专利名称：一组抗hbv感染及防治乙型肝炎的核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组抗HBV感染及防治乙型肝炎的核苷酸序列及其应用。
背景技术：
慢性乙型病毒性肝炎(“乙肝”)是乙型肝炎病毒引致的肝脏炎性病变。我国是“乙肝”的高发区，约1.2亿人的乙肝表面抗原呈现阳性。乙肝的流行，严重危害人类健康。
近年的研究发现，多种细胞内存在着“RNA干扰”机制。“RNA干扰”是一种由双链RNA(干扰RNA)诱导的基因沉默，在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA被降解，从而抑制了该基因的表达。通过该途径也可降解病毒基因、抑制病毒基因在细胞内的表达。因此，寻找针对乙型肝炎病毒的特异“干扰RNA”序列为诊断和治疗乙型肝炎提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供一组抗HBV感染及防治乙型肝炎的核苷酸序列及其片段，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
本发明的另一个目的是提供上述核苷酸序列的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下设计方案一组抗HBV感染及防治乙型肝炎的DNA序列及其片段，该组DNA序列如下1)catcctgctgctatgcctcat2)aaggtatgttgcccgtttgtcc3)cctattgattggaaagtatgtcaaa4)tcgccaacttacaaggcctttct5)tgtgctgccaactggatcct6)ccgtgtgcacttcgcttcacct7)ggaggctgtaggcataaattggtctgt8)ggagtgtggattcgcactcct9)agaccaccaaatgcccctatc10)gaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgc11)tattcttgggaacaagagctacag12)ttcaagcctccaagctgtgccttgggtggcttt。
所述的DNA序列及其片段和与其反向互补序列形成的双链DNA序列。该双连序列主要应用于克隆至表达载体，以表达干扰RNA。
所述的DNA序列及其片段在其5’端或3’端加核苷酸修饰形成的DNA序列。其用途如在DNA两端加上酶切位点。
一组所述的DNA序列对应的RNA序列及其片段。该RNA序列在细胞内可能与细胞内RNA形成双链RNA。
所述的RNA序列及其片段和与之互补的序列杂交形成的双链RNA序列。该RNA双链具有RNA干扰活性，可以使特异的mRNA降解。
所述的RNA序列及其片段和与之反向互补的序列加上中间非互补连接序列形成的发夹样双链RNA序列。在细胞内可通过载体表达发夹样双链，具有干扰RNA活性，促使特异mRNA降解。
所述的RNA序列及其片段在其5’端或3’端加核苷酸修饰形成的RNA序列。这种修饰通常是在合成RNA的3’端或5’端加UU修饰。
包含所述的DNA序列及其片段的表达载体。即利用质粒等载体，在细胞内表达RNA，形成干扰RNA。
包含所述的RNA序列及其片段的表达载体。
包含所述DNA序列及其片段、RNA序列及其片段和表达载体的脂质体。使用脂质体，可以将RNA或可表达RNA的质粒导入细胞，从而达成治疗目的。
将所述的DNA序列及其片段或RNA序列及其片段利用病毒载体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。常用的病毒载体包括DNA病毒载体，如rAAV和ad-5；RNA病毒载体，如Lentivirus和Coronovirus。使用重组腺病毒伴随病毒载体，携带合适真核启动子及编码发夹状双链RNA的以上所述的DNA或RNA片段，该重组病毒感染细胞或注射给予动物及人体后表达形成干扰RNA，抑制HBV基因的表达，从而治疗HBV感染。
将所述的表达载体和脂质体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
所述的DNA序列及其片段、RNA序列及其片段、表达载体、脂质体和方法用于制备抗HBV感染及乙型肝炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
本发明通过同源序列比较，获得了一系列在各种乙型肝炎病毒(HBV)间保守的DNA序列。使用该序列衍生的干扰RNA可以有效抑制乙型肝炎病毒基因的表达。与已有的基因治疗方法比较，本发明具有以下优点1.通过同源比较，获得了一系列与所有已经发表的乙型肝炎病毒序列高度同源的DNA序列片段，使用该系列片段衍生的干扰RNA可以有效抑制乙型肝炎病毒基因的表达，而且作用位点多、作用范围广泛；2.这些干扰RNA作用的位点是乙型肝炎病毒的保守序列，因而不会因病毒基因的突变而失去作用效果；3.使用质粒转录的这些干扰RNA，可在细胞内抑制相应基因的表达，因此不仅有望用于乙肝患者的治疗，而且有可能用于乙肝感染的预防；4.用腺病毒伴随病毒作为载体，可将目的干扰RNA对应的DNA片段整合到宿主细胞的染色体上，因而有可能使人体产生永久的抗HBV能力。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
图1为合成干扰RNA抑制HBsAg表达的效率2为合成干扰RNA抑制HBcAg表达的效率3为表达内部双链RNA的质粒pH1-HBVS1的的构建4为质粒pAAV-HBVS1的构建图5为质粒pcDNA-HBVS的构建具体实施方式
实施例中采用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版(科学出版社，1998年)。
实施例1极度保守HBV DNA序列的获得选择已经发表的HBV1典型序列，按功能基因分成每个约70个核苷酸(nt)的片段；每一个片段用NIH(美国国立卫生研究院)提供的BLAST软件(BLASTN2.2.6)在英特网上分析其在GenBank(NCBI，美国国家生物技术信息中心)，EMBL(欧洲分子生物学实验室核酸序列数据库)，DDBJ(日本DNA数据库)及GDB(基因组数据库)等数据库核酸序列中的同源序列；选择出符合以下条件的核苷酸序列(1)该片段大于或等于19个核苷酸；(2)该片段在所比较的HBV序列中极度保守或完全同源；所获得的序列见表1。
表1.通过同源比较发现的HBV序列中极度保守的DNA序列编号 HBV基因 DNA序列1 Polymerase；Scatcctgctgctatgcctcat2 Polymerase；Saaggtatgttgcccgtttgtcc3 Polymerase cctattgattggaaagtatgtcaaa4 Polymerase tcgccaacttacaaggcctttct5 Polymerase；Xtgtgctgccaactggatcct6 Polymerase；Xccgtgtgcacttcgcttcacct
编号HBV基因 DNA序列7 X ggaggctgtaggcataaattggtctgt8 Core ttcaagcctccaagctgtgccttgggtggcttt9 Core ggagtgtggattcgcactcct10 Core agaccaccaaatgcccctatc11 Polymerase；core gaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgc12 Polymerasetattcttgggaacaagagctacag实施例2.使用合成RNA双链，降低HBV S基因的表达。
根据上述env基因的保守序列(表1中1号序列)，合成DNA序列对应的19核苷酸的RNA片段，并根据互补原则合成该链的互补RNA链，在RNA链3’端加UU修饰5’uccugcugcuaugccucauuu3’uuaggacgacgatacggagta上述合成的RNA链各1μg，加1μl退火缓冲液(10mmol/LTrisHCl(PH7.4)，100mmol/L NaCl)，加不含RNase的去离子水至总体积10μl。90℃加热5分后25℃保温1h，取2μg退火后的RNA双链、经4IU单链RNA特异的RNase及DNase I 37℃消化30分钟后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别双链RNA的形成情况。结果发现，20bp处有一单一的RNA条带出现。说明合成的两条互补RNA单链已杂交成RNA双链。
接种CHO-HBV细胞(该细胞整合有乙肝病毒全基因组并表达有关蛋白，本公司自行构建)于100mm的培养皿中培养过夜，使细胞达到90％的汇合度(confluence)。分别取1.5ml无抗生素的DMEM稀释2μg合成的双链干扰RNA、以2μg合成的单链RNA为对照，然后加入1.5ml无抗生素DMEM稀释的适量0ligofectamine转染试剂(Invitrogen公司产品)，轻微混匀后室温中放置20分钟。将转染液加入到所培养的CHO-HBV细胞中，转染细胞6小时。弃去转染液，加入含10％FCS的DMEM培养液，继续培养72小时。裂解细胞，离心提取上清。使用HBV表面蛋白抗原ELISA检测试剂(华美生物工程公司)测定乙肝表面抗原的表达量，并观察干扰RNA对乙肝表面抗原表达的影响。
结果如图1所示，转染2μg双链RNA的细胞，其HBsAg表达量(1#)较转染2μg单链(作为阴性对照)的细胞显著降低，仅为对照的1/10。由于该蛋白为病毒的外膜蛋白且含有病毒进入细胞的配体序列，因此抑制该基因的表达可阻断病毒颗粒的形成、防止病毒感染细胞。
实施例3、合成RNA双链抑制core(HBcAg)基因表达根据上述core保守序列(表1中8号序列)合成19核苷酸的RNA片段，并根据互补原则合成该链的互补RNA链，在互补RNA链3’端加UU，如实施例2退火，形成RNA双链5’gaguguggauucgcacuccuu3’uucucacaccuaagcgugagg按照实施例2的方法，将2μg双链RNA及2μg单链RNA(正链)分别转染CHO(HBV)细胞，72小时后收集细胞，破碎后测定HBcAg的表达量(使用华美生物工程有限公司HBcAg ELISA试剂盒)。
结果表明，与对照相比，合成双链RNA使细胞HBcAg的表达量降低了85％(图2，8#)。
实施例4.合成其它双链RNA抑制S基因和c基因的表达同实施例2，合成了实施例1中2号、9号、10号序列对应的双链RNA，同样测定转染CHO(HBV)细胞后HBsAg或HBcAg的表达水平，结果表明这3个序列均使相应蛋白的表达量大幅降低(分别见图1中2#，图2中9#和10#)。
实施例5.合成含有S基因保守序列对应的DNA片段及其杂交序列，克隆至真核表达载体，在细胞内表达干扰RNA，抑制HBV膜蛋白的表达合成含有S基因保守序列(表1中1号序列)的DNA片段及其杂交序列(黑斜体)的DNA片段，退火后形成DNA片段，5’端为BamHI位点的末端，3’端为HindIII位点的末端，在同源序列及其互补序列中间含有间隔序列。B为A的互补序列1A gatcccctcctgctgctatgcctcatttcaagagaatgaggcatagcagcaggatttttggaaa1B agcttttccaaaaatcctgctgctatgcctcattctcttgaaatgaggcatagcagcaggaggg如图3所示，通过PCR(以人基因组DNA 1μg为模板，引物15’-TAATTAATACGGCTGCGGCCGCAATTCGAACGCTGACGTC-3’100ng，其5‘端分别含有AseI，MluI和NotI位点；引物25’-GCACTAGTAAGCTTGGATCCGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC-3’100ng，其5’端含有SpeI、HindIII和BglII位点，使用Roche High Fidelity PCR试剂盒按说明书，使用PE公司9700型PCR仪，进行扩增。扩增条件94℃ 50秒；46℃ 50秒，72℃ 90秒，扩增2个循环；94℃ 50秒；56℃ 50秒，72℃ 90秒，扩增25个循环；获得人H1 RNA基因的启动子区，质粒pEGFPC1(Clontech)用AseI和XbaI酶切后回收大片段作为载体，上述扩增片段用AseI和SpeI酶切后回收，与载体连接，转化大肠杆菌后获得质粒pH1。将上述合成的DNA片段(A，B)退火后克隆至pH1质粒的BamHI和HindIII位点，构建质粒pH1-HBVS1(图3)。该质粒在细胞中，在RNA聚合酶III的作用下，表达发夹状RNA，形成RNA双链。
用4μg pH1-HBVS1质粒(使用同量pH1质粒作为对照)，使用Lipofectamine法转染CHO(HBV)细胞，通过如实施例2所述方法比较HBsAg表达产量的差异。结果表明pH1-HBVS1转染细胞后HBsAg表达量降低90％左右(图1)。
实施例6.使用腺病毒伴随病毒载体，携带如实施例5中所述的H1启动子及编码发夹状双链RNA的DNA片段，重组病毒感染细胞后抑制HBV S基因的表达。
如图5所示，质粒pAAV-MCS(购于Stratagene)用MluI和HindIII酶切；含H1启动子和编码HBV S1发夹状RNA的DNA片段从质粒pH1-HBVS1中用MluI和HindIII酶切获得，并克隆至pAAV-MCS的相应位点.构建质粒pAAV-HBV S1(图4)，将该质粒(4μg)(对照病毒载体用pAAV-MCS)与辅助质粒pHelper(1μg，Stratagene)和质粒pAAV-RC(2μg Stratagene)一起用LIPOFECTamine法共转染HEK 293FT细胞(见说明书)，转染72小时后收集细胞和培养液上清，反复冻融4次，12000rpm离心10分钟，取上清储存在-20℃备用，此上清即为AAV-干扰RNA病毒上清。
以乙型肝炎病毒(adr亚型)基因组DNA 1ng为模板，加入引物HBV S5(cggatccatgcagtggaactccacaaca)和HBV S3(cgaattctcaaatgtatacccaaagac)，和HBV S3各100ng，使用Roche公司HighFidelity PCR试剂盒(方法见说明书)，使用PE公司9700型PCR仪，94℃ 50秒；46℃ 50秒，72℃ 90秒，扩增25个循环，获得HBV的S基因(含PreS1和PreS2)。该片段用BamHI+EcoRI酶切后克隆至pcDNA3.1的相应位点，获得质粒pcDNA-HBVS(图5)。
使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK 293细胞至50％左右，加入上述病毒上清，继续培养12h。质粒pcDNA-HBS 5μg，使用Lipofectamine法转染上述感染病毒的293细胞，继续培养72小时后受细胞，使用ELISA法分析HBsAg的表达水平。
结果和对照(携带半乳糖苷酶基因的AAV)病毒相比，表达干扰RNA的重组腺相关病毒可以显著抑制HBsAg的表达(图2)。
序列表<110>北京三诺佳邑生物技术有限公司<120>一组抗HBV感染及防治乙型肝炎的核苷酸序列及其应用<130>
<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>1catcctgctg ctatgcctca t 21<210>2<211>22<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>2aaggtatgtt gcccgtttgt cc22<210>3<211>25<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)
<400>3cctattgatt ggaaagtatg tcaaa25<210>4<211>23<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>4tcgccaactt acaaggcctt tct 23<210>5<211>20<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>5tgtgctgcca actggatcct 20<210>6<211>22<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>6ccgtgtgcac ttcgcttcac ct 22<210>7
<211>27<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>7ggaggctgta ggcataaatt ggtctgt27<210>8<211>21<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>8ggagtgtgga ttcgcactcc t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>9agaccaccaa atgcccctat c 21<210>10<211>33<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>10
gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgc33<210>11<211>24<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>11tattcttggg aacaagagct acag24<210>12<211>33<212>DNA<213>正嗜肝DNA病毒属(orthohepadnaviridae)<400>12ttcaagcctc caagctgtgc cttgggtggc ttt3权利要求
1.一组抗HBV感染及防治乙型肝炎的DNA序列及其片段，该组DNA序列如下1)catcctgctgctatgcctcat2)aaggtatgttgcccgtttgtcc3)cctattgattggaaagtatgtcaaa4)tcgccaacttacaaggcctttct5)tgtgctgccaactggatcct6)ccgtgtgcacttcgcttcacct7)ggaggctgtaggcataaattggtctgt8)ggagtgtggattcgcactcct9)agaccaccaaatgcccctatc10)gaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgc11)tattcttgggaacaagagctacag12)ttcaagcctccaagctgtgccttgggtggcttt。
2.权利要求1所述的DNA序列及其片段和与其反向互补序列形成的双链DNA序列。
3.权利要求1所述的DNA序列及其片段和与之反向互补的序列加上中间非互补连接序列形成的发夹样双链DNA序列。
4.权利要求1或2所述的DNA序列及其片段在其5’端或3’端加核苷酸修饰形成的DNA序列。
5.一组权利要求1所述的DNA序列对应的RNA序列及其片段。
6.权利要求5所述的RNA序列及其片段和与之互补的序列杂交形成的双链RNA序列。
7.权利要求5所述的RNA序列及其片段和与之反向互补的序列加上中间非互补连接序列形成的发夹样双链RNA序列。
8.权利要求5或6所述的RNA序列及其片段在其5’端或3’端加核苷酸修饰形成的DNA序列。
9.包含权利要求1至4中任何一项所述的DNA序列及其片段的表达载体。
10.包含权利要求5至8中任何一项所述的RNA序列及其片段的表达载体。
11.包含权利要求1至4中任何一项所述的DNA序列及其片段的脂质体。
12.包含权力要求5至8中任何一项所述的RNA序列及其片段的脂质体。
13.包含权利要求9或10所述的表达载体的脂质体。
14.将权利要求1至4中任何一项所述的DNA序列及其片段利用病毒载体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
15.将权利要求5至8中任何一项所述的RNA序列及其片段利用病毒载体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
16.将权利要求9或10所述的表达载体导在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
17.将权利要求11至13中任何一项所述的脂质体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
18.权利要求1至4中任何一项所述的DNA序列及其片段用于制备抗HBV感染及乙型肝炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
19.权利要求5至8中任何一项所述的RNA序列及其片段用于制备抗HBV感染及乙型肝炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
20.权利要求9或10所述的表达载体用于制备抗HBV感染及乙型肝炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
21.权利要求11至13中任何一项所述的脂质体用于制备抗HBV感染及乙型肝炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
22.权利要求14至17中任何一项所述的方法用于制备抗HBV感染及乙型肝炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一组抗HBV感染及防治乙型肝炎的DNA序列及其片段，如序列表所示；与该组序列相应的RNA序列及其片段、修饰的核苷酸序列、双链核苷酸序列；包含上述核苷酸序列的表达载体、脂质体以及将所述核苷酸序列、表达载体和脂质体在体内或体外导入真核细胞系、动物或人体的方法；上述内容在用于制备抗HBV感染及乙型肝炎诊断、治疗和预防的药物的应用。本发明的优点是通过同源比较，获得一系列与所有已经发表的HBV序列高度同源的DNA序列片段，使用该系列片段衍生的双链RNA序列可以有效地抑制HBV基因的表达；使用质粒转录的该系列RNA也可在细胞内抑制HBV基因的表达；携带该片段DNA的腺病毒伴随病毒感染细胞后可以转录出对应的双链RNA并抑制HBV基因的表达。
文档编号C07H21/00GK1580070SQ0314969
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月6日 优先权日2003年8月6日
发明者周志文, 李月娟, 赵春文, 冯宇霞 申请人:北京三诺佳邑生物技术有限责任公司