专利名称：一种紫杉醇的制备方法
技术领域：
本发明涉及大规模制备紫杉醇的方法，特别提供了一种前处理除杂工艺顺序为提取→固相萃取→联合树脂层析的方法。
背景技术：
紫杉醇通过其稳定微管的独特机理发挥抗癌作用。目前，在临床上广泛用于卵巢癌、乳腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、食道癌、头颈癌、抗化疗白血病等多种癌症的化疗，具有确切的疗效。正如美国NCI所预测，紫杉醇是20世纪发现的最重要的抗癌新药。作为唯一促进微管聚合的抗癌新药，紫杉醇产品Taxol和Taxotere已成为主要的抗癌药物之一。
制备紫杉醇的方法包括(1)、自紫杉或其它可再生的紫杉属植物中提取Taxol；(2)、自其它天然紫杉烷(10-去乙酰基巴卡亭III)化合物半合成Taxol或Taxotere(10-去乙酰基巴卡亭III仍自紫杉属植物中分离获得)；(3)、从头全合成。目前为止，仅仅提取和半合成方法实现了商业化，因紫杉醇结构复杂，已报道的全合成方法路线长、收率低、成本极高，无法达到商业化的要求。
制备紫杉醇的植物资源及原料来源包括(1)天然资源；(2)人工栽培；(3)植物器官、组织或细胞的培养；(4)微生物发酵。植物细胞培养和微生物发酵还处于研究阶段，目前尚未实现规模化工业生产，因此，现有资源还无法摆脱依赖天然资源的现状。全世界约有11种红豆杉，主要分布在北半球温带和亚热带。我国有4个品系和1个变种。除浆果红豆杉、加拿大红豆杉和杂交品种的曼地亚红豆杉外，其余红豆杉生长缓慢，需100多年才能成树，并且资源极少，属不可再生资源。紫杉醇在该属植物的树皮中含量为0.0001～0.069％，平均0.015％，收率0.01％。每提取生产1公斤紫杉醇需10吨紫杉树皮，需砍伐3000棵成树。目前全球每年紫杉醇需求量为400公斤左右，即便将全部的天然资源采伐，也只能满足短期的需要。
紫杉醇资源珍贵，价格居高难下，制备的收率成为制药紫杉醇成本的关键因素。在天然原料中紫杉醇的含量低、紫杉烷系列化合物共存，并含有大量的植物腊、色素和树胶等杂质，因而，紫杉醇的分离难度极高。目前常用的工艺过程是将液～液萃取、色谱分离和重结晶手段有机结合，并反复多次采用色谱手段。萃取和重结晶是紫杉醇收率难以提高的制约因素，色谱过程中溶剂消耗大也使其加工成本居高难下。
紫杉醇的制备过程一般为浸出(或超声或微波提取)→己烷脱脂→二氯甲烷或氯仿萃取得粗提物→2～3次工业色谱粗分离→结晶→溴化(或氧化)→正相色谱精分离→重结晶得产品。在此基础上发展了许多改进工艺，包括固相萃取和专用反相柱的使用以及省去溴化过程等。生产紫杉醇的一个最关键技术是工业色谱技术。工业色谱(industrial preparativechromatography or process chromatography，IPC or PC)是以公斤为计量单位的规模制备技术，它是现有大规模制备技术中，人类掌握的分离能力最高的规模制备技术。工业色谱的巨大潜力在于对目标成分与相邻成分间的分离能力。但是其致命的缺陷是被分离体系中，无需色谱就能分离的杂质亦会竞争吸附位点、增加传质阻力，大幅度降低色谱分离能力甚至导致不可分离。因此，在进行色谱分离前，使用用萃取、沉淀和结晶等传统技术最大限度地除去杂质，是成功地进行色谱制备分离的基础。
Wani(J.Am.Chem.Soc.，1971932325-2327)和Miller(J.Org.Chem.，1981；461469)等报道将醇提物溶于最少量的醇、丙酮或乙晴水溶液，用己烷、石油醚或轻汽油等非极性溶剂萃取脱酯后，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取水相中紫杉醇，极性杂质则残留于水相中被除去。
美国专利USP56544448公开了用最少量的醇、丙酮或乙晴等极性溶剂溶解醇提物，通过上述溶液中添加己烷、石油醚或轻汽油等非极性溶剂将紫杉醇沉淀析出，非极性杂质则残留于母液中被除去的操作过程。
中国专利CN1342155A和美国专利USP5279949、5475120、5670673以及USP6136989公开了用最少量的醇、丙酮或乙晴等极性溶剂溶解醇提物，通过在上述溶液中添加水使紫杉醇沉淀析出，极性杂质则残留于母液中被除去的工艺过程。
中国专利CN1356992A(USP6452024)公开了用最少量的醇、丙酮或乙晴等极性溶剂溶解醇提物，首先向溶液中添加碱性水溶液(乙酸钠、乙酸钾或三(羟甲基)氨基甲烷)或酸性水溶液(盐酸、乙酸或柠檬酸)，将紫杉醇沉淀析出，酸性或碱性杂质则残留于母液中与紫杉醇分离。
中国专利CN1377882A和美国专利USP6469186公开了用碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、三乙胺或Tris等碱性水液洗涤上述二氯甲烷相(或乙酸乙酯相)，以进一步除去色素等杂质。
Nair(USP5279949)、Hong(WO96/34973)和Kasitu(USP6469186)等报道了活性碳脱色的使用方法。
Senilh(J.Nat.Prod.，1984，47131-137)、Rao(USP5380916、5475120、5670673)、Nair(USP5478736)Liu(USP6229027)和Kasitu(USP6469186)等报道了快速色谱(Flash Chromatography)除去杂质的方法。
上述除杂法中，萃取法和沉淀法除去杂质的能力均不彻底，需反复多次操作，常伴随相当量的紫杉醇的损失；碱洗涤法操作繁琐，溶剂损耗大，同时，紫杉醇在碱性条件下不稳定，易因水解造成紫杉醇的损失；活性碳脱色和快速色谱除杂法，因对紫杉醇具有不可逆吸附的特点，也会造成一定量的紫杉醇的损失。
张志强(高等化学工程学报，1999，13(2)161-164)和元进英(离子交换与吸附，1994，10(6)543-545)等报道的离子交换树脂的脱色作用尚不具备使用水平，所使用溶剂体系统不适合规模生产。而Liu(USP5969165、6229027)、Li(CN96102442.9)、朱法科(CN1442413A)和刘开禄(CN1377882A)公开的多孔有机高分子聚合物的反相色谱法，其目的在于取代常规正相色谱，进行紫杉醇的分离。
因而，紫杉醇的生产的迫切需要一个除杂彻底、紫杉醇收率高，并且操作简便、消耗低前处理除杂方法。
发明的技术内容为了提高紫杉醇的回收率，并充分发挥续后色谱的分离能力，本发明的目的在于提供一种低成本、简单、方便、大批量地制备紫杉醇的前处理除杂方法。
本发明提供了一种紫杉醇的制备方法，过程为
——提取，以红豆杉为原料获得含有紫杉醇的提取物；——除杂，除去提取物中的大量杂质；——色谱分离，其特征在于所述的除杂过程为——固相萃取，固相萃取除去脂溶性杂质，同时将紫杉烷化合物分离为紫杉醇/三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III和7-木糖紫杉醇三组；——树脂联用层析，吸附树脂除去极性杂质，离子交换树脂除去色素等负电荷杂质和/或正电荷杂质，同时，将目标紫杉烷分为紫杉醇/三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III和7-木糖-紫杉醇三个部分。
本发明紫杉醇的制备方法中，树脂联用是指大孔吸附树脂与阴离子交换树脂和/和阳离子交换树脂联用。三种树脂独立装柱，串联使用，串联顺序为大孔吸附树脂→阴离子交换树脂→阳离子交换树脂、大孔吸附树脂→阳离子交换树脂→阴离子交换树脂或大孔吸附树脂→阴离子交换树脂。若将离子交换树脂置于吸附树脂之前，两者之间需增加一步浓缩工序，带来诸多不利。
本发明紫杉醇的制备方法中，大孔吸附树脂指以苯乙烯-二乙烯苯共聚物(styrene-divinylbenzene copolymers)或聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)等有机聚合物为材料的吸附树脂。如南开大学化工厂生产的D3520、D4006、D4020、H103、H107和X-5，以及美国Amberlite XAD系列中非极性吸附树脂。吸附树脂用量为红豆杉树皮、枝叶重的0.5～0.8倍(w/w)，醇提浸膏重的1～1.5倍(w/w)。
本发明紫杉醇的制备方法中，阴离子交换树脂为碱性苯乙烯系列阴离子交换树脂。如南开大学化工厂生产的201、D201、D201GF、D290、D296、D280、D284、D261、D262、D301、D370和D372，美国Amberlite IRA系列和Dowex，日本Diaion SA，俄国AB-17，以及法国Duolite等。阴离子交换树脂用量为红豆杉树皮、枝叶重的0.3～0.5倍(w/w)，醇提浸膏重的0.5～1倍(w/w)。
本发明紫杉醇的制备方法中，阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系列阳离子交换树脂。如南开大学化工厂生产的001、002、003、004、D072、D061、D001-CC、D001-SS和NKC-9，美国Amberlite IR、Amberlite ER、Amberlyste和Dowex 50，日本Diaion，以及俄KY等。用量为红豆杉树皮、枝叶重的0.3～0.5倍(w/w)，醇提浸膏重的0.5～1倍(w/w)。
本发明紫杉醇的制备方法中，上柱样品为经固相固相萃取后的粉末样品。洗脱液为有机溶剂水溶液，浓度范围为20～100％(V/V)。有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、乙腈之一种或其混合物，以丙酮为佳。洗脱方式可以是梯度洗脱，也可以是等度分段洗脱。等度分段洗脱时，以10％的浓度差为一段，每段洗脱体积为2～3个柱体积。洗脱液流速为1～2个柱体积/小时。如采用40％的丙酮溶液3个柱体积→50％的丙酮溶液3个柱体积→60％的丙酮溶液3个柱体积→90％的丙酮溶液3个柱体积进行等度分段洗脱。
本发明紫杉醇的制备方法中，固相萃取中固体样品的制备过程为红豆杉醇提液浓缩至原体积的1/5～1/3后，与适量硅藻土[红豆杉树皮、枝叶重的0.5～0.8倍(w/w)]混匀，或红豆杉醇提浸膏溶于最少量溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷或氯仿)后与硅藻土[浸膏2～4倍(w/w)]混匀，经减压干燥制成粉末。
本发明紫杉醇的制备方法中，固相萃取的洗脱液为不同极性的有机溶剂。不同极性的有机溶剂通过非极性溶剂(己烷、石油醚、轻汽油、氯仿、乙酸乙酯或其混合液等)与适量的极性溶剂(如氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇或其混合液等)混合配制。极性溶剂用量为混合溶剂的溶剂量的0％～100％。洗脱液用量为7～18个柱床积。
本发明紫杉醇的制备方法中，固相萃取的方式可以是柱层析洗脱，也可以是固液萃取。柱层析洗脱可以是梯度洗脱，也可以是等度分段洗脱。柱层析洗脱具有设备简单、操作方便、溶剂用量少和洗脱彻底的优势。如采用己烷/乙酸乙酯(70/30)3个柱体积→己烷/乙酸乙酯(65/35)3个柱体积→己烷/乙酸乙酯(60/40)3个柱体积→乙酸乙酯(70/30)3个柱体积→己烷/甲醇(96/4)3个柱体积→丙酮3个柱体积进行等度分段洗脱。
本发明紫杉醇的制备方法中，树脂联用层析在有效除去杂质的同时，将目标紫杉烷分为紫杉醇/三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III和7-木糖-紫杉醇A/B/C三个部分，简化了其纯化工艺并降低了其续后的分离费用。
本发明紫杉醇的制备方法中，吸附树脂的作用是取代传统的二氯甲烷萃取法除去极性杂质，其除杂能力、溶剂消耗和紫杉醇损失均优于二氯甲烷萃取法；离子交换树脂的作用是取代酸碱沉淀法或碱液洗涤法除去色素等负电荷杂质和正电荷杂质，其除杂能力、溶剂消耗和紫杉醇损失均优于酸碱沉淀法或碱液洗涤法；固相萃取的主要作用在于传统的己烷萃取法除去脂溶性杂质，保护树脂不受污染、延长树脂受命。固相萃取同时还具有吸附相色谱的作用，将紫杉烷化合物分离为紫杉醇/三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III和7-木糖紫杉醇三组，减轻了后续色谱的负荷。固相萃取的除杂能力、溶剂消耗和紫杉醇损失同样优于己烷萃取。
本发明紫杉醇的制备方法具有如下优点1、固相萃取与树脂法联用具有处理量大、去除杂质彻底、回收率高、溶剂消耗低、操作简便以及所有样品制备用载体、树脂和色谱填料均可再生使用等优势，基本克服了传统方法(萃取法、沉淀法、碱洗涤法、活性碳脱色和快速色谱除杂法)中紫杉醇的大量损失；2、避免了萃取法、沉淀法和碱洗涤法杂质去除不彻底，需反复多次、操作繁琐、溶剂损耗大等工艺弊端；3、10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III的回收工艺大为简化、收率高；4、极大地提高了后续色谱分离能力、降低了其负荷和费用。
本发明为大批量制备紫杉醇提供了一种简单方便、回收率高、成本低的方法。使用本方法制备的紫杉醇含量≥99.5％，目标紫杉烷总收率≥80％，紫杉醇产率≥0.025％，总产率(紫杉烷+10-去乙酰巴卡亭III)≥0.035％。
具体实施例方式实施例1树脂处理丙酮浸泡3天(每天换液一次)→取出树悬浮于乙醇中、装柱→按每小时3个柱体积的流速乙醇洗柱洗至流出液清澈→蒸馏水洗净乙醇→浸泡于70％乙醇中→3天后用水洗净乙醇即可使用。对于离子交换树脂还需进一步的处理，阴离子交换树脂的处理程序为3个柱体积的2N盐酸洗柱→水洗至中性→3个柱体积的2N HaOH洗柱→水洗至中性；阳离子交换树脂的处理程序为3个柱体积2N的HaOH洗柱柱→水洗至中性→3个柱体积2N的盐酸洗→水洗至中性。各种溶液的洗脱速度为每小时候1.5～2.5个柱体积。
实施例2树脂再生吸附树脂的再生3个柱体积的95％乙醇洗柱→蒸馏水洗净乙醇。
离子交换树脂的再生与相应的树脂处理相同。
本发明实施例中，各种溶液的洗脱速度为每小时候1.5～2.5个柱体积，洗脱液体积为3个柱体积。
实施例3提取、样品制备红豆杉树皮(或茎叶)→干燥、粉碎过筛(40目，100公斤)→甲醇提取(室温～60℃、500L×1、150L×3、24h×4)→≤45℃减压浓缩至200L→加入硅藻土(30kg)混匀→≤45℃真空靶式干燥→固体粉末(51.5kg)实施例4固相萃取固体粉末(51.5kg)→上不锈钢柱(φ500×1000)→己烷/乙酸乙酯(70/30)3个柱体积→己烷/乙酸乙酯(65/35)3个柱体积→己烷/乙酸乙酯(60/40)3个柱体积→乙酸乙酯(70/30)3个柱体积→己烷/甲醇(96/4)3个柱体积→丙酮3个柱体积(流速1.0L/min)。紫杉醇/三尖杉宁碱段→≤45℃真空分部浓缩回收溶剂→残留物A(1.8公斤)。
实施例4树脂联用层析残留物A(1.8公斤)→甲醇溶解→加入硅藻土(5kg)混匀→≤45℃真空干燥→固体粉末→上于D4020柱头(φ300×1500)→丙酮水溶液分步洗脱(20％3个柱体积，30％、40％、50％、60％和70％各2个柱体积，90％1个柱体积，流速流速1.0L/min)→20％段洗脱液由D4020柱直接排入溶剂回收槽，其余各段直接流经→D280柱(φ200×1500)→D4020柱(φ200×1500)→分段收集(每段5～10L)→分部合并(经TLC和HPL检测后按紫杉醇/三尖杉宁碱和10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III二个部分合并)→≤45℃真空分部浓缩回收丙酮→水相4℃过夜→过滤收集沉淀→真空干燥→沉淀A(131g，主要含紫杉醇/三尖杉宁碱)，沉淀B(152g，主要含10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III)。
实施例5紫杉醇/三尖杉宁碱的纯化沉淀A(113g)→溶于最少量丙酮→加入硅藻土(250g)混匀→减压干燥→粉末样品→上中性Al2O3柱(Al2O34.5kg，φ80×1500)→0.0％～5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱(流速50～100mL/min)→分段收集(每段1～1.5L)→分部合并(经TLC和HPL检测后按紫杉醇/三尖杉宁碱和10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III两个部分合并)→紫杉醇/三尖杉宁碱部分→≤45℃真空分部浓缩回收丙酮→获残余物(35.3g，含紫杉醇75％、三尖杉宁碱14％)。
实施例6溴化及紫杉醇的分离获残余物(35.3g)→溶于180mL氯仿中→加入液溴0.9mL→0℃避光搅拌反应5min→上中性SiO2柱(SiO21.6kg，φ80×800)→四氯化碳洗脱(3L)→1∶1的己烷/乙酸乙酯混合液洗脱(流速30～50mL/min)→分段收集(每段0.5～1.0L)→分部合并(经TLC和HPL检测后按紫杉醇和溴化三尖杉宁碱两个部分合并)→紫杉醇部分→≤45℃真空分部浓缩回收溶剂→获残余物(23.75g)。
实施例7紫杉醇的结晶、干燥获残余物(23.75g)→40℃溶于300mL丙酮中→搅拌下滴加40℃蒸馏水至出现混浊→静置至室温→4℃结晶24小时→过滤回收结晶→真空干燥→紫杉醇产品(20.5g)。
权利要求
1.一种紫杉醇的制备方法，过程为——提取，以红豆杉为原料获得含有紫杉醇的提取物；——除杂，除去提取物中的大量杂质；——色谱分离，其特征在于所述的除杂过程为——固相萃取，固相萃取除去脂溶性杂质，同时将紫杉烷化合物分离为紫杉醇/三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III和7-木糖紫杉醇三组；——树脂联用层析，吸附树脂除去极性杂质，离子交换树脂除去色素等负电荷杂质和/或正电荷杂质，同时，将目标紫杉烷分为紫杉醇/三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III和7-木糖-紫杉醇三个部分。
2.按照权利要求1所述紫杉醇的制备方法，其特征在于所述的树脂联用是指大孔吸附树脂与阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂单独装柱，串联使用；串联顺序为大孔吸附树脂→阴离子交换树脂→阳离子交换树脂、大孔吸附树脂→阳离子交换树脂→阴离子交换树脂、大孔吸附树脂→阴离子交换树脂或大孔吸附树脂→阳离子交换树脂。
3.按照权利要求2所述树脂联用制备紫杉醇的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂指以苯乙烯-二乙烯苯共聚物或聚甲基丙烯酸酯有机聚合物为材料的吸附树脂；吸附树脂用量为红豆杉树皮、枝叶重的0.5～0.8倍w/w，醇提浸膏重的1～1.5倍w/w；所述的阴离子交换树脂为碱性苯乙烯系列阴离子交换树脂；阴离子交换树脂用量为红豆杉树皮、枝叶重的0.3～0.5倍w/w，醇提浸膏重的0.5～1倍w/w；所述的阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系列阳离子交换树脂；阳离子交换树脂用量为红豆杉树皮、枝叶重的0.3～0.5倍w/w，醇提浸膏重的0.5～1倍w/w。
4.按照权利要求2所述紫杉醇的制备方法，其特征在于所述树脂联用层析过程中，洗脱液为有机溶剂水溶液，浓度范围为20～100％V/V；有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、乙腈之一种或其混合物；洗脱方式为梯度洗脱，或者是等度分段洗脱。
5.按照权利要求4所述紫杉醇的制备方法，其特征在于所述等度分段洗脱时，以10％的浓度差为一个间隔段，每段的洗脱体积为2～3个柱体积，洗脱液流速为1～2个柱体积/小时。
6.按照权利要求1所述紫杉醇的制备方法，其特征在于所述固相萃取过程中，固体样品的制备过程为——红豆杉醇提液浓缩至原体积的1/5～1/3后，与红豆杉树皮、枝叶重0.5～0.8倍w/w的硅藻土混匀；或红豆杉醇提浸膏溶于最少量的甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷或氯仿溶剂后与浸膏2～4倍w/w的硅藻土混匀；——经减压干燥制成粉末。
7.按照权利要求1所述紫杉醇的制备方法，其特征在于所述固相萃取中，洗脱液为非极性溶剂与极性溶剂的混合溶剂，极性溶剂用量占溶剂量的0％～100％；洗脱液用量为7～18个柱床积。
8.按照权利要求7所述紫杉醇的制备方法，其特征在于所述非极性溶剂选自己烷、石油醚、轻汽油、氯仿、乙酸乙酯之一种或多种，极性溶剂选自氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇之一种或多种。
9.按照权利要求1所述紫杉醇的制备方法，其特征在于所述固相萃取的方式是柱层析洗脱，或者是固液萃取。
10.按照权利要求8所述紫杉醇的制备方法，其特征在于所述柱层析洗脱是梯度洗脱，或者是等度分段洗脱。
全文摘要
一种紫杉醇的制备方法，过程为提取，除杂，色谱分离，其特征在于除杂过程为固相萃取，固相萃取除去脂溶性杂质，同时将紫杉烷化合物分离为紫杉醇/三尖杉宁碱、10－去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III和7－木糖紫杉醇三组；树脂联用层析，吸附树脂除去极性杂质，离子交换树脂除去色素等负电荷杂质和/或正电荷杂质，同时，将目标紫杉烷分为紫杉醇/三尖杉宁碱、10－去乙酰巴卡亭III/巴卡亭III和7－木糖－紫杉醇三个部分。本发明为大批量制备紫杉醇提供了一种简单方便、回收率高、成本低的方法。使用本方法制备的紫杉醇含量≥99.5％，目标紫杉烷总收率≥80％，紫杉醇产率≥0.025％，总产率(紫杉烷+10－去乙酰巴卡亭III)≥0.035％。
文档编号C07D305/14GK1670018SQ20041002141
公开日2005年9月21日 申请日期2004年3月18日 优先权日2004年3月18日
发明者杨凌, 何克江, 杨义 申请人:中国科学院大连化学物理研究所