专利名称：从生物物质中提取大环内酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种从生物物质，特别是发酵液中提取大环内酯，例如他克莫司的方法。
背景技术：
大环内酯是含有一个或多个脱氧糖作为取代基的多元内酯环。红霉素、阿奇霉素和克拉霉素是具有抑菌和/或杀菌活性的大环内酯。
他克莫司(FK 506)也是一种大环内酯类抗菌素，它同时也是一种免疫抑制剂。它对于T淋巴细胞具有选择性的抑制效果，比环孢素更有效。
大环内酯通常是通过发酵获得的，尽管有一些合成路线是已知的。本提取法与先有技术相比，具有若干优点，例如，整个发酵液可以用作本方法的原料(″整体发酵液法″)，使用疏水性提取溶剂获得有效的提取收率，留下大部分水溶性杂质，并且一步脱除菌丝体。在25℃以上的温度和减压下减压浓缩使得在不发生他克莫司的沉淀或分解的情况下获得高的溶剂蒸发速率。本发明另外的优点对本领域技术人员来说将显而易见。
发明概述一方面，本发明涉及一种获得大环内酯，特别是他克莫司的方法，其包括如下步骤用疏水性提取溶剂，特别是其中疏水性提取溶剂选自正丁醇，异丁醇，乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷，卤代乙烷，和在25℃为液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃，来提取含大环内酯的生物物质，以获得大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液，其中被提取生物物质的pH值为约5.5至约13。
另一方面，本发明涉及一种获得大环内酯，特别是他克莫司的方法，其包括如下步骤用疏水性提取溶剂，特别是其中疏水性提取溶剂选自正丁醇，异丁醇，乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷，卤代乙烷，和在25℃为液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃，来提取含大环内酯的生物物质，其中提取在约2℃到约70℃，特别是约15℃到约35℃的温度下进行，以获得大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液。
再一方面，本发明涉及一种获得大环内酯，特别是他克莫司的方法，其包括如下步骤用疏水性提取溶剂，特别是其中疏水性提取溶剂选自正丁醇，异丁醇，乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷，卤代乙烷，和在25℃为液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃，来提取含大环内酯的生物物质，其中提取在约2℃到约70℃，特别是约15℃到约35℃的温度，且pH值为约5.5至约13，特别是约7.5至约13的条件下进行，以获得大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液。
再一方面，本发明涉及一种获得大环内酯，特别是他克莫司的方法，其包括如下步骤用疏水性提取溶剂，特别是其中疏水性提取溶剂选自正丁醇，异丁醇，乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷，卤代乙烷，和在25℃为液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃，来提取含大环内酯的生物物质，其中提取在约2℃到约70℃，特别是约15℃到约35℃的温度，且pH值为约5.5至约13，特别是约7.5至约13的条件下进行，以获得大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液；浓缩含大环内酯的溶液；用柱色谱处理浓缩后的溶液，得到至少一个含大环内酯的级分，其为含大环内酯的溶液；并从溶液中结晶出大环内酯。
再一方面，本发明涉及一种获得大环内酯，特别是他克莫司的方法，其包括如下步骤用疏水性提取溶剂，特别是其中疏水性提取溶剂选自正丁醇，异丁醇，乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷，卤代乙烷，和在25℃为液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃，来提取含大环内酯的生物物质，以获得大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液；将含大环内酯的溶液与提取后的含大环内酯的生物物质分离；浓缩分离出来的含大环内酯的溶液；用柱色谱处理浓缩后的溶液，得到至少一个含大环内酯的级分，其为含大环内酯的溶液；任选将溶液浓缩；并通过冷却，特别是冷却至约20℃或更低的温度而从任选浓缩的分离后的溶液中结晶出大环内酯；并分离结晶出的大环内酯。
再一方面，本发明涉及一种获得大环内酯，特别是他克莫司的方法，其包括如下步骤用疏水性提取溶剂，特别是其中疏水性提取溶剂选自正丁醇，异丁醇，乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷，卤代乙烷，和在25℃为液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃，来提取含大环内酯的生物物质，以获得大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液；将含大环内酯的溶液与提取后的含大环内酯的生物物质分离；浓缩分离出来的含大环内酯的溶液；用柱色谱处理浓缩后的溶液，得到至少一个含大环内酯的级分，其为含大环内酯的溶液；任选将溶液浓缩；并通过将浓缩的分离后的溶液与选自乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、己烷、庚烷、和水的结晶溶剂混合而从任选浓缩的分离后的溶液中结晶出大环内酯；并分离结晶出的大环内酯。
再一方面，本发明涉及一种获得大环内酯，特别是他克莫司的方法，其包括如下步骤用疏水性提取溶剂，其中该疏水性提取溶剂选自正丁醇，异丁醇，乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷，卤代乙烷，和在25℃为液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃，来提取含大环内酯的生物物质，以获得大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液，其中所述含大环内酯的生物物质是从选自筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、和变青链霉菌(Streptomyceslividans)的微生物得到的，且其中被提取的生物物质的pH值为约5.5至约13。
再一方面，本发明涉及一种从含他克莫司的生物物质获得他克莫司的方法，其包括如下步骤用选自乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、和甲苯的疏水性提取溶剂，在约2℃到约70℃，特别是约15℃到约35℃的温度下，在pH值为约5.5到约13，特别是约7.5到约13的条件下，提取含他克莫司的生物物质，以获得他克莫司在疏水性提取溶剂中的溶液，其中所述含他克莫司的生物物质是由选自筑波链霉菌、吸水链霉菌、和变青链霉菌的微生物发酵得到的整体发酵液；将含他克莫司的溶液与提取后的含他克莫司的生物物质分离；浓缩所述含他克莫司的溶液；用柱色谱处理浓缩后的溶液，以得到至少一个含大环内酯的级分，其为含大环内酯的溶液；任选将溶液浓缩；并通过冷却或将其与选自乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、己烷、庚烷、和水的结晶溶剂混合而从任选浓缩的分离后的溶液中结晶出他克莫司，由此形成结晶他克莫司沉淀；并分离出他克莫司。
再一方面，本发明涉及一种从含他克莫司的生物物质获得他克莫司的方法，其包括如下步骤用乙酸异丁酯，在约2℃到约70℃，特别是约15℃到约35℃的温度下，提取含他克莫司的生物物质，以获得他克莫司在乙酸异丁酯溶剂中的溶液，其中所述含他克莫司的生物物质是由选自筑波链霉菌、吸水链霉菌、和变青链霉菌的微生物发酵得到的整体发酵液；将含他克莫司的乙酸异丁酯溶液与提取后的含他克莫司的生物物质分离；浓缩所述含他克莫司的乙酸异丁酯溶液；用柱色谱处理浓缩后的溶液，以得到至少一个含大环内酯的级分，其为含大环内酯的溶液；任选将溶液浓缩；并通过将其冷却到约20℃或更低的温度，或将其与选自乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、己烷、庚烷、和水的结晶溶剂混合而从任选浓缩的分离后的溶液中结晶出他克莫司，由此形成结晶他克莫司沉淀；并分离出他克莫司。
发明详述在一个实施方案中，本发明提供一种从含大环内酯的生物物质中获得大环内酯，优选他克莫司(亦称FK 506)的方法，其包括用疏水性提取溶剂从含大环内酯的生物物质中提取大环内酯以获得大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液的步骤，由此可获得大环内酯。在另一个实施方案中，本发明提供一种从含大环内酯的生物物质获得大环内酯，优选他克莫司的方法，它通过用疏水性提取溶剂提取所述生物物质以获得大环内酯的溶液，随后浓缩该溶液，得到浓缩液，由此分离出大环内酯。
含大环内酯的生物物质是由或通过使用可产生大环内酯的微生物，例如通过发酵或培养等途径产生大环内酯的细菌或真菌得到的。微生物的发酵可以通过本领域技术人员公知的方法进行，例如参见10Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，361页，Surjit S.Sengha的文章，Fermentation，(Jacquiline I.Kroschwitz编，第4版，1993)。
优选的含大环内酯的生物物质是含他克莫司的生物物质，特别是可通过使用产生他克莫司的微生物发酵而获得的发酵液，例如美国专利4,894,366，5,116,756，5,624,842，5,496,727，和5,622,866中所述的筑波链霉菌，其新的突变菌株，吸水链霉菌，和变青链霉菌。
对由可产生大环内酯的微生物发酵产生的发酵液进行过滤所获得的菌丝体和滤液同样也是可用于本发明实践的生物物质。未被过滤或被纯化用以分离菌丝体的整体发酵液，即由可产生大环内酯的微生物发酵产生的″整体发酵液″是优选用于本发明实践的含大环内酯的生物物质。当使用整体发酵液时，本方法可以称为″整体发酵液法″。
用疏水性提取溶剂提取含大环内酯的生物物质，这种疏水性提取溶剂是能溶解大环内酯，特别是他克莫司的溶剂，但是它在25℃下仅微溶于水。优选的疏水性提取溶剂是乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯如乙酸异丁酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷如二氯甲烷，卤代乙烷如二氯乙烷，和在25℃下液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃。正或异丁醇也可以用作疏水性提取溶剂。
优选作为疏水性提取溶剂的是乙酸异丁酯，乙酸正丁酯，乙酸叔丁酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，甲酸乙酯，丁基甲基酮(2-己酮)，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，和甲苯。
乙酸乙酯和乙酸异丁酯是特别优选的疏水性提取溶剂。
用来形成大环内酯溶液的提取操作可以使用本领域技术人员公知的或类似的常规的方法和设备进行。所述方法和设备的选择必须只提供适当的搅拌并使得溶液能与提取后的含大环内酯的生物物质分离，或者使得提取混合物转移到分离装置中。提取可以在约2℃到约70℃之间任何合理而可行的温度下进行，优选，提取温度为约15℃到约35℃。本领域技术人员将知道如何根据含大环内酯的生物物质、疏水性提取溶剂、使用的设备和温度来优化提取时间。提取结束时，提取混合物包括大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液以及残余的提取后的含大环内酯的生物物质。
在优选实施方案中，提取在没有事先进行任何纯化处理，例如没有过滤除去菌丝体的生物物质如发酵液上进行。在这种情况下，提取被称为整体发酵液提取。
提取可以在pH值约1到约13之间的任何pH值下进行。优选，进行提取的pH值在约5.5到约13之间，最优选约7.5到约13。生物物质，特别是发酵液的pH值可以使用适当的无机碱，例如NH4OH、NaOH、KOH、LiOH或Ca(OH)2来调节，这些仅仅是举例。本发明人发现，当在pH值为约5.5到约13的生物物质上进行提取时特别有益，尤其是就大环内酯的纯度而论。优选，pH值是碱性pH，特别是约7.5到约13。
提取后，将大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液与提取混合物分离，并且，在优选实施方案中，浓缩得到浓缩液。分离可以使用本领域技术人员公知的或类似的常规的方法和设备完成，例如滗析、分液漏斗分离、和使用液-液-离心分离。
与提取后的含大环内酯的生物物质分离开来的含大环内酯的溶液经浓缩得到浓缩液。浓缩可以在普通大气压(本领域技术人员知道，这一大气压在约760mmHg的均值附近微小变化)下进行，或可以借助于例如真空泵或水泵的帮助在减压下进行。浓缩优选在约25℃以上的温度下进行。浓缩的进行一直到含大环内酯溶液的体积降低到其初始体积的约0.2％-约2.0％或者更低，以得到浓缩的含大环内酯的溶液(″浓缩液″)。粗品他克莫司可以从浓缩液中分离出来。
在优选实施方案中，对浓缩液用硅胶柱色谱进行处理。应用的色谱法可以参见美国专利4,894,366，其全文在此引入作为参考。
为了进行处理，将浓缩液(浓缩的含大环内酯的溶液)装到硅胶柱上。装载时，可以将浓缩液与能溶解大环内酯的溶剂，例如乙酸乙酯结合并与硅胶成浆。将溶剂从浆液中脱除，得到的硅胶负载有大环内酯及来自于浓缩液的其他物质。将负载的硅胶装入柱的顶部，并且，如果希望的话，使装填洗脱剂通过该柱。然后用洗脱剂洗脱该柱。
洗脱剂可以是等组成的(isochratic)，即具有恒定的组成，或洗脱剂的组成在洗脱过程中可以发生变化。优选的洗脱剂包括乙酸乙酯和己烷的混合物。
收集级分得到至少一个含大环内酯的级分，它是大环内酯在洗脱剂中的溶液。多个含大环内酯的级分可以合并成单一的含大环内酯的级分。对这种含大环内酯的级分可以进行浓缩，以得到大环内酯的浓缩溶液(浓缩级分)，由此可结晶出大环内酯。
大环内酯从优选浓缩的含大环内酯的溶液中结晶(沉淀)出来。这样结晶(沉淀)出来的大环内酯可以通过例如过滤或离心方式分离。结晶可以通过将含大环内酯的溶液冷却到优选约20℃或更低的温度下完成。结晶也可以通过将结晶溶剂与优选浓缩的含大环内酯的溶液混合实现。在优选实施方案中，混合物随后在约25℃或更低的温度下保持约10到约60小时。典型的保持时间是48小时。可用的结晶溶剂包括乙腈，甲醇，乙醇，丙酮，乙醚，乙酸乙酯，己烷，庚烷，和水。
在具体实施方案中，将含大环内酯的溶液浓缩至干，不进行进一步冷却和不使用结晶溶剂就得到大环内酯。
以下用非限定性实施例来说明本发明的实施。
实施例1将发酵液(50毫升)与50毫升乙酸异丁酯混合。用稀硫酸溶液将混合物的pH值调节到pH值＝2。搅拌30分钟之后，分离各相。分离的乙酸异丁酯相(39毫升)在60℃减压浓缩至干，收率为83％。
实施例2将发酵液(50毫升)与50毫升乙酸异丁酯混合。向混合物中加入250毫克硫酸镁和几滴稀十二烷基三甲基氯化铵溶液。用稀硫酸溶液将混合物的pH值调节到pH值＝4。搅拌30分钟之后，分离各相。分离的乙酸异丁酯相(44毫升)在70℃减压浓缩至干，收率为88％。
实施例3将发酵液(50毫升)与50毫升乙酸异丁酯混合。向混合物中加入250毫克硫酸镁和几滴稀十二烷基三甲基氯化铵溶液。用稀氢氧化钠溶液将混合物的pH值调节到pH值＝8。将混合物加热到35-40℃。搅拌30分钟之后分离各相。分离的乙酸异丁酯相(44毫升)在82℃减压浓缩至干，收率为94％。
实施例4将发酵液(50毫升)与50毫升乙酸异丁酯混合。向混合物中加入250毫克硫酸镁和几滴稀十二烷基三甲基氯化铵溶液。用稀氢氧化钠溶液将混合物的pH值调节到pH值＝10。将混合物冷却到15℃。搅拌30分钟之后分离各相。将乙酸异丁酯相(43毫升)在55℃减压浓缩至干。收率为92％。
实施例5
将发酵液(50毫升)与50毫升乙酸乙酯混合。向混合物中加入250毫克硫酸镁和几滴稀十二烷基三甲基氯化铵溶液。用稀硫酸溶液将混合物的pH值调节到pH值＝4。搅拌30分钟之后分离各相。分离的乙酸乙酯相在29℃减压浓缩至干。收率为92％。
权利要求
1.一种获得大环内酯的方法，其包括如下步骤用疏水性提取溶剂提取含大环内酯的生物物质以得到大环内酯在疏水性提取溶剂中的溶液，其中待提取的含大环内酯的生物物质的pH值为约5.5至约13。
2.权利要求1的方法，其中疏水性提取溶剂选自正丁醇，异丁醇，乙酸或甲酸的C2-C6直链和支链酯，C3-C6直链或支链脂肪族酮，卤代甲烷，卤代乙烷，和在25℃为液体且在大气压下的沸点低于约150℃的芳香烃。
3.权利要求2的方法，其中疏水性提取溶剂选自正丁醇、异丁醇、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丙酮、丁基甲基酮、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、和甲苯。
4.权利要求3的方法，其中疏水性提取溶剂是乙酸乙酯、乙酸异丁酯、或其混合物。
5.权利要求4的方法，其中疏水性提取溶剂是乙酸异丁酯。
6.权利要求1的方法，其中提取在约2℃到约70℃的温度下进行。
7.权利要求6的方法，其中提取在约15℃到约35℃的温度下进行。
8.权利要求1的方法，其中提取的生物物质的pH值为约7.5至约13。
9.权利要求1的方法，其中含大环内酯的生物物质是从选自筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)、和变青链霉菌(Streptomyces lividans)的微生物得到的。
10.权利要求9的方法，其中含大环内酯的生物物质是整体发酵液。
11.权利要求10的方法，其中大环内酯为他克莫司。
12.权利要求11的方法，其中生物物质的pH值为约7.5至约13。
13.权利要求12的方法，其中疏水性提取溶剂是乙酸异丁酯。
14.权利要求1的方法，在提取后还包括如下步骤将含大环内酯的溶液与提取后的含大环内酯的生物物质分离，浓缩分离出来的含大环内酯的溶液，将浓缩后的含大环内酯的溶液装载到硅胶柱上并用洗脱剂洗脱，得到至少一个含大环内酯的级分，其为含大环内酯的溶液，从含大环内酯的溶液中结晶出大环内酯，并分离结晶出的大环内酯。
15.权利要求14的方法，其中通过浓缩至少一个为含大环内酯的溶液的含大环内酯的级分并将浓缩后的溶液冷却到约25℃或更低的温度来进行结晶。
16.权利要求14的方法，其中通过将分离后的溶液与结晶溶剂混合来进行结晶。
17.权利要求16的方法，其中结晶溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、己烷、庚烷、和水。
18.权利要求17的方法，其中结晶溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和水。
19.权利要求16的方法，其中使分离后的溶液与结晶溶剂的混合物在约25℃或更低的温度保持约10-约60小时。
20.一种从含他克莫司的生物物质获得他克莫司的方法，其包括如下步骤a)用选自正丁醇、异丁醇、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷和甲苯的疏水性提取溶剂，在约2℃到约70℃的温度下，在pH值为约5.5到约13的条件下，提取含他克莫司的生物物质以获得他克莫司在疏水性提取溶剂中的溶液，其中所述含他克莫司的生物物质是由选自筑波链霉菌、吸水链霉菌、和变青链霉菌的微生物发酵得到的整体发酵液；b)将含他克莫司的溶液与提取后的含他克莫司的生物物质分离；c)浓缩所述含他克莫司的溶液；d)将浓缩后的含他克莫司的溶液装载到硅胶色谱柱上并用洗脱剂洗脱该柱，得到至少一个含他克莫司的级分，其为含他克莫司的溶液；e)从至少一个含他克莫司的级分结晶出他克莫司，由此形成结晶他克莫司沉淀；并f)分离出结晶他克莫司。
21.权利要求20的方法，其中整体发酵液的pH值为约7.5至约13。
22.权利要求20的方法，其中疏水性提取溶剂是乙酸异丁酯。
23.权利要求20的方法，其中提取在约15℃到约35℃的温度下进行。
24.权利要求20的方法，其中通过浓缩至少一个含他克莫司的级分并将浓缩后的级分冷却到约25℃或更低的温度来进行结晶。
25.权利要求20的方法，其中通过将至少一个含他克莫司的级分与选自乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、己烷、庚烷、和水的结晶溶剂混合来进行结晶。
26.一种从含他克莫司的生物物质获得他克莫司的方法，其包括如下步骤用选自乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳和甲苯的疏水性提取溶剂提取含他克莫司的生物物质，其中含他克莫司的生物物质为整体发酵液，含他克莫司的生物物质的pH值为约5.5至约13。
27.一种从含他克莫司的生物物质获得他克莫司的方法，其包括如下步骤a)用乙酸异丁酯在约2℃到约70℃的温度下提取含他克莫司的生物物质，以获得他克莫司在乙酸异丁酯中的溶液，其中所述含他克莫司的生物物质是由选自筑波链霉菌、吸水链霉菌、和变青链霉菌的微生物发酵得到的整体发酵液；b)将含他克莫司的溶液与提取后的含他克莫司的生物物质分离；c)浓缩所述含他克莫司的溶液；d)将浓缩后的含他克莫司的溶液装载到硅胶色谱柱上并用洗脱剂洗脱，得到至少一个含他克莫司的级分，其为含他克莫司的溶液；e)浓缩至少一个含他克莫司的级分；f)从浓缩后的级分结晶出他克莫司，由此形成结晶他克莫司沉淀；并g)分离出结晶他克莫司。
28.权利要求27的方法，其中含他克莫司的生物物质的pH值为约5.5至约13。
29.权利要求28的方法，其中含他克莫司的生物物质的pH值为约7.5至约13。
30.权利要求27的方法，其中提取温度为约15℃到约35℃。
全文摘要
提供一种由生物物质获得大环内酯，特别是他克莫司的方法。
文档编号C07D267/22GK1649852SQ03807327
公开日2005年8月3日 申请日期2003年2月12日 优先权日2002年2月13日
发明者V·克里, L·迪克, C·绍博 申请人:特瓦药厂有限公司