专利名称：金丝桃苷和异鼠李素－3－o－半乳糖苷对照品的同时制备方法
技术领域：
本发明涉及一种金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法。
背景技术：
近年来在回归自然潮流的影响下，中药(天然药物)迅速发展。随着对中药(天然药物)药效物质基础研究的不断深入，对中药(天然药物)对照品的需求量也日益增加，如在用高效液相色谱法对一些天然产物作定性定量分析时，常常因一时难以找到适量的对照品而无法深入开展研究。目前对照品的制备方法通常采用制备型高效液相色谱纯化，设备昂贵且成本高昂，仅适于制备少量样品。
吴茱萸(Evodia rutaecarpa[Juss.]Benth)为芸香科植物吴茱萸干燥将近成熟的果实。有“温中散寒、疏肝止痛之功效”，常用于治疗脘腹冷痛、呕吐腹泻、头痛、胃痛、疝痛、腹痛和痛经等。《本草纲目》称吴茱萸“开郁化滞，治吞酸、厥阴、痰涎头痛、阴毒腹痛、疝气血痢和喉舌口疮”。近代医学亦证明吴茱萸有镇痛、安神、抗菌、降压和抗缺氧等药理作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法。
它的步骤如下1)将吴茱萸药材置于容器中，加入溶剂回流提取；2)吴茱萸提取液过滤，减压浓缩，得浸膏；浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取；3)乙酸乙酯萃取部分经两次柱层析纯化；4)柱层析洗脱液合并浓缩，再经重结晶，分别得到金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷两种对照品。
本发明的优点如下1)由于吴茱萸药材提取物中杂质很多，既有高极性组分，又有低极性组分，对提取物直接进行柱层析难于得到纯品，因此本发明先采用两相萃取对吴茱萸提取物进行初步的纯化，用石油醚萃取可除去吴茱萸提取物中的低极性组分，用氯仿萃取可除去吴茱萸提取物中的生物碱类组分，用乙酸乙酯萃取可使吴茱萸提取物中的黄酮类物质富集在乙酸乙酯相；2)分离纯化的另一个难点是将性质相近的金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷分开。本发明采用两次柱层析，第一次柱层析可将绝大部分金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷分离开，第二次柱层析可彻底将金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷分开；3)采用甲醇重结晶可使产品得到进一步的纯化，得到纯度98.0％以上的晶体；4)本发明所得的高纯度金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷在避光，低温(0℃)下可稳定保存至少半年而含量基本没有变化；5)本发明工艺流程短，操作简单，不需昂贵的特殊设备就可同时制得纯度98％以上的金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷纯品，不仅成本低廉而且适于较大规模的制备。
图1是金丝桃苷液相色谱图；图2是异鼠李素-3-O-半乳糖苷液相色谱图。
具体实施例方式
金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法步骤如下(1)将吴茱萸药材置于容器中，加入溶剂(甲醇或乙醇水溶液)回流提取。
(2)吴茱萸提取液过滤，减压浓缩，得浸膏。浸膏加适量的水溶解，依此用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。
(3)乙酸乙酯部分经两次聚酰胺柱层析，第一次柱层析采用水、10～95％乙醇梯度洗脱；第二次采用20～40％乙醇等度洗脱。
(4)柱层析洗脱液合并浓缩，甲醇重结晶，分别得到金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷两种对照品。
用上述制备方法对金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷进行提取、分离、纯化，得到的产品纯度在98.0％以上，符合新药审批办法规定中药对照品的纯度要求，因而可作为金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷的对照品使用。
本发明方法中金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷的鉴别采用薄层色谱法；含量测定采用HPLC法，仪器先进，结果可靠。
下面结合实施例对本发明作详细说明。
实施例1
吴茱萸果实800g，甲醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，20％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷30mg，含量为99.5％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷171mg，含量为98.4％(HPLC)。
实施例2吴茱萸果实800g，甲醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，30％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷31mg，含量为99.4％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷175mg，含量为98.3％(HPLC)。
实施例3吴茱萸果实800g，甲醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，40％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷35mg，含量为98.5％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷179mg含量为98.1％(HPLC)。
实施例4吴茱萸果实800g，50％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，20％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷33mg，含量为99.3％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷178mg，含量为98.3％(HPLC)。
实施例5吴茱萸果实800g，50％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，30％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷36mg，含量为99.1％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷185mg，含量为98.2％(HPLC)。
实施例6吴茱萸果实800g，50％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，40％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷38mg，含量为98.3％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷187mg，含量为98.1％(HPLC)。
实施例7吴茱萸果实800g，水回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，30％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷18mg，含量为98.2％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷132mg，含量为98.1％(HPLC)。
实施例8吴茱萸果实800g，25％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，30％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷32mg，含量为99.0％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷178mg，含量为98.2％(HPLC)。
实施例9吴茱萸果实800g，75％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，30％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷35mg，含量为99.2％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷182mg，含量为98.1％(HPLC)。
实施例10吴茱萸果实800g，无水乙醇回流提取3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏。浸膏加水溶解，分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分经聚酰胺柱层析，水、10％乙醇、30％乙醇、50乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，以聚酰胺薄层色谱法鉴别。合并相同组分，再经聚酰胺柱层析，30％乙醇洗脱，甲醇重结晶得到金丝桃苷28mg，含量为99.3％，异鼠李素-3-O-半乳糖苷164mg，含量为98.3％(HPLC)。
金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷的分子结构 金丝桃苷异鼠李素-3-O-半乳糖苷金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷的理化常数及结构鉴定金丝桃苷mp228～230℃(熔点仪测定法)。ESI-MS(m/z)463(M--H)。
1HNMR(CD3OD)δ7.84(1H，d，J＝1.8Hz，C2′-H)，7.57(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.5Hz，C6 ′-H)，6.85(1H，d，J＝8.5Hz，C5′-H)，6.38(1H，d，J＝1.4Hz，C8-H)，6.18(1H，d，J＝1.4Hz，C6-H)，5.15(1H，d，J＝7.8Hz，C1″-H)，3.46～3.84(6H，m，糖上质子)。13CNMR(CD3OD)δ158.42(C2)，135.77(C3)，179.51(C4)，162.97(C5)，99.92(C6)，166.07(C7)，94.74(C8)，158.81(C9)，105.42(C10)，122.95(C1 ′)，116.09(C2′)，145.79(C3′)，149.94(C4′)，117.79(C5′)，120.04(C6′)，105.61(C1″)，73.17(C2″)，75.08(C3″)，70.01(C4″)，77.16(C5″)，61.94(C6″)。
异鼠李素-3-O-半乳糖苷 mp224～226℃(熔点仪测定法)。ESI-MS(m/z)477(M--H)。1HNMR(CD3OD)δ8.02(1H，d，J＝1.5Hz，C2′-H)，7.55(1H，dd，J＝1.5Hz，J＝8.4Hz，C6′-H)，6.88(1H，d，J＝8.4Hz，C5′-H)，6.32(1H，d，J＝1.4Hz，C8-H)，6.14(1H，d，J＝1.4Hz，C6-H)，5.28(1H，d，J＝7.8Hz，C1″-H)，3.94(3H，S，C3′-OCH3)，3.46～3.83(6H，m，糖上质子)。13CNMR(CD3OD)δ158.24(C2)，135.42(C3)，179.04(C4)，162.68(C5)，99.85(C6)，166.01(C7)，94.67(C8)，158.72(C9)，105.21(C10)，123.60(C1′)，114.53(C2′)，150.99(C3′)，148.48(C4′)，115.99(C5′)，122.98(C6′)，104.69(C1″)，73.19(C2″)，75.06(C3″)，70.00(C4″)，77.21(C5″)，62.16(C6″)，56.95(C3 ′-OCH3)。
金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷的定性鉴别和定量测定定性鉴别采用聚酰胺薄层层析，展开剂为乙醇∶水(3∶2)，金丝桃苷的Rf值为O.47，异鼠李素-3-O-半乳糖苷的Rf值为0.60。
定量测定采用HPLC法。仪器Agilentl100型高效液相色谱仪(配四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、UV检测器)。色谱条件色谱柱为Diamonsil-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-0.5％磷酸溶液(50∶50)；流速1.0mL·min-1；检测波长360nm；柱温30℃。在本色谱条件下，金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷的HPLC色谱图见附图1和附图2。用高效液相色谱面积归一法测定图1和图2所示的金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷的纯度分别为99.4％和98.3％。
权利要求
1.一种金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法，其特征在于它的步骤如下1)将吴茱萸药材置于容器中，加入溶剂回流提取；2)吴茱萸提取液过滤，减压浓缩，得浸膏；浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取；3)乙酸乙酯萃取部分经两次柱层析纯化；4)柱层析洗脱液合并浓缩，再经重结晶，分别得到金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷两种对照品。
2.根据权利要求1所述的一种金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法，其特征在于所说的提取溶剂为甲醇或0～100％乙醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法，其特征在于所说的柱层析填料为聚酰胺树脂。
4.根据权利要求1所述的一种金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法，其特征在于所说的两次柱层析纯化第一次柱层析采用水、10～95％乙醇梯度洗脱；第二次采用20～40％乙醇等度洗脱。
5.根据权利要求1所述的一种金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的同时制备方法，其特征在于所说的重结晶采用的溶剂为甲醇。
全文摘要
本发明公开了一种金丝桃苷和异鼠李素－3－O－半乳糖苷对照品的同时制备方法。它的步骤如下1)将吴茱萸药材置于容器中，加入溶剂回流提取；2)吴茱萸提取液过滤，减压浓缩，得浸膏。浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取；3)乙酸乙酯萃取部分经两次柱层析纯化；4)柱层析洗脱液合并浓缩，再经重结晶，分别得到金丝桃苷和异鼠李素－3－O－半乳糖苷两种对照品。本发明的优点是工艺流程短，操作简单，不需昂贵的特殊设备就可同时制得纯度98％以上的金丝桃苷和异鼠李素－3－O－半乳糖苷纯品，不仅成本低廉而且适于较大规模的制备。
文档编号C07H1/08GK1523032SQ0315084
公开日2004年8月25日 申请日期2003年9月3日 优先权日2003年9月3日
发明者吕秀阳, 潘浪胜, 吴平东 申请人:浙江大学