专利名称：抗人多囊蛋白-1 n端单克隆抗体ma7b1的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药分子生物学、免疫学检测技术领域，是一类抗人PC-1N端单克隆抗体MA7B1，可用于制备研究常染色体显性遗传性多囊肾病发病机制的试剂。
背景技术：
常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是严重危害人类健康的遗传性肾脏病，患者双侧肾脏密布囊肿，常在中年后期发展成为终末期肾衰竭，由于其致病基因在体内广泛表达，还常累及其他有上皮的器官，包括肝脏、胰腺、卵巢和脉络丛等，危害甚大。目前已经明确，多囊蛋白的功能异常及由此导致的一系列生物信号传导的异常是ADPKD发病的关键环节。85～90％ADPKD的发生系由于多囊肾病基因1(PKD1)的编码产物—多囊蛋白-1(PC-1)的结构和功能异常所致，但迄今为止对PC-1的具体功能尚不清楚。PC-1的功能研究正在成为当前国际上研究ADPKD的热点。
肾脏的PC-1表达主要在肾小管上皮细胞，它是一个分子量约460kD的跨膜糖蛋白，由4302个氨基酸组成，包括1个庞大的胞外区，11个跨膜区和1个相对小的胞浆尾。其中胞外区含3074个氨基酸残基，其所拥有的众多复杂的蛋白基序决定了胞外部分对PC-1行使正常生理功能的重要性。因此，人们通常从胞外区着手，运用多种研究方法试图阐明PC-1的复杂功能，包括确定PKD1的mRNA转录水平和PC-1的表达水平，分析PC-1在组织、细胞及亚细胞水平的分布模式等。在这些实验中，多数应用了抗PC-1胞外区的抗体，如英国的Ong等制备了针对PC-1N端的单克隆抗体7e12(Ong A.C.et al.Polycystin-1 expression in PKD1，early-onset PKD1，and TSC2/PKD1 cystic tissue.KidneyInt，1999，56(4)1324-1333)。然而多数抗体在免疫组织化学、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫印记(Western blot)和免疫沉淀(IP)等综合性能指标中，仅能满足其中的一至两项指标的检测，而能够应用于IP的抗体则更少见，且实验稳定性较差。当前迫切需要一个稳定性好、综合性能指标良好的抗PC-1单克隆抗体用于PC-1的功能研究。
发明内容
本发明提供一种稳定性好、能够满足免疫组织化学、ELISA、Western blot、IP等多种免疫学、分子生物学实验需求的抗人PC-1单克隆抗体MA7B1。本发明抗体能特异性结合人PC-1胞外区N端的flank-LRR-flank区和部分WSC区的第46～202位氨基酸残基，经免疫组织化学、免疫细胞化学、ELISA、Western blot和IP等免疫学、分子生物学实验证明，其敏感性高，特异性强。故该抗体可用于研究ADPKD的发病机制。
本发明单克隆抗体MA7B1是用分子生物工程技术制备的，其为PC-1N端第46～202位的氨基酸残基与6个组氨酸组成的融合蛋白经免疫Balb/C小鼠后，再采用杂交瘤技术制备的抗体。其制备方法如下1.制备抗原(1)制备人肾组织总RNA取新鲜健康成人肾组织，用RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取总RNA。
(2)合成引物根据已知的人类PKD1 cDNA序列(GenBankL33243)，设计并合成引物。正向引物 其5’端引入BamHI酶切位点 反向引物 其5’端引入HindIII酶切位点 (3)RT-PCR扩增PKD1e2以人肾组织总RNA为模板，用上述引物通过RT-PCR扩增编码PC-1N端flank-LRR-flank区和部分WSC区的PKD1 cDNA序列PKD1e2，其全长474bp，核苷酸序列见表1。
(4)构建表达载体pQE30-PKD1e2和工程菌M15/pQE30-PKD1e2将融合蛋白表达载体pQE30(德国Qiagen公司产品，其阅读框的5’端含编码连续6个组氨酸的核苷酸序列)和PKD1e2分别用BamHI和HindIII双酶切，将两种酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，然后转化感受态大肠杆菌M15，其转化子重组质粒通过BamHI/HindIII双酶切和DNA序列分析鉴定，重组表达载体为pQE30-PKD1e2，工程菌为M15/pQE30-PKD1e2。
(5)制备融合蛋白PC-1-e2工程菌M15/pQE30-PKD1e2在2×YT培养基中振荡培养至OD600值为0.5～0.6时，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4～5小时。经破菌和Ni-NTAAgarose(德国Qiagen公司产品)纯化后，行SDS-PAGE电泳，显示表达的融合蛋白PC-1-e2相对分子量为19.0kD，纯度达95％以上。融合蛋白PC-1-e2的氨基酸序列见表2。
2.免疫Balb/C小鼠以纯化的融合蛋白PC-1-e2皮下免疫雄性Balb/C小鼠，多次免疫至小鼠多抗血清的效价达1∶6,000～1∶10,000时即可用于制备单克隆抗体。
3.单克隆抗体MA7B1的制备采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。取上述免疫成功的小鼠脾脏细胞在聚乙二醇4000(PEG 4000)诱导下与骨髓瘤细胞株SP2/0进行细胞融合，HAT选择性培养筛选出融合细胞，用间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA法)筛选出分泌抗PC-1N端抗体的杂交瘤细胞，再以有限稀释法进行克隆化培养，得到稳定分泌抗PC-1N端单克隆抗体MA7B1的杂交瘤细胞株7B1。将该株7B1杂交瘤细胞接种于同系小鼠腹腔，诱导产生腹水，抽取腹水，通过亲和层析法纯化，得到纯化的IgG型抗体MA7B1。
4.单克隆抗体MA7B1的鉴定(1)单克隆抗体的效价常规间接ELISA法测得粗制腹水单克隆抗体效价为1∶2.0×104；纯化的腹水单克隆抗体效价为1∶1.0×104。
(2)单克隆抗体MA7B1的Western blot鉴定杂交瘤细胞7B1分泌的单克隆抗体MA7B1与分子质量19.0kD的PC-1融合蛋白PC-1-e2呈特异性反应。
(3)单克隆抗体IgG亚型鉴定常规直接ELISA检测方法结果显示7B1分泌的单克隆抗体为IgG1亚型。
(4)单克隆抗体的稳定性检测杂交瘤细胞株7B1体外连续培养3个月，仍能稳定分泌抗体。于液氮中冻存半年后复苏，仍分泌抗体且效价不变。
(5)杂交瘤细胞染色体核型鉴定用秋水仙碱裂解法对杂交瘤细胞株7B1进行染色体核型鉴定。在显微镜下可见杂交瘤细胞株7B1核内既有中部着丝、亚中部着丝点等骨髓瘤细胞的染色体标记，又有小鼠脾细胞端着丝点染色体标记，杂交瘤染色体2n＝90～126，平均为96，符合小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的核型特点。
实验证明，单克隆抗体MA7B1对PC-1具有高度的敏感性和特异性，并在免疫学实验和分子生物学实验中具备良好的稳定性。
图1为本发明中融合蛋白PC-1-e2的重组表达载体pQE30-PKD1e2构建流程图；图2为本发明构建的融合蛋白重组表达载体pQE30-PKD1e2的结构示意图。
具体实施例方式
现对制备抗人PC-1单克隆抗体MA7B1作详细描述。
一、材料(1)质粒和菌株融合蛋白表达载体pQE30，该载体自上游至下游依次含有PT5启动子、2个lac诱导序列、编码RBS的核苷酸序列、起始密码ATG、编码连续6个组氨酸的核苷酸序列、多克隆位点MCS和终止密码。该质粒还含氨苄青霉素抗性标记基因和复制子Col E1。表达宿主菌M15，该菌种含有阻遏质粒pREP4，其含卡那霉素抗性标记基因。PQE30和M15购自德国Qiagen公司。
(2)动物雌性新西兰大白兔购自上海第二医科大学实验动物中心。
(3)主要试剂总RNA抽提试剂盒、胶回收试剂盒为华舜公司产品，One-Step RT-PCR试剂盒、Ni-NTA纯化试剂购自德国Qiagen公司。Protein G抗体纯化试剂盒(Mab TrapKit)为Amersham Biosciences公司产品。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶为Takara公司产品。福氏佐剂，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG酶标二抗为Sigma公司产品。
二、制备方法(一)抗原的制备1.制备人肾组织总RNA以正常人肾组织，用华舜公司的大量组织总RNA抽提试剂盒制备总RNA，该试剂盒配有TCL裂解液、RP液、W3液和吸附柱等，操作所用材料均经RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯(DEPC)的0.1％水溶液处理。
(1)将新鲜肾组织300mg放入50ml离心管并置冰裕，加入5ml TCL裂解液，用匀浆器充分匀浆，将匀浆液移入50ml离心管中，再用带针头的20ml一次性注射器抽打裂解物10次。
(2)加5ml Tris-HCl饱和酚，高速振荡2分钟，再加2ml氯仿，用力颠倒混匀后室温5000g离心10分钟，移取5ml水相至50ml离心管中。加75％乙醇2.5ml，混匀后移入吸附柱。加RP液5ml，5000g离心5分钟。
(3)在吸附柱中加W3液5ml，静置2分钟后，5000g离心10分钟。此步骤重复两遍。
(4)将吸附柱放入一个干净的离心管中，往吸附膜中央加500μl无菌纯水，静置3分钟，5000g离心10分钟，即获得总RNA样品，置-80℃保存备用。
(5)RNA的鉴定RNA甲醛变性电泳配制1％甲醛变性凝胶(10×MOPS缓冲液10ml，0.1％DEPC水溶液90ml，琼脂糖1.0克。加热融化并冷却至60℃后加入37％甲醛5.4ml和10mg/ml的溴化乙淀6μl，倒入制胶器)；将上述RNA溶液20μl同20μl载样缓冲液混合，95℃水浴变性2分钟后加样电泳。总RNA电泳后在紫外灯下拍照，可看到清晰的28S rRNA和18S rRNA两个条带，前者亮度强于后者。
A260/A280＝1.9418，介于1.7～2.0之间，说明RNA降解较少，纯度理想。
2.RT-PCR扩增PKD1 cDNA片段PKD1e2(1)引物设计合成根据已知的人类PKD1 cDNA序列(GenBank L33243)，设计合成1对引物，用于扩增编码PC-1N端flank-LRR-flank区和部分WSC区的PKD1 cDNA。正向引物 其5’端引入BamHI酶切位点 反向引物 其5’端引入HindIII酶切位点 引物由Invitrogen公司合成。
(2)RT-PCR扩增以上述人总RNA为模板，用上述引物，采用Qiagen公司的One-Rep RT-PCR试剂盒(该试剂盒配有无RNA酶水、QIAGEN酶混合物——反转录酶和热启动TaqDNA多聚酶、5×QIAGEN缓冲液、5×Q溶液、dNTP混合物等)进行扩增。反应体系为总RNA4.0μl(1.354μg)，10mmol/LdNTP混合物2.0μl，QIAGEN酶混合物2.0μl，5×QIAGEN缓冲液10.0μl，5×Q溶液10.0μl，正向引物3.0μl(30pmol)，反向引物3.0μl(30pmol)，无RNA酶水16.0μl。反应条件50℃反转录30分钟；95℃15分钟激活热启动TaqDNA多聚酶；以cDNA第一链为模板，94℃40秒，58℃40秒，72℃1分钟，共进行35个循环；最后72℃延伸10分钟。RT-PCR扩增产物用1.8％琼脂糖凝胶电泳，并用DNA胶回收试剂盒回收474bp的扩增产物PKD1e2。
3.制备感受态大肠杆菌M15
大肠杆菌M15中含有卡那霉素抗性的阻遏质粒pREP4，融合蛋白在M15中高效表达时，需要阻遏质粒pREP4表达的阻遏蛋白作用于表达载体pQE30的表达调控序列，严密调控融合蛋白的表达。
(1)取少量-80℃冻存的甘油菌M15，接种于含卡那霉素25μg/ml的LB琼脂平皿，37℃培养过夜。挑取单菌落种于3ml LB(含卡那霉素25μg/ml)的试管中，37℃，250转/分钟振摇过夜。
(2)取200μl过夜培养菌种于含20ml LB(含卡那霉素25μg/ml)的试管中，37℃，300转/分钟振摇3小时，至OD600值为0.4，将试管取出冰浴15分钟。
(3)培养物于4℃，4000g离心10分钟，弃上清，加入4ml冰预冷的0.1M的CaCl2重悬菌体，冰浴30分钟。
(4)4℃，4000g离心10分钟，弃上清，各加入1ml冰预冷的0.1M的CaCl2重悬菌体，在4℃冰箱放置12-24小时即得到感受态M15菌，可用于转化。
4.构建融合蛋白表达载体pQE30-PKD1e2和工程菌M15/pQE30-PKD1e2取上述纯化的RT-PCR产物PKD1e2和融合蛋白表达载体pQE30，按常规分别用BamHI和HindIII双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后用DNA胶回收试剂盒纯化，分别得到PKD1e2和表达载体pQE30的酶切片断，按分子数9∶1比例，用T4DNA连接酶连接16小时，将连接反应产物转化上述制备的感受态宿主菌M15，涂于氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)抗性的LB琼脂平皿，37℃培养过夜获得转化子。
挑取转化子经LB振荡培养后，碱裂解法抽提质粒DNA(1)在抗性LB平皿上挑取含质粒的大肠杆菌单克隆，接种在含相应抗生素的2ml LB试管中，37℃，250转/分钟振摇过夜。
(2)4℃，15000g离心30秒，收集菌体。
(3)加100μl冰预冷的溶液I(50mmol/L Glucose，25Mmol/LTris-HCl，10Mmol/L EDTA，pH8.0)，振荡悬浮。加入溶液II(0.2M/L NaOH，1％SDS)200μl，迅速颠倒离心管7次。加入冰预冷的溶液III(5M/L KAc 60ml，CH3COOH 11.5ml，双蒸水21.5ml)150μl，振荡混匀，置冰浴2分钟。
(4)4℃，15000g离心5分钟。小心吸取上清约450μl放入另一试管中。
(5)加450μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀。4℃，15000g离心2分钟。
(6)将上层水相约400μl转移至另一离心管，加入无水乙醇800μl混匀。室温静置2分钟。
(7)4℃，15000g离心5分钟。弃上清，加入冰预冷的70％乙醇1ml，4℃下洗涤双链DNA。4℃，15000g离心2分钟，弃上清，得质粒DNA沉淀。
将所得质粒DNA经BamHI和HindIII双酶切，初步鉴定为重组质粒pQE30-PKD1e2，经ABIPRISMTM 3700型DNA测序仪测序分析证实pQE30载体上连接的是PKD1cDNA，大小为474bp，阅读框正确。测序引物位于表达载体pQE30上，正向引物为5’-CGGATAACAATTTCACACAG-3’，反向引物为5’-GTTCTGAGGTCATTACTGG-3’。该大肠杆菌转化子为工程菌M15/pQE30-PKD1e2。重组质粒pQE30-PKD1e2的构建流程图见图1，重组质粒pQE30-PKD1e2的结构示意图见图2。
5.PC-1融合蛋白的诱导表达和纯化(1)将上述获得的工程菌M15/pQE30-PKD1e2接种于含氨卞青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB 25ml，37℃，250转/分钟，培养过夜。
(2)以1∶20体积比接种在2×YT培养基中，继续培养至OD600值为0 5～0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，32℃诱导表达4～5小时。
(3)4℃，9000g，离心3分钟收集菌体。
(4)每克菌体加5ml 8M/L尿素裂解液(pH8.0)，充分裂解菌体至裂解溶液呈半透明，9000g离心45分钟，收集上清。
(5)将上清与50％Ni-NTAAgarose混合(每4ml裂解溶液加1ml Agarose)，常温下250转/分钟振摇1小时，然后将混合液装柱，行梯度洗脱纯化。
(6)配制pH值分别为pH6.3，pH5.9，pH4.5的三种尿素缓冲液(其成分均为100mMNaH2PO4，10mMTris.HCl，8Murea)，按pH值从高到低的顺序对上柱蛋白进行梯度洗脱。pH5.9和pH4.5的尿素缓冲液可将柱上的融合蛋白洗脱下来。分别收集其洗脱蛋白液保存于-80℃冰箱。
(7)将上述初步纯化的融合蛋白样品液用12％SDS-PAGE电泳分析，操作参照《分子克隆实验指南》(科学出版社，1992年10月第2版)。分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。电泳后用0.05％考马斯亮蓝250染色液染色3小时，再经脱色液脱色。结果表明诱导表达后的细菌裂解物上清有一条明显的蛋白条带，分子量约为19.0kD，与理论预计的PC-1融合蛋白PC-1-e2分子量相吻合，确认所得的是融合蛋白PC-1-e2。蛋白薄层扫描分析融合蛋白PC-1-e2占菌体总蛋白的47.11％，纯化后的融合蛋白PC1-e2的纯度在95％以上。
(二)单克隆抗体的制备1.抗原的复性(1)配制复性相关试剂磷酸盐缓冲液(PBS，pH8.0)NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O 2.9gKCl 0.2g双蒸水加至 1000ml复性缓冲液2mmol/L还原型谷胱甘肽，0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽(2)取上述PC-1-e2蛋白样品液1ml，缓慢加入9ml复性缓冲液，室温孵育4小时。在4℃环境下，将该蛋白溶液对500ml pH8.0 PBS缓冲液进行透析48小时，其间更换透析缓冲液5次。
2.免疫Balb/C小鼠将复性的融合蛋白PC-1-e2 100μg(约100μl)加入等体积的福氏佐剂，充分乳化，对6只6周龄雄性Balb/C小鼠经皮下多点注射免疫，每隔2周免疫1次，总计6次。初次免疫用完全福氏佐剂配置注射液，此后用不完全福氏佐剂配置。每次免疫前1天从被免疫的小鼠的尾静脉取血，以上述纯化的PC-1-e2作为抗原包被酶标板，用常规间接ELISA法测其血清多克隆抗体效价，可见多抗效价逐步升高，末次免疫后第3天其效价为1∶6,000～1∶10,000，符合制备单克隆抗体的要求，此时不加免疫佐剂从小鼠尾静脉注射100μg融合蛋白，加强免疫1次。3天后取小鼠脾脏用于细胞融合。
3.骨髓瘤细胞的培养在细胞融合前10天复苏冻存的骨髓瘤细胞株SP2/0，用20％小牛血清1640培养液(1640培养液+20％小牛血清+100u/ml青霉素+100μg/ml链霉素)加30μg/ml 8-杂氮鸟嘌呤，37℃、5％CO2培养。每3～4天按1∶4的比例稀释传代，融合前1天换液1次，改用20％胎牛血清1640培养液(1640培养液+20％胎牛血清+100u/ml青霉素+100μg/ml链霉素)培养，不再加8-杂氮鸟嘌呤。骨髓瘤细胞进入对数生长期(活细胞数在90％～95％以上)时，即可同小鼠脾细胞进行融合。
4.饲养层细胞的制备融合前1天取2只未经免疫的健康雄性Balb/C小鼠，去眼球采血后处死，于75％酒清中浸泡5分钟。在无菌条件下切开腹部皮肤，暴露腹部皮下组织。用5ml无菌注射器取5ml预冷至4℃的含小牛血清的HAT选择性培养基，轻轻注射入小鼠腹腔，注射器针头不抽出，用无菌棉球轻揉腹部，留置液体5分钟，再慢慢将培养液吸回注射器内，再用5ml该HAT培养基稀释，然后滴加到96孔板内，每孔1滴，放入37℃、5％CO2培养箱内过夜以备次日融合用。
5.制备脾细胞悬液取1只免疫好的Balb/C小鼠，眼球采血后颈椎脱臼法处死，用75％酒精消毒，切开腹腔，无菌条件下取出脾脏，将其放在盛有不含血清的完全培养液的小平皿中，剥去脾脏外的脂肪和结缔组织，用洗液(无血清无抗生素的RPMI1640培养液)冲洗，再用显微手术剪轻轻剪碎，在200目的无菌不锈钢筛网上轻柔研磨，然后用无血清培养液洗涤2次，使脾细胞通过网眼成为单细胞悬液。将悬液放入50ml离心管，1500转/分钟离心8分钟收集细胞，用5ml NH4Cl溶液(0.02mol/LTris-HCl，pH7.2和0.14mol/L NH4Cl)细胞，室温放置5分钟以溶解红细胞。加入45ml无血清培养液后离心收集细胞，再用50ml无血清培养液洗涤2次细胞，最后用10ml无血清培养液重悬细胞，并进行细胞计数，以备细胞融合。
6.细胞融合(1)按1∶1的比例将骨髓瘤细胞SP2/0和脾细胞混合(每种细胞计数约为1×108个)后，放入50ml离心管中，再加满无血清培养液。
(2)室温离心后弃上清，将有细胞沉淀的离心管置37℃水浴。
(3)用滴管取1ml预热至37℃的50％PEG 4000逐滴加入到离心管中，边摇动离心管边滴入，1分钟内滴完。继续在水浴箱中摇动离心管1分钟。
(4)同法滴入2ml无血清培养液，动作要轻柔。
(5)将7ml无血清培养液逐滴滴入离心管，2～3分钟加完。
(6)室温离心，弃上清，用10ml完全培养液悬浮，轻轻混匀，按每孔2滴(约100～125μl/孔)加入96孔板。37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
细胞融合后的96孔细胞培养板中，细胞融合率为100％(即所有融合孔中都有融合细胞的生长)。
7.杂交瘤细胞系的建立细胞融合1天后，在96孔板中每孔加入2滴HAT选择性培养基，放入培养箱中继续培养。每2～3天换半量的培养液，10天后改用HT培养基(1640培养液+20％胎牛血清+100u/ml青霉素+100μg/ml链霉素+100μmol/L次黄嘌呤+16μmol/L胸腺嘧啶核苷)培养，融合第15天后换用20％胎牛血清DMEM培养液。当大多数有细胞生长的孔达到10％～25％满时，即可准备筛选。
8.杂交瘤细胞系的筛选用常规间接ELISA法对杂交瘤培养上清进行初步筛选，阳性克隆再用有限稀释法单克隆化。
(1)间接ELISA法主要试剂如下①包被液0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)Na2CO31.59gNaHCO32.93g双蒸水加至 1000ml②PBS缓冲液(pH7.4)NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O 2.9gKCl 0.2g双蒸水加至 1000ml③抗体稀释液含0.05％吐温-20和1％小牛血清(BSA)的PBS缓冲液(pH7.4)④洗涤液含0.05％吐温-20的PBS缓冲液(pH7.4)⑤封闭液含1％BSA的PBS缓冲液(pH7.4)⑥磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)0.1M柠檬酸(19.2g/1000ml)24.3ml0.2M Na2HPO4(28.4g/1000ml) 25.7ml双蒸水 50ml
⑦底物显色溶液邻苯二胺(OPD)-H2O2(新鲜配制)pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液10ml邻苯二胺 4mg30％H2O215μl⑧终止剂2M H2SO4H2SO422.2ml双蒸水177.8ml操作步骤如下①用包被液稀释抗原(PC-1-e2)成10μg/ml，于酶标板每孔加100μl包被，4℃包被过夜(不少于12小时)。
②用封闭液37℃湿盒封闭1小时。
③用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，从含有融合细胞的孔中吸取100μl上清加样，阳性对照孔为免疫小鼠的血清(100倍稀释)，阴性对照为SP2/0细胞上清，37℃湿盒温育1-2小时。
④用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，每孔加入用抗体稀释液稀释好的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶1,000)100μl，37℃湿盒温育1-2小时。
⑤温育后再洗3次，加入底物溶液100μl，在避光条件下显色约30分钟，待底物显色适当时，每孔滴加50μl终止液，酶联检测仪测定OD492值。抗体效价以OD492值≥阴性2倍以上者，判断为阳性。
(2)有限稀释法在96孔培养板中每孔都加入等量小鼠腹腔细胞培养上清，取杂交瘤培养板中效价较高、克隆较小的阳性孔细胞，计数后将细胞悬液浓度调节到10个/ml，在含饲养细胞上清的96孔板中每孔加入0.1ml悬液，于37℃、5％CO2培养10天，用常规间接ELISA法检测培养上清，再取效价较高、克隆较小的阳性孔细胞进行下一次有限稀释。
间接ELISA法检测克隆孔培养上清，得到13个阳性克隆孔，抗体阳性率为13.54％。有限稀释的第一次阳性率为23％，第二次为96％，第三次为100％。
9.单克隆抗体的大量制备取8周龄雄性Balb/C小鼠1只，腹腔内注射0.5ml石蜡油，1周后腹腔内接种107个杂交瘤细胞(约2ml)，1周后腹腔内产生腹水，取腹水0.5ml注射到另1只Balb/C小鼠腹腔内(1周前腹腔内已注射石蜡油)，1周后再取腹水注射另1只Balb/C小鼠腹腔内(腹腔内事先并没有注射石蜡油)，1周后再次取腹水注射另1只Balb/C小鼠腹腔内，如此反复几次后取出腹水离心，取上清，加入NaN3，使终浓度为0.2％，置-20℃冰箱中待用。
10.单克隆抗体的纯化取单抗粗制品(腹水或细胞培养上清)，于4℃ 20,000g离心30分钟，取上清，用0.45μm滤器过滤后，采用蛋白G(Protein G)抗体纯化试剂盒层析法纯化单克隆抗体MA7B1。
层析柱规格及缓冲液成分如下层析柱HiTrap Protein G HP，1ml缓冲液10×结合缓冲液0.2M磷酸钠，pH7.010×洗脱缓冲液1M甘氨酸，pH2.71×中和缓冲液1M三羟甲基胺基甲烷(Tris-HCl)，pH9.0多克隆抗体纯化步骤简述如下①配制结合缓冲液和洗脱缓冲液的工作液结合缓冲液工作液2.5ml 10×结合缓冲液+22.5ml双蒸水洗脱缓冲液工作液0.5ml 10×洗脱缓冲液+4.5ml双蒸水②注射器装满水，将柱子去顶盖，将5ml注射器和柱子连接好，确保密封严格，避免产生气泡。
③将柱子下面的底盖去掉。
④用5ml双蒸水冲洗柱子，速度至少1滴/秒，以去除柱子中的乙醇。
⑤平衡层析柱用3ml结合缓冲液工作液过柱，速度1滴/2秒。
⑥加样1ml小鼠腹水+1ml结合缓冲液工作液，混匀后上样；或10ml小鼠单克隆细胞培养液直接上样。液体流出速度1滴/秒。
⑦冲洗7ml结合缓冲液工作液过柱。速度1滴/2秒。
⑧洗脱5ml洗脱缓冲液工作液过柱。速度1滴/2秒。
⑨中和每毫升洗脱液加中和缓冲液75μl，分装后-80℃密封保存备用。
11.间接ELISA法检测抗体效价方法同上述步骤8(1)，测得粗制腹水单克隆抗体效价为1∶2.0×104；纯化的腹水单克隆抗体效价为1∶1.0×104。
12.纯化单克隆抗体的SDS-PAGE和Western blot鉴定(1)纯化单克隆抗体的10％SDS-PAGE电泳操作参照《分子克隆实验指南》(科学出版社，1992年10月第2版)。分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％。电泳结束后用0.05％考马斯亮蓝250染色液染色3h，再经脱色液脱色。结果表明纯化的单克隆抗体在约25kD处显示IgG1的轻链，约55kD处为其重链。
(2)Western blot鉴定①将Ni-NTA Agarose纯化的融合蛋白PC-1-e2样品，经12％SDS-PAGE胶电泳。
共做4个12％SDS-PAGE胶。
②用半干法电转移转将电泳胶蛋白至硝酸纤维素膜，电转条件为250伏，90分钟。
③取下硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉封闭2h，PBST反复洗涤3次，每次3～5分钟。接下来将3张硝酸纤维素膜分别与3株间接ELISA效价在1∶8,000以上的杂交瘤细胞株培养上清的纯化物(稀释比例均为1∶100)反应，以ELISA反应阴性的杂交瘤细胞培养上清的纯化物做阴性对照，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次3～5分钟。用稀释好的辣根过氧化物酶标记的抗鼠酶标二抗与纤维素膜在37℃摇床温育1～2小时，PBST洗涤3次，加入DAB-H2O2底物显色液，显色后拍照。结果表明3株阳性克隆(7B1、4A10、4G3)只有7B1杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体与多囊蛋白-1的融合蛋白PC1-e2有特异性反应。
13.单克隆抗体IgG亚型鉴定用直接ELISA检测方法确定7B1产生的单克隆抗体的亚型。具体操作简述如下将单抗MA7B1以10μg/ml的浓度包被酶标板(同时用已知亚型的3F4和5A9单抗作为对照，3F4为IgG2a，5A9为IgG1)，4℃过夜，1％BSA 37℃湿盒封闭1小时，甩干后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗亚型抗体(分别是anti-IgG1-HRP，anti-IgG2a-HRP，anti-IgG2b-HRP，anti-IgG3-HRP，anti-IgM-HRP)，37℃湿盒反应1小时，OPD-H2O2系统显色，测定OD492值，结果单克隆抗体MA7B1在与anti-IgG1-HRP作用后的OD492值最高(1.04)，这表明其亚型为IgG1。
14.杂交瘤细胞染色体核型鉴定细胞培养终止前6小时加秋水仙碱至终浓度为0.5mg/L，离心后去上清，加入预温至37℃的0.075mol/L氯化钾溶液5ml，在37℃培养箱中置30分钟。离心去上清，加固定液5ml，置室温5分钟，再离心去上清，留少许液体，制成细胞悬液，加2滴于预冷玻璃片上，自然扩散，待干燥后用5％Giemsa染色10分钟，流水冲洗后吹干，镜下观察并进行染色体计数。在镜下可见核内既有中部着丝、亚中部着丝点等骨髓瘤细胞染色体标记，又有小鼠脾细胞端着丝点染色体标记，杂交瘤染色体2n＝90～126，平均为96，符合小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的核型特点。
(三)抗体综合指标的检测实验1.免疫组织化学正常新鲜肾组织经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋并切片，以抗PC-1N端单克隆抗体MA7B1(1∶800稀释)做一抗，生物素化羊抗鼠IgG做二抗，行常规免疫组织化学ABC法，发现PC-1分布于肾小管组织，尤以远端肾小管为主，结果符合国际同类实验的普遍发现。
2.ELISA双抗体夹心ELISA法用抗PC-1N端单克隆抗体MA7B1作为捕获抗体包被酶标板，洗涤后加人血清，洗涤后再加检测抗体抗PC-1N端多克隆抗体，通过与抗PC-1N端多克隆抗体结合的羊抗兔酶标IgG与底物系统的显色反应来测定人血清中的PC-1N端含量。标准曲线及测量值均较理想。
3.Western blot将克隆有PKD1 cDNA全长序列的真核表达载体pCDNA3.1转染293细胞后，裂解细胞，提取细胞蛋白(含PC-1)，用抗PC-1N端单克隆抗体MA7B1(1∶500稀释)做Western blot分析，结果在450kD～500kD处有一蛋白条带，同PC-1分子量的理论预计值相符。没有转染该表达质粒的293细胞则没有这条带。说明MA7B1对PC-1具有高度特异性和敏感性。
4.IP将克隆有PKD1 cDNA全长序列的真核表达载体pCDNA3.1转染293细胞(人胚肾细胞株，购自中科院上海细胞所)，用125I对细胞进行表面标记，裂解细胞，将MA7B1与细胞裂解液中的蛋白共免疫沉淀，SDS-PAGE分析在450kD～500kD处有一蛋白条带，同PC-1分子量的理论预计值相符。用商品化的抗PC-1C端单克隆抗体对IP产物做Western blot分析，证实所沉淀的蛋白是PC-1。
5.稳定性纯化的MA7B1在4℃放置半年或在常温下放置10天效价无明显改变，说明该抗体在4℃及常温下稳定性较强。
本发明单克隆抗体MA7B1稳定性好，检测PC-1时敏感性高，特异性强，故可用于制备研究常染色体显性遗传性多囊肾病发病机制的试剂。
表1 PKD1cDNA核苷酸序列GCCTGCCGCGTCAACTGCTCGGGCCGCGGGCTGCGGACGCTCGGTCCCGCGCTGCGCATCCCCGCGGACGCCACAGCGCTAGACGTCTCCCACAACCTGCTCCGGGCGCTGGACGTTGGGCTCCTGGCGAACCTCTCGGCGCTGGCAGAGCTGGATATAAGCAACAACAAGATTTCTACGTTAGAAGAAGGAATATTTGCTAATTTATTTAATTTAAGTGAAATAAACCTGAGTGGGAACCCGTTTGAGTGTGACTGTGGCCTGGCGTGGCTGCCGCGATGGGCGGAGGAGCAGCAGGTGCGGGTGGTGCAGCCCGAGGCAGCCACGTGTGCTGGGCCTGGCTCCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCTTGGCATCCCCTTGCTGGACAGTGGCTGTGGTGAGGAGTATGTCGCCTGCCTCCCTGACAACAGCTCAGGCACCGTGGCAGCAGTGTCCTTTTCAGCTGCCCACGA表2 融合蛋白PC-1-e2的氨基酸序列MHHHHHHGSACRVNCSGRGLRTLGPALRIPADATALDVSHNLLRALDVGLLANLSALAELDISNNKISTLEEGIFANLFNLSEINLSGNPFECDCGLAWLPRWAEEQQVRVVQPEAATCAGPGSLAGQPLLGIPLLDSGCGEEYVACLPDNSSGTVAAVSFSAAHEKL
权利要求
1.一种抗人多囊蛋白-1单克隆抗体MA7B1的制备方法，包括制备抗原、免疫动物、制备抗体，其特征在于所制备的抗原为PC-1-e2，其氨基酸序列为MHHHHHHGSACRVNCSGRGLRTLGPALRIPADATALDVSHNLLRALDVGLLANLSALAELDISNNKISTLEEGIFANLFNLSEINLSGNPFECDCGLAWLPRWAEEQQVRVVQPEAATCAGPGSLAGQPLLGIPLLDSGCGEEYVACLPDNSSGTVAAVSFSAAHEKL。
2.按权利要求1所述的多囊蛋白-1单克隆抗体MA7B1的制备方法，其特征在于所说的免疫动物选用Balb/C小鼠。
3.权利要求1或2所述制备方法所制得的抗多囊蛋白-1单克隆抗体MA7B1。
4.权利要求3所述抗多囊蛋白-1单克隆抗体MA7B1在制备研究常染色体显性遗传性多囊肾病发病机制试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药分子生物学、免疫学检测技术领域，是一种抗人PC－1N端单克隆抗体MA7B1，可用于制备研究常染色体显性遗传性多囊肾病发病机制的试剂。本发明根据人类多囊肾病基因1(PKD1)的cDNA序列和其编码产物——多囊蛋白－1(PC)的分子结构，采用分子生物学技术克隆到编码PC－1的cDNA，并构建其原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达出PC－1N端的融合蛋白(PC－1的flank－LLR－flank区和部分WSC区)，用杂交瘤技术制备抗PC－1N端的单克隆抗体MA7B1。经针对多囊蛋白－1N端的综合性能指标测试，该抗体在免疫组织化学、酶联免疫吸附、免疫印记和免疫沉淀实验中性能稳定，敏感性高，特异性强，故可用于制备研究常染色体显性遗传性多囊肾病发病机制的试剂。
文档编号C07K16/18GK1526734SQ0315118
公开日2004年9月8日 申请日期2003年9月25日 优先权日2003年9月25日
发明者梅长林, 赵海丹 申请人:中国人民解放军第二军医大学