专利名称：金葡菌毒力因子调控蛋白的抗原表位及其模拟表位和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗原表位及模拟表位，具体涉及金黄色葡萄球菌(金葡菌)毒力因子调控蛋白的两个抗原表位及其模拟表位。本发明还涉及与这些表位氨基酸序列一致的多肽在制备抗金葡菌感染药物或疫苗等方面中的应用。
背景技术：
金葡菌是一类常见的革兰氏阳性致病菌，是引起烧伤及战伤感染、肺炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年仅医院内感染金葡菌的人数就超过数百万。目前临床上对金葡菌的治疗多采用联合使用抗生素的办法，但是效果并不理想。由于金葡菌极易产生耐药性且无好的解决方法，常用的许多抗生素对之无效，控制金葡菌感染是临床医学殛待解决的问题之一。
金葡菌的主要致病物质是毒素，包括溶血毒素、杀白细胞素、肠毒素等。最新研究表明，金葡菌这些毒力因子的合成是受一种可调节RNA分子，及RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因转录，通过碱基互补调节毒力因子的翻译。在细菌生长的对数早期其RNAIII水平低，但到对数晚期RNAIII水平会增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的蛋白RAP(RNAIIIactivating protein)即RNAIII激活蛋白调节的，故因子RAP又称为金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持续分泌RAP，在RAP达到一定浓度后才有激活毒力因子产生的作用。没有RAP产生的金葡菌本身并不致病。最新研究发现，RAP激活RNAIII的转录是通过一个21KD的蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)介导的，当TRAP蛋白的编码基因被突变失活后，RAP不能够激活RNAIII的转录。TRAP由167个氨基酸组成，具有His激酶活性。TRAP蛋白在金葡菌生长的早期开始磷酸化，在对数生长中期达到最大水平。在RAP作用后，通过自身磷酸化来进行信号传导，从而介导细胞内RNAIII水平上升，加速金葡菌外毒素的分泌(Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，2762658-2667)。由此可见TRAP蛋白在金葡菌的毒素表达调控也起着关键性的作用。2001的研究发现TRAP的抗体可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌(Oleny V，et al.Peptides 2001，221621-1627)。
抗原表位作为免疫细胞识别的靶结构和激发特异性免疫应答的物质基础，对于免疫反应的相关研究具有重要意义。抗原缺失突变、合成肽段扫描(PEPSCAN)、X射线晶体衍射等技术的应用，使“抗原表位”的确定成为可能，但这些方法费用高昂，需耗费大量人力、物力，而且不适于复杂表位的研究，因而其应用受到限制。“模拟表位”(mimotope)这一概念的出现，不仅为抗原表位的分析提供了线索，也为疫苗研究的发展开辟了一条新的思路。模拟表位(mimotope)，通常指能够模拟抗原表位的多肽结构，它具有与天然抗原相似的反应原性，与适当的载体偶联后，还可能具有相似的免疫原性，(但在天然抗原中可能并无与之相同或相似的序列或空间结构)。对于一些难以获得或尚不确定的抗原，人们很难甚至无法确定其抗原表位，使相关的研究难以进行。而通过获得“模拟表位”这一径，便有可能解决上述问题。不仅为抗原表位的分析提供了线索，也为疫苗研究的发展开辟了新思路，尤其是推动了构象型表位和非蛋白抗原表位的研究。
推动模拟表位研究的一项关键技术，是1985年由Dr.Smith建立并发展的噬菌体展示技术。噬菌体展示肽库的构建是运用噬菌体展示技术，将随机排列的外源肽(通常6～15个氨基酸残基组成)展示在噬菌体表面，构成多样性为107以上的随机肽库。通过亲和纯化的生物淘选过程，从噬菌体肽库中筛选出靶分子(如单克隆抗体、多克隆抗体)的结合肽，将结合肽与天然抗原进行比较，其中有的与天然抗原表位高度同源，有的与天然抗原完全不同，但都具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性，这些结合肽便被称为“模拟表位”。与分析抗原表位的传统方法相比，噬菌体展示技术具有很强的优势，不仅简便、快捷，而且应用范围广泛，适于构象型表位、非蛋白抗原表位以及尚不明确的抗原研究(Zhong G，et al.J Biol Chem 1994，26924183-24188；Mottic etal.Gene 1994，146191-198；Rodriguez L，et al.J Gen Virol 1999，80(Pt3)727-738)。
与单克隆抗体相比，以多克隆抗体或抗血清为靶标的筛选过程，难度大，但有明显的优势。表现在首先，靶标容易获得，较制备单克隆抗体时间短、成本低、操作简单；其次，可获得多个抗原表位的模拟表位，筛选效率高，有利于制备具有强免疫原性的复合疫苗。本实验将抗血清进行了免疫亲和层析纯化，去除了非特异抗体，以获得特异性高的筛选分子，有利于筛选到特异的噬菌体克隆，减少非特异克隆的富集。
发明内容
本发明的目的是提供金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)的两个抗原表位及其模拟表位。
本发明的另一目的是提供上述表位或与这些表位氨基酸序列一致的多肽在制备抗金葡菌感染药物或疫苗等方面中的应用。
为实现本发明的第一个目的，我们以TRAP多克隆抗体为靶标，通过线性肽库筛选获得了两组TRAP蛋白的抗原模拟表位，通过与TRAP蛋白序列比较，发现两个家族的序列都可以在表达序列上找到一致序列，即TRAP蛋白本身的两个抗原表位21-34位氨基酸序列和156-167位氨基酸序列。它们的氨基酸序列如下抗原表位1对应于TRAP蛋白的21-34位氨基酸序列21 NPTHQLFQFSASDT 34抗原表位2对应于TRAP蛋白的156-167位氨基酸序列
156 SYFERYLYPIKE 167本发明的金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP的两个抗原模拟表位是具有以下氨基酸序列结构模式的多肽抗原模拟表位1XPXHHQHXTGFT抗原模拟表位2SWFDXXLYPXXX上述抗原表位和抗原模拟表位结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即A代表丙氨酸残基，R代表精氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，D代表天冬氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基，E代表谷氨酸残基，H代表组氨酸残基，W代表色氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，T代表苏氨酸残基，S代表丝氨酸残基，L代表亮氨酸残基，G代表甘氨酸残基，P代表脯氨酸残基，V代表缬氨酸残基，K代表赖氨酸残基，M代表甲硫氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，X代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的任意一种。
上述表位中的有些氨基酸可以根据氨基酸的相似性进行相互替代，如谷氨酰胺残基(Q)，谷氨酸残基(E)，天冬氨酸残基(D)或天冬酰胺残基(N)之间可以相互替代；色氨酸残基(W)，酪氨酸残基(Y)或苯丙氨酸残基(F)之间可以相互替代；赖氨酸残基(K)和精氨酸残基(R)之间可以相互替代；丝氨酸残基(S)和苏氨酸残基(T)之间可以相互替代；丙氨酸残基(A)和甘氨酸残基(G)之间可以相互替代；亮氨酸残基(L)和甲硫氨酸残基(M)之间可以相互替代。
本发明的小分子多肽可通过化学合成或用基因工程重组表达的方法制得。
实验证明，具有上述结构模式的多肽能够与可以特异竞争TRAP与其多抗的结合，有效地抑制抗体的功能，与合适的载体耦联后具有与TRAP相似的免疫原性。这就为抗金葡菌感染疫苗的研究打下良好的基础，从而得以实现本发明的第二个目的。
传统抗生素治疗产生抗药性的原因主要是用药后细菌在生存压力下产生分解抗生素中有效基团的诱导酶。本发明利用的TRAP抗原表位及其模拟表位所对应的多肽在不同的金葡菌菌株TRAP蛋白之间高度保守，并且可以刺激人体产生针对TRAP的抗体，抑制TRAP的活性，因此可以制备疫苗对抗金葡菌的感染，不杀灭细菌而使细菌的致病性丧失，适用于所有耐药及非耐药菌株，这就为根除一直困扰临床的抗药性金葡菌感染这一常见、多发且有致命性的疾病找到新的出路。
图1为TRAP多抗亲和纯化电泳2为竞争ELISA方法检测抗原模拟表位序列1噬菌体克隆竞争TRAP蛋白与抗体的结合图本发明的抗原表位及其模拟表位为抗金葡菌感染疫苗方面的研究奠定了基础，为治疗金葡菌感染开辟了新的途径，具有广泛的应用价值及广阔的市场前景。
具体实施例方式
下面以抗原模拟表位1为实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1.TRAP蛋白多抗的制备及纯化将纯化的TRAP蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。利用偶联了TRAP蛋白的亲和柱从多抗血清中分离抗TRAP的IgG。SDS-PAGE电泳结果表明所纯化的IgG纯度＞90％，ELISA结果表明效价在1×105以上(见附图1，图中1表示低分子量蛋白标准，2表示纯化后的TRAP多抗)。
实施例2.TRAP多抗抗原模拟表位的筛选首先用100μl纯化的TRAP多抗IgG包被于酶联板，置4℃过夜。经过2％的明胶封闭1h后，加入噬菌体十二肽库，室温孵育1h，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1％TWEEN20，pH7.5)洗涤非特异结合的噬菌体，再用0.2mmol/L甘氨酸-HCl pH2.2洗脱特异结合的噬菌体，洗脱液用1mmol/L Tris-HCl pH9.0中和。按照试剂盒提供的方法，测定洗脱液中的噬菌体的滴度，以未包被的靶蛋白的洗脱噬菌体的滴度作为对照，测定投入产出比。同时将洗脱的与TRAP抗体IgG结合的噬菌体扩增，并测定其下滴度，用于下一轮的筛选。经过3轮筛选后，测定的投入产出有了明显的提高。将富集的噬菌体克隆进行ELISA鉴定，随机挑取24个阳性克隆进行测序。分析后得到包含抗原模拟表位序列1的上述2个家族的多肽序列。
实施例3.筛选到的抗原模拟表位序列1和表达的TRAP序列进行比较将筛选的序列和表达的TRAP蛋白的原始序列进行分析发现，抗原模拟表位序列1的序列与TRAP蛋白的21-34位氨基酸序列相似抗原模拟表位序列1NPLHHEHATGWTTRAP蛋白一级序列 21NPTHOLFQFSASDT34实施例4.抗原模拟表位序列1噬菌体克隆竞争TRAP蛋白与抗体的结合选择扩增抗原模拟表位序列1的噬菌体克隆，检测其是否能够竞争TRAP与TRAP多抗的结合。包被TRAP抗体，加入不同量TRAP蛋白和噬菌体(109)的混和物，通过酶标抗M13的单克隆抗体检测噬菌体竞争TRAP蛋白与抗体的结合。实验结果表明抗原模拟表位序列1的噬菌体克隆可以竞争TRAP蛋白与其抗体的结合，随着TRAP蛋白量的逐步提高，与抗体结合的噬菌体数目在逐步减少(附图2，图中1表示109抗原模拟表位序列1噬菌体克隆，2表示5μgTRAP+109抗原模拟表位序列1噬菌体克隆，3表示10μgTRAP+109抗原模拟表位序列1噬菌体克隆)。
实施例5.抗原模拟表位序列1的噬菌体克隆对TRAP多抗活性的抑制作用1∶100接种RN6390B，将样品加入CY培养基与金葡菌共培养6h，通过MDBK细胞毒模型检测金葡菌外毒素的分泌水平。实验结果表明TRAP多抗可以降低金葡菌外毒素的水平，而抗原模拟表位序列1的噬菌体克隆可以抑制抗体的功能，能使TRAP多抗的作用降低25％左右。这表明抗原模拟表位序列1的多肽可以通过特异结合抗体与TRAP结合部位而抑制抗体的作用。
实施例6.TRAP抗原模拟表位序列1展示在细菌鞭毛上及免疫动物的效果观察利用鞭毛的在细菌表面的高拷贝数(每个细菌约二万个拷贝)的性质，我们将TRAP抗原模拟表位序列1对应的多肽展示在大肠杆菌GI826鞭毛蛋白的硫氧环蛋白区，将重组菌免疫小鼠，检测特异抗体的产生，经过两次免疫后。ELISA和Westen Blot实验结果显示产生的抗血清能够特异结合TRAP蛋白，并且抗血清的效价大于5000，表明我们获得的模拟肽与合适的载体耦联后具有与TRAP相似的免疫原性。这就为抗金葡菌感染疫苗的研究打下良好的基础。
序列表<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所海南通用同盟药业有限公司<120> 金葡菌毒力因子调控蛋白抗原表位及其模拟表位和用途<130>
<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 14<212> PRT<213>
<400> 1Asn Pro Thr His Gln Leu Phe Gln Phe Ser Ala Ser Asp Thr1 5 10<210> 2<211> 12<212> PRT<213>
<400> 2Ser Tyr Phe Glu Arg Tyr Leu Tyr Pro Ile Lys Glu1 5 10
权利要求
1.金葡菌毒力因子调控蛋白的抗原表位，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
2.金葡菌毒力因子调控蛋白的抗原表位，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。
3.权利要求1抗原表位的模拟表位，其特征在于具有下式所示的氨基酸序列XPXHHQHXTGFT式中，字母X代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的任意一种。
4.权利要求2抗原表位的模拟表位，其特征在于具有下式所示的氨基酸序列SWFDXXLYPXXX式中，字母X代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的任意一种。
5.金葡菌毒力因子调控蛋白的抗原表位，其特征在于其氨基酸序列是根据氨基酸的相似性对权利要求1或2序列中的有些氨基酸进行替代而成。
6.金葡菌毒力因子调控蛋白的抗原模拟表位，其特征在于其氨基酸序列是根据氨基酸的相似性对权利要求3或4序列中的有些氨基酸进行替代而成。
7.权利要求1至6中的任意一种序列的多肽以任何形式在制备抗金葡菌感染药物或疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP的两个抗原表位及其模拟表位。该抗原表位的氨基酸序列为NPTHQLFQFSASDT或SYFERYLYPIKE，模拟表位的氨基酸序列为XPXHHQHXTGFT或SWFDXXLYPXXX，式中X代表二十一种已知天然L－型氨基酸残基或其D－型异构体的任意一种。本发明的抗原表位及其模拟表位可用于制备新型抗金葡菌感染疫苗或药物。
文档编号C07K14/31GK1569893SQ0315020
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月21日 优先权日2003年7月21日
发明者邵宁生, 杨光, 柳川, 高亚萍, 董洁, 丁红梅, 沈倍奋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所, 海南通用同盟药业有限公司