一种泌尿生殖系统疾病的治疗系统的制作方法

专利名称：一种泌尿生殖系统疾病的治疗系统的制作方法
技术领域：
本发明用于泌尿生殖系统疾病的治疗，尤其涉及多肽和二聚体用于泌尿生殖系统疾病的治疗。
背景技术：
泌尿生殖系统疾病通常累及男女两性，包括泌尿系统和生殖系统的感染和/或炎症。例如，根据美国国家少儿健康和发育研究所(NICHD)的统计，“大多数女性一生中至少患过一种类型的阴道炎。”《阴道炎》(Vaginitis)，发表于《美国国家儿少健康和发育研究所-在线刊物》(National Institute of Child Health and HumanDevelopment-Publications On-line)，2000年1月12日修定，<http//www.nichd.nih.gov/publications/pubs/vagl.html>)。导致阴道炎的原因包括从细菌、真菌或病毒感染到乳液、喷雾或者贴身衣物所含的化学物质的刺激。同样地，对于有细菌和真菌感染的女性，这些感染因素经常来自肛门区，从此处经过会阴到达阴道或尿道。
常见的一类阴道炎是念珠菌或酵母菌感染，主要由白色念珠菌感染引起。念珠菌属于人体正常菌群，存在于皮肤、口腔和消化道(Robbins，《疾病的病理学基础》第五版(pathologic Basis ofDisease 5thed)，Saunders公司，费城(1994)p.354)，女性阴道也可有少量存在。它们最适合的生长环境是诸如阴道或口腔的温暖潮湿环境。念珠菌通常不致病，但当环境改变时，例如女性绝经后、怀孕期、或应激时发生体内激素水平的改变，会过度繁殖造成酵母菌感染。此情况也可见于免疫抑制或身体机能受损的个体，如接受化疗、服用免疫抑制剂的病人，或艾滋病患者。
目前对于念珠菌感染的治疗包括非处方药物，其活性成分如布康唑硝酸盐(Femstat)、克霉唑(Gyne-Lotrimin及其它)、咪康唑(Monistat及其它)和噻康唑(Vagistat)。这些药物作为阴道感染的局部用药，可以裂解念珠菌的细胞壁。其它类似的治疗包括处方药物，其活性成分来自与氟康唑(Diflucan)、三康唑(Terazol)和酮康唑(Nizoral)等同一系列。
虽然通常的观点认为阴道炎与念珠菌有关，但据NICHD的调查(《阴道炎》(Vaginitis))，实际上细菌性阴道炎是育龄妇女最常见的阴道感染疾病。阴道内的细菌过度繁殖会导致与念珠菌性阴道炎相似的细菌性阴道炎，其治疗药物不同。
另一方面，男性阴茎也可以感染念珠菌，累及阴茎头和包皮。阴茎头包皮炎是阴茎头和包皮的非特异性感染，由多种微生物引起，包括真菌(如念珠菌)和化脓性细菌(如葡萄球菌)(Robbins，《疾病的病理学基础》第五版(Pathologic Basis of Disease 5th ed).，Saunders公司，费城(1994)p.1008)。
葡萄球菌为革兰氏染色阳性细菌，通常存在于人体的皮肤和其它粘膜。特别值得一提的是金黄色葡萄球菌，为毒性致病源，可以引起皮肤损伤、心内膜炎、呼吸系统感染、食物中毒、甚至中毒性休克综合征等多种病症。对于采用高吸收性月经棉条的女性而言，金黄色葡萄球菌可以在阴道内形成菌落，并分泌一种称为中毒性休克综合征毒素(TSST-1)的毒素。据FDA的统计，目前报导的大约半数中毒性休克综合征病例与月经期棉条关，多为年轻女性(《月经棉条与石棉、二恶英以及中毒性休克综合征》(Tampons andAsbestos，Dioxin，& Toxic Shock Syndrome)，FDA设备与放射健康中心(July 23，1999)，<http//www.fda.gov/cdrh/ocd/tamponsabs.html>)。
金黄色葡萄球菌感染一般用甲氧西林(methicillin)治疗。此药虽然很有效，但金黄色葡萄球菌的一些菌株已经产生抗药性，只有少数抗生素能有效治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)。常用于治疗MRSA的抗生素之一是万古霉素(vancomycin)。但是，现已发现对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌菌株(Khuishid，M.A.等，《对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌》(Staphylococcus aureus with Reduced susceptibility to Vancomycin)，发表于伊利诺斯1999《发病率与死亡率周报》(Morbidity andMortality Weekly Report)，48(51)1165-1167(2000)，<http//www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm4851al.htm>)。抗药性菌株的出现使应用其他方法用于治疗细菌感染成为必要。
除真菌和细菌感染外，病毒性阴道炎也比较常见。此类感染大多通过性交传播，包括单纯疱疹病毒(HSV)或人类乳头状病毒(HPV)引起的感染。例如，HSV病毒，在生殖系统的入口处复制，也感染支配生殖器的神经。为了躲避机体免疫系统，HSV病毒潜伏在这些神经元中，在某些环境条件下活化，如应激、免疫抑制、放射或病毒感染等。目前治疗HSV感染的药物包括阿昔洛韦(acyclovir)、法昔洛韦(famciclovir)、或伐昔洛韦(valacyclovir)等。
对于泌尿系统，根据美国医药协会的调查数据，泌尿道感染(UTIs)是促使就医的最常见疾患之一(《女性健康》—《尿道感染治疗的患者指导》(Women’s Health，Urinary Tract infectionsAPatient’s Guide to Treatment)，《在线健康信息-AMA健康透视》(AMA Health Insight，On-line Health Information for Everyone)，1998年10月30日更新，<http//www.ama-assn.org/insight/h_focus/wom_hlth/uti/uti.html>。此类感染性疾患主要是由埃希氏大肠杆菌(E.coli.)引起，但念珠菌和葡萄球菌也有参与。同样地，这些感染始于尿道，向膀胱发展引起膀胱炎。最后，病菌可沿输尿管上行至双肾，导致肾盂肾炎。男性和女性均可感染。
既然泌尿-生殖系统疾病不局限于单一病因，那么目前的治疗就需要针对特定病因采用不同的药物。当然，要先确定病因。检测病源需要时间，但更重要的是对女性要进行妇科检查以确定是否有特异感染因素存在。
随着抗生素和其它药物应用的增加，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌这类的微生物就越容易对目前所用药物产生抗药性。这样，就持续需要新的广谱抗菌药物。

发明内容
本发明用于治疗泌尿生殖系统疾病，它的一个方面涉及的由单一或多种肽组成的用于泌尿生殖系统疾病的治疗体系，其中多肽的氨基酸序列有KPV(序列号1号)，MEHFRWG(序列号2号)，HFRWGK(序列号3号)，SYSMEHFRWGLPV(序列号4号)。单个或多个多肽也可以通过上述氨基酸序列形成二聚体。泌尿生殖系统疾病包括感染、炎症，或者二者兼有。在本发明的一个优选实施例中，泌尿-生殖系统疾病包括阴道、外阴、尿道、阴茎和/或直肠的感染和/或炎症。在另一个优选实施例中，单一或多种多肽溶于载体内。在第三个优选实例中，一种或多种多肽与棉条结合，以避免中毒性休克综合征。在第四个优选实施例中，一种或多种多肽与避孕工具相结合，以防止性传播疾病或感染。在第五个实施例中，一种或多种多肽与栓剂结合，以便于插入阴道或肛门。在本发明的第六个实施例中，一种或多种多肽溶于液体载体中，以用于阴道灌注。


图1α-MSH和/或其衍生物对金黄色葡萄球菌生长的抑制效应。
图2α-MSH和/或其衍生物对尿激酶(UK)诱导的金黄色葡萄球菌生长的影响。
图3α-MSH和/或其衍生物对白色念珠菌(C.albicans)生长的抑制效应。
图4α-MSH和/或其衍生物与氟康唑抗真菌活性的比较。
图5A-5Dα-MSH和/或其衍生物对白色念珠菌芽管形成的抑制效应。
图6α-MSH和/或其衍生物抗念珠菌的强化中性粒细胞杀伤力的效应。
图7、8、9α-MSH和/或其衍生物抑制白色念珠菌生长的机制。
图10-13α-MSH和/或其衍生物对慢性感染细胞内病毒复制和表达的抑制效应。
图14α-MSH和/或其衍生物抑制病毒复制、表达和活化的机制。
图15α-MSH和/或其衍生物对急性感染细胞内病毒复制和表达的抑制效应。
图16用于本发明一方面的一种KPV二聚体形式的化学结构示例。
具体实施例方式
以下所引用的文献在此作为参考文献。本发明是关于采用α-黑素细胞刺激素(α-MSH)和/或其衍生物治疗泌尿生殖系统疾病的一种方法和系统。α-MSH是经典的由13个氨基酸组成的肽(序列号4号)，由较大的前体分子——前黑阿皮素原经翻译后修饰产生。它与同是来自前黑阿皮素原的促肾上腺皮质激素(ACTH)的1-13氨基酸序列相同。许多种细胞均可分泌α-MSH，包括垂体细胞、单核细胞、黑素细胞和角化细胞。α-MSH可见于大鼠皮肤、人体表皮以及正常和垂体切除术大鼠消化道的粘膜屏障(可参阅Eberie，A.N.，《促黑激素》(The Melanotrophins)，瑞士巴塞尔Karger(1998)；Lipton，J.m.等，《α-MSH神经免疫调质的抗炎影响》(Anti-inflammatory influence of the Neuroimmunomodulator α-MSH)，《今日免疫学》(Immunol. Today)18，140-145(1997)；Thody，A.J.等，《α-MSH的免疫反应性，在正常和垂体切除大鼠消化道的分布》(Immunoreactive α-Melanocyte Stimulating Hormone，Its Distribution in the Gastrointestinal Tract of Intact andHypophysectomized Rats)，《生命科学》(Life.Sci.)18，2127-2132(1981))。
现已知道α-MSH及其衍生物具有很强的解热和抗炎特性，而且毒性极低。它可以降低宿主细胞的离体前炎症介质的产生，并且可以降低动物炎症模型的局部和全身反应。例如，α-MSH的核心序列(4-10)(序列号2号)具有学习和记忆行为效应，但解热和抗炎活性很低。相反，解热和抗炎活性的活化信息序列位于α-MSH的C-末端氨基酸序列，即赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸(“Lys-Pro-Val”或“KPV”)(序列号1号)。此三肽在体和离体情况下与母体分子有相同的活性。α-MSH和/或其衍生物的抗炎活性在下述两项专利有阐述，并包括在所列的参考中美国专利第5,028,592号，1991年7月2日提交于Lipton，J.M.，题为《Lys Pro Val解热和抗炎成分及其使用方法》(Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro ValCompositions and Method of Use)；美国专利第5,157,023号，1992年10月20日提交于Lipton，J.M.，题为《Lys Pro Val解热和抗炎成分及其使用方法》(Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro ValCompositions and Method of Use)。(参阅Catania，A.等，《α-MSH对宿主机体反应的调节》(α-Melanocyte Stimulating Hormone in theModulation of Host Reactions)，《内分泌综述》(endocr.Rev.)14，564-576(1993)；Lipton，J.M.等，《α-MSH神经免疫调质的抗炎影响》(Anti-inflammatory influence of the Neuroimmunomodulatorα-MSH)，《今日免疫学》(Immunol.Today)18，140-145(1997)；Rajora，N.等，《α-MSH产生受体及其对新喋呤的影响，在人单核/巨噬细胞系》(α-MSH Production Receptors and Influence onNeopterin，in a human Monocyte/macrophage Cell Line)，《白血病生物学杂志》(J.Leukoc.Biol.)59，248-253(1996)；Star，R.A.等，《α-MSH对巨噬细胞一氧化氮合成酶自分泌调节的证明》(Evidence ofAutocrine Modulation of Macrophage Nitric Oxide Synthase by α-MSH)，Proc.Nat’l.Acad. Sci.(USA).92，8015-8020(1995)；Lipton，J.M.等，《神经肽α-MSH在急慢性全身性炎症的抗炎作用》(Anti-inflammatory Effects of the Neuropeptide α-MSH in AcuteChronic and systemic inflammation)，Ann.N.Y.Acad. Sci.741，137-148(1994)；Fajora，N.等，《α-MSH调节大脑炎症实验模型的局部和循环肿瘤坏死因子-α》(α-MSH Modulation Local and CirculatingTumor Necrosis Factor αin Experimental Brain Inflammation)，《神经科学杂志》(J. Neurosci.)17，2181-2186(1995)；Richards，D.B.等，《α-MSH(11-13)(lys-pro-val)对兔发热的作用》(Effects ofα-MSH(11-13)(lysine-proline-valine)on Fever in the Rabbit)，《肽物质》5，815-817(1984)；Hiltz，M.E.等，《神经肽α-MSH COOH末端片断的抗炎活性》(Anti-inflammatory of αCOOH-teminalFragment of the Neuropeptide α-MSH)，FASEB杂志3，2282-2284(1989)。
除了抗炎和解热功能外，本发明的另一方面涉及α-MSH和/或其衍生物的抗微生物和抗感染活性。如下所述，α-MSH和/或其衍生物有重要的抗感染用途，包括如下的应用降低微生物生存力，降低酵母菌长芽，在不损害中性粒细胞对微生物的杀伤能力的情况下杀伤微生物，治疗与微生物感染有关的炎症而不降低微生物的杀伤力，增加微生物细胞内cAMP的积累，抑制病毒性致病源的复制与表达。
在本发明的首选实施例中，这些抗微生物或抗感染活性最主要与C-末端氨基酸序列-KPV有关。此三肽与α-MSH及其衍生物在很大浓度范围内均有效，包括通常存在于人体浆液的皮摩尔浓变。
正如在技术背景部分中所讨论的，泌尿生殖系统疾病并不局限于单一病因。从细菌、真菌到病毒在内的多种微生物和感染因素可以单独或联合引起多种病症，包括阴道炎、外阴炎、尿道炎、阴茎头包皮炎、念珠菌病、行传播疾病以及中毒性休克综合征。α-MSH和/或其衍生物可局部用于上述疾病状态的感染和/或炎症部位以达到治疗目的，可利用现有技术的施药方法。例如，α-MSH及其衍生物可以溶于一些溶液中，诸如磷酸盐缓冲液、透明质酸、甲基纤维素、羧甲基纤维素或乙醇。还可以用一般的载体，如油膏、油脂、胶体、可溶性弹丸、气溶胶喷雾、栓剂、灌注所用液体溶剂或者具吸收性的物质，携带α-MSH和/或其衍生物作为活性成分治疗泌尿生殖系统疾病。这些载体可用敷料器施用于感染或炎症部位，敷料器可以是注射器或类注射器式的器具、绷带、导管、带活塞的管子、涂药用抹刀或其它类型的平面敷料器、避孕套、海绵、棉签、或手指。
更明确地说，本发明的一个优选实施例是将α-MSH和/或其衍生物溶于以液体基底的载体。然后将溶有α-MSH和/或其衍生物的载体储存于密封加压箱内。打开释放阀门或通过其它方式将载体从密封加压箱内释放时，会形成气溶胶泡沫并被装进注射器和注射器类的器具。接着，注射器部分插入阴道，其内容物也就释放入阴道腔内。注射器或注射器类的器具及其开口也可以有不同的大小、形状和长度，以插入不同的泌尿生殖区，如尿道或肛门。
本发明的另一个优选实施例为包含载体的栓剂。此载体如胶体或甘油在常温下为固体或半固体，但是插入阴道或肛门后在体温下便融化。载体融化后，携带所溶的α-MSH和/或其衍生物至泌尿生殖系统疾病的发病部位。
我们采用油脂、油膏、胶体、喷雾、泡沫材料或止痛香膏等形式将α-MSH和/或其衍生物涂于外阴、阴茎头和阴茎包皮等外生殖器部分。其组分为本技术领域所熟知。
在本发明的另一方面，还可以在棉条的生产加工过程中用α-MSH和/或其衍生物进行处理。这样棉条中存在α-MSH和/或其衍生物，可以抑制分泌中毒性休克综合征(TSST-1)的微生物的生长，如金黄色葡萄球菌。此种棉条的加工处理技术为本领域现有技术所熟知。采用α-MSH和/或其衍生物处理的棉条吸收性材料进行治疗，一种方法是将棉条的吸收性材料浸泡于含有α-MSH和/或其衍生物的溶液，然后予以干燥。可供选择的另一种方法，是将α-MSH以干燥粉末形式喷洒到棉条的吸收性材料上。
在本发明的另一方面，α-MSH和/或其衍生物可通过避孕工具转运至感染部位，这些避孕工具包括避孕套、隔膜、海绵或其它用于防止怀孕或性传播疾病的屏障型工具。α-MSH和/或其衍生物可溶于避孕套所用的润滑剂以及与隔膜共同使用的胶质或泡沫材料，或者溶于与避孕套、隔膜或海绵共用的任何类型的杀精子溶液。
在本发明的另一方面，α-MSH和/或其衍生物可溶于灌注用的液体。这些液体可以通过灌注被转运至阴道以治疗感染和/或炎症。
下述实施例阐明了α-MSH和/或其衍生物抗感染的效力及其应用。实施例中所用的微生物学、分子生物学以及细胞培养的方法没有在文中详细说明，但在科研文献中有大量的报导。本领域技术人员熟知这些方法。
下述实施例中所用的肽类包括α-MSH(1-13)(序列号4号)、(4-10)(序列号002号)、(6-13)(序列号003号)、和(11-13)(序列号1号)，均有乙酰化的N末端和酰胺化的C末端，以及促肾上腺皮质激素ACTH(1-39)和(18-39)(CLIP)。这些肽类由固相肽合成方法制备，经保留相的高效液相色普法纯化。部分实施例还包括氨基酸序列CKPV(序列号8号)的二聚体(KPV二聚体)，此二聚体同样也有乙酰化的N末端和酰胺化的C末端。图16显示了KPV二聚体的化学结构。在上述任意一种多肽的N末端加半胱氨酸，并使两个多肽的半胱氨酸形成二硫键，即可得到二聚体。同源二聚体和异源二聚体均可由此方法获得。
下述实施例中所阐述的统计学意义采用方差的单因素分析和斯氏t检验。概率大于0.05被认为是有显著性差异的。
实施例I本实施例目的在于阐明α-MSH和/或其衍生物的抗微生物特性，这里选取金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为例。
金黄色葡萄球菌培养物(ATCC 29213)由Ospedale Maggiore diMilano微生物学系提供。金黄色葡萄球菌(于Hank平衡盐溶液中1×106/毫升)在α-MSH(1-13)(序列号4号)、α-MSH(11-13)(序列号1号)或KPV二聚体存在或缺如的情况下，37℃培养2小时，肽的浓度为10-15-10-4M。随后细胞在冷蒸馏水中冲洗，并用HBSS稀释至100个生物体/毫升。将-微升的等分试样涂于血浆琼脂板，37℃培养24小时。然后根据所形成的菌落评估微生物的生存力。另一实验中是在细菌浓度为105/100毫升的培养液中加入不同的肽段和500单位的尿激酶(金黄色葡萄球菌的生长促进剂)，并且在37℃水浴中振荡培养4小时。
图1表明α-MSH(1-13)(序列号4号)、α-MSH(11-13)(序列号1号)和KPV二聚体均抑制金黄色葡萄球菌菌落的形成。此抑制效应在很大浓度范围内均可发生，并在10-12-10-4M的浓度范围内有显著性差异(p＞0.01)。图2说明了浓度为10-6摩尔/升的α-MSH(1-13)(序列号4号)和α-MSH(11-13)(序列号1号)明显抑制尿激酶的生长促进作用。这样，α-MSH或其衍生物可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，此细菌会引起中毒性休克综合症，该病征与月经棉条使用、阴道炎、泌尿道感染、以及阴茎头包皮炎有关。
实施例II本实施例的目的在于阐明α-MSH和/或其衍生物的抗真菌特性，这里选取的实验菌株是白色念珠菌(Candida albicans)。
白色念珠菌的临床隔离株由Ospedale Maggiore di Milano微生物学系提供。白色念珠菌的培养在沙氏琼脂斜面板上进行，并周期性地转移到沙氏琼脂板上，28℃培养48小时。为了制备静止期酵母菌，从琼脂板上挑取菌落，将其转移到30毫升沙氏葡糖液体培养基中，32℃培养72小时。将所得细胞以1000xg离心10分钟，用蒸馏水冲洗沉积细胞两次。然后计数细胞个数，并悬浮于Hank平衡盐溶液(HBSS)中至需要的浓度。通过0.01％的甲基蓝外排实验，以此确定细菌的生存力。结果显示其生存能力大于98％。
在HBSS中密度为1×106/毫升时，这些真菌在α-MSH(1-13)(序列号4号)、α-MSH(11-13)(序列号1号)或KPV二聚体存在或缺如的情况下，37℃培养2小时，肽的浓度为10-15-10-4M。随后用冷蒸馏水冲洗细胞，并用HBSS稀释至100个生物体/毫升。将一毫升的等分样品涂于血浆琼脂板上，37℃培养48小时。微生物的生存力根据所形成的菌落估计。
图3表明α-MSH(1-13)(序列号4号)、α-MSH(11-13)(序列号1号)和KPV二聚体在10-12-10-4M浓度范围内均抑制白色念珠菌菌落形成的能力(与对照相比p＜0.01)。此结果说明，α-MSH或其衍生物能够抑制白色念珠菌的生长，此真菌是已知导致念珠菌病、阴道炎、尿道炎和阴茎头包皮炎的因素。
实施例III本实施例的目的在于比较α-MSH和/或其衍生物与氟康唑(fluconazole)的抗菌活性，后者是已被承认的抗真菌药物。
检测α-MSH(1-13)(序列号4号)、(4-10)(序列号2号)、(6-13)(序列号3号)、(11-13)(序列号1号)和ACTH(1-39)、(18-39)以及氟康唑在10-6-10-4M浓度下的抗白色念珠菌的能力，方法同实施例II。图4表明，与氟康唑相比，α-MSH(11-13)(序列号1号)、(4-10)(序列号2号)、(6-13)(序列号3号)和(1-13)(序列号4号)抗白色念珠菌是非常有效的，其抑制活性与等摩尔浓度的氟康唑是类似的。相比之下，具有行为效应但极少抗炎活性的核心α-MSH序列(4-10)(序列号2号)产生了近50％的对菌落形成单位抑制效应。虽然此抑制效应具有显著性(与对照相比p＜0.01)，但是明显弱于含有KPV信号序列的α-MSH片断，这些KPV信号序列包括α-MSH(6-13)(序列号3号)、(11-13)(序列号1号)(p＜0.01)，或者母体分子α-MSH(1-13)(p＜0.05)。图4也表明ACTH(1-39)及其片断(18-39)不能降低白色念珠菌的生存力。甚至在10-4M浓度下(图中未显示)，ACTH肽段也同样无效。
由此本实施例说明α-MSH或其衍生物在抑制白色念珠菌生长方面与氟康唑同样有效。
实施例IV本实施例的目的在于阐明α-MSH及其衍生物对白色念珠菌出芽或芽管形成的抑制作用。芽管形成是白色念珠菌感染发病机理的重要方面，包括粘附于宿主上皮和内皮细胞的过程，从椭圆形的芽生孢子到各种丝状体的形态转变，如芽管、假菌丝、菌丝。(Gow，N.A.，《白色念珠菌芽管的生长》(Germ Tube Growth of Candidaalbicans)，《当代医学真菌话题》(Curr.Topics Med.Myco.)8，43-55(1997))。
蒸馏水冲洗培养所得的静止期白色念珠菌两次，然后将菌体悬浮于HBSS中，密度为2×106/毫升。于此菌液中加入10％的灭活马血清(由英国Paisley GIBCO/BRL提供)，37℃振荡培养45分钟，可以诱导白色念珠菌菌丝的生长。HBSS冲洗菌体两次以去除马血清，然后在浓度为10-6M的α-MSH(1-13)(序列号4号)、(6-13)(序列号3号)或(11-13)(序列号1号)存在的条件下，37℃继续培养60分钟，并不断振荡。采用血细胞计数器在光学显微镜下计算出丝状菌体的百分比。此实验以重复三次，至少计数了200个细胞。采用装配在Axioskop Zeiss显微镜上的MC100相机拍摄显微照片。
图5A至5D表明α-MSH(1-13)(序列号4号)或(11-13)(序列号1号)可以抑制由马血清诱导的白色念珠菌芽管形成。α-MSH(1-13)(序列号4号)使丝状菌体数目降低28-32％，α-MSH(11-13)(序列号1号)导致丝状菌体数目降低54-58％。虽然图中未显示，α-MSH(6-13)(序列号3号)同样可以引起丝状菌体数目降低近50％。由此说明α-MSH或其衍生物通过抑制芽管形成可以抑制念珠菌发病机理的一种模式。
实施例V对病原体杀伤力的降低是感染期间应用皮质类固醇和其它非甾体类消炎药物治疗的负面作用(Stevens，D.L.，《非甾体类消炎药物(NSAIDs)是否能促进细菌性感染发展为中毒性休克综合征》(Could Nonsteriodal Anti-inflammatory Drugs(NSAIDs)EnhanceProgression of Bacterial Infections to Toxic Shoc Syndrome？)，《临床感染性疾病》(Clin.Infect.Dis.)21，977-80(1997)；Capsoni，F.等，《皮质类固醇对中性粒细胞功能的影响抑制抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)》(Effect of Corticosteriods on NeutrophilFunctionInhibition of Antibody-dependent Cell-MediatedCytotoxicity(ADCC))，《免疫药理学杂志》(J. Immunopharmacol.)5，217-30(1983))。本实施例阐明α-MSH和/或其衍生物抑制感染源的生长，而且不降低中性粒细胞抗感染的能力。本实施例进一步表明α-MSH和/或其衍生物确实可以增强中性粒细胞杀伤感染源的能力。
来自健康志愿者的静脉血(20毫升)肝素抗凝处理后，加入右旋糖苷沉淀剂并采用Ficoll-Hypaque(购于美国密苏里州圣路易斯的Sigma化学制剂公司)离心机离心分离中性粒细胞。低渗休克下红细胞溶解，中性粒细胞则至少占细胞悬浮液的97％。由胎盘兰排除法得到的细胞生存力大于98％。中性粒细胞再悬浮于HBSS中，以用于实验。
将白色念珠菌(1×106)与AB型血清置于37℃振荡水浴中调理30分钟。随后，在单纯培养基上或含有浓度为10-15-10-4M的α-MSH(1-13)(序列号4号)或α-MSH(11-13)(序列号1号)培养基上与中性粒细胞一起培养，于振荡水浴中37℃培养2小时。2小时后，将培养管置于冰上以中断生长，冲洗细胞外生物体两次，并4℃离心(1000xg)。于悬浮液中加入2.5％的脱氧胆酸钠溶液，振荡试管5分钟。然后加入冷蒸馏水得到密度为106个细胞/毫升的菌液，再在HBSS中按1/100地比例依次稀释两次，从而得到密度为100个细胞/毫升的菌液。从此菌液中取一毫升的等分样品涂于血琼脂板，37℃培养48小时。48小时后选取三分之一计数菌落形成单位，并采用五个不同个体来源的血浆重复计数。
图6表明α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列号1号)在10-12-10-4M浓度范围内(p＜0.01)确实能够增强中性粒细胞对白色念珠菌的杀伤力。同时图6表明它们在很大的浓度范围内都可以促进中性粒细胞的杀伤力，即使是在相当于人血浆α-MSH浓度的皮摩尔浓度条件下。
由此本实施例说明α-MSH或其衍生物可以同时抗感染和炎症，此特性也适用于念珠菌病、阴道炎、尿道炎、阴茎头包皮炎或痔疮。
实施例VI本实施例提示α-MSH和/或其衍生物的抗微生物特性的一般细胞机制，以及抗真菌特性的特殊机制。
经甲苯/乙醇渗透作用的白色念珠菌(106/毫升)，在10-6M浓度的α-MSH(1-13)(序列号4号)、(11-13)(序列号1号)或毛喉萜(forskolin)(已知能够增加细胞内cAMP)存在或缺失的条件下，37℃下振荡培养。三分钟后加入用冰冷却的乙醇以中止反应。cAMP水平由市售酶免疫试剂盒(购于英国Amersham)测定两次，在测定之前根据产品说明通过液相方法对反应体系进行抽提。在另一个相关实验中，白色念珠菌暴露于浓度为25、50和1×10-5M的双脱氧腺苷(ddAdo，Sigma)2小时，再与α-MSH或其衍生物作用2小时。双脱氧腺苷是蛋白抑制剂，抑制腺苷酸环化酶。采用与实施例II相同的方法测定毛喉萜和双脱氧腺苷对白色念珠菌菌落形成的影响。
图7表明α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列号1号)可提高白色念珠菌内cAMP含量，其cAMP的增加量与等摩尔毛喉萜诱导的增加量的数量级相同。图8显示与α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列号1号)一样，毛喉萜也明显抑制白色念珠菌生长(与对照相比p＜0.01)。图9表明双脱氧腺苷能过扭转α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列号1号)对白色念珠菌生长的影响。
本实施例说明α-MSH及其衍生物抑制白色念珠菌和其它微生物生长的作用最可能是通过增加cAMP水平实现的，cAMP含量的提高抑制mRNA和蛋白合成(参阅Bhattacharya A.等，《cAMP对白色念珠菌RNA和蛋白合成的作用》(Effect of Cyclic AMP on RNAand Protein Synthesis in Candida albicans)，《生化与生理研究通讯》(Biochem.Biophysics.Res.Commun.)771483-44(1997))。
实施例VIII本实施例阐明α-MSH或其衍生物抑制人体细胞内病毒复制的能力，或者更确切地说，阐明α-MSH抑制慢性感染的人单核细胞内HIV-1病毒的复制和表达。
HIV-1慢性感染的幼单核细胞U1细胞系是潜伏型单核细胞HIV感染的体外模型。这些细胞携带两套整合的HIV原病毒拷贝，HIV的基本表达较低。但是，根据RNA转录、p24抗原或逆转录酶释放等测定的病毒复制可以被不同的刺激活化，如TNF-α、IL-6、IL-10、PMA或细胞拥挤状态。
上述细胞置于由完全培养基(含有10毫摩尔Hepes的RPMI1640培养基)、包含2毫摩尔L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)、10％热灭活的FCS(美国犹他州Logan的Hyclone实验室提供)、100单位/毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素(纽约，Grand Island，Gibco实验室提供)，组成的培养基中维持对数期生长，以观察α-MSH和/或其衍生物对HIV复制的影响。首次的试验性实验用来确定上述培养条件下的最佳细胞密度、刺激物浓度HIV-1 p24抗原生成的动力学。在使用前，用HBSS冲洗细胞三次以去除细胞外病毒。然后在浓度为10-15-10-4摩尔范围的α-MSH(1-13)(序列号4号)或(11-13)(序列号1号)存在或缺乏的条件下，将细胞以2×105/毫升的密度(1毫升的最终体积)铺于24孔的平底培养皿，培养皿中只有培养基或加入TNF-α(10毫微克/毫升)(英国英格兰牛津R&D系统提供)。
在进一步的实验中，U1细胞中单独加入浓度为10-5M的α-MSH(11-13)(序列号1号)，这些细胞是经过TNF-α(10毫微克/毫升)、IL-6(20毫微克/毫升)、IL-10(20毫微克/毫升)(英国英格兰牛津的R&D系统提供)、PMA(1毫微克/毫升)(Sigma-Aldrich)或细胞拥挤刺激的。将密度为2×105/毫升的U1细胞在37℃、5％CO2的条件下不更换培养基培养7天，细胞即可达到拥挤状态。由细胞因子或PMA激活的培养只能持续48小时。然后离心以分离上清液，采用市售ELISA试剂盒(美国纽约Buffalo的细胞实验产品有限公司生产)检测p24抗原，采用市售逆转录酶ELISA反向分析试剂盒(瑞典Lund Innovagen生产)检测逆转录酶的释放。对于所有这些实验，在第一天加入α-MSH(11-13)(序列号1号)，每一种条件下的结果的测定均重复三次。
图10表明α-MSH(1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列号1号)在较大浓度范围内明显抑制TNF-α刺激的U1细胞的p24抗原释放。对于上述二种肽最有效的浓度均是10-5M，分别产生52.7％和56.0％的抑制效应。图11表明α-MSH(11-13)(序列号1号)也抑制IL-6、IL-10、PMA或细胞拥挤状态诱导的U1细胞的p24抗原和逆转录酶释放。此外，图12表明，根据Northern印记分析的测定结果，α-MSH(11-13)(序列号1号)还可以抑制PMA刺激的U1细胞的剪切和未剪切HIV-1RNA的转录。
由此本实施例说明α-MSH或其衍生物能够抑制由TNF-α、IL-6和IL-10途径诱导的病毒基因的转录。
实施例VIII本实施例进一步阐明了α-MSH抑制病毒复制和活化的能力，或者更确切地说，阐明了向U1细胞中加入α-MSH的中和性抗体明显增加p24抗原的释放。
U1细胞的培养方法与实施例VII中所述的类似。采用亲和纯化的兔抗α-MSH抗体(瑞典，Malmo，Euro-Diagnostica提供)阻断U1细胞内源性α-MSH的产生，此抗体对介质以1∶250稀释。对照抗体选用同等稀释度的兔IgG。抗α-MSH抗体和对照抗体处理的细胞(2×105/毫升)在培养基或PMA(1毫微克/毫升)中共同培养。37℃培养48小时后，分离上清液并检测p24抗原的释放。在拥挤状态实验中，U1细胞的培养同上述方法，抗α-MSH抗体和对照IgG在第一天加入，第七天收集上清液。
图13表明在静止状态、PMA诱导状态、或U1细胞拥挤状态，阻断α-MSH会明显增加p24抗原的释放。本实施例强有力地提示病毒复制受α-MSH的影响。
实施例IX本实施例阐明了α-MSH和/或其衍生物抑制病毒复制和表达的机制，或者更确切地说，阐明了α-MSH或其衍生物抑制TNF-α诱导的NF-κB活化和结合的机制。
取20×106个U1细胞(在完整培养基中密度为2×105/毫升)制备核提取物，以测定NF-κB活性水平，其中U1细胞先在浓度为10-5M的α-MSH(11-13)(序列号1号)存在或缺失的条件下用TNF-α(20毫微克/毫升)刺激4小时。用冷PBS冲洗细胞一次，缓冲液A(10毫摩尔Hepes(pH7.9)，1.5毫摩尔MgCl2，10毫摩尔KCl，0.5毫摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)冲洗两次，离心，置于冰上，在加入0.1％NP-40的缓冲液A中培养10分钟。随后，弃去上清液，核碎片悬浮于15微升的缓冲液C(20毫摩尔Hepes(pH7.9)，1.5毫摩尔MgCl2，0.42摩尔KCl，0.2毫摩尔EDTA，25％甘油，0.5毫摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)中，冰上培养15分钟，混匀，离心。用75微升标定的缓冲液D(20毫摩尔Hepes(pH7.9)，0.05毫摩尔KCl，0.2毫摩尔EDTA，20％甘油，0.5毫摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)稀释上清液，-80℃保存。结合反应于室温下进行10分钟，反应体系中含有10微克核提取蛋白和0.5毫微克32P标记的NF-κB(30,000cpm/微升)或者AP1混合于缓冲液A(12毫摩尔Tis-HCl(pH7.8)，60毫摩尔KCl，0.2毫摩尔EDTA和0.3毫摩尔DTT)，再加入10％甘油、2微克/毫升牛血清白蛋白和1微克/毫升单链DNA(Pharmacia Biotech)。此研究中用于NF-κB的寡核苷酸有+GAT CCA AGG GGA CTT TCC GCTGGG GAC TTT CCA TG，和-GAT CCA TGG AAA GTC CCC AGCGGA AAG TCC CCT TG。每一个寡核苷酸退火与其互补结合，并且用多聚核苷酸酶在末端标记32P-γ-ATP。为了确定特定链，在与标记探针温浴之前，核提取物先与100倍过量的未标记探针温浴五分钟。然后，混合物在1x TBE条件下，于5％(30∶1)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，再将凝胶干燥，进行放射自显影。
图14表明TNF-α明显增强NF-κB的结合活性，但是与浓度为10-5M的α-MSH(11-13)(序列号1号)共同培养明显降低NF-κB的活化。但是α-MSH(11-13)(序列号1号)并不改变静止细胞NF-κB的活化。此现象说明α-MSH和/或其衍生物通过调控NF-κB的结合而抑制病毒复制和表达。
病毒物质的复制通常依赖被感染细胞的活化状态，受病毒和宿主的相互作用调控。这些宿主因素可能包括TNF-α和其它细胞因子，如白介素。与HIV-1感染和活化类似，单纯疱疹病毒(HSV)在宿主细胞因子作用下也可以从潜伏状态活化。例如，TNF-α和IL-6，但不包括IL-1和IL-3，已经确定可以活化HSV感染。用抗IL-6抗体中和IL-6可明显抑制HSV的活化，相比之下中和α或β干扰素却没有影响。(参阅Baker，M.等，《白介素-6和单纯疱疹病毒1型的关系对行为和免疫病理的提示》(The Relationshipbetween Interleukin-6 and Herpes Simple virus Type-1Implications forBehavior and Immunopathology)，《大脑行为免疫》(BrainBehav.Immunol.)13(3)201-11(1999)；Noisakran S.等，《体外移植的潜伏感染的三叉神经节中HSV-1活化过程中淋巴细胞延迟动力学》(Lymphocytes Delay Kinetics of HSV-1 Reactivation fromin vitro Explanes of Latent Infected Trigeminal Ganglia)，《神经免疫学杂志》(J. Neuroimmunol.)95(1-2)126-35(1999)；Walev，I.等，《TNF-α对小鼠三叉神经节内潜伏单纯疱疹病毒的复活和复制的增强作用》(Enhancement by TNF-α of Reactivation andReplication of Latent Herpes Simplex Virus from Trigeminal Ganglia ofMice)，《病毒学文献》(Arch. Virol.)140(6)987-92(1995)；Domk-Optize，I.等，《内源性毒素刺激巨噬细胞导致持续单纯疱疹病毒感染的复活》(Stimulation of Macrophages by Endotoxin Results inthe Reactivation of a Persistent Herpes Simplex Virus Infection)，《斯堪的纳维亚免疫杂志》(Scand.J.Immunol.)32(2)69-75(1990)；Fauci，A.S.，《HIV所致疾病发病机理中宿主因子的作用》(HostFactors in the Pathogenesis of HIV-induced Disease)，《自然》(Nature)384529(1996))。
TNF-α或包括HSV在内的病毒感染可以导致IκB的靶向损害，后者又可活化NF-κB的核转位。核转位促进NF-κB与DNA操纵子的结合，从而促进大量炎症因子的转录，包括TNF-α、IL-6和其它细胞因子。这些细胞因子的表达又进一步复活其它HSV感染的细胞以产生HSV病毒(参阅Patel，A.等，《单纯疱疹病毒I型对持续NF-κB核转位的诱导提高病毒复制的效率》(HerpesSimplex Virus Type-1 Induction of Persistent NF-κB NuclearTranlocation Increases the Efficiency of Virus Replication)，《病毒学》(Virology)247(2)212-22(1998))。
因此，α-MSH和/或其衍生物通过阻断NF-κB的结合抑制更多活化HSV的炎症性细胞因子的表达。本实施例以及实施例VII-VIII表明α-MSH和/或其衍生物抑制病毒复制、表达和复活，此作用是通过抑制机体细胞因子或其它病毒感染诱发的NF-κB的结合而实现的。
实施例X本实施例阐明α-MSH和/或其衍生物抑制急性感染人体细胞内病毒复制的能力，或者更确切地说，阐明α-MSH抑制实际感染的人外周血单核细胞(PBMCs)内HIV-1复制和表达的能力。
采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离来自正常个体的PBMCs。单核细胞由Percoll梯度分离，然后选取24孔组织培养板，在加入20％FCS的RPMI完全培养基内使其分化7天，成为巨噬细胞(MDM)，细胞密度为106/毫升。用嗜单核细胞的HIVBα-1株(1∶10)感染MDM，过夜。未稀释的病毒群包含107个感染单位/毫升。24小时后，冲洗MDM并将其重新悬浮于完整介质中。一周更换三次，连续三周。采用市售ELISA Retrosys RT试剂盒(瑞典lund Innovagen生产)，感染后每周测定反转录酶的释放量。HIV感染时及其后的每一天加入10-5M的α-MSH(11-13)(序列号1号)，直到最后采样。
图15表明α-MSH明显抑制急性感染的MDM中逆转录酶的释放。此抑制效应在第6天更显著，但第21天仍有统计学意义。
由此本实施例说明感染部位的病毒复制可以被α-MSH和/或其衍生物抑制。所以，通常性传播疾病，尤其是HIV，可以通过α-MSH和/或其衍生物与避孕工具的结合运用而被抑制，避孕工具如用于性交的避孕套、隔膜、海绵和/或性交后所用的含α-MSH和/或其衍生物的栓剂、油脂、油膏、凝胶或气溶胶泡沫。
实施例XI本实施例阐明α-MSH和/或其衍生物的生物学功能相当物。
虽然这里所述特定氨基酸序列是有效的，但对于熟悉本专业的技术人员来说，很容易做到替换或去除氨基酸而不改变肽类的有效性。进一步来说，α-MSH序列的稳定可以大幅度提高肽类活性，替换D-氨基酸构型为L型可以提高或降低肽类活性。例如，α-MSH的稳定类似物，[Nle4，D-Phe7]-α-MSH，其解热作用是母体肽分子大约10倍有余。此物质已知对黑素细胞和黑素瘤细胞有明显的生物学活性。确切地说，在α-MSH(11-13)(序列号1号)的C-末端加入氨基酸能够降低或加强解热效应。加入甘氨酸形成10-13序列(序列号5号)，可以略微减弱其效应；形成9-13序列(序列号6号)，几乎无解热作用；而8-13序列(序列号7号)的解热效应强于11-13序列(序列号1号)。已知Ac-[D-K11]-α-MSH11-13-NH2具有和α-MSH(11-13)(序列号1号)的L型三肽相同的总体效应。但是在三肽的12位以D-脯氨酸替换将导致其活性的丧失(参阅Holdeman，M.等，《一种有效α-MSH类似物的解热活性》(Antipyretic Activity of a Potent α-MSH Analog)，《肽物质》(Peptides)6，273-5(1985)；Deeter，L. B.等，《兔中枢给予α-MSH片断的解热特性》(Antipyretic Properties of centrally Administered α-MSH Fragments in the Rabbit)，《肽物质》(Peptides)9，1285-8(1989)；Hiltz，M.E.，《α-MSH(11-13)类似物的抗炎活性立体化学改变的影响》(Anti-inflammatory Activity of α-MSH(11-13)AnalogsInfluences of Alterations in Stereochemistry)，《肽物质》(Peptides)12，767-71(1991))。
生物学功能相当物也可通过替换具有近似亲水值的氨基酸来获得。例如，异亮氨酸和亮氨酸(亲水指数分别是+4.5和+3.8)可以用来替换缬氨酸(亲水指数为+4.2)，这样仍可得到具有相似生物学功能的蛋白。可供选择的另一种方法针对亲水指数为负值的氨基酸，如赖氨酸(-3.9)可用精氨酸(-4.5)替换，等等。一般而言，和被替换氨基酸亲水指数差别在单位+/-1范围内的氨基酸能够成功地进行替换。
此外，这些经修饰的α-MSH和/或其衍生物的类似物也能够象图16中所描述的KPV二聚体一样形成二聚体。
实施例XII女性经受着阴道、外阴和/或尿道的不适。医生的检查包括上述部位取材的培养。确定了包括任何感染和炎症在内的不适之后，医生可以开处方，如适当的抗生素、抗真菌药、抗病毒药或消炎药。此外，治疗也可以包括剂量达到药理学效应的α-MSH和/或其衍生物的局部应用，α-MSH和/或其衍生物由药膏、油脂、胶体、可溶性药丸、喷雾、栓剂、用于灌注的溶液、或者棉条吸收材料携带到达局部。根据医生的判断，局部治疗可一次或多次使用，直到疾病治愈。
本实施例在医生的判断下适用，也可应用于有阴茎、睾丸和/或尿道不适的男性病人。此外，α-MSH和/或其衍生物的局部治疗也可不在医生的指导下进行，而以非处方药物形式使用。
上述实施例I-XII阐明了α-MSH和/或其衍生物的抗感染活性和应用。其中引用数据的目的只是便于说明实施例，并不是把本发明局限于这些实施例范围内。应该明了的是，对上述实施例的修改并不偏离本发明的精神。而且，这些实施例可单独或联合进行。
权利要求
1.一种包含两个连接在一起的多肽的二聚体，其中第一个多肽包括位于其C末端的Lys-Pro-Val氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的二聚体，其中第二个多肽包括位于其C-末端的Lys-Pro-Val氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的二聚体，其中所述第二个多肽选自由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、和SEQ ID NO7组成的组。
4.根据权利要求1所述的二聚体，其中在所述第一个多肽的N末端所述第一个多肽与第二个多肽连接。
5.根据权利要求4所述的二聚体，其中在所述第二个多肽的N端所述第二个多肽与所述第一个多肽连接。
6.根据权利要求5所述的二聚体，其中所述二聚体是一个同型二聚体或者异质二聚体。
7.根据权利要求6所述的二聚体，其中所述二聚体包括至少一个D型氨基酸。
8.根据权利要求1所述的二聚体，其中所述的两个多肽通过共价键连接，其中所述共价键是一个二硫键。
9.根据权利要求8所述的二聚体，其中每个所述多肽具有一个N末端半胱氨酸，所述N末端半胱氨酸通过一个二硫键将单体连接在一起。
10.根据权利要求9所述的二聚体，其中所述二聚体具有乙酰化N端、或酰胺化C端、或者二者兼有。
11.一种包含两个连接在一起的单体的二聚体，其中所述的两个单体中的每个单体的C末端具有氨基酸序列Lys-Pro-Val。
12.根据权利要求11所述的二聚体，其中所述单体在N末端连接。
13.一种包含二聚体的组合物，其中所述二聚体包含至少一个C-末端，所述C-末端具有氨基酸序列Lys-Pro-Val。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述二聚体是一个同型二聚体或者异质二聚体。
15.在C-末端具有氨基酸序列KPV的多肽在制备用于治疗泌尿生殖系统疾病的药物中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述多肽包括至少一个D型氨基酸。
17.在C-末端具有KPV的二聚体在制备用于治疗泌尿生殖系统疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及治疗泌尿生殖系统疾病的方法。一方面涉及由一种或多种多肽组成的、用于泌尿生殖系统疾病的治疗系统，其中多肽的氨基酸序列包括KPV(序列号1号)、MEHFRWG(序列号2号)、HFRWGKPV(序列号3号)、SYSMEHFRWGKPV(序列号4号)。一种或多种多肽也可以通过上述氨基酸序列形成二聚体。泌尿生殖系统疾病包括感染、炎症、或者二者兼有。在本发明的一个优选实施例中，泌尿生殖系统疾病包括阴道、外阴、尿道、阴茎、和/或直肠的感染、和/或炎症。一种或多种多肽溶于载体内。该多肽与棉条结合，用来预防中毒性休克综合征；或者与避孕工具结合，以防止性传播疾病或感染；还可以与栓剂结合，以便于插入阴道或肛门。
文档编号C07K5/09GK1544461SQ200410038019
公开日2004年11月10日 申请日期2000年3月23日 优先权日1999年3月24日
发明者詹姆斯·利普顿, 安娜·卡塔尼亚, 卡塔尼亚, 詹姆斯 利普顿 申请人:曾根公司