专利名称：小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种小麦高分子量麦谷蛋白亚基特异性多克隆抗体的制备方法及其用途。
2.背景技术小麦高分子量麦谷蛋白(High Molecular Weight Glutenin)是小麦的一类重要的储藏蛋白。亚基的组成对小麦面包加工品质有非常重要的影响，不同亚基或亚基组合对面包加工品质的贡献大小不同(Payne等，1983，Cereal Res Commun，1983，1129-35；Shewery等，1992，J Cereal Sci，1992，15105-120)。Payne品质评分标准已经在国际上通用，其中5+10亚基的评分最高，它们对面包加工品质的贡献最大并已经得到公认。宋健民等(2003，作物学报，29(6)829-834)测定了233份小麦面粉样品的高分子量麦谷蛋白亚基含量、Zeleny沉降值和谷蛋白大聚体(GMP)含量、并根据SDS-PAGE结果计算了其Payne亚基品质评分。结果表明，中国小麦HMW-GS对品质的影响与其他国家和地区有所差异，对Payne品质评分标准进行了调整，在所有的亚基组合中，13+16亚基的GS品质评分、沉降值评分均是最高。基因工程技术广泛用于作物的品质改良。因此，小麦品质相关基因的克隆和利用是改良小麦品质的重要措施。目前已经从小麦和近缘物种中克隆了若干品质相关基因。免疫化学技术逐渐应用到了小麦品质改良中。使用针对高分子量麦谷蛋白亚基的特异的抗体作探针，无论对于优质品种的选育、从cDNA文库中筛选高分子量麦谷蛋白基因、高分子量麦谷蛋白亚基基因的原核及真核表达、转基因植物的筛选等都是一个有效的技术。已经有针对小麦高分子量麦谷蛋白亚基制备的多克隆和单克隆抗体的报道(Festenstein等，Planta，1985，164，135-141；宋希云等，作物学报，1997，23(5)522-528；Mills等，JAgric Food Chem，2000，48611-617)，并有一个“小麦高分子量麦谷蛋白亚基单克隆抗体及其杂交瘤细胞系”申请中国专利(申请号01144781.8)。在以往的报道中，作为抗原的小麦高分子量麦谷蛋白亚基的收集往往要经过复杂的步骤，如电洗脱、透析、或用KCl溶液处理凝胶等。而且单克隆抗体的制备存在生产周期长、成本较高，而且有些杂交瘤细胞系分泌抗体很不稳定，培养一定时期后，分泌抗体的能力就丢失的缺陷。另外，小麦高分子量麦谷蛋白亚基之间具有极高的同源性，很难在某一亚基找到特定的抗原决定簇。
3.发明内容本发明的目的是为在短期内快速、经济、简便地制备大量的针对某一亚基的特异性抗体，提供一种小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的制备方法及其用途。
本发明是通过以下方法实现的。
小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)作为抗原的小麦高分子量麦谷蛋白13和16亚基经SDS-PAGE电泳进行分离，切割含有抗原的凝胶；(2)将凝胶与佐剂混合均匀后，采取皮下多点注射法免疫新西兰纯种家兔；(3)选用Western印迹法检测抗体的使用浓度；(4)抗血清的收集，Western印迹法抗体效价的检测。
上述小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的制备方法，其特征是步骤(1)中的切割含有抗原的凝胶，是先将凝胶两侧的部分凝胶切下进行染色，然后与未经染色的凝胶拼接，对比切挖；在切凝胶两侧的凝胶条时，采用的是锯齿状切割线。步骤(2)动物免疫时，动物采用雄性的新西兰纯种家兔。
上述方法制备的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的用途，其特征是用作探针，对不同小麦品种高分子量麦谷蛋白亚基进行鉴定，筛选出含1Bx13和1By16高分子量麦谷蛋白亚基的小麦品种。用作探针，鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因的原核及真核表达。用作探针，对小麦高分子量麦谷蛋白亚基表达文库实施筛选，可以排除其它基因的干扰，高效、准确地分离和克隆高分子量麦谷蛋白亚基的编码基因。
4.具体实施方式
下面给出本发明的一个最佳实施例小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Bx13和1By16多克隆抗体的制备选取单粒含13+16亚基的小麦种子研磨成粉，置于1.5ml离心管中，加200μl提取缓冲液(每10ml提取液中含十二烷基磺酸钠(SDS)0.4g；二硫苏糖醇(DTT)100mg；哌咯宁(Y Pyronin)3mg；0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)2.5ml；甘油2ml；用蒸馏水定容)，充分混匀，置沸水浴中十分钟，13000转/分离心30分钟，上清置-20℃备用或立即上样电泳。
电泳时采用北京六一仪器厂的垂直板电泳槽进行分离。用制备型加样梳制胶。分离胶浓度为7.5-17％的梯度胶，交联度2.67％；浓缩胶浓度3.7％，交联度2.67％；1.5mm厚的凝胶，20cm×20cm；恒流13mA，电泳15小时。
电泳完毕，从凝胶的两边各切下1cm宽的胶条进行快速染色，切割线为锯齿状。用新配制的染色液在摇床上染20分钟，用蒸馏水脱色。染色液配方为12％三氯乙酸，0.05％考马斯亮蓝G-250)。用凝胶成像仪的软件进行定量。将染色的胶条与未染色的凝胶拼在一起对比，用刀片分别切下高分子量麦谷蛋白13亚基和16亚基所在位置的胶条，装入离心管中-20℃冻存备用。在注射家兔及其它大型实验动物之前，不必将蛋白从凝胶中洗脱出来。
收集到抗原后，就可进行特异性多克隆抗体的制备。
先配置如下溶液。
pH7.2的0.02M的磷酸盐缓冲液的配置方法为首先配置A、B两种贮液[A液0.2mol/L NaH2PO4水溶液(NaH2PO4.H2O 27.6克或NaH2PO4.2H2O 31.2克溶于蒸馏水中，最后补加蒸馏水至1000ml)。B液0.2mol/L Na2HPO4水溶液(Na2HPO4.7H2O 53.6克或Na2HPO4.12H2O 71.6克或Na2HPO4.2H2O 35.6克加蒸馏水溶解，最后加水至1000ml)]，然后将这两种贮液按比例混合[A液28ml，B液72ml，加NaCl 8.5克，用蒸馏水稀释至1000ml]。
第一次免疫新西兰大白兔时使用弗氏完全佐剂(GIBCOBRL公司生产)，随后的几次加强注射均采用弗氏不完全佐剂(GIBCOBRL公司生产)。将先前从凝胶上切下来的含有目的蛋白质的胶条捣碎，在一个玻璃匀浆器或一个研钵中将1-3ml的凝胶和1.5ml的pH7.2的0.02M的磷酸盐(PBS)缓冲液以及1.0-1.5ml的弗氏完全佐剂一起匀浆，随后用一个带7号针头的玻璃注射器抽吐几次，直至呈白色粘稠乳剂，用注射器吸取1小滴于冷水中，液滴仍保持完整，聚成滴状，浮于水面，即表示乳化完全，可以用于动物接种。
在新西兰大白兔背部上方的每侧选取10-20个皮肉容易分离的部位，用左手食指和中指提起皮肤，在皮下各注射100-200μl的凝胶—蛋白—佐剂悬乳液。每次免疫注射的植物蛋白总量一般为100-500微克。
第二次注射在10-15天后进行，注射物为与弗氏不完全佐剂混合0.5-1倍于第一次注射量的抗原。首次加强注射后10-15天可以采血检测。
静脉采血在兔耳缘静脉处用剪刀剪去兔毛，用手揉搓静脉，使其充血，70％乙醇擦拭后，用七号针头刺破血管，收集约0.5ml血。室温静置1小时后4℃存放过夜。用移液器吸取上清置1.5ml离心管中，其余置4℃下2500rpm离心30分钟后，吸取上清与前者混合。-20℃保存备用。Western印迹法鉴定多克隆抗体的产生和效价。若达到合适效价，就可以停止免疫，用颈动脉放血法收集血液，室温静置1小时后4℃存放过夜。用移液器吸取上清分装至1.5ml离心管中，其余置4℃下2500rpm离心30分钟后，吸取上清与前者混合。-20℃保存备用。
将上述方法制备的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体用作探针，对不同小麦品种高分子量麦谷蛋白亚基进行鉴定提取不同品种小麦(共有不同的高分子量麦谷蛋白亚基)的高分子量麦谷蛋白亚基，经SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜。然后用该方法制备的多克隆抗体作探针进行Western印迹。结果可以清楚地表明所得多克隆抗体与小麦高分子量麦谷蛋白亚基间结合反应的差异。凡是有13+16亚基的小麦品种(如栽培小麦4072等)，皆发生强烈的杂交，而其它类型亚基的杂交信号很弱。因此，可以用该抗体作探针进行小麦品种的鉴定。
将制备的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体用作探针，鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因的原核及真核表达先构建高分子量麦谷蛋白亚基基因的原核表达载体，转化大肠杆菌，经诱导，收集菌体并提取蛋白质，SDS-PAGE分离后，以采用该发明所描述的方法制备的多克隆抗体为探针对表达产物进行Western印迹分析。多克隆抗体与原核表达的产物有强烈的杂交反应，而与菌体蛋白的反应却很弱或无反应。因此，可以用该多克隆抗体进行表达产物的鉴定。
将制备的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体用作探针，对小麦高分子量麦谷蛋白亚基表达文库实施筛选以采用该发明所描述的方法制备的多克隆抗体为探针对小麦高分子量麦谷蛋白亚基表达文库进行筛选，可获得阳性噬菌斑。说明采用本发明所描述的方法制备的多克隆抗体可以用于小麦高分子量麦谷蛋白亚基表达文库的筛选。
权利要求
1.小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)将小麦高分子量麦谷蛋白13和16亚基经SDS-PAGE电泳进行分离，切割含有抗原的凝胶，作为抗原；(2)将凝胶与弗氏佐剂混合均匀后，采取皮下多点注射法免疫新西兰纯种家兔；(3)选用Western印迹法检测抗体的使用浓度；(4)抗血清的收集，Western印迹法抗体效价的检测。
2.根据权利要求1所描述的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的制备方法，其特征是步骤(1)中描述的切割含有抗原的凝胶，是先将凝胶两侧的部分凝胶切下进行染色，然后与未经染色的凝胶拼接，对比切挖；在切凝胶两侧的凝胶条时，采用的是锯齿状切割线。
3.根据权利要求1所述的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的制备方法，其特征是步骤(2)动物免疫时，动物采用雄性的新西兰纯种家兔。
4.根据权利要求1-3所述方法制备的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的用途，其特征是用作探针，对不同小麦品种高分子量麦谷蛋白亚基进行鉴定，可以筛选出含1Bx13和1By16高分子量麦谷蛋白亚基的小麦品种。
5.根据权利要求1-3所述方法制备的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的用途，其特征是用作探针，鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因的原核及真核表达。
6.根据权利要求1-3所述方法制备的小麦麦谷蛋白亚基多克隆抗体的用途，其特征是用作探针，对小麦高分子量麦谷蛋白亚基表达文库实施筛选，可以排除其它基因的干扰，高效、准确地分离和克隆高分子量麦谷蛋白亚基的编码基因。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种小麦高分子量麦谷蛋白亚基特异性多克隆抗体的制备方法及其用途。该方法包括将作为抗原的小麦高分子量麦谷蛋白13和16亚基进行分别分离，凝胶与佐剂混合，皮下多点注射法免疫新西兰纯种家兔，效价测定和抗血清的收集等步骤。用本发明制备的1Bx13和1By16亚基多克隆抗体，可以用作探针，对不同小麦品种相应的高分子量麦谷蛋白亚基进行鉴定，筛选出含1Bx13和1By16高分子量麦谷蛋白亚基的小麦品种，高效、准确地分离和克隆1Bx13和1By16高分子量麦谷蛋白亚基的编码基因。
文档编号C07K16/16GK1569897SQ200410024038
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月23日 优先权日2004年4月23日
发明者夏光敏, 封德顺, 赵双宜, 陈凡国 申请人:山东大学