一种从红车轴草制备红车轴草异黄酮的制备工艺的制作方法

专利名称：一种从红车轴草制备红车轴草异黄酮的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从红车轴草制备临床药用或功能食品用的红车轴草异黄酮的制备方法。
背景技术：
现代医学研究已证明雌激素代谢紊乱与更年期征候群、骨质疏松症、心血管疾病、老年痴呆、雌激素依赖性肿瘤，如子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等密切相关，雌激素替代疗法对更年期征候群、骨质疏松症、心血管疾病、老年痴呆、前列腺癌、结肠癌的防治有裨益，但可能增加子宫癌、乳腺癌的发病率。大量研究证明，植物雌激素的补充有助于上述疾病的防治，却没有人雌激素替代疗法的弊病。因此，植物雌激素的补充疗法越来越受到人们重视。
红车轴草是一种广泛种植的牧草，又称红三叶草、红花苜蓿。红车轴异黄酮(Isoflavones)是一类含有与人体雌激素结构相似的、非甾体样结构的、对人体雌激素及促性腺激素代谢及表达具有双相调节作用的活性物质。它主要包括“染料木素”、“大豆黄素”、“鹰嘴豆芽素A”、“刺芒柄花素”及其甙类，常被称为“植物雌激素”(Phytoestrogens)。红车轴草是一种少见的同时含有四种有效异黄酮的植物，近年来西方先进国家已推荐将红车轴草总异黄酮制品作为食品补充剂应用于更年期和绝经妇女、骨质疏松患者。
目前从红车轴草制备红车轴异黄酮的制备方法有以下几种1.溶剂法用水、甲醇、含水乙醇等极性溶剂作热提取。水与中、低浓度乙醇适宜于黄酮甙的提取；甲醇与高浓度乙醇则用于甙元的提取。用溶剂法所得的提取物成分复杂，常需将水或醇的流浸膏用不同极性溶剂萃取分离，且提取物异黄酮的含量低，溶剂耗量大。
2.沉淀法用水或醇提取，提取液以醋酸铅或聚乙烯吡咯烷酮沉淀法获取黄酮甙及具有邻二酚羟基或羧基结构的黄酮类成分。此法虽简便，但异黄酮提取不完全，并且制备物中异黄酮的含量较低。
3.水解法将溶剂法或沉淀法获得的粗异黄酮甙以盐酸液加热水解；或极性溶剂热提取溶液直接加酸或酶水解，冷却析出甙元。此法虽简便，但制备物中异黄酮的杂质含量很高。
4.柱层析法 常采用的有聚酰胺、硅胶、氧化铝、葡聚糖凝胶、大孔树脂柱层析法。将溶剂法或沉淀法获得物，以上述填充剂吸附，后以不同极性梯度的多组多元溶剂系统洗脱，浓缩干燥后获取各种不同的异黄酮甙和甙元。此法可以获得含量相当高的异黄酮制品，但分开不同的异黄酮甙及甙元操作比较复杂，生产周期长，成本高，难以大规模工业化生产。
5.制备型高效液相色谱法是将柱层析法获得的粗异黄酮制品通过制备型高效液相色谱以制备高纯度的某一异黄酮成分的单体，而不适用于总异黄酮制品的制备。
植物中异黄酮成分十分复杂，各种异黄酮成分的理化性质差异甚大，难以采用一个通法。目前，红车轴草异黄酮制剂的生产工艺一般是采用溶剂法生产异黄酮含量比较低的粗产品——红车轴草浸膏；采用柱层析法以红车轴草浸膏为原料制备异黄酮含量比较高的制品。另外，植物中具有雌激素样作用的异黄酮成分通常包括异黄酮甙元(素)和异黄酮甙二大类。一般认为活性部位是甙元，其甙类不仅活性低而且难以吸收。植物中异黄酮甙含量相当高，特别是在叶和花中。红车轴草中异黄酮甙的含量超过其总异黄酮的1/3，而红车轴草总异黄酮制品中追寻的目标是高含量的异黄酮甙元。
《制备红车轴草提取物的方法》(专利申请号03118845)，该方法包括下列步骤用甲醇或乙醇提取红车轴草全草；过滤该提取液并浓缩；将浓缩液离心取渣；将药渣用石油醚或正己烷脱脂干燥；用脂肪族的酯类萃取浓缩后，析晶得到提取物a；将萃取后渣用50-90％的醇提取、回收醇，得浓缩液；将所得析晶后母液及浓缩液调pH值＝8-10以内，过聚苯乙烯骨架大孔吸附树脂分离，得提取物b，将提取物a和b合并，用醇再精制，得高含量提取物。该申请提供了一种应用淫羊藿、维生素B↓[1]、B↓[6]及含维生素为组合与红车轴草提取物配伍，用于补肾、补充植物雌激素，从而能更好地预防乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和防治骨质疏松、更年期综合症。

发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种能较简便、高效率地从红车轴草中制取四种有效成分异黄酮刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素A、染料木素、大豆黄素，制备物的总异黄酮含量超过60％，具有很好的药用或功能食品价值的从红车轴草制备红车轴草异黄酮的制备工艺。
本发明目的的实现方式为，一种从红车轴草制备红车轴草异黄酮的制备工艺，其具体工艺流程为1)将晒干储藏药材剁成细段，2)制备红车轴草醇流浸膏红车轴草细段用6～12倍量低碳醇热回流提取，减压回收溶剂并浓缩制得每毫升含生药1克±0.2克的红车轴草流浸膏，
3)醇红车轴草流浸膏的水解处理将流浸膏先用2～5倍量95％乙醇充分搅拌复溶，过滤去沉淀，滤液加矿酸至终浓度为2～5％，热回流水解处理1.5～3小时，水解液过滤去渣，4)将水解处理的滤液加饱和氢氧化钠或氢氧化钾溶液调pH至中性，过滤去渣，5)中性的滤液减压浓缩至原体积1/2左右后，或加高温活化的硅胶粉充分研磨吸附，硅胶用量为溶液量的1/2-1，干燥，再进行后续洗涤及洗脱处理，或加高温活化的活性氧化铝颗粒搅拌1/2～1小时，氧化铝用量为溶液重量的1/2～2倍，再抽滤去滤液，6)吸附物洗涤去杂先以2～5倍量的、温度低于15℃的冷石油醚搅拌洗涤，抽滤去醚，后以5～20倍量的，温度低于15℃的冷水搅拌洗涤抽滤去水，脱去硅胶或活性氧化铝吸附物中的杂质，7)硅胶或活性氧化铝吸附物洗脱洗涤处理后的硅胶吸附物以水饱和醋酸乙酯在50～60℃热搅拌充分洗脱，水饱和醋酸乙酯用量为吸附物重量的2～4倍，氧化铝吸附、络合物以水饱和醋酸乙酯-冰醋酸液(1000∶1)热回流洗脱，水饱和醋酸乙酯用量为吸附物重量的2～4倍，洗脱液过滤、回收溶剂、浓缩、干燥即得红车轴草总异黄酮制备物。
采用本发明，将红车轴草中含量相当高的刺芒柄花甙(Ononin)与印度黄檀甙(Sissoirin)预先水解转化为刺芒柄花素与鹰嘴豆芽素A，可以较简便、高效率地从红车轴草中制取四种有效成分异黄酮——刺芒柄花素(Formonontin)、鹰嘴豆芽素A(Biochanin A)、染料木素(Genistein)、大豆黄素(Daidzein)，制备物的总异黄酮含量超过50％而具有很好的药用或功能食品价值。


图1水解前红车轴草醇流浸膏高效液相色谱分析谱2水解后红车轴草醇流浸膏高效液相色谱分析谱3吸附物冷石油醚洗涤液高效液相色谱4吸附物冷水洗涤液高效液相色谱5红车轴草醇浸膏-水解-硅胶吸附-醋酸乙酯洗脱制品液相色谱6红车轴草醇浸膏-水解-氧化铝吸附-酸化醋酸乙酯洗脱制品液相色谱图具体实施方式
本发明具体工艺流程为1)将晒干储藏药材剁成细段，2)制备红车轴草醇流浸膏红车轴草细段用6～12倍量低碳醇多次热回流提取3小时，2～4次，低碳醇如40～95％乙醇、甲醇、水饱和正丁醇。减压回收溶剂并浓缩制得每毫升含生药1克±0.2克的红车轴草醇流浸膏，红车轴草醇流浸膏中富含刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素A、刺芒柄花甙、印度黄檀甙，并含有少量大豆异黄酮及染料木素。其高效液相色谱分析谱图见图13)红车轴草醇流浸膏的水解处理将红车轴草醇流浸膏先用2～5倍量95％乙醇充分搅拌复溶，过滤去沉淀，滤液中富含刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素A、刺芒柄花甙、印度黄檀甙，并含有少量大豆异黄酮及染料木素，其高效液相色谱分析谱图见图1。滤液加矿酸至终浓度为2～5％，热回流水解处理1.5～3小时，水解液过滤去渣，甲醇、水饱和正丁醇热回流提取浓缩制得的流浸膏加3～5倍量原溶剂搅拌稀释，同上过滤、去沉淀。。滤液加矿酸，如加浓盐酸水解处理。过滤去渣，滤液样品干燥残渣用甲醇溶解高效液相色谱检测证实刺芒柄花甙、印度黄檀甙成分峰基本消失，分别转化为刺芒柄花素与鹰嘴豆芽素A，这从图2可见，4)将水解处理的滤液加饱和氢氧化钠或氢氧化钾溶液调pH至中性，过滤去渣，如若不加碱调pH至中性而直接浓缩、吸附将导致部分有效成分碳化失效，5)硅胶粉或活性氧化铝颗粒吸附处理中性的滤液减压浓缩至原体积1/2左右后，或加高温活化的100～200目硅胶粉充分研磨吸附硅胶用量为溶液量的1/2-1，干燥，再进行后续洗涤及洗脱处理，或加高温活化的活性氧化铝颗粒搅拌1/2～1小时，并静置2小时以上，氧化铝用量为溶液重量的1/2～2倍，充分吸附络合后再抽滤去滤液，采用氧化铝颗粒吸附时部分异黄酮成分将与氧化铝形成络合物，6)硅胶或活性氧化铝吸附物洗涤去杂先以2～5倍量的、温度低于15℃的冷石油醚搅拌洗涤2次，每次1/2～1小时，抽滤去醚，后以5～20倍量的，温度低于15℃的冷水搅拌洗涤2～5次，每次1/2～1小时，抽滤去水，冷石油醚搅拌洗涤可以祛除非极性和低极性杂质，这从图3中可证实其中基本不含所需的6种异黄酮成分，若采用热石油醚搅拌洗涤将丢失部分有效部分异黄酮成分；冷水搅拌洗涤可以祛除大量高极性杂质，图4的水洗涤液高效液相色谱证实其中基本不含所需的6种异黄酮成分；若不进行冷水搅拌洗涤则制备物为高光泽泥膏，吸潮性强难以粉碎并明显降低制品总异黄酮含量。
7)硅胶或活性氧化铝吸附物洗脱洗涤处理后的硅胶吸附物以水饱和醋酸乙酯在50～60℃热搅拌充分洗脱，每次搅拌洗脱时间不少于1/2小时，洗脱次数4～5次，水饱和醋酸乙酯用量为吸附物重量的2～4倍，氧化铝吸附、络合物以水饱和醋酸乙酯-冰醋酸液(1000∶1)热回流洗脱，水饱和醋酸乙酯用量为吸附物重量的2～4倍，每次回流洗脱时间不少于2小时，洗脱液过滤，洗脱次数2～4次，再回收溶剂、浓缩、干燥即得红车轴草总异黄酮制备物。洗脱液含一定量的醋酸有助于解除络合，可明显提高成品率。
紫外分光光度法检测，本发明方法制备的红车轴草总异黄酮含量，以刺芒柄花素计用将超过60％，制备物高效液相色谱检测证实主要含有刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A、并含有少量的大豆异黄酮及染料木素。其中硅胶吸附醋酸乙酯洗脱法成品得率高于活性氧化铝法；而活性氧化铝吸附、络合，酸化醋酸乙酯洗脱法成品中鹰嘴豆芽素A的相对含量较高。两法所得制品的总异黄酮含量相近，这从图5、6可看出。
用本发明方法制备的红车轴草总异黄酮制品的经用14月龄更年期雌性Wistar种大鼠，手术摘除双侧卵巢一周后随机分为阴性对照组、己烯雌酚组、大中小3个剂量的红车轴草总异黄酮组，每组10只，假手术组10只。每天灌胃给药1次，分别给以溶剂、己烯雌酚及不同剂量的红车轴草总异黄酮，连续90天，动物实验结果见表1表1 红车轴草总异黄酮对更年期去势大鼠雌二醇、卵泡生成素、子宫指数的影响

从表中可见本制备物具有良好的植物雌激素作用。
权利要求
1.一种从红车轴草制备红车轴草异黄酮的制备工艺，其特征在于其具体工艺流程为1)将晒干储藏药材剁成细段，2)制备红车轴草醇流浸膏红车轴草细段用6～12倍量低碳醇热回流提取，减压回收溶剂并浓缩制得每毫升含生药1克±0.2克的红车轴草流浸膏，3)醇红车轴草流浸膏的水解处理将流浸膏先用2～5倍量95％乙醇充分搅拌复溶，过滤去沉淀，滤液加矿酸至终浓度为2～5％，热回流水解处理1.5～3小时，水解液过滤去渣，4)将水解处理的滤液加饱和氢氧化钠或氢氧化钾溶液调pH至中性，过滤去渣，5)中性的滤液减压浓缩至原体积1/2左右后，或加高温活化的硅胶粉充分研磨吸附，硅胶用量为溶液量的1/2-1，干燥，再进行后续洗涤及洗脱处理，或加高温活化的活性氧化铝颗粒搅拌1/2～1小时，氧化铝用量为溶液重量的1/2～2倍，再抽滤去滤液，6)吸附物洗涤去杂先以2～5倍量的、温度低于15℃的冷石油醚搅拌洗涤，抽滤去醚，后以5～20倍量的，温度低于15℃的冷水搅拌洗涤抽滤去水，脱去硅胶或活性氧化铝吸附物中的杂质，7)硅胶或活性氧化铝吸附物洗脱洗涤处理后的硅胶吸附物以水饱和醋酸乙酯在50～60℃热搅拌充分洗脱，水饱和醋酸乙酯用量为吸附物重量的2～4倍，氧化铝吸附、络合物以水饱和醋酸乙酯-冰醋酸液(1000∶1)热回流洗脱，水饱和醋酸乙酯用量为吸附物重量的2～4倍，洗脱液过滤、回收溶剂、浓缩、干燥即得红车轴草总异黄酮制备物。
全文摘要
一种从红车轴草制备红车轴草异黄酮的制备工艺，涉及一种从红车轴草制备红车轴草异黄酮的制备方法。其具体工艺流程为先低碳醇热回流提取制备红车轴草醇流浸膏，再用矿酸作水解处理，水解处理的滤液调pH至中性，中性滤液减压浓缩加高温活化的硅胶粉或加高温活化的活性氧化铝吸附，吸附物洗涤去杂后洗脱，洗脱液过滤、回收溶剂、浓缩、干燥即得红车轴草总异黄酮制备物。采用本发明，能将红车轴草中含量相当高的刺芒柄花甙与印度黄檀甙预先水解转化为刺芒柄花素与鹰嘴豆芽素A，可以较简便、高效率地从红车轴草中制取四种有效成分异黄酮刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素A、染料木素、大豆黄素，制备物的总异黄酮含量超过60％具有很好的药用或功能食品价值。
文档编号C07D311/00GK1693306SQ200410013189
公开日2005年11月9日 申请日期2004年5月21日 优先权日2004年5月21日
发明者薛存宽 申请人:薛存宽