专利名称：免疫tbid基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的基因治疗，具体涉及基因工程方法构建免疫tbid基因(我们把它命名为Immuno-tbid)、上述基因编码的蛋白及所述的基因和蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
背景技术：
随着医学新技术的不断出现，原发性肿瘤，特别是早期诊断者的外科治疗效果得到了明显的提高。但是当肿瘤细胞发生远隔器官的转移后，尤其是泛发转移者，常规的疗法如化疗、放疗、手术治疗等均不能达到对肿瘤的控制。分泌性表达靶向蛋白诱导肿瘤细胞凋亡而杀灭肿瘤的思路，将指导一些高效、低毒的肿瘤基因治疗新方案的出现。
HER-2是一种由原癌基因编码的表皮生长因子受体，在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞中高度表达，是一种公认的肿瘤标志物，而且，很多研究表明，HER-2阳性的乳腺癌预后往往很差，肿瘤表现出很强的转移的能力，目前还没有行之有效的治疗药物和手段。通过对HER-2抗原的特异性识别，可望在正常细胞不造成损害的情况下，实现对恶性肿瘤的特异性杀伤。
Bid(BH3 Interacting Death Agonist；BH3相互作用促凋亡蛋白)是1996年发现的Bcl-2家族BH3亚家族的一个成员，具有促凋亡活性。Bid蛋白只含BH3结构域，通过它与Bcl-2和Bax相互作用，当其在细胞内过表达时诱导细胞凋亡。其名称也由此而来。
Bid的促凋亡活性主要依赖于Caspase-8的剪切。当有凋亡信号刺激时，Caspase-8活化并切割掉Bid蛋白N端片段，产生Bid截短体片断从细胞浆转位到线粒体，引起多种与凋亡相关分子由线粒体中释放，从而实现通过Cytc途径和其它线粒体凋亡机制调节细胞凋亡。
将Bid截短体作为肿瘤杀伤效应分子其优势在于，它是连接细胞凋亡内在和外在途径的关键分子，通过内在途径，放大外在途径的凋亡信号，同时激活数条凋亡通路，引发级联反应，使多个凋亡效应分子(caspase3，6，7和AIF)同时发挥作用。
发明内容
本发明的目的在于构建一种特异性强、活性高、免疫原性低、能持续杀伤肿瘤细胞的新型分子，提供一种免疫tbid基因、上述基因编码的蛋白及所述的基因和蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
本发明的技术解决方案是免疫tbid基因，其具有序列表<400>1-2之一的序列。
由上述基因编码的蛋白，其具有序列表<400>3-4之一的序列。
上述基因在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
上述蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
本发明应用了能特异性识别并结合HER-2阳性肿瘤细胞的单链抗体e23sFv基因(Chen SY，et al.Nature 1997；38578-80)，与PEA转膜结构域和活性截短型bid基因(tbid)融合。这样，同时结合了抗体对肿瘤细胞的特异性识别功能和活性tbid对细胞的快速高效杀伤功能。本发明构建分泌型免疫靶向基因，表达分泌后产生能特异性地识别和杀伤肿瘤细胞的效应分子，无论是使用重组病毒直接瘤体和肌肉注射，或通过回输基因修饰的淋巴细胞，抑或将基因的原核、真核表达产物通过肌肉、瘤体和静脉注射入患者体内，均能在杀伤肿瘤细胞的同时产生免疫监视作用。这一兼具细胞免疫和体液免疫特点的基因治疗策略同其它策略相比，具有明显的优势。
本发明所构建的免疫tbid基因具有以下特点□安全性——由于在N端融合长的抗体和PEA序列，因而这种融合蛋白在分泌后的转移过程中和进入肿瘤细胞前，由于不能正确折叠而不具有tbid的促凋亡活性。加之，免疫tbid效应分子通过抗体特异性地识别原发和转移的HER-2阳性肿瘤细胞，而对正常组织细胞没有识别和杀伤作用。另外，免疫tbid主要由人源化抗体和人自身蛋白构成，反复使用不会诱发体内产生中和抗体，而且细胞发生凋亡时不引起炎症反应，所以治疗的毒副作用较小。实验中发现被修饰的淋巴细胞本身功能正常，回输这种细胞将可以持续分泌效应蛋白。动物模型的抗肿瘤应用中也发现对除HER-2阳性肿瘤组织以外的其他组织没有毒性；□高效性-Bid是细胞凋亡通路中重要的信号传导分子，向细胞中导入活性形式的tbid分子，不仅能够激活caspases通路的凋亡效应，还可以促进AIF等不依赖caspases的凋亡诱导分子从线粒体中释放，即使caspases被抑制也能启动凋亡的发生，使其对肿瘤细胞的杀伤作用更直接，且效率更高；□持续性——免疫tbid基因转染细胞后可长期表达，分泌进入血液循环系统，对机体进行长期的免疫监视。
本发明可望为HER-2阳性肿瘤的靶向治疗提供一种新手段。
图1为全长人bid基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图2为截短型人bid基因(tbid61和tbid76)的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图3为pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图4为pCMV-Immuno-tbid61或pCMV-Immuno-tbid76质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图5为人tbid61和tbid76基因转染后，荧光显微镜下HeLa细胞的形态变化图(×400)。
图6为人tbid61和tbid76基因转染后，细胞的双标间接免疫荧光染色图。
图7为人PEA-tbid61和PEA-tbid76基因转染后，细胞的双标间接免疫荧光染色图。
图8为转染PEA-tbid61和PEA-tbid76基因后细胞生长状况变化的曲线图。
图9为转染PEA-tbid61和PEA-tbid76基因后，细胞Annexin V染色的流式细胞术分析图。
图10为免疫荧光显示Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白在转染细胞内的分布图。
图11为稳定分泌Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白的细胞培养上清的western blot鉴定图。
图12为不同的细胞上清与SKBR-3细胞培养后细胞计数结果的直方图。
图13为含有Immuno-tbid61蛋白的上清对细胞杀伤的特异性比较的直方图。
图14为Immuno-tbid61基因抗肿瘤应用研究中，肿瘤体积变化的曲线图。
图15为Immuno-tbid61基因抗肿瘤应用研究中，实验动物生存期的曲线图。
具体实施例方式
1.免疫tbid基因的构建本发明构建的免疫tbid基因包括三部分，分别为抗肿瘤表面抗原HER-2的单链抗体(e23sFv)，具有转膜功能的绿脓杆菌外毒素(PEA)的转膜结构域和具有诱导细胞凋亡功能的截短型Bid(tBid)。
(1)截短型bid基因(tbid)的克隆①全长bid基因的克隆提取人淋巴瘤Jurkat细胞的总RNA，反转录合成cDNA。在PCR专用的薄壁管中依次加入反转录产物2μL、10×PCR buffer 5μL、50mM MgCl21.5μL、上下游引物(1E、2XS)各1μL、10mM dNTP 1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和H2O 38μL，进行PCR反应。PCR反应条件为96℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸45秒；共进行20循环。扩增出588bp的基因片段bid(附图1)。将其克隆入载体pcDNA3——命名为pcDNA3-bid，经序列测定，结果获得的bid基因片段序列与GenBank中的序列完全一致。
1E 5′-TTTGAATTCATGGACTGTGAGGTCAACAAC-3′2XS5′-TTTTCTAGAGTCGACTCAGTCCATCCCATTTCTGGC-3′②bid基因的截短在PCR专用的薄壁管中依次加入，pcDNA3-bid质粒1μL、10×PCR buffer5μL、50mM MgCl21.5μL、上下游引物(2XS和3-61E或2XS和4-76E)各1μL、10mM dNTP 1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和H2O 39μL，进行PCR反应，扩增编码61-195aa的tbid61基因和编码76-195aa的tbid76基因(附图2)。PCR反应条件为96℃变性30秒；55℃退火45秒；72℃延伸45秒；共进行20循环。基因片段分别克隆入pcDNA3载体中，经酶切鉴定和测序证实。
3-61E5′-TTTGAATTCAT G GGCAACCGCAGCAGCCACTCC-3′4-76E5′-TTTGAAATGTTCATGTCTGAAAGTCAAGAAGACATC-3′(2)PEA-tbid61和PEA-76融合基因的克隆在截短型bid基因(tbid61和tbid76)克隆成功的基础上，与绿脓杆菌外毒素PEA的部分转膜结构域(280-364aa)的基因片断，及线性化的pcDNA3载体进行连接反应，获得重组质粒pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76，酶切鉴定图谱如(附图3)所示。
(3)Immuno-tbid融合基因的克隆将截短型bid基因(tbid61和tbid76)与在本室已有线性化的质粒pCMV-e23sFv-PEAII(253-364)-X连接，得到包含有Immuno-tbid61或Immuno-tbid76融合基因的真核表达载体，分别命名为pCMV-Immuno-tbid61或pCMV-Immuno-tbid76。(附图4)2.tbid基因及其表达产物活性的验证将tbid61和tbid76基因克隆入荧光表达载体pIRES2-EGFP，构建成功pIRES2-EGFP-tbid61和pIRES2-EGFP-tbid76质粒。用脂质体包裹的方法，分别将pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-tbid61和pIRES2-EGFP-tbid76转染入HeLa细胞。荧光显微镜观察，空载体转染组的细胞生长良好，pIRES2-EGFP-tbid61和pIRES2-EGFP-tbid76转染的细胞，在转染后12h即可见部分细胞内出现空泡，细胞体积发生固缩，至24h固缩的细胞荧光减弱而分散，许多细胞已不具有清晰的轮廓(附图5)。结果表明，tbid61和tbid76基因转染进入细胞后，引起细胞死亡程序的开放。
用脂质体分别包裹pcDNA3、pcDNA3-tbid61和pcDNA3-tbid76转染HeLa细胞，20h后用Cy3标记的山羊抗人bid抗体和FITC标记的兔抗人Cytc抗体进行间接免疫荧光检测，荧光显微镜观察的结果显示，pcDNA3-tbid61和pcDNA3-tbid76转染组的细胞，细胞色素c的荧光标记转移至细胞核的周围，呈环簇状存在，提示tBid可以促使细胞色素c从线粒体中释放到细胞质中(附图6)。
3.PEA-tbid61和PEA-tbid76融合基因及其表达产物活性的验证(1)PEA-tbid61和PEA-tbid76在细胞内的表达用脂质体包裹pcDNA3、pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76转染HeLa细胞，20h后用Cy3标记的山羊抗人bid抗体间接免疫荧光染色，荧光显微镜观察的结果显示，pcDNA3转染组的细胞内有少量内源性的bid蛋白，而pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76转染后的细胞着色较深，说明目的基因在细胞内大量表达(附图7)。
(2)PEA-tbid61和PEA-tbid76基因转染对细胞生长的影响PEA-tbid61和PEA-tbid76基因转染HeLa细胞，于不同时间点取样，进行噻唑蓝(MTT)比色实验，该实验是检测细胞存活和生长的重要方法，在一定细胞数范围内，蓝紫色结晶物形成的量(OD490nm值)与存活细胞数成正比。将490nm的光吸收值与时间做图，显示转染目的基因后细胞生长状况的变化(附图8)。结果表明，与对照组相比，PEA-tbid61和PEA-tbid76融合基因的表达均可抑制HeLa细胞的生长。
(3)PEA-tbid61和PEA-tbid76的表达诱导细胞凋亡的发生①PEA-tbid61和PEA-tbid76的表达引发细胞色素c的释放用脂质体包裹pcDNA3、pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76转染HeLa细胞，20h后用FITC标记的兔抗人Cytc抗体进行间接免疫荧光染色，荧光显微镜观察的结果显示，与pcDNA3转染组相比，pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76转染后，细胞色素c的荧光标记转移至细胞核的周围，呈环簇状存在，并出现典型的细胞皱缩及核固缩，核结构严重破坏，提示细胞色素c从线粒体中释放到细胞质中(附图7)。
PEA-tbid61和PEA-tbid76融合蛋白引发磷脂酰丝氨酸外翻细胞凋亡早期，细胞膜表面会出现磷脂酰丝氨酸从细胞膜内侧外翻，暴露于细胞膜外侧，此时可以与Annexin V试剂结合而被检测出来。Annexin V检测是鉴定细胞凋亡的重要方法。脂质体包裹pcDNA3、pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76转染SKBR-3细胞12h后，用Annexin V-FITC和PI染色，结果发现，与对照组相比，pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76转染组的细胞呈现明显的阳性，阳性率分别为10.9％和9.2％，说明融合基因PEA-tbid61和PEA-tbid76的表达可以导致细胞凋亡的发生(附图9)。
③PEA-tbid61和PEA-tbid76基因表达后细胞的超微结构变化用脂质体包裹pcDNA3、pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76转染HeLa细胞，固定并染色后，用电子显微镜观察转染细胞超微结构。结果发现，pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76转染后的细胞，呈现典型的凋亡细胞特征如细胞膜表面微绒毛消失，核膜及细胞膜完整，细胞膜表面出泡，染色体凝集且聚集于核膜周边。而未转染细胞或转染空载体细胞形态正常。
4.Immuno-tbid基因及其表达产物的肿瘤异性体外杀伤活性的验证(1)Immuno-tbid61和Immuno-tbid76分泌型HeLa细胞系的建立将pCMV-e23sFv-PEA-tbid61和pCMV-e23sFv-PEA-tbid76用脂质体包裹后，转染HeLa细胞，48h后进行免疫细胞化学染色，可观察到Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白主要分布于内质网及高尔基体中，呈分泌表达模式，且Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白高表达对HER-2阴性的HeLa细胞无不良影响(附图10)。
将转染后的HeLa细胞，用800μg/ml G418筛选，3周后得到阳性克隆，扩大培养。收集建系HeLa细胞培养上清，除盐并浓缩后进行Western blot检测，可检测到培养上清中Immuno-tbid蛋白的存在，由此证实筛选得到的细胞并能持续分泌Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白的HeLa细胞系。(附图11)对筛选得到的细胞在不同时间进行细胞计数，并绘制细胞生长曲线，发现分泌Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白的HeLa细胞具有与未转染HeLa细胞类似的生长曲线，表明转染Immuno-tbid61和Immuno-tbid76基因后细胞能够正常生长。
(2)Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白对HER-2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤作用收集建系HeLa细胞培养上清，用于不同来源的肿瘤细胞的培养，研究Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白对肿瘤细胞的杀伤活性。
首先，比较Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白对HER-2阳性乳腺癌细胞——SKBR-3杀伤作用的不同。以含有Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白的上清培养SKBR-3细胞，于不同时间点进行细胞计数。结果表明，Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白均能有效杀伤HER-2阳性肿瘤细胞，但以Immuno-tbid61蛋白的杀伤作用较强，并且杀伤率与培养时间有相关性。(附图12)以含有Immuno-tbid61蛋白的分别上清培养HER-2阳性的SKBR-3和SKOV-3细胞以及HER-2阴性的Hep2和ECV-304细胞，验证杀伤作用是否具有靶向性。培养细胞每天换液，并进行计数，计算HeLa细胞上清对HER-2阳性细胞的杀伤率。结果发现，HER-2阳性肿瘤细胞的生长明显被抑制，而HER-2阴性肿瘤细胞——Hep2和正常细胞——ECV-304生长基本不受影响。充分表明，Immuno-tbid61蛋白对细胞的杀伤活性是具有靶向性的(附图13)。
4.Immuno-tbid61和Immuno-tbid76基因及其表达产物的体内抗肿瘤应用皮下接种1～2×106SKBR-3细胞建立HER-2阳性荷瘤裸鼠模型。分别肌肉注射用脂质体包裹的pCMV空载体和pCMV-Immuno-tbid61重组质粒，测量肿瘤的体积变化和观察裸鼠存活时间的长短，结果发现，治疗组瘤体的生长速度明显慢于对照组(附图14)，治疗组裸鼠存活期延长(附图15)。
裸鼠组织石蜡切片的免疫组织化学染色结果显示，Immuno-tbid61蛋白只选择性地分布于治疗组裸鼠的肿瘤组织中，在其他组织如心、肝、脾、肺、肾中，以及在对照组的肿瘤组织中，只检测到少量内源性bid的表达。同时，只有实验组的肿瘤组织中TUNEL染色呈阳性，表明Immuno-tbid61不仅能够特异性的识别并结合于HER-2阳性的肿瘤组织，还通过引起肿瘤细胞凋亡而有效地杀灭肿瘤，而对分泌产生Immuno-tbid61蛋白的肌肉组织和其他正常组织细胞没有杀伤，对其他组织没有毒副作用。
权利要求
1.免疫tbid基因，其具有序列表<400>1-2之一的序列。
2.由权利要求1的基因编码的蛋白，其具有序列表<400>3-4之一的序列。
3.如权利要求1所述的基因在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
4.如权利要求2所述的蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种免疫tbid基因、由所述基因编码的蛋白、及上述基因和蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。本发明应用了能特异性识别并结合HER－2阳性肿瘤细胞的单链抗体e23sFv基因，与PEA转膜结构域和活性截短型bid基因(tbid)融合构建了一种特异性强、活性高、免疫原性低、能持续杀伤肿瘤细胞的新型分子——免疫tbid基因。本发明构建分泌型免疫靶向基因，表达分泌后产生能特异性地识别和杀伤肿瘤细胞的效应分子，在杀伤肿瘤细胞的同时产生免疫监视作用。这一兼具细胞免疫和体液免疫特点的基因治疗策略同其它策略相比，具有明显的优势。本发明所构建的免疫tbid基因具有安全性、高效性和持续性，本发明可望为HER－2阳性肿瘤的靶向治疗提供一种新手段。
文档编号C07K14/435GK1594567SQ20041002631
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月8日 优先权日2004年7月8日
发明者杨安钢, 裘秀春, 许彦鸣, 贾林涛, 于翠娟, 赵晶, 张立红, 王立锋, 孟艳玲, 王智, 范清宇, 王成济 申请人:杨安钢