专利名称：白色念珠菌转录激活因子基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及白色念珠菌菌丝生长相关基因和致病基因。具体地，涉及从白色念珠菌的基因组文库中克隆到白色念珠菌转录激活因子基因CaSWI1及其用途。该基因编码的产物CaSwi1蛋白是重要的菌丝生长激活因子和毒性因子，参与白色念珠菌的菌丝生长和致病过程。
背景技术：
白色念珠菌(Candida albicans)是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，特别在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡(Odds，F.C.1994.J.Am.Acad，Dermatol.31S2-S5.)。
白色念珠菌在不同的生长条件下，有不同的生长形态，包括菌体(yeastform)，假菌丝(pseudohyphae)和菌丝(hyphae)。这种形态转化能力直接影响白色念珠菌的致病能力(Odds，F.C.1985.Crit Rev Microbiol.1245-93；Brown，A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7334-338.)，菌丝生长缺陷的菌株其系统感染能力大大下降或消失(Lo，H.J.et al，Cell 90939-949.)。许多培养条件可以引起白色念珠菌的形态转换，包括血清，温度，pH值，氮源利用以及氧压等等。
调节白色念珠菌的形态转换的细胞内分子机制主要有MAPK途径(mitoge-actlvaied protein kinase pathway)和cAMP/PKA途径(cAMP-dependentprotein kinase A pathway)。同时还发现Cph2介导的，Efg1介导的以及pH应答的信号途径也都和白色念珠菌的形态发生相关(Stoldt，V.R.，et al.EMBOJ.161982-1991；El Barkani A et al.Mol.Cell.Biol.204635-4647.)。在白色念珠菌中还存在抑制效应的信号途径，主要是Tup1介导的信号途径，依靠抑制因子Rfg1，Nrg1等来发挥作用(Kadosh D et al.Mol.Cell.Biol.212496-2505Braun BR et al EMBO J.204753-4761.)。
酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)SWI1基囚(ScSWI1)最先根据其和单倍体细胞HO基因和乙醇脱氢酶2基因(ADHII)的正确表达相关而克隆得到的(Michael Stern et al.J.Mol.Biol.1984，178853-868；Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530.)。ScSwi1p具有BRIGHT/ARID(AT-richinteractive domain)结构域，是一个核定位蛋白(Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530.)。ScSWI1基因的敲除，在单倍体细胞中可阻断a型和α型生殖型之间的转换，在双倍体细胞间引起减数分裂缺陷，导致生长缺陷，对非发酵糖类(如半乳糖，蔗糖，棉于糖，甘油等)利用的缺陷以及a，α型细胞特异性基因(如STE6，MCM1，MATα1等)以及其他和代谢相关基因(如SUC2，INO1，ADHI，PHO85等)表达的下调(Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530；Craig L.Peterson et al.Cell.1992，68573-583；Priya Sudarsanam etal.PANS.2000，97(7)3364-3369.)。遗传和生化证据表明在酵母细胞中，ScSwi1p是由11个成分组成的SWI/SNF复合物的一个组分，在ATP存在的条件下，此复合物可以和RNA聚合酶II全酶(RNA polymerase holoenzyme)，转录激活因子(transcriptional activator)，染色质上的组蛋白，非组蛋白成分以及其它抑制因子相互作用，改变染色质的结构，去除抑制因素，把RNA聚合酶II全酶募集到所调控基因的启动子上，从而激活转录(Loree GriffinBurns et al.Mol.Cell.Biol.1997，17(8)4811-4819；Kruger et al.Genes.Dev.1995，92770-2779；Igor M et al.EMBO.J.1997，16(20)6263-6271；Christopher J et al.Cell.1996，84235-244；Kristen E.Neely et al.Mol.Cell.Biol.2002，22(6)1615-1625；Natalya Yudkovsky et al.GenesDev.1999，132369-2374.)，也有可能使染色质结构更加紧密而抑制转录(Joseph A et al.Genes Dev，2002，162231-2236.)。
综上所述，鉴于白色念珠菌引起的疾病越来越多，因此本领域迫切需要开发与白色念珠菌致病性有关的基因和蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种参与白色念珠菌致病作用的新的白色念珠菌转录激活因子基因及其编码蛋白。
本发明的另一目的是提供该多肽及其编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的白色念珠菌CaSWI1多肽，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个(1-15个，较佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有转录激活功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列具有SEQ ID NO1中554-3514位。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明上述的多核苷酸的多核苷酸，以及一种宿主细胞，它含有上述的载体。
在本发明第四方面，提供了一种能与本发明所述的白色念珠菌CaSWI1蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第三方面，提供了含有本发明所述的多核苷酸的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种能与本发明所述的白色念珠菌CaSwi1蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第五方面，提供了制备CaSwi1蛋白的方法，该方法包含(a)在表达条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出CaSwi1蛋白。
在本发明的第六方面，提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-3802个核苷酸。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CaSwi1蛋白的方法，它包括将样品与CaSwi1蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaSwi1蛋白。
在本发明的第八方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进CaSwi1多肽活性的激动剂，或者筛选抑制CaSwi1多肽活性的拮抗剂。本发明的CaSwi1蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
图1显示了白色念珠菌CaSWI1基因全长核苷酸序列。
图2显示了白色念珠菌CaSWI1基因开放阅读框的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。
图3A显示了白色念珠菌CaSwi1蛋白和酿酒酵母ScSwi1蛋白的氨基酸序列比较。黑色部分表示相同氨基酸。
图3B显示了CaSWI1能部分互补scswi1突变株在甘油培养基上的生长缺陷。左边是YPD培养基，无明显的生长缺陷互补现象，右边是以甘油为唯一碳源的SD培养基，CaSWI1能部分互补scswi1生长缺陷现象。
图4A显示了白色念珠菌野生菌和CaSWI1高表达菌株的菌落形态。培养条件为SD培养基，37℃，7天。CaSWI1高表达菌株形成表面皱褶的菌落。
图4B显示了从图4A中刮取的白色念珠菌野生菌和CaSWI1高表达菌株的细胞形态，菌株有明显伸长的细胞和假菌丝。
图4C显示了Northern杂交分析，检测白色念珠菌野生菌和CaSWI1高表达菌株中CaSWI1基因的表达情况。
图5显示了CaSWI1基因的敲除导致白色念珠菌生长缓慢。培养条件为YPD固体培养基，37℃，3天。
图6显示了白色念珠菌CaSWI1基因的敲除导致白色念珠菌菌丝生长缺陷。A.固体血清培养基和Lee’s培养基，37℃培养。B.液体YPD加10％血清和Lee’s培养基，37℃培养。
图7显示了Northern杂交分析，检测CaSWI1基因对菌丝生长基因转录的调控。caswi1缺失株阻断菌丝特异性基因HWP1和ECE1的表达。
图8显示了小鼠系统感染试验，CaSWI1基因的敲除导致白色念珠菌毒性下降。High为1×107/ml高浓度菌液；Low为1×106/ml低浓度菌液，每只小鼠尾静脉注射100μl菌液。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，从白色念珠菌(Candida albicans)基因组文库中筛选得到一个3.8kb的新的转录激活因子基因CaSWI1(SEQ ID NO1)，其开放阅读框含2964个核苷酸，编码一个987个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO2)。
试验表明，(1)CaSwi1可部分互补酿酒酵母scswi1突变株在甘油培养基上的生长缺陷表型。在白色念珠菌中，CaSwi1呈组成型表达，CaSWI1基因的敲除导致白色念珠菌生长形态发生变化，包括菌丝生长缺陷，生长速度下降。(2)在分子水平上CaSWI1基因能调控一些菌丝特异性基因如HWP1、ECE1的表达，在白色念珠菌中高表达CaSWI1基因能在一定程度上激活菌丝生长。(3)CaSWI1基因的缺失确实阻断了白色念珠菌菌丝的形成。CaSWI1基因的缺失确实影响了菌丝生长相关基因的表达。(4)CaSWI1基因的敲除导致白色念珠菌菌丝生长缺陷，使得白色念珠菌即使在强烈的菌丝诱导条件下也无法形成菌丝。(5)通过小鼠系统感染试验发现CaSWI1基因敲除株没有毒性。因此，转录激活因子CaSwi1蛋白是白色念珠菌中重要的菌丝生长激活因子和毒性因子，参与白色念珠菌的致病过程。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“CaSwi1蛋白”、“CaSwi1多肽”或“白色念珠菌CaSwi1多肽”可互换使用，都指具有白色念珠菌CaSwi1氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽，以及将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有转录激活功能的由(a)衍生的多肽。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的白色念珠菌CaSwi1蛋白或多肽”是指白色念珠菌CaSwi1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化白色念珠菌CaSwi1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
在本发明中，术语“白色念珠菌CaSwi1多肽”指具有白色念珠菌CaSwi1蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与白色念珠菌CaSwi1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括白色念珠菌CaSwi1蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本发明中，“白色念珠菌CaSwi1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码白色念珠菌CaSwi1蛋白的多聚核苷酸。
本发明的白色念珠菌CaSwi1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的DNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或白色念珠菌CaSwi1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CaSwi1多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码白色念珠菌CaSwi1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，白色念珠菌CaSwi1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含白色念珠菌CaSwi1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的白色念珠菌CaSwi1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于筛选促进或对抗白色念珠菌CaSwi1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组白色念珠菌CaSwi1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激白色念珠菌CaSwi1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对白色念珠菌CaSwi1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于白色念珠菌CaSwi1基因产物或片段。较佳地，指那些能与白色念珠菌CaSwi1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的白色念珠菌CaSwi1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达白色念珠菌CaSwi1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
抗白色念珠菌CaSwi1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的白色念珠菌CaSwi1蛋白。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与白色念珠菌CaSwi1蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明还涉及定量和定位检测白色念珠菌CaSwi1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。
一种检测检测样品中是否存在白色念珠菌CaSwi1蛋白的方法是利用白色念珠菌CaSwi1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与白色念珠菌CaSwi1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在白色念珠菌CaSwi1蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
通用方法Southern分析白色念珠菌基因组DNA抽提方法和Southern杂交分析方法按照文献操作(Chen et al.J.Bacteriol.1745624-56312.)。基因组DNA用PvuII(购自GIBCO公司)完全酶切，电泳完成后的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡45min，尼龙膜用双蒸水或10xSSC浸透，搭好转膜平台，胶与膜间用Parafilm封闭，加一个500g砝码。，以10xSSC为转膜液转移过夜，第二天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管，加入10ml预杂交液(6xSSC，5xdenhardt’s Reagent，0.5％SDS，100μg/ml鱼精DNA于42℃预杂交12h，探针在100℃变性5min，加入150μl(约1/3所标记的探针)42℃杂交10-16h。0.1xSSC，0.1％SDS洗两到三次，每次40min，取出膜，晾干，室温或-70℃压片。探针标记用invitrogene的随机引物标记试剂盒并按照其说明进行操作。将含25ng DNA的溶液于100℃加热变性5-10min，置于冰浴中，再依次加入Random Primers Buffer Mixture，2μl dCTP，2μl dGTP，2μl dTTP，3μl[α-32P]-dATP(10μCi/μl)，混匀后加入1μl Klenow酶，于25℃保温1h，以Sephadex G-25柱以3000rpm离心4min，收集离心液，即为纯化后的探针溶液。探针于100℃变性5min冰上冷却后加入杂交体系中。
Northern分析用热酚法抽提白色念珠菌总RNA，以及Northern杂交分析方法参照文献(Greenberg，M.E.1987，Current protocols in molecular biology，vol.1.Wiley Interscience，New York，N.Y.)。具体而言方法如下各菌株在YPD，30℃中培养至对数生长期后期，转接至YPD+10％血清，或者Lee’s培养基叫1，起始OD＝0.05，并在相应温度下培养指定时间，用热酚法抽提白色念珠菌总RNA。20μl上样量包括RNA样品12μl(25μg)，4μl甲醛，2μl 10xMOPS，2μl上样缓冲液、65℃加热10min，0℃冷却2min，离心5s，上样。电泳在含甲醛的变性胶上进行(1g agarose，10ml 10xMOPS，87ml DEPC处理水，加热融化稍冷后加入2.7ml 37％甲醛)。电泳条件为100mA，50-70V，5-7h电泳完成后同样用毛细法转膜，转膜液用5xSSC。转膜过夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-Ra GS Gene Linker C3protocol紫外交联，加入10ml预杂交液，65℃，2h后更换为10ml杂交液，加入探针65℃杂交过夜，用2xSSC，0.1％SDS，65℃洗膜两次，每次30min。杂交好的膜不要晾干，用保鲜膜包好后-70℃压片。重杂交洗膜用0.5％SDS，90-100℃加热5-10min，或按照Clontech推荐用0.5％SDS，90-100℃加热10min后让其自然冷却10min后取出备用，若不立即位用，用保鲜膜包好后置于-20℃保存。
白色念珠菌和酿酒酵母的转化准备PEG/LiAc溶液(pH 7.5)10ml；在1.5mI Eppendof管中依次加入质粒(如果转酿酒酵母，质粒0.μg，如果转白色念珠菌，线形化质粒大约5μg)，10μl10mg/ml鱼精DNA，混匀；加入0.1ml感受态细胞和0.6ml PEG/LiAc，votex混匀；30℃200rpm培养30min；加入70μl DMSO，轻轻混匀；42℃热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴～2min高速离心15s，吸掉上清，用0.2ml TE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。
小鼠系统感染试验以体重在16-18g ICR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射100μl白色念珠菌各菌株，并培养观测25天。各个菌株各注射高低两个浓度，高浓度菌液为5×107细胞/ml，低浓度菌液为5×106细胞/ml。
实施例1CaSWI1基因的克隆将用常规方法构建的白色念珠菌的染色体基因库转入酿酒酵母单倍体flo8缺失株(可购自Yeast Genetics Stock Culture Center of the American Type CultureCollection)，在SD-ura平板上生长，得到三万个菌落，用水冲洗后，平板上共剩下40个菌落。这些菌落互补了flo8缺失所引起的侵入生长缺陷，能够进行侵入生长。
按以下方法抽提酵母菌质粒接种单菌落于5ml SD ura-液体培养基中，30℃振荡培养20h，室温5000r/min离心3min，弃上清，加入200μl酵母裂解液(2％Triton X-100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)，振荡重悬酵母菌，加入0.3mg酸洗玻璃珠(425～600μm)，200μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分振荡5min，液氮冻10min，室温融化，再充分振荡5min，室温12000r/min离心10min，将上清液转移至新的1.5ml离心管，加入20μl 3mol/L NaAc，500μl无水乙醇，-70℃冻存1h，4℃12500r/min离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，抽干，加入20μl TE(pH8.0)溶解。
将从这些菌落中抽提出的质粒，转入大肠杆菌，从大肠杆菌中抽提的质粒分别导入单倍体和双倍体flo8缺失株，观察菌落的侵入生长和丝状生长表型，发现37号质粒对酿酒酵母flo8缺失株的的假菌丝生长和侵入生长有很强的促进作用。将37号质粒测序，并通过NCBI进行比较分析，得到CaSWI1基因，包括开放阅读框的5’和3’端非编码区，全长共有3802个核苷酸(图1和SEQ ID NO1)，其ORF位于第554-3314位，编码全长987aa的蛋白(图2和SEQ ID NO2)。
利用BLAST同源搜索，发现这个基因的编码产物与酿酒酵母(Sacchromycescerevisiae)的SWI1基因编码产物有最高的同源性(23％identity)，因此把这个基因命名为CaSWI1，CaSWI1基因编码的蛋白称为CaSwi1。
实施例2白色念珠菌CaSWI1基因能部分互补ScSWI1功能缺陷CaSWI1基因在酿酒酵母中的表达能够校正ste7/ste7，ste12/ste12，tec1/tec1，flo8/flo8和phd1/ste12缺失株菌丝生长的缺陷，说明CaSWI1在酿酒酵母中具有激活菌丝形成的能力。
通过结构域分析，发现CaSwi1和ScSwi1都有一个明显的BRIGHT/ARID结构域，这个结构域具有非特异性的DNA结合性质，具有这个结构域的蛋白质可以结合于含AT较多的DNA区域(Deborah Wilsker et al.Cell.Growth.Differentiation.2002，1395-106.)，这个结构域在结构和功能上具有多样性。在两者BRIGHT/ARID结构域N端都有富含谷氨酰胺的区域，这个区域推测可以与一些转录因子相结合。在ScSwi1的C端还有一个锌指结构，在CaSwi1中没有(图3A)。根据这个锌指结构证明ScSwi1是一个核定位蛋白(Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530.)。
ScSWI1基因的缺失株scswi1表现出对非发酵糖利用的缺陷(Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530；Craig L.Peterson et al.Cell.1992，68573-583.)，而重新导入ScSWI1可以抑制这种缺陷。白色念珠菌CaSwi1和酿酒酵母ScSwi1在序列和结构域上具有相似性，但是在非发酵糖的利用上，只有在甘油培养基中CaSWI1能部分互补scswi1缺失株的生长缺陷。在以可发酵糖葡萄糖为碳源的培养基上，scswi1缺失株和野生菌株生长速度差别不大，但是在以半乳糖，蔗糖，棉子糖等非发酵糖为碳源的培养基上，scswi1缺失株生长速度明显下降，导入并过表达CaSWI1不能提高缺失株的生长速度，其生长速度基本上与scswi1缺失株差不多。而在以甘油为唯一碳源的SD培养基上，scswi1缺失株导入CaSWI1后能提高其生长速度并在甘油培养基中生长，说明在以甘油为碳源的利用上，CaSWI1能部分互补ScSWI1功能的缺陷(图3B)，而在以其他非发酵糖为碳源的培养基上CaSWI1不能互补scswi1缺失株生长的缺陷，因此CaSwi1和ScSwi1在序列上有一定的相似性，在功能上也有部分的互补性。
实施例3CaSWI1的高表达促进白色念珠菌菌丝生长1.CaSWI1高表达质粒的构建CaSWI1编码框用pfu DNA聚合酶(购自鼎国公司)从野生型菌株PCR扩增得到，用KpnI(购自GIBCO公司)37℃酶切1小时。白色念珠菌高表达载体BA1(Feng，Q.et al.J.Bacteriol.1816339-6346)用KpnI酶切并用碱性磷酸酯酶(CIP，购自BioLab公司)37℃处理后1小时，和PCR酶切片断用T4 DNA连接酶(购自GIBCO公司)16℃连接1小时，转化大肠杆菌，挑取单克隆，抽取质粒用KpnI和EcoRV(均购自GIBCO公司)酶切鉴定得到CaSWI1高表达质粒。扩增CaSWI1编码框所用的引物为引物1GCT GGT ACC ATG TCT GAT TGG TTG AAT GAA AAT GC(SEQID NO3)和引物2GTC GGT ACC CTA GAT CCC CTC ACA AGC CTT TAA(SEQ ID NO4)。
表达的CaSwi1蛋白的分子量约为110KD，与预测值相符。
2.CaSWI1的高表达促进白色念珠菌菌丝生长CaSWI1在酿酒酵母缺失株中的高表达可以激活缺失株的菌丝形成，为了研究CaSWI1在白色念珠菌中的高表达能否激活菌丝生长，利用在ADHI启动子操纵下的ADE2位点整合型载体把CaSWI1导入白色念珠菌中，发现CaSWI1的高表达，在一定程度上能促进白色念珠菌菌丝的形成。野生型菌株在SD培养基，37℃培养7天后，形成表面光滑，边缘规则的菌落，而CaSWI1的高表达菌株表面开始形成皱褶，边缘不规则，而且形成少量的菌丝侵入培养基中(图4A)，刮取少量菌在显微镜下观察，发现CaSWI1的高表达菌株比野生型菌株形成更多的假菌丝(图4B)。Northern实验证实CaSWI1在该菌株中确实高表达了(图4C)。
这些结果表明CaSWI1在白色念珠菌体内的高表达有一定的菌丝激活作用。
实施例4白色念珠菌CaSWI1基因的敲除为了研究白色念珠菌CaSWI1基因的功能，在本实施例中，在白色念珠菌中敲除了这个基因。体外构建了CaSWI1基因敲除质粒，把CaSWI1开放阅读框(openreading frame，ORF)中1.8kb BclI片断用HisG-URA3-HisG替代，通过同源重组的方法，可以把染色体上的CaSWI1基因中BclI片段用HisG-URA3-HisG替换，从而破坏染色体上的CaSWII基因。筛选标志URA3和一份HisG序列可以在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上通过两个同向HisG同源序列在同一条染色体上的重组而环出，丢失了URA3筛选标志的重组子可以在5-FOA平板上通过正向筛选得到(Boeke et al.Mol.Gen.Genet.197345-346)，从而可以进行下一轮的转化进而破坏另一条染色体上的CaSWI1基因，重组子基因型用Southern杂交检测鉴定。
结果1、白色念珠菌CaSWI1缺失株的表型CaSWI1基因的敲除，引起了白色念珠菌一系列细胞形态和菌落形态的变化。CaSWI1基因的敲除导致白色念珠菌生长缺陷，而CaSWI1的重新导入则可以回复生长速度(图5)。在以蔗糖，半乳糖和棉子糖非发酵糖为碳源的培养基与在以葡萄糖为碳源的培养基上的生长速度没有明显差别，但是在以甘油为碳源的培养基上，缺失株生长速度比以葡萄糖为碳源的培养基上略有下降，说明CaSWI1确实在利用甘油的代谢途径上有作用。CaSWI1基因的敲除导致白色念珠菌细胞形态的变化。caswi1缺失株在YPD或者SD培养基中，30℃培养条件下，几个到几十个细胞会形成有分枝的链状细胞，在这些细胞团中，往往中间最初的母细胞会形成较大的球形细胞，而链中间的子细胞往往会伸长，某些子细胞会在不同部位长出几个子细胞，末端的子细胞大部分都是球形的，一部分也有略微伸长的，这种细胞形态和白色念珠菌中的假菌丝很相似。而野生型菌株在同样培养条件下，呈现典型的分散的球形细胞生长。缺失株中这种链状生长的细胞形态在其它白色念珠菌和酿酒酵母的缺失株中都有发现(Mark D.McNemaret al.J.Bacteriology.Apr.2002，p2058-206；Eric S.Bensen et al.Eukaryotic Cell，Oct.2002，p787-798.)，提示可能G2/M期的转换或者有丝分裂后septin ring的正常形成或者septum的分裂分离发生问题，暗示CaSwi1可能在这些过程中有作用。在YPD或者SD培养基上，caswi1缺失株的菌落形态也发生变化。由原来的具有光滑的表面，规则的边缘转变为皱褶的表面和不规则的边缘，而且菌落和培养基间以及菌和菌之间的粘附明显下降。而在酿酒酵母ScSWI1的缺失并没有引起细胞和菌落形态的变化，也说明了CaSWI1和ScSWI1在体内可能发挥不同的作用。在白色念珠菌CBK1，FKH2缺失株和酿酒酵母FKH1，FKH2双缺失株中也可形成类似的细胞和菌落形态(Mark D.McNemar etal.J.Bacteriology.Apr.2002，p2058-206；Peter C.Hollenhorst etal.Genetics.2000.1541533-1548；Eric S.Bensen et al.EukaryoticCell，Oct.2002，p787-798.)。
2、CaSWI1基因的敲除对白色念珠菌菌丝形成的影响白色念珠菌菌丝形成能力对其侵入和感染是必需的。CaSWI1基因的敲除大大降低了白色念珠菌菌丝形成能力。在含血清的固体Agar板上，经过37℃5天培养，野生型菌株和回复菌株都强烈地形成菌丝，而缺失株形成较小的圆形菌落，菌丝形成严重受阻(图6A)。这种菌丝生长阻断现象在固体Lee’s平板上更加明显。经过7天37℃培养，野生型菌株和回复菌株都强烈地形成菌丝，而caswil缺失株菌丝形成能力完全被阻断，虽然缺失株在Lee’s固体板上长成边缘不规则的菌落，但是边缘却是光滑的，并没有看到菌丝的形成(图6A)。在液体培养基中(图6B)，YPD加10％小牛血清，经过37℃，3小时培养后，可以看到野生型菌株和回复菌株都形成典型的菌丝(hyphae)，延长的管状细胞和平行生长的细胞壁，细胞之间没有明显的缢缩，而caswi1缺失株则不能形成这种典型的菌丝，细胞之间仍然是链状相连。在Lee’s液体培养基中，细胞形态和在YPD加10％血清培养中基本一致，说明CaSWI1基因的缺失确实阻断了白色念珠菌菌丝的形成。
3、CaSWI1基因的缺失引起白色念珠菌菌丝特异基因表达的变化白色念珠菌CaSWI1基因的缺失引起了一系列细胞和菌落形态的变化，在基因水平上检测了CaSWI1基因缺失引起的表型变化是通过哪些基因表达的改变来实现的。HWP1，ECE1(Staab et al.J.Biol.Chem.2716298-6305；Birse et al.Infect.Immun.613648-3655.)是白色念珠菌菌丝生长特异性基因，在菌丝生长条件下，这些基因均呈现高表达，而在酵母生长条件下，这些基因不表达。通过Northern杂交分析可以看到，在菌丝诱导条件下，CaSWI1基因的缺失并没有诱导HWP1和ECE1的表达，而其它可被诱导成菌丝生长的菌株均有HWP1和ECE1的高表达(图7)，说明CaSWI1基因的缺失确实影响了菌丝生长相关基因的表达。
4、CaSWI1基因的缺失对白色念珠菌毒性的影响CaSWI1基因的敲除导致白色念珠菌菌丝生长缺陷，使得白色念珠菌即使在强烈的菌丝诱导条件下也无法形成菌丝，通过小鼠尾静脉注射白色念珠菌菌株进行系统感染实验来检测CaSWI1基因的敲除是否导致了菌株毒性下降。结果表明野生型菌株有毒性，而caswi1缺失株不管在高浓度(5×107细胞/ml)还是在低浓度(5×106细胞/ml)下均没有毒性(图8)，说明转录激活因子CaSwi1是白色念珠菌中重要的毒性因子，参与白色念珠菌的致病过程。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>白色念珠菌转录激活因子基因及其用途<130>034049<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3802<212>DNA<213>白色念珠菌(Candida albicans)<220>
<221>CDS<222>(554)..(3514)<223>
<400>1gatcagagtg gtcggagatg ctcttggata tatggtggga ccctgctatg tacgaacaaa 60tgcacatgca atgggaacac aaagaacagg acgctctaga aaccttgtat tcaacacaag 120cttggataag agagagaatt gcgtttttac ctttacgcca aatcaatgcg ttcccaccag 180gcgcttgttc agaccaagct gacgatccac agtatttttt ccaaaaccat gactttgtag 240tgaatatggc agggtgtgaa tggggtagag attgctgggg tgaaatggaa cattataagg 300cgttgtcgaa aaagcttcat aagagatggt ggaagttttg ggagtagtag aattgtactt 360tgtagtgtgt ttttttttaa tttacatagt tactttaaca gccgttagga aacagcgaca 420aagaagagaa aaaaaaaact tcgagttcaa gagagagaga aaaaaaaaat caaaacaaca 480aaaaactgag gaaacggaaa agttctattc aaaggtcaac cataaatcta ggtttagcga 540aatataataa atc atg tct gat tgg ttg aat gaa aat gca ttt gca gat 589Met Ser Asp Trp Leu Asn Glu Asn Ala Phe Ala Asp1 5 10agc aac agc aat gac gat ttt ttg aat tcc att ttt gat cag agc caa637Ser Asn Ser Asn Asp Asp Phe Leu Asn Ser Ile Phe Asp Gln Ser Gln15 20 25gga gag caa caa gct cca cag gtt gcg cag gtt tct aca tca atg tca685Gly Glu Gln Gln Ala Pro Gln Val Ala Gln Val Ser Thr Ser Met Ser30 35 40aac cca cca ctt caa tca caa tca gcc ctg tct act tca aga atc tca733Asn Pro Pro Leu Gln Ser Gln Ser Ala Leu Ser Thr Ser Arg Ile Ser45 50 55 60caa gca cac act cca atg tac caa cag tct cct gtt act gct cac act781Gln Ala His Thr Pro Met Tyr Gln Gln Ser Pro Val Thr Ala His Thr65 70 75ata ccg caa aac agt cct caa agt atg ccg aat caa gta gca cag cct829Ile Pro Gln Asn Ser Pro Gln Ser Met Pro Asn Gln Val Ala Gln Pro80 85 90caa caa caa ata cca cca ccc cct ctg caa cac tta caa cag aca acc877Gln Gln Gln Ile Pro Pro Pro Pro Leu Gln His Leu Gln Gln Thr Thr95 100 105gcc caa atg ctt cct caa cag caa cag caa cag caa cag caa caa cag925Ala Gln Met Leu Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln110 115 120cag caa caa aaa caa gag cag cta tac aga atg aag caa cag att tac973Gln Gln Gln Lys Gln Glu Gln Leu Tyr Arg Met Lys Gln Gln Ile Tyr
125 130 135 140caa cag cag atg cta aaa aag cag caa gaa aac atg tct cgt cag cct1021Gln Gln Gln Met Leu Lys Lys Gln Gln Glu Asn Met Ser Arg Gln Pro145 150 155tct ccc atg aat tca gct ggg cat aac aca caa caa aat acg cca atc1069Ser Pro Met Asn Ser Ala Gly His Asn Thr Gln Gln Asn Thr Pro Ile160 165 170acc cag aat gca aaa aca cct caa aat aat tca aaa ttg caa tca atg1117Thr Gln Asn Ala Lys Thr Pro Gln Asn Asn Ser Lys Leu Gln Ser Met175 180 185caa atg gaa ttg ttt ttt tct gtt ttg tat gac ttt ttg cag cgg agc1165Gln Met Glu Leu Phe Phe Ser Val Leu Tyr Asp Phe Leu Gln Arg Ser190 195 200ggg atc tcc att ccc caa tca tta gct atc aat ggt aag aga gtc aat1213Gly Ile Ser Ile Pro Gln Ser Leu Ala Ile Asn Gly Lys Arg Val Asn205 210 215 220ttg ttc att ttg tat atc ttg agt caa aga ttg ggt gga tac agg gtc1261Leu Phe Ile Leu Tyr Ile Leu Ser Gln Arg Leu Gly Gly Tyr Arg Val225 230 235atg aag gct ttt cta ctt atg tca cca gag cag cag cgt atg cag caa1309Met Lys Ala Phe Leu Leu Met Ser Pro Glu Gln Gln Arg Met Gln Gln240 245 250cag aat cct tgg gca cta atg gcc gac aaa atg ggg ttt cat gat aaa1357Gln Asn Pro Trp Ala Leu Met Ala Asp Lys Met Gly Phe His Asp Lys255 260 265ggg gag gac ccc atg gcc aaa gaa aga att gct aga gaa ctt tgc aat1405Gly Glu Asp Pro Met Ala Lys Glu Arg Ile Ala Arg Glu Leu Cys Asn270 275 280tgc tat agt aac ttt att tta cca tat gaa gag tat tat gcc aca cct1453Cys Tyr Ser Asn Phe Ile Leu Pro Tyr Glu Glu Tyr Tyr Ala Thr Pro285 290 295 300gaa ggg aat aag gat att gaa gct agc aaa cat aga ttc caa cag caa1501Glu Gly Asn Lys Asp Ile Glu Ala Ser Lys His Arg Phe Gln Gln Gln305 310 315att gtt cag aaa tat ctg tcc aat gtc ccc aca ccg gct cct aat caa1549Ile Val Gln Lys Tyr Leu Ser Asn Val Pro Thr Pro Ala Pro Asn Gln320 325 330caa agt cca atg ata agt agc gct cca aca cca cac caa caa agg aag1597Gln Ser Pro Met Ile Ser Ser Ala Pro Thr Pro His Gln Gln Arg Lys335 340 345tta tct cgt act agc aac tcg gtg aat aac tca cca aat gtc agc tct1645Leu Ser Arg Thr Ser Asn Ser Val Asn Asn Ser Pro Asn Val Ser Ser350 355 360cct ttc cat aac acc cct cga caa gtt cca gca cca gca ccg gca ccg1693Pro Phe His Asn Thr Pro Arg Gln Val Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro365 370 375 380gta caa acg gcc gcg tct atg cct ccg cca aca cct gtt aca gcc aaa1741Val Gln Thr Ala Ala Ser Met Pro Pro Pro Thr Pro Val Thr Ala Lys385 390 395tct caa aca aca aaa gca gat gcc cat att ttg aaa aat tat act cct1789Ser Gln Thr Thr Lys Ala Asp Ala His Ile Leu Lys Asn Tyr Thr Pro400 405 410ttc aaa aag att gta gaa acg cat ggt cca ttc aat atc aaa gag ctc1837Phe Lys Lys Ile Val Glu Thr His Gly Pro Phe Asn Ile Lys Glu Leu415 420 425tcg caa ttg tct act gaa atc gag gtg aca aaa cca gtt tat ctt ttt1885Ser Gln Leu Ser Thr Glu Ile Glu Val Thr Lys Pro Val Tyr Leu Phe430 435 440
gct cca gaa tta gga atc atc aac ctc cag gct ttg aca atg tca gta1933Ala Pro Glu Leu Gly Ile Ile Asn Leu Gln Ala Leu Thr Met Ser Val445 450 455 460aaa agc aat agt ggg atc caa agc tca gaa gtt gtg aac gcc ctt aac1981Lys Ser Asn Ser Gly Ile Gln Ser Ser Glu Val Val Asn Ala Leu Asn465 470 475aca ttg ttg gtt gct aca tca gac gtt aat tat gct ttt caa ata aag2029Thr Leu Leu Val Ala Thr Ser Asp Val Asn Tyr Ala Phe Gln Ile Lys480 485 490gat atc atg gag tta tta gac gca tta tct tct ttg ggg aag gat gtt2077Asp Ile Met Glu Leu Leu Asp Ala Leu Ser Ser Leu Gly Lys Asp Val495 500 505ttg aac aaa att gta gga gtc aac aca gaa gag gat tgc gtg aat gct2125Leu Asn Lys Ile Val Gly Val Asn Thr Glu Glu Asp Cys Val Asn Ala510 515 520gat gtg aca aaa ttg tct gcc aat ggt cgg att gat gat att ttt aat2173Asp Val Thr Lys Leu Ser Ala Asn Gly Arg Ile Asp Asp Ile Phe Asn525 530 535 540cgt tat gtt aaa gga caa ggc gaa gat ata ctg tat gtg gtt aat tcg2221Arg Tyr Val Lys Gly Gln Gly Glu Asp Ile Leu Tyr Val Val Asn Ser545 550 555ctt aca ggg gaa gtt gtt tct gac gat gag gat atc gag gaa ctt ttt2269Leu Thr Gly Glu Val Val Ser Asp Asp Glu Asp Ile Glu Glu Leu Phe560 565 570tca gta tgt gat gac ggg aat ctg gaa tct cct att gac aag ctg act2317Ser Val Cys Asp Asp Gly Asn Leu Glu Ser Pro Ile Asp Lys Leu Thr575 580 585gat ctg tta gat gtg ctt gag ttt cat ttg gat gat tat ctt aca gca2365Asp Leu Leu Asp Val Leu Glu Phe His Leu Asp Asp Tyr Leu Thr Ala590 595 600ttg aag aat ttc aaa tct gaa aac aaa cac cat ttt agc aaa ctt caa2413Leu Lys Asn Phe Lys Ser Glu Asn Lys His His Phe Ser Lys Leu Gln605 610 615 620aca cga agt gcc acg gat gat caa ata ttg tta gtc gat gaa ttg ata2461Thr Arg Ser Ala Thr Asp Asp Gln Ile Leu Leu Val Asp Glu Leu Ile625 630 635act ata aca atg atc ttg aga aat att tct ttt gct gaa tat aat aaa2509Thr Ile Thr Met Ile Leu Arg Asn Ile Ser Phe Ala Glu Tyr Asn Lys640 645 650gaa cct atg gca gga aat cgt ctt ttc aag gat tta ttg ttt tca act2557Glu Pro Met Ala Gly Asn Arg Leu Phe Lys Asp Leu Leu Phe Ser Thr655 660 665gtc aaa agc gtt gct tta aac aat gac aaa ttt gtg ttt agc cgc aaa2605Val Lys Ser Val Ala Leu Asn Asn Asp Lys Phe Val Phe Ser Arg Lys670 675 680cgg tta tgt tta ctc aag gat tgt ctt tta atg cta gac aat att tct2653Arg Leu Cys Leu Leu Lys Asp Cys Leu Leu Met Leu Asp Asn Ile Ser685 690 695 700ttg ttt act cat ttg cat act tta gag gaa gca ttt tta tca ttt gtt2701Leu Phe Thr His Leu His Thr Leu Glu Glu Ala Phe Leu Ser Phe Val705 710 715tta gta gca tcc ttt gga cct aag att gaa gat caa tac aag atc cca2749Leu Val Ala Ser Phe Gly Pro Lys Ile Glu Asp Gln Tyr Lys Ile Pro720 725 730cga tgc aat att gaa acc cat tcg tat ttt gcc ttt ggt ctt gat gcc2797Arg Cys Asn Ile Glu Thr His Ser Tyr Phe Ala Phe Gly Leu Asp Ala735 740 745ttc acc aag ttg atg gtc aga gag cca tac aat aga tca tta att cag2845
Phe Thr Lys Leu Met Val Arg Glu Pro Tyr Asn Arg Ser Leu Ile Gln750 755 760gca gtt ttg aat gga act ttg aat tcc agt atg aca gga tat tct gtc2893Ala Val Leu Asn Gly Thr Leu Asn Ser Ser Met Thr Gly Tyr Ser Val765 770 775 780agt tta cag gat caa gag tac aca aga aag tta atc aag gct tac aac2941Ser Leu Gln Asp Gln Glu Tyr Thr Arg Lys Leu Ile Lys Ala Tyr Asn785 790 795aaa gat tat aag tca gca tca ctt ttg agt caa gct ttc cag atg tat2989Lys Asp Tyr Lys Ser Ala Ser Leu Leu Ser Gln Ala Phe Gln Met Tyr800 805 810atg agt ata ttg cct ttt gat gcc aac aca ttt gaa ttg tca aaa ttc3037Met Ser Ile Leu Pro Phe Asp Ala Asn Thr Phe Glu Leu Ser Lys Phe815 820 825atc ttc atg agg agt cca aca att tca cag atg tta ttt ggg gcc aaa3085Ile Phe Met Arg Ser Pro Thr Ile Ser Gln Met Leu Phe Gly Ala Lys830 835 840ttg tta ata gac atg gtt cca gtt gat gat ttg aac aca cat cat aac3133Leu Leu Ile Asp Met Val Pro Val Asp Asp Leu Asn Thr His His Asn845 850 855 860aag ttg tct ctt tat tgg cta ttg gaa aac cgg gag tta tta ttg ggt3181Lys Leu Ser Leu Tyr Trp Leu Leu Glu Asn Arg Glu Leu Leu Leu Gly865 870 875aat ttt gcc agg ata gtc gtt gct tta tct aca gaa act gga aaa ttc3229Asn Phe Ala Arg Ile Val Val Ala Leu Ser Thr Glu Thr Gly Lys Phe880 885 890cca cgc gaa tcg cct gag cac aag gtt ttg tcg ctg gta tta cgc aag3277Pro Arg Glu Ser Pro Glu His Lys Val Leu Ser Leu Val Leu Arg Lys895 900 905gcc ctc gtt gtt atc aat tca ttg gtc gac aat gca gtt ttg gct aag3325Ala Leu Val Val Ile Asn Ser Leu Val Asp Asn Ala Val Leu Ala Lys910 915 920gaa ata gga gac ctg cga cac acc gac ttg atg gag agt ttg aca gat3373Glu Ile Gly Asp Leu Arg His Thr Asp Leu Met Glu Ser Leu Thr Asp925 930 935 940tgt ttg gct ttc cca aga ata ata ccc gat gcc att ttg aca ttg gac3421Cys Leu Ala Phe Pro Arg Ile Ile Pro Asp Ala Ile Leu Thr Leu Asp945 950 955acg ttt ttg gca cct acc att gat acc aat tta ggt aaa gaa gtt gtc3469Thr Phe Leu Ala Pro Thr Ile Asp Thr Asn Leu Gly Lys Glu Val Val960 965 970aga tta ctt agg tat ttg aag gat tta aag gct tgt gag ggg atc3514Arg Leu Leu Arg Tyr Leu Lys Asp Leu Lys Ala Cys Glu Gly Ile975 980 985tagatgtatc ttcggtttgg tttttttttt tgtgatttgt tcttatctat aattgttgtt 3574gtgtattgtt tttattttgt aaattttaat gtataattaa tcaaagcgca agtgcgcaag 3634aatataattt tgttgcaatc atgtaagcac ctttatctgt agattgcaaa tattacactt 3694tcctaattat taatgccctg atgtgtattc gttatctttt tgcttgattg cttgtgcttg 3754tattccctcc ccctctttat catgtttacc aatctgggta taacgatc 3802<210>2<211>987<212>PRT<213>白色念珠菌(Candida albicans)<400>2Met Ser Asp Trp Leu Asn Glu Asn Ala Phe Ala Asp Ser Asn Ser Asn
1 5 10 15Asp Asp Phe Leu Asn Ser Ile Phe Asp Gln Ser Gln Gly Glu Gln Gln20 25 30Ala Pro Gln Val Ala Gln Val Ser Thr Ser Met Ser Asn Pro Pro Leu35 40 45Gln Ser Gln Ser Ala Leu Ser Thr Ser Arg Ile Ser Gln Ala His Thr50 55 60Pro Met Tyr Gln Gln Ser Pro Val Thr Ala His Thr Ile Pro Gln Asn65 70 75 80Ser Pro Gln Ser Met Pro Asn Gln Val Ala Gln Pro Gln Gln Gln Ile85 90 95Pro Pro Pro Pro Leu Gln His Leu Gln Gln Thr Thr Ala Gln Met Leu100 105 110Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys115 120 125Gln Glu Gln Leu Tyr Arg Met Lys Gln Gln Ile Tyr Gln Gln Gln Met130 135 140Leu Lys Lys Gln Gln Glu Asn Met Ser Arg Gln Pro Ser Pro Met Asn145 150 155 160Ser Ala Gly His Asn Thr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Thr Gln Asn Ala165 170 175Lys Thr Pro Gln Asn Asn Ser Lys Leu Gln Ser Met Gln Met Glu Leu180 185 190Phe Phe Ser Val Leu Tyr Asp Phe Leu Gln Arg Ser Gly Ile Ser Ile195 200 205Pro Gln Ser Leu Ala Ile Asn Gly Lys Arg Val Asn Leu Phe Ile Leu210 215 220Tyr Ile Leu Ser Gln Arg Leu Gly Gly Tyr Arg Val Met Lys Ala Phe225 230 235 240Leu Leu Met Ser Pro Glu Gln Gln Arg Met Gln Gln Gln Asn Pro Trp245 250 255Ala Leu Met Ala Asp Lys Met Gly Phe His Asp Lys Gly Glu Asp Pro260 265 270Met Ala Lys Glu Arg Ile Ala Arg Glu Leu Cys Asn Cys Tyr Ser Asn275 280 285Phe Ile Leu Pro Tyr Glu Glu Tyr Tyr Ala Thr Pro Glu Gly Asn Lys290 295 300Asp Ile Glu Ala Ser Lys His Arg Phe Gln Gln Gln Ile Val Gln Lys305 310 315 320Tyr Leu Ser Asn Val Pro Thr Pro Ala Pro Asn Gln Gln Ser Pro Met325 330 335Ile Ser Ser Ala Pro Thr Pro His Gln Gln Arg Lys Leu Ser Arg Thr340 345 350Ser Asn Ser Val Asn Asn Ser Pro Asn Val Ser Ser Pro Phe His Asn355 360 365Thr Pro Arg Gln Val Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Val Gln Thr Ala370 375 380Ala Ser Met Pro Pro Pro Thr Pro Val Thr Ala Lys Ser Gln Thr Thr385 390 395 400Lys Ala Asp Ala His Ile Leu Lys Asn Tyr Thr Pro Phe Lys Lys Ile405 410 415Val Glu Thr His Gly Pro Phe Asn Ile Lys Glu Leu Ser Gln Leu Ser420 425 430Thr Glu Ile Glu Val Thr Lys Pro Val Tyr Leu Phe Ala Pro Glu Leu435 440 445Gly Ile Ile Asn Leu Gln Ala Leu Thr Met Ser Val Lys Ser Asn Ser450 455 460Gly Ile Gln Ser Ser Glu Val Val Asn Ala Leu Asn Thr Leu Leu Val
465 470 475 480Ala Thr Ser Asp Val Asn Tyr Ala Phe Gln Ile Lys Asp Ile Met Glu485 490 495Leu Leu Asp Ala Leu Ser Ser Leu Gly Lys Asp Val Leu Asn Lys Ile500 505 510Val Gly Val Asn Thr Glu Glu Asp Cys Val Asn Ala Asp Val Thr Lys515 520 525Leu Ser Ala Asn Gly Arg Ile Asp Asp Ile Phe Asn Arg Tyr Val Lys530 535 540Gly Gln Gly Glu Asp Ile Leu Tyr Val Val Asn Ser Leu Thr Gly Glu545 550 555 560Val Val Ser Asp Asp Glu Asp Ile Glu Glu Leu Phe Ser Val Cys Asp565 570 575Asp Gly Asn Leu Glu Ser Pro Ile Asp Lys Leu Thr Asp Leu Leu Asp580 585 590Val Leu Glu Phe His Leu Asp Asp Tyr Leu Thr Ala Leu Lys Asn Phe595 600 605Lys Ser Glu Asn Lys His His Phe Ser Lys Leu Gln Thr Arg Ser Ala610 615 620Thr Asp Asp Gln Ile Leu Leu Val Asp Glu Leu Ile Thr Ile Thr Met625 630 635 640Ile Leu Arg Asn Ile Ser Phe Ala Glu Tyr Asn Lys Glu Pro Met Ala645 650 655Gly Asn Arg Leu Phe Lys Asp Leu Leu Phe Ser Thr Val Lys Ser Val660 665 670Ala Leu Asn Asn Asp Lys Phe Val Phe Ser Arg Lys Arg Leu Cys Leu675 680 685Leu Lys Asp Cys Leu Leu Met Leu Asp Asn Ile Ser Leu Phe Thr His690 695 700Leu His Thr Leu Glu Glu Ala Phe Leu Ser Phe Val Leu Val Ala Ser705 710 715 720Phe Gly Pro Lys Ile Glu Asp Gln Tyr Lys Ile Pro Arg Cys Asn Ile725 730 735Glu Thr His Ser Tyr Phe Ala Phe Gly Leu Asp Ala Phe Thr Lys Leu740 745 750Met Val Arg Glu Pro Tyr Asn Arg Ser Leu Ile Gln Ala Val Leu Asn755 760 765Gly Thr Leu Asn Ser Ser Met Thr Gly Tyr Ser Val Ser Leu Gln Asp770 775 780Gln Glu Tyr Thr Arg Lys Leu Ile Lys Ala Tyr Asn Lys Asp Tyr Lys785 790 795 800Ser Ala Ser Leu Leu Ser Gln Ala Phe Gln Met Tyr Met Ser Ile Leu805 810 815Pro Phe Asp Ala Asn Thr Phe Glu Leu Ser Lys Phe Ile Phe Met Arg820 825 830Ser Pro Thr Ile Ser Gln Met Leu Phe Gly Ala Lys Leu Leu Ile Asp835 840 845Met Val Pro Val Asp Asp Leu Asn Thr His His Asn Lys Leu Ser Leu850 855 860Tyr Trp Leu Leu Glu Asn Arg Glu Leu Leu Leu Gly Asn Phe Ala Arg865 870 875 880Ile Val Val Ala Leu Ser Thr Glu Thr Gly Lys Phe Pro Arg Glu Ser885 890 895Pro Glu His Lys Val Leu Ser Leu Val Leu Arg Lys Ala Leu Val Val900 905 910Ile Asn Ser Leu Val Asp Asn Ala Val Leu Ala Lys Glu Ile Gly Asp915 920 925Leu Arg His Thr Asp Leu Met Glu Ser Leu Thr Asp Cys Leu Ala Phe
930 935 940Pro Arg Ile Ile Pro Asp Ala Ile Leu Thr Leu Asp Thr Phe Leu Ala945 950 955 960Pro Thr Ile Asp Thr Asn Leu Gly Lys Glu Val Val Arg Leu Leu Arg965 970 975Tyr Leu Lys Asp Leu Lys Ala Cys Glu Gly Ile980 985<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(35)<223>引物<400>3gctggtacca tgtctgattg gttgaatgaa aatgc35<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(33)<223>引物<400>4gtcggtaccc tagatcccct cacaagcctt taa 3权利要求
1.一种分离的白色念珠菌CaSWI1多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有转录激活功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列具有SEQID NO1中554-3514位。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种能与权利要求1所述的白色念珠菌CaSWI1蛋白特异性结合的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种参与白色念珠菌致病作用的新的白色念珠菌转录激活因子基因CaSWI1及其编码蛋白CaSwi1。本发明还提供了所述蛋白及其编码序列的用途。该基因编码的产物CaSwi1蛋白是重要的菌丝生长激活因子和毒性因子，参与白色念珠菌的菌丝生长和致病过程。
文档编号C07K16/12GK1583788SQ0315042
公开日2005年2月23日 申请日期2003年8月20日 优先权日2003年8月20日
发明者陈江野, 毛旭明 申请人:中国科学院上海生命科学研究院