质及其体外高效表达方法
技术领域
本发明涉及化合物的新用途,特别是涉及心肌肌钙蛋白I的新用途。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康最严重的一类疾病。目前治疗恶性肿瘤的常用方法有外科手术治疗、化学药物疗法、放射治疗、生物疗法和中医中药疗法。其中以外科手术治疗、化学药物疗法、放射治疗最为常用。外科手术治疗作为大多数肿瘤治疗的首选和主要方案,使无数肿瘤患者得以康复、延长寿命或者提高了生活质量。但是,在肿瘤治疗方面,外科手术治疗只适用于一定条件和范围的病人,而且由于肿瘤可复发和转移的原因,手术切除并不都能达到根治的目的。化学药物疗法和放射治疗的运用在肿瘤的治疗方面也发挥着非常重要和必不可少的作用,并且也在不断的发展。但是,目前应用的化疗药物疗法和放射治疗对身体中所有活跃的增殖细胞都有侵害,如造血系统、胃肠道等,所以放化疗的病人常有血象降低、胃肠道出血、恶心、呕吐等症状。而且,由于受到病人机体和精神方面承受力及肿瘤细胞出现耐药性等多方面原因的限制,放化疗并不能杀死所有的肿瘤细胞,为肿瘤的复发和转移及疾病的恶化留下了隐患。生物疗法和中医中药疗法也是抗肿瘤的合理的方法,但仍需继续研究以提高疗效。因此,开发有明显治疗效果、安全的抗肿瘤药物是医药界面临的一项迫在眉睫的任务。
研究表明,恶性实体肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移依赖于新血管的不断生成,所以抑制血管生成能显著地抑制肿瘤的生长。抑制血管生成,阻断瘤体血液供应是不同于常规抗肿瘤治疗的新策略,也称为“肿瘤饥饿疗法”,已经成为抗肿瘤治疗研究的热点。正常生理状态下,除了女性生殖系统在排卵,黄体生成,怀孕等过程,有短暂的新生血管生成过程外,成年人的脉管系统增生处于相对静止状态。但是在肿瘤组织中,为适应瘤组织的快速生长,血管生成非常活跃,以及时为瘤组织生长供应血液。肿瘤组织中的微血管来源有两种一种是肿瘤细胞等产生的血管内皮生长因子,诱导瘤体生成微血管;另一种是残存于瘤体的宿主血管逐渐变为肿瘤血管,既宿主血管的肿瘤化。与正常血管不同,肿瘤血管的血管内皮细胞不完整,基底膜稀疏且易于泄露。肿瘤血管生成后不再进一步分化改建成动脉及静脉,无平滑肌及神经末梢,属于被动血管,其血流完全依赖于体循环。新生的微血管是肿瘤浸润和转移的第一站,肿瘤细胞通过肿瘤微血管壁进入血液循环向远处转移。
实体肿瘤生长需要大量的血液供应。许多实验研究证实抑制动物体内新血管生成,可有效地切断为肿瘤生长提供养分的血液供应,使瘤体萎缩以至消失。抗新生血管药物TNP-470以及抗bFGF、VEGF单克隆抗体的应用,突变型VEGF受体FlK-1竞争性阻断VEGF信号传导,αVβ3过度表达诱导内皮细胞凋亡、以及Angiostatin特异抑制肿瘤新生血管形成等,均可抑制肿瘤生长,是一种新型的、有前途的抗肿瘤药物,可以弥补当前临床肿瘤治疗手段的局限并取代部分治疗手段。由于这类药物是通过抑制新生血管的形成来达到抑制肿瘤生长的,而人的正常组织细胞的生长不依赖于新生血管的生成,所以对正常组织几乎没有毒副作用。这类药物不直接作用于肿瘤细胞,故抑制肿瘤具有广谱性而不产生抗药性,是当前国际上公认的有效、安全、有前途的抗肿瘤药物,主要用于原位和转移实体瘤的治疗和辅助肿瘤的手术治疗,也可以用来防止肿瘤的复发和转移。因此,开发一种具有血管增生抑制作用的抗肿瘤药物,在恶性肿瘤的防治方面,具有重要的临床意义。
心肌肌钙蛋白I是心肌肌钙蛋白的三个亚基之一,目前常被用作心肌梗塞诊断的标志物,具有序列表中的SEQ ID №1氨基酸残基序列,由210个氨基酸残基组成。
大肠杆菌和毕赤酵母表达系统是用于表达外源蛋白的最成功的表达系统之一,近年来发展非常迅速,目前已有几百种蛋白在该表达系统中得以表达。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母菌,其生长迅速,培养条件简单,可以高密度连续培养,遗传操作与酿酒酵母相似,技术已相当成熟,是工业生产中常用的高表达菌种。

发明内容
本发明的目的是提供心肌肌钙蛋白I的一种新用途。
本发明发明人的研究表明,心肌肌钙蛋白I具有抑制肿瘤增生的作用。因此本发明的技术方案是心肌肌钙蛋白I在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
需要的时候,在以心肌肌钙蛋白I为活性成分的药物中,还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明的药物中,心肌肌钙蛋白I的有效剂量为1微克-1毫克/公斤体重/天,可以制成注射液、冻干粉针剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明的另一个目的是提供在毕赤酵母和大肠杆菌表达系统中高效表达的心肌肌钙蛋白I的编码基因。
本发明提供的心肌肌钙蛋白I编码基因有两种,第一种是在毕赤酵母表达系统中高效表达的心肌肌钙蛋白I编码基因,是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2;2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸;3)与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列2的DNA序列由633个核苷酸组成,编码序列表中序列1的蛋白质。
含有上述基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围,如pPIC9K-AAF载体,(物理图谱如图1所示)和GS115毕赤酵母细胞系。
本发明提供的第二种心肌肌钙蛋白I编码基因是在大肠杆菌表达系统中高效表达的心肌肌钙蛋白I编码基因,是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №3;2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸;3)与序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列3的DNA序列由633个核苷酸组成,编码序列表中序列1的蛋白质。
含有上述基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围,如pET-AAF载体,(物理图谱如图3所示)和BL21-DE3大肠杆菌细胞系。
本发明创造性地揭示了心肌肌钙蛋白I的抗肿瘤活性。以心肌肌钙蛋白I为活性成分的药物不直接作用于肿瘤细胞,抑制肿瘤具有广谱性而不产生抗药性,具有深远的实践意义。


图1为表达质粒pPIC9KAAF的物理图谱图2为质粒pPIC9K-AAF的酶切电泳图谱图3为甲醇诱导后的GS115毕赤酵母菌培养液电泳图谱图4为表达质粒pET-AAF的物理图谱图5为表达质粒pET-AAF的酶切电泳图谱图6为IPTG诱导后的BL21-DE3大肠杆菌培养液电泳图谱具体实施方式
实施例1、心肌肌钙蛋白I的毕赤酵母菌体外表达(1)心肌肌钙蛋白I基因的合成人工合成序列表中序列2的全长序列,并在其5’端加上NdeI酶切位点、3’端加上NotI酶切位点,得到序列AAF1。
(2)心肌肌钙蛋白I体外表达a、将人工合成的全序列装入pGEM-T-EASY质粒内,构建质粒pGEM-AAF1。
b、表达质粒的构建采用购自美国Invitrogen公司的高效表达质粒pPIC9K,用NdeI和NotI分别酶切pGEM-AAF1质粒和pPIC9K质粒,凝胶电泳收集目标片段,用T4连接酶16℃过夜连接。经常规方法的转化,挑菌,扩增获得表达质粒pPIC9K-AAF,其结构图谱如图1所示。酶切鉴定结果如图2所示,证明表达质粒的结构正确。
c、将质粒pPIC9K-AAF用SacI线性化,采用浙江新芝公司电基因导入仪,将线性化的pPIC9K-AAF导入GS115毕赤酵母菌(购自Invitrogen公司)内,经培养,挑选,筛选等过程,获得抗G418mg/ml的单克隆菌。
d、挑选单克隆菌,接种于5ml培养基中,30℃过夜,然后转入250ml培养基中,继续培养至OD600=10-20,收集菌体,用无碳源培养基稀释至OD600=50,继续培养24小时,加入甲醇至终浓度为1%诱导表达,每隔24小时加甲醇一次,至96小时。离心取上清液,进行凝胶电泳分析和功能测定。取10ml上清液,用12%SDS-PAGE电泳,并经考马斯亮兰染色。如图3所示,结果表明在32kD的位置,有诱导的蛋白表达,并根据BSA对照,计算得到表达量为120mg/L。
(3)本发明心肌肌钙蛋白I的功能测定取24只昆明小鼠,分为甲醇诱导前上清和甲醇诱导后上清两组,分别颈部皮下接种S180腹水细胞瘤株,三天后分别皮下注射甲醇诱导前上清和甲醇诱导后上清0.5ml/只,每隔12小时注射一次,连续注射7天。观察并切取瘤组织,称重,结果甲醇诱导前上清和甲醇诱导后上清组瘤体重分别为0.82+0.22克和0.11+0.05克,抑瘤率为86.6%。
实施例2、心肌肌钙蛋白I的大肠杆菌体外表达(1)人工基因的合成人工合成基因序列3全长1-210碱基,分别在5’端加上SnabI酶切位点和3’端加上NotI酶切位点,得到序列AFF2。
(2)心肌肌钙蛋白I体外表达a、将人工合成的全序列装入pGEM-T-EASY质粒内,构建pGEM-AAF2克隆载体。
b、表达质粒的构建采用购自美国Novagen公司的高效表达质粒pET21b,用SnabI和NotI分别酶切pGEM-AAF2质粒和pET21b质粒,凝胶电泳收集目标片段,用T4连接酶16℃过夜连接。经常规方法的转化,挑菌,扩增获得表达质粒pET-AAF,其结构图谱如图4所示。酶切鉴定结果,如图5所示,证明表达质粒的结构正确。
c、将质粒pET-AAF用转化法导入BL21-DE3大肠杆菌内,经培养,挑选,筛选等过程,获得单克隆菌。
d、挑选单克隆菌,接种于5ml培养基中,37℃过夜,然后转入250ml培养基中,继续培养至OD600=0.8,加入IPTG至终浓度为1%37℃诱导表达4小时。离心取沉淀,用裂解液混悬,超声破碎,10000g离心30分钟,弃上清,沉淀洗涤两次,最后用8M尿素溶解,经50mM磷酸缓冲盐液过夜透析。取10ul,用12%SDS-PAGE电泳,并经考马斯亮兰染色。如图6所示,结果表明在29KD的位置,有诱导的蛋白表达,并根据BSA对照,计算得出表达量为85mg/L。
(3)本发明心肌肌钙蛋白I的功能测定取24只昆明小鼠,分为磷酸盐缓冲液和表达提纯液组,分别颈部皮下接种S180腹水细胞瘤株,三天后分别皮下注射磷酸盐缓冲液和表达提纯液1.0mg蛋白/kg,每隔12小时注射一次,连续注射7天。观察并切取瘤组织,称重,结果磷酸盐缓冲液和表达提纯液组瘤体重分别为1.02+0.28克和0.15+0.06克,抑瘤率为85.3%。
实施例3、心肌肌钙蛋白I的大肠杆菌体外表达提纯液的体内稳定性实验取24只昆明小鼠,分为磷酸盐缓冲液和表达提纯液组,分别皮下注射磷酸盐缓冲液和表达提纯液2.0mg蛋白/kg,注射8小时,眼底静脉取血,分离血清,采用常规酶联免疫法测定血清心肌肌钙蛋白I浓度。结果磷酸盐缓冲液和表达提纯液组血清心肌肌钙蛋白I浓度分别为0.52+0.08ng/ml、3.55+0.12ng/ml,表明心肌肌钙蛋白I在体内的稳定性较高。
序列表<160>3<210>1<211>210<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala15 10 15Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala20 25 30Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg35 40 45Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu50 55 60Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala65 70 75Leu Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe80 85 90Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp95 100 105Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys110 115 120Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu125 130 135Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg Ile Ser140 145 150Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu
155 160 165Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp170 175 180Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile185 190 195Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser200 205 210<210>2<211>633<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atggctgacg gttcctccga cgctgctaga gagccaagac cagctccagc tccaatcaga 60agaagatcct ccaactacag agcttacgct accgagccac acgctaagaa gaagtccaag 120atctccgctt ccagaaagtt gcaattgaag accttgttgt tgcaaatcgc taagcaagag 180ttggagagag aggctgagga gagaagaggt gagaagggta gagctttgtc caccagatgt 240caaccattgg agttggctgg tttgggtttc gctgagttgc aagacttgtg tagacaattg 300cacgctagag tcgacaaggt cgacgaggag agatacgaca tcgaggctaa ggtcaccaag 360aacatcaccg agatcgctga cttgacccaa aagatcttcg acttgagagg taagttcaag 420agaccaacct tgagaagagt cagaatctcc gctgacgcta tgatgcaagc tttgttgggt 480gctagagcta aggagtcctt ggacttgaga gctcacttga agcaagtcaa gaaggaggac 540accgagaagg agaacagaga ggtcggtgac tggagaaaga acatcgacgc tttgtccggt 600atggagggta gaaagaagaa gttcgagtcc taa 633<210>3<211>633<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.心肌肌钙蛋白I在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于在所述抑制肿瘤的药物中,心肌肌钙蛋白I的有效剂量为1微克-1毫克/公斤体重/天。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于在制备抑制肿瘤的药物中还加入一种或多种药学上可接受的载体。
4.在毕赤酵母表达系统中高效表达的心肌肌钙蛋白I编码基因,是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2;2)与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列具有90%以上同源性,具有毕赤酵母偏爱密码子编码SEQ ID №1的DNA序列。
5.含有权利要求4所述基因的表达载体和细胞系。
6.根据权利要求5所述的表达载体和细胞系,其特征在于所述表达载体为pPIC9K-AAF;所述细胞系为GS115毕赤酵母。
7.在大肠杆菌表达系统中高效表达的心肌肌钙蛋白I编码基因,是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №3;2)与序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列具有90%以上同源性,具有大肠杆菌偏爱密码子编码SEQ ID №1的DNA序列。
8.含有权利要求7所述基因的表达载体和细胞系。
9.根据权利要求8所述的表达载体和细胞系,其特征在于所述表达载体为pET-AAF;所述细胞系为BL21-DE3大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了心肌肌钙蛋白I在制备抑制肿瘤药物中的用途。研究表明,心肌肌钙蛋白I具有抑制肿瘤的作用。本发明的技术方案是心肌肌钙蛋白I在制备抑制肿瘤的药物中的应用。在抑制肿瘤的药物中,心肌肌钙蛋白I的有效剂量为1微克-1毫克/公斤体重/天。在制备抑制肿瘤的药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。本发明还公开了在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中高效表达的心肌肌钙蛋白I编码基因。本发明的药物不直接作用于肿瘤细胞,抑制肿瘤具有广谱性而不产生抗药性,具有深远的实践意义。
文档编号C07K14/435GK1537633SQ0310986
公开日2004年10月20日 申请日期2003年4月15日 优先权日2003年4月15日
发明者刘凤鸣 申请人:刘凤鸣
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