专利名称：鲍肽素及其制备方法和在生物医药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种鲍肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)及其制备方法和在生物医药中的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
1、关于老年痴呆老年痴呆是老年人脑循环障碍、脑功能失调的一种表现，是以智力衰退和行为及人格异常变化为特征的一种病症。临床表现主要有记忆力、抽象思维及定向力障碍等。目前该病主要分为阿尔茨海默氏病(Alzheimer disease AD)、血管性痴呆(Vascular dementia VD)及混合性痴呆3型。阿尔茨海默氏病的发病机制目前尚不甚明了；血管性痴呆多是由于长期的慢性缺血或急性的脑卒中所致。我国老年痴呆发病率为2％～18％，65岁以上痴呆发病率为3.9％，其中血管性痴呆占68.5％，居痴呆患者的首位，并呈随年龄增长而上升的趋势。西医对血管性痴呆的治疗，大都以调节大脑代谢药、缓解精神症状药、抗凝血、溶栓药、扩张血管药等对症处理之。近年来，应用中医药防治老年痴呆的进展较快，其优势业已初露端倪，日益受到广泛的重视。
2、关于失眠和神经衰弱脑力劳动过度、精神压力过大、长期紧张疲劳、人体生物钟紊乱、脏腑功能失平衡都可导致失眠和神经衰弱。失眠是最常见的一种睡眠障碍，据初步统计，约有35％以上的人患失眠，其中17％为长期深度失眠，老年人占60％。睡眠不足和神经衰弱，可导致精神萎糜、疲乏无力、头昏脑胀、注意力减低、植物神经功能紊乱，最终缩短生命周期。长期服用化学合成的安眠药、镇静药，有可能削弱记忆能力、诱发老年痴呆、形成药物依赖。
3、关于营养性贫血营养性贫血是常见的营养缺乏病。据WHO资料显示，小儿发病率高达52％，男性成人约为10％，女性20％以上，孕妇约40％。复旦大学儿科医院经城市1042名初生至13岁小儿的调查结果发现3月组发病率13.2％，6月组42.2％，1～2岁组31.8％，2岁以上较低，7～13岁组15.1％；据复旦大学华山医院资料，在非妊娠育龄女工中的Hb＜110g/L发病率为11.39％，妊娠女工中Hb＜100g/L为19.28％。营养性贫血的治疗，常施以口服二价铁剂、注射铁剂，或在膳食中应用铁强化食品，但是，长期进食铁补充剂后是否引起铁中毒的问题尚未得到充分的答案。
4、关于皮肤干褶WHO的健康定义中包含皮肤健康，可见，皮肤健康属于人体健康的一个重要方面。皮肤的健康与否由外观、湿度、弹性、张力、色泽、细度等鉴别。内在睡眠不足、营养缺乏、血液循环不良，外在不注意清洁、护肤，都有可能引发皮肤干褶。外用涂抹化学护肤品，有一定保养作用。但皮肤最外层的表皮中没有血管，其吸收作用有限，皮肤的营养主要来自真皮的血液供应，故一般的外用化学护肤品很难持久、深透；还有，不同的季节、不同的气温、不同的湿度、不同的汗液酸碱度，都有可能对涂抹在皮肤上的化学护肤品产生一些影响。
5、关于海洋生物——鲍鱼海洋是生命的发源地，地球上生命30多亿年的发展史，其中85％以上的时间是完全在海洋中度过的。海洋与陆地相比具有很大的特殊性，尤其是深海的强大压力和黑暗无光，使海洋动物、细菌等在外部和内部形态上的多样性和特殊性十分明显。这些特征和活性成份，陆栖生物是无法完全替代的。
鲍鱼为驰名海珍品，早在西汉初年《黄帝内经》医书中，就有用海洋生物鲍鱼汁治血枯病的记载。有学者(彭汶铎等.柳珊瑚酸及其衍生物对小鼠学习和记忆的影响.中国药理学报，1996，17<3>215-218)从海南柳珊瑚中分离到一种类似中枢拟胆碱化学药的成份——柳珊瑚酸，后者主要用于治疗阿尔茨海默氏病(AD)。对于位居我国老年痴呆发病率首位的血管性痴呆治疗，检索尚未见任何有关海洋生物的有效应用；对于鲍肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)及其制备方法和在生物医药中应用，本发明申请人在检索过程中及经卫生部上海市医学科技查新委员会国内外检索报告(报告书编号2004126)，也未发现任何有关报道。本发明，不采用依化学合成药结构去寻找海洋生物替代品的模式操作，而寻径从医到药、从人到物、从整体到局部、从已有记载的经典方剂中去高通量筛选有效成分的中药制药思路，并为我们制备合成鲍肽素及其片段提供依据。
发明内容
本发明的目的就是公开一种具有改善大脑和皮肤血液循环、增强学习记忆能力、提高睡眠质量、缓解神经衰弱、防治皮肤干褶作用的鲍肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)，同时公开其制备方法和在防治老年痴呆、记忆减退、长期失眠、神经衰弱、营养性贫血、皮肤干褶的药物和保健食品(食品)、化妆品中的应用。
鲍肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)，是本发明人首次从海洋生物鲍鱼中提取分离的一种单链多肽，分子量＜105。其一级结构中组成为丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、色氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、缬氨酸、胱氨酸、天冬氨酸。
本发明是通过如下的技术方案来实现的。将活体鲍鱼放入净水暂养池，使其排出体内排泄物后移至流水池，剥去外壳，取出整个鲍鱼内脏团组织，弃其水份，放入立式粉碎机中粉碎后，再放入组织匀浆器中研磨成匀浆，将内脏团匀浆置于容器中，逐次加入适量医用乙醇、苯甲酸钠、硫酸铝钾，经混合、搅拌再加入适量盐酸，致pH值为4,4000r/min离心15min，去上清，沉淀部分加入适量医用乙醇搅拌，滤除乙醇残液，置于玻璃干燥器中，真空干燥后即得。分子量测定用十二烷基磺酸纳一聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法，氨基酸测定用高速氨基酸自动分析仪，纯度测定用高效液相色谱(HPLC)法。
用本发明制成的生物医药产品，能提高拟血管性痴呆大鼠的学习记忆能力和血红蛋白含量，改善右利手老年血管性痴呆患者的体征，减缓中老年人的神经衰弱和失眠状态，使长白猪皮肤代谢活跃、弹性纤维增加。
具体实施例方式
下面结合实例对本发明作进一步的描述。取活体鲍鱼，放入净水暂养池，使其排出体内排泄物，再移至流水池，剥去鲍鱼外壳，取出整个鲍鱼内脏团组织，弃其水份，放入立式粉碎机中粉碎后，再放入组织匀浆器中研磨成匀浆，将内脏团匀浆置于容器中，逐次加入适量医用乙醇、20％苯甲酸钠、10％硫酸铝钾，配制比例为鲍鱼内脏团匀浆∶乙醇∶20％苯甲酸钠∶10％硫酸铝钾＝45∶35∶0.8∶1.2，经混合、搅拌再加入适量盐酸，致pH值为4,4000r/min离心15min，去除上清，沉淀部分加入适量医用乙醇搅拌，经清洗消毒后再过滤除去乙醇残液，放入干燥器中，经真空冷冻干燥器真空干燥后即得到鲍鱼鲍肽素干粉，于无菌操作室中将该干粉按剂量装入无菌容器中密封备用。
1、拟血管性痴呆大鼠实验洁净级雄性SD大鼠，体重321±29.43g，随机分为4组。第1、2、3组为造模+鲍肽素组(小剂量、中剂量、大剂量组)，总数为54只(以造模2/3成功率计)；第4组12只，为空白对照组。于造模后第60d处死。
模型制备实验组，10％水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉，卧位固定在带电热痰的手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，用1号丝线结扎，切口撒青霉素粉适量，缝合切口。空白对照组麻醉、手术过程与实验组同，不结扎颈总动脉。整个手术过程用肛表观察肛温，保持肛温在37+0.5℃。
行为检测各组在术后60d进行Morris水迷宫痴呆检测。定位航行检测连续训练4.5d，分am和pm时段，分别记录为1am、1pm，2am、2pm，3am、3pm，4am、4pm，5am，每个时段再各分为4次。每次均随机顺序从不同等分水池的4个起点将大白鼠面向池壁投入水池中，记录大白鼠从水中找到并爬上平台的时间，该时间定义为逃避潜伏期。让大白鼠在平台上休息100s后再进行下一次检测，如果在120s内大白鼠仍未找到平台，则将其引导到平台，此时逃避潜伏期记为最高值120s。每一时间段内4次逃避潜伏期的平均值即为这时段的成绩。空间探索检测第5d的pm，撤去平台，在水池随机任意点将大白鼠投入水池中，记录大白鼠在2min内穿过原先平台所在位置的次数。
痴呆标准以对照组逃避潜伏期均值为参照，计算实验组大白鼠各鼠各时段的平均逃避潜伏期值与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期值的比值，此比值＞35％定为痴呆。
给药途径及方法灌胃给药，分别为1.0ml/100g、1.5ml/100g、2.0ml/100g，每日2次。
学习与记忆能力检测采用Y型迷宫法测试。Y型迷宫为三等分120°辐射封闭式三条箱臂。箱臂底板为铜栅，铜栅通电后可产生0.6-0.8mA强度的电流。三条箱臂近端相通，每条箱臂远端设有信号灯，当某一箱臂信号灯亮时，该箱臂的铜栅就不通电，因此，信号灯亮的箱臂为安全区。安全区箱臂随机更替。经学习3分钟后测试，若大鼠直接进入安全区记5分，反之不记分。结果见表1。
血液检测指标为红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(Hb)。结果见表2。
表1. 血液检测结果
表2. Y型迷宫法测试结果
2、右利手老年血管性痴呆患者临床观察我们持续动态观察了鲍肽素对31例右利手老年血管性痴呆患者的疗效，每日1剂，8.5ml/kg，分3次冲服，90d为1疗程，分别在0d、30d、60d、90d行基础局部脑血流灌注显像与认知激活显像，在0d、90d行认知能力筛查量表(CASI)和跨文化认知检查(CCCE)等认知评定。结果显示，治疗组基础局部脑血流灌注显像与认知激活显像均示额叶、颞叶、基底节等脑区血流低灌注有所改善，与对照组(28例)相比60d差异有显著性意义(P＜0.05)，90d差异有极显著性意义(P＜0.01)，90d的CASI和CCCE等积分均有所改善，与自身相比0d差异有极显著性意义(P＜0.01)，与对照组相比90d差异亦有极显著性意义(P＜0.01)。
3、中老年人神经衰弱和失眠状态临床观察我们陆续观察了鲍肽素对29例临床诊断为神经衰弱患者的疗效，其中16例为治疗组，每日1剂，6.5ml/kg，分3次冲服，60d为1疗程，13例使用淀粉安慰剂作为对照组。治疗组年龄49.53±4.75岁，其中9名为女性，6名为男性，对照组年龄45.91±7.36岁，其中8名为女性，5名为男性。在治疗周期始末分别填写主观问卷和用注意力测试仪测试注意力。结果显示，与对照组相比，治疗组的精神萎糜、疲乏无力、困倦思睡、头昏脑胀症状及植物神经功能紊乱症状等均有所减轻，而注意力测试评分的客观指标明显提高。
4、长白猪皮肤实验在长白公猪皮肤上做对比实验。20-24天龄长白公猪，体重43.84±6.73kg，分外敷+内服组、外敷组、内服组、空白对照组4组。取鲍肽素干粉与适量滑石粉、氧化锌、硅酸铝按5∶3∶1∶1比例调和拌匀，空白对照组不放鲍肽素干粉，每天外敷后维持30分钟，连续30天，内服10ml/kg，每日2次。常规病理切片、染色，光学显微镜下，可见外敷+内服组长白猪表皮底层的基底细胞代谢活跃，真皮的毛细血管与胶原纤维分布广泛、弹力纤维缠绕增多，与空白对照组相比差异有极显著意义，与外敷组和内服组相比差异有显著意义。
权利要求
1.鲍肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)，其特征是从海洋生物鲍鱼内脏团中分离得到的一种单链多肽，分子量＜105。其一级结构中组成为丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、色氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、缬氨酸、胱氨酸、天冬氨酸。
2.鲍肽素的制备方法，其特征是取活体鲍鱼，流水清洗，剥去外壳，将鲍鱼内脏团组织弃水份后置粉碎机中粉碎、匀浆器中研磨，将匀浆置容器中，逐次加入适量医用乙醇、苯甲酸钠、硫酸铝钾，经混合、搅拌再加入适量盐酸，致pH值为4，4000r/min离心15min，去上清，沉淀部分加入适量医用乙醇搅拌，去乙醇残液，真空干燥后即得。
3.鲍肽素作为制备防治老年痴呆、记忆减退、长期失眠、神经衰弱、营养性贫血、皮肤干褶的药物和保健食品(食品)、化妆品的应用。
全文摘要
本发明属生物医药领域。鲍肽素(PFH)是从鲍鱼内脏团中分离得到的一种单链多肽，分子量＜10
文档编号C07K14/08GK1690074SQ20041001779
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者万平, 万柔, 赖小俭 申请人:万平, 万柔, 赖小俭