专利名称：作为免疫抑制剂的紫草素衍生物及其金属络合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种紫草素衍生物及其金属络合物，具体是一种作为免疫抑制剂的紫草素衍生物及其金属络合物。属于药物领域。
背景技术：
紫草(Lishopermum eryhrorhizon)为传统中药，药用其根部。味甘，性寒，归肝经，功能凉血活血，解毒透疹。适用于麻疹或温热病发斑疹。近代药理学研究证明紫草具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用。其主要成分有紫草素(shikoin I)，乙酰紫草素(Acetyl shikonin II)等。
经文献检索发现，Xin Chen等在《International Immunopharmacology》第2001年第1期P229-236上发表的Shikonin，a component of antiinflammatoryChinese herbal medicine，selectively blocks chemokine binding to CC chemokinereceptor-1(一种传统中药抗炎成分紫草素选择性地阻抗趋化因子与CC趋化因子受体-1)和在《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》2003年第47卷第9期P2810-2816上发表的Shikonin，a component of Chinese herbal medicine，inhibits chemokine receptot function and suppresses human immunodeficiencyvirus type-1(一种传统中药成分紫草素抑制趋化因子受体功能和抑制I型人自身免役缺陷病毒)，文中报道了紫草素具有选择性的趋化因子(Chemokine)受体-I抑制活性。可能用于某些自身免疫性炎症疾病及自身免役缺陷病毒的治疗。趋化因子是一类具有趋化作用的细胞因子，它们能引导白细胞迁移、诱导其活性，在人体免疫反应中起重要作用。趋化因子的过度表达或以正常健康组织为攻击的靶时，则引起某些自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化、红斑狼疮、器官移植排斥反应等。趋化因子还与肿瘤转移和HIV感染有关。因此，趋化因子抑制剂可能用于上述与自身免疫有关疾病的治疗。该文作者首次提出了紫草素对趋化因子受体的抑制作用并预测了紫草素用于自身免疫相关疾病的可能性。但没有报道紫草素衍生物及其络合物的生物活性，也没有报道它们对免疫细胞的抑制作用。
发明内容
本发明针对现有发明的不足和缺陷，提供一种作为免疫抑制剂的紫草素衍生物及其金属络合物，使其解决了活性更强和毒性更低的免疫抑制剂，合成了一些紫草素的衍生物和金属离子络合物，测定了其对免疫细胞的抑制作用和细胞毒作用本发明是通过如下技术方案实施的，本发明以辽宁紫草为原料，取其根，通过CO2临界萃取，得到总紫草色素，然后，将CO2临界萃取物用碱水解，得到紫草素(I)。
将紫草素与各种有机酸(如乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、α-甲基丙烯酸、β-甲基丙烯酸、β，β-二甲基丙烯酸、苯甲酸、对硝基苯甲酸)在DCC和DMAP催化下进行缩合，得到以分子式(III)为代表的紫草素酯类衍生物。
将紫草素及其酯类衍生物与金属离子(如Cu++、Zn++、Ca++)络合，得到以分子式(IV)为代表的络合物。
以免疫细胞增殖法(H3法)和细胞毒法(MTT法)实验测定了所合成化合物的免疫抑制作用及细胞毒作用，结果列于表1中。
结果表明紫草的衍生物通式III所代表的化合物在实验的浓度范围内(0.1-100μg/ml)时具有很强的免疫抑制作用，但具有细胞毒作用。通式IV代表的化合物在较低浓度时仍保留较强的免疫抑制活性而没有细胞毒作用。可用于与自身免疫有关疾病的治疗。
本发明提到的紫草的衍生物化学结构式(III)及其金属络合物化学结构式(IV)为 式III中，R代表1-6个碳原子的饱和、不饱和及芳香族的酰基，如R为乙酰基(II)、丙酰基(III-1)、丁酰基(III-2)、异丁酰基(III-3)、α-甲基丙烯酰基(III-4)、β-甲基丙烯酰(III-5)、β，β-二甲基丙烯酰基(III-6)、苯甲酰基(III-7)、对硝基苯甲酰基(III-8)。
式IV中，R代表氢，1-6个碳原子的饱和、不饱和及芳香族的酰基，M代表金属Cu、Ca、Zn。如R＝H，M＝Cu(IV-1)、R＝H，M＝Ca(IV-2)、R＝H，M＝Zn(IV-3)、R＝Ac，M＝Cu(IV-4)、R＝Ac，M＝Ca(IV-5)、R＝Ac，M＝Zn(IV-6)。
表1部分化合物的免疫抑制及细胞毒试验结果
本发明具有实质性特点和显著进步，这些化合物具有免疫抑制作用，可用于与人体自身免疫有关的疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化病、红斑狼疮、HIV感染、恶性肿瘤。
具体实施例方式
实验部分1、紫草素的制备取辽宁硬紫草原药材的CO2超临界提取物10克，溶于500ml的0.2mol/l的NaOH溶液中，室温搅拌24小时，离心除去不溶物，合并上清液，加入0.5mol/l的H2SO4溶液，直至溶液变成红色，放置2小时，离心，得红色沉淀物，水洗，干燥，得紫草素粗品5g，石油醚重结晶，得红褐色有金属光泽的晶体2.5g，收率25％。熔点148-149℃，H-NMR(CDCl3)δ1.651，1.755(s，各3H，2CH3)，2.311-2.387(1H，m，-CHa)，2.623-2.660(1H，m，-CHb)，4.911(1H，d，J＝7.2，4.0，-OCH-)，5.202(1H，dd，J＝8.0，6.8，＝CH-)，7.165(s，1H，Quin-H)，7.192(2H，2Ar-H)，12.494，12.598(各1H，s，2Ar-OH)，与文献报道一致(植物学报，1989，31(7)，549-553)。
2、紫草素酯类衍生物的制备通法取紫草素粗品若干克，溶于干燥的CH2Cl2中，待全部溶解后，加入1-2倍摩尔量的有机酸(脂肪酸，不饱和酸，芳香酸)，以及2-3倍摩尔量的DCC和DMAP，室温-30℃搅拌1-12小时，停止反应。滤除不溶物，滤液水洗3次，加无水Na2SO4干燥，减压蒸出溶媒，粗品经层析分离，用适当溶剂重结晶，可得紫草素的酯类衍生物。
(1)乙酰紫草素取紫草素1.44g，溶于干燥的CH2Cl2中，待全部溶解后，加入1g冰醋酸，以及2g DCC和0.3g DMAP，室温搅拌1小时，停止反应。滤除不溶物，滤液水洗3次，加无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶媒，得粗品，用石油醚重结晶，得到黑红色有金属光泽的晶体1.15g，收率70％。熔点106-107℃。1H-NMR(CDCl3)δ1.579，1.694(各3H，S，2CH3)，2.142(3H，S，CH3C＝O)，2.444-2.518(m，1H，-CHa)，2.580-2.650(1H，m，-CHb)，5.122(1H，t，J＝9.6，-CH＝)，6.021(1H，dd，J＝9.2，6.2，-OCH-)，6.991(1H，s，Quin-H)，7.186(2H，s，2Ar-H)，12.433，12.589(各1H，s，2Ar-OH)，与文献报道一致(植物学报，1989，31(7)，549-553)。
(2)α-甲基丙烯酰紫草素取紫草素2.88g，溶于干燥的CH2Cl2中，待全部溶解后，加入2g α-甲基丙烯酸，以及4g DCC和0.6g DMAP，30℃搅拌5小时，停止反应。滤除不溶物，滤液水洗3次，加无水Na2SO4干燥，50℃以下，减压蒸除溶媒，硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1的流动相洗脱，得产物1.76g，收率49.4％。用甲醇重结晶，得到红色有金属光泽的晶体，熔点83-84℃。1H-NMR(CDCl3)δ1.563，1.580[各3H，s，＝C(CH3)2]，1.976(3H，s，＝C-CH3)，2.505-2.541(1H，m，-CHa)，2.646(1H，m，-CHb)，5.118(1H，t，J＝7.2，-CH＝)，5.659，6.208(各1H，s，＝CH2)，6.062(1H，dd.J＝7.2，4.8，-OCH-)，6.967(1H，s，Quin-H)，7.187(2H，s，2Ar-H)，12.431，12.601(各1H，s，2Ar-OH)。
(3)对硝基苯甲酰紫草素取紫草素1g，溶于干燥的CH2Cl2中，待全部溶解后，加入0.5g对硝基苯甲酸，以及2g DCC和0.3g DMAP，30℃搅拌12小时，停止反应。滤除不溶物，滤液水洗3次，加无水Na2SO4干燥，50℃以下减压蒸除溶媒，硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1的流动相洗脱，得产物0.83g，收率58.5％，用石油醚重结晶，得到黑红色有金属光泽的晶体，熔点143-144℃，1H-NMR(CDCl3)δ1.611，1.689(各3H，s，2CH3)，2.644-2.699(1H，m，-CHa)，2.751-2.780(1H，m，-CHb)，5.191(1H，t，J＝7.2，-CH＝)，6.294(1H，dd，J＝6.8，5.2，-OCH-)，7.06(1H，s，Quin-H)，7.187(2H，s，2Ar-H)，8.247(2H，d，J＝9.2，2’6’-Ar-H)，8.339(2H，d，J＝9.2，3’5’-Ar-H)，12.386，12.629(各1H，s，2Ar-OH)。
3、紫草素及其酯的金属络和物的制备通法用最少量的丙酮溶解若干克紫草素或紫草素酯；另用最少量的水溶解2倍摩尔量的Cu(Ac)2，Zn(Ac)2，Ca(Ac)2。将两者混合，产生沉淀，过滤，干燥即得金属络合物。
实例(1)乙酰紫草素铜络合物取乙酰紫草素176mg，溶于3ml丙酮中，另取醋酸铜194mg溶于5ml水中，将二者混合，放置，析出沉淀，过滤，少量水洗，干燥，得络合物229mg，收率94.2％。
(2)乙酰紫草素锌络合物取乙酰紫草素236mg，溶于5ml丙酮中，另取醋酸锌263mg溶于5ml水中，将二者混合，放置，析出沉淀，过滤，少量水洗，干燥，得络合物309mg，收率93.8％。
(3)乙酰紫草素钙络合物取乙酰紫草素250mg，溶于5ml丙酮中，另取醋酸钙240mg溶于8ml水中，将二者混合，放置，析出沉淀，过滤，少量水洗，干燥，得络合物298mg，收率96.4％。
4、细胞增殖抑制实验1)、细胞增殖法(H3法)(1)脱脊椎处死小鼠，无菌取其脾脏。将脾脏用玻璃片磨碎，过膜，于1200rpm离心5分钟。弃去上清。沉淀加入红细胞裂解液每个脾脏约1ml，混匀，静置1分钟，加入PBS，离心。再加入PBS，过膜，离心。将所剩细胞洗涤1-2次后，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调成4×106/ml。
(2)于96孔板中每孔加入100μl的细胞悬液，50μl的样品，(对照加50μl的培养液)和50μl的ConA或LPS，总体积200μl。每实验组设3个复孔，另设3孔不加有丝分裂原作为细胞增殖的本底对照。
(3)细胞于含5％CO2的37℃培养箱中培养，培养结束前12小时每孔加入25μl3H-胸腺嘧啶核苷酸。
(4)继续培养至实验结束，然后将培养板冻存于-20℃冰箱；测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta计数仪上读取掺入细胞DNA的3H-胸腺嘧啶核苷酸量，以cpm值代表细胞增殖的情况。
2)、细胞毒法(MTT法)(1)取ICR小鼠脱脊椎处死，消毒后取脾脏。将脾脏用玻璃片磨碎，过膜，于1200rpm离心5分钟。弃去上清。沉淀加入红细胞裂解液2-4ml，混匀，静置1分，加入PBS，离心。再加入PBS，过膜，。将所剩细胞洗涤1-2次后，将细胞浓度调至5×106个/ml。(5×105个/well)(2)于96孔板中每孔加入90μl的细胞悬液，45μl的样品(对照加45μl的培养液)和45μl的ConA或LPS，总体积180μ。每实验组设3个复孔，另设3孔不加有丝分裂原作为细胞增殖的本底对照。
(3)37℃，5％CO2孵箱中培养48小时，结束培养前4-5小时每孔加入MTT 18μl。
(4)培养结束时，加入溶解液90μl，放置6-7小时左右，用酶标仪(Bio-Rad Model550，Japan)于570nm处测OD值。
权利要求
1.一种作为免疫抑制剂的紫草素衍生物及其金属络合物，其特征在于，紫草的衍生物化学结构式III及其金属络合物化学结构式IV为 式III中R代表1-6个碳原子的饱和、不饱和及芳香族的酰基；式IV中R代表氢，1-6个碳原子的饱和、不饱和及芳香族的酰基，M代表金属Cu、Ca、Zn。
2.根据权利要求1所述的作为免疫抑制剂的紫草素衍生物及其金属络合物，其特征是，将紫草素与乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、α-甲基丙烯酸、β-甲基丙烯酸、β，β-二甲基丙烯酸、苯甲酸、对硝基苯甲酸各种有机酸在DCC和DMAP催化下进行缩合，得到以分子式III为代表的紫草素酯类衍生物；将紫草素及其酯类衍生物与Cu++、Zn++、Ca++金属离子络合，得到以分子式IV为代表的络合物。
全文摘要
一种作为免疫抑制剂的紫草素衍生物及其金属络合物，属于药物领域。紫草的衍生物化学结构式III及其金属络合物化学结构式IV为式III中，R代表1－6个碳原子的饱和、不饱和及芳香族的酰基；式IV中，R代表氢，1－6个碳原子的饱和、不饱和及芳香族的酰基，M代表金属Cu、Ca、Zn。本发明具有免疫抑制作用，可用于与人体自身免疫有关的疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化病、红斑狼疮、HIV感染、恶性肿瘤。
文档编号C07F3/04GK1546450SQ20031010905
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月4日 优先权日2003年12月4日
发明者李绍顺, 胡昆 申请人:上海交通大学