专利名称：冠状病毒特异性t－细胞抗原决定簇的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)的T-细胞抗原决定簇谱，以及所述抗原决定簇作为潜在的免疫治疗药物、疫苗或者治疗性疫苗抗原，可用于研究开发用于预防或治疗与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒感染的药物和疫苗的用途。
背景技术：
与人类相关的冠状病毒(Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus(SARS-CoV))已经被确认为新的一类病毒，人类以迄今最快的速度测定了其基因序列，主要由RNA-依赖性RNA聚合酶、刺突(S)、膜(M)、被膜(E)、核壳(N)、聚合酶(P)等蛋白组成(1、MarraMA等人，SARS相关冠状病毒的基因组序列，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月1日；2、Rota PA等人，与重症急性呼吸道综合征相关的新冠状病毒的表征，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月1日；3、Qin E’de，等人，SARS相关病毒的完整序列和比较分析(Isolate BJ01)，Chinese ScienceBulletin 2003，48(10)941-948；4、Peoros JS，等人，重症急性呼吸道综合征的可能病因-冠状病毒，The Lancet，www.nejm.org，2003年4月8日；5、Ksiazek TG等人，与重症急性呼吸道综合征相关的新冠状病毒，N Engl J Med，2003，348(20)1953～1966；6、Dorsten C等人，重症急性呼吸道综合征患者中新冠状病毒的鉴定，N Engl J Med，www.nejm.org，2003年4月10日；Anand K等人，冠状病毒主要蛋白酶(3CLpro)结构设计抗SARS药物的基础，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月13日)。其中刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白和被膜(E)蛋白组成了病毒外壳，是病毒识别、结合并进入宿主细胞的蛋白质。尤其是刺突S蛋白是关键性蛋白(图1)。
虽然文献研究结果表明HCoV-229E刺突S蛋白的417-546序列是宿主受体结合的部位，但同时也指出不同的冠状病毒通过使用不同的受体进入宿主细胞。这很可能与刺突S蛋白的变异有关(Marra MA等人，出处同前)。核壳(N)蛋白属于胞浆内蛋白，处于病毒颗粒的核心部分，和基因组RNA以结合的形式存在。病毒RNA在细胞质中复制完成后会和N蛋白结合，结合产物可以被M蛋白识别并被包装到病毒颗粒中。所以N和M蛋白与病毒在宿主细胞中的复制具有明显的关系。N蛋白是宿主T-细胞识别的主要位点之一(见图1)。因而，发展合成病毒蛋白的多肽化合物化学库，对于寻找病毒表面蛋白的多重最小多肽抗原决定簇(包括B-细胞和T-细胞抗原决定簇)，进而寻求和发展合成多肽疫苗、临床诊断试剂和血清治疗方案有极其重要的意义。同时，该化学库还可用于筛选并发现病毒结合受体的多重配基，进而阻断冠状病毒进入宿主细胞，发展治疗药物(特别是对于耐药病毒的药物治疗)有极大的参考价值。
目前，寻找抗原决定簇最为常用的方法是利用各种计算机软件，通过已经发表的序列采用亲水性、疏水性、转角结构、HPLC滞留系数、螺旋结构、保守性等参数进行预测。我们的实验结果表明，这种预测方法与实际测得的序列仅有30％～50％的重复性(1、ZHANG XM，LIU G和SUN MJ，Brain Research，2000，868157-164；2、ZHANGXM，LIU G和SUN MJ，Brain Research，2001，895277-282.)。另一种方法是采用组合化学技术对蛋白抗原决定簇谱的研究(“交叉重叠”多肽化合物)组合化学把化学合成、计算机设计选结为一体，能同时产生许多种结构相关但有序变化的化合物，并采用高度灵敏和高通量的生物学方法对这些化合物同时进行筛选，从中确定具有生物活性的物质，或者全新的先导化合物的技术。因而，本技术涉及了许多种类的“似药”分子，如小分子杂环化合物、天然产物、生物寡聚体及其模拟物等。本发明是在前述专利(一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段，申请号200310101892.6。)所组合合成的SARS-CoV“交叉重叠”生物寡聚体多肽化学库基础上完成的。该法的特点是以一定数目的氨基酸残基肽(比如1到50个氨基酸残基)为合成“交叉重叠”片段，将蛋白序列通过逐个错位(或者间隔错位，包括从2到合成肽片段的氨基酸的总位数)的方式全部合成出来，然后进行多肽与抗体、受体、酶、或者细胞等反应，进而有可能发现抗原决定簇、配基、酶的底物或者抑制和激活剂、以及诱导细胞产生细胞因子等。
本发明人采用固相合成技术、射频编码技术短时间内合成了大量的“交叉重叠”多肽化合物，在首次合成与SARS-CoV相关的S、M、E和N蛋白的全部“交叉重叠”多肽的基础上，通过采用ELISPOT实验技术从在先专利申请(200310101892.6)中所得的“交叉重叠”多肽化学库中分四步筛选得到了如下的特异性T-细胞抗原决定簇，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一组冠状病毒SARS-CoV的T-细胞抗原决定簇，其选自至少一种下列多肽序列，或其任一组合，包括T-1KKISNCVADY(S343-352)(SEQ ID NO1)T-2VADYSVLYNS(S349-358)(SEQ ID NO2)T-3DQLTPAWRI(S613-621)(SEQ ID NO3)T-4IIRGHLRMAG(M143-152)(SEQ ID NO4)T-5IPIGAGICAS(S650-659)(SEQ ID NO5)T-6MAGHSLGRCD(M150-159)(SEQ ID NO6)T-7TALALLLLDR(N218-227)(SEQ ID NO7)T-8TVTKKSAAEA(N246-255)(SEQ ID NO8)本发明的完成是在化学合成了冠状病毒(SARS-CoV)结构蛋白“交叉重叠”肽库的基础上完成的。
具体的，本发明首先通过采用物理编码法依据现有技术中公开的相关信息，合成了“交叉重叠”多肽化学库。在此基础上，通过采用ELISPOT实验技术从“交叉重叠”多肽化学库中分四步筛选得到了上述的特异性T-细胞抗原决定簇步骤一将肽库中单一多肽化合物顺序按照每10个多肽(25微克/孔)为一组进行混合，并与含一定细胞数的新鲜分离得到的外周血单核细胞(3×105细胞/孔，从SARS康复患者采取血样中分离得到)在37℃下共孵育24小时，阴性和阳性对照分别为(0.1％DMSO)和(Con A 8.0μg/孔)，再加入生物基化的检测抗体，并显色。IFN-γ-释放细胞数由Bio-Reader 4000(Bio-Sys Inc.德国)读取。本实验中以新鲜分离的正常人外周血单核细胞做对照。
步骤二将第一轮发现的活性孔内多肽分别分配到10个检测板孔内，进行第二次ELISOPT实验(重复第一步)，从而确定单一多肽化合物。代表性结果见图3。
步骤三将单一多肽与一定量的非特异性性免疫调节剂MDP-C(参见在先申请专利，申请号200310101618.9)共孵育，观察是否有协同作用。与正常人的外周血单核细胞对比，只有对SARS康复患者的外周血单核细胞产生显著协同作用的多肽化合物被确认为特异性T-细胞抗原决定簇。代表性结果见图3。
步骤四采用四份SARS康复患者的外周血单核细胞重复实验，具有统计学意义的化合物被最终确认为特异性T-细胞抗原决定簇。结果见图4。
本发明的又一方面涉及上述冠状病毒(SARS-CoV)T-细胞抗原决定簇作为一种新的细胞免疫抗原，用于开发和研制预防和/或治疗重症急性呼吸道综合征的药物和疫苗的用途。
图1显示ELISPOT测定中阴性对照和阳性对照检测结果。
图2显示代表性混合样品的ELISPOT结果。左侧图为空白对照，右侧图为阳性结果。
图3显示单一多肽(T2)的ELISPOT实验结果，以及与非特异性免疫增强剂MDP-C的协同作用。其中黑点代表化合物诱导产生IFN-γ的细胞数。
图4显示多肽刺激产生IFN-γ活性以及与非特异性免疫增强剂MDP-C的协同刺激作用。A-G代表康复SARS病人的外周血单核细胞(PBMC)，(n＝4，代表周姓康复者、辛姓康复者、石姓康复者和苏姓康复者)。H-K代表健康者外周血单核细胞(n＝4)。
A和H为无刺激物对照。BT1，T2，T3，T4各25微克；C代表MDP-C(10.0μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；DMDP-C(3.0μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；EMDP-C(1.0μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；FMDP-C(0.3μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；GMDP-C(0.1μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；IMDP-C(10.0μM)；JT1，T2，T3，T4(各25微克)；KMDP-C(10.0μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)。
a.P＜0.01，b.P＜0.001vs A；c.P＜0.05，d.P＜0.01，e.P＜0.001vs B；f.P＜0.05，g.P＜0.01vs J；h.P＜0.05，i.P＜0.01，j.P＜0.001vs J；k.P＜0.05，l.P＜0.01vs K。
具体实施例方式
组合化学研究分三个阶段分子多样性化合物库的合成；群集筛选(进行活性检测)；活性分子的结构测定。
1、肽库的建立要建立肽文库必须事先考虑许多方面设计模板分子；选择合适的构建单元；确定合成方案；如何完成半自动或者自动合成等。
本发明中我们的主要目的是寻找针对SARS-CoV病毒的人的T-细胞抗原决定簇。选择逐位错位的合成方式可以直接找到最小的抗原决定簇。高通量地合成方法一般采用固相合成技术，特点是中间体的纯化仅采用简单的洗涤和过滤操作即可完成。同时，反应中可以使用大大过量的构建单元来保证反应进行完全，并易半自动化或者自动化。因而，我们选择了固相合成技术，在树脂上完成了全部多肽化合物的合成。使用20种天然L-构型氨基酸为构建单元来合成数千个多肽化合物时，相同的反应条件可以在多肽编码的条件下同步进行，如相同的脱保护步骤、不同的多肽序列与相同的保护氨基酸进行反应步骤等。这样就可以完成大规模、快速地合成。其中编码方式有多种，如化学编码、物理编码等。物理编码的特点是无“化学污染”，无须多余的化学解码步骤等。因而，我们选择了IRORI编码-解码的分类技术。一次可操作数千个化合物的合成，本实验中我们选择了一次合成600～700个多肽化合物的规模。
2、群集筛选总的来讲，筛选可分为随机筛选和定向筛选。但无论是随机筛选还是定向筛选，都要考虑选定筛选模式为固相筛选或者液相筛选，或用何法(细胞功能筛选、受体筛选、抗体筛选等)进行筛选，用何种指示剂(同位素标记、荧光标记、染料染色)等。具体的筛选方法有三种固相筛选、液相筛选和两者的结合。
3、确认活性分子结构编码技术已应用于解析组合库中高活性化合物的结构。最早提出此技术的是Brenner和Lerner，Nicolaou等提出了射频编码合成仪突破了以往的编码形式，它是建立在射频信号及应用多功能微反应仪的半导体记忆装置基础上的。
本发明中使用的射频编码技术可以直接将裂解到96孔板中多肽化合物编码对应孔号。因而，筛选得到的活性孔经过与编码子序号对比即可给出多肽的序列。
具体的，在下面的实施例中分别通过采用ELISPOT技术筛选所述肽化学库，获得了本发明所述的针对SARS-CoV病毒T-细胞的抗原决定簇。
实施例1多肽化合物的合成1)加树脂及射频子选取9个Microkan并分别装入15毫克Rink树脂和射频子并盖紧盖子；2)合并Microkan，在一个适当的容器中用20％哌啶/DMF脱Fmoc保护基15min×2；3)洗涤树脂DMF 3min×6，DCM 3min×3，重蒸DMF 3min×3；IRORI射频子编码(或解码)采用IRORI Sorting程序，按照多肽编码次序将Microkan分配至不同氨基酸反应瓶中；4)在每一个反应瓶中加入溶解于DMF中计算量的Fmoc-保护氨基酸、HOBt、HBTU，振摇反应3h；5)合并Microkan并洗涤树脂DMF 3min×3次；6)重复步骤3～7，直至连接全部氨基酸；7)合并Microkan，重复3～4步；8)采用15％Ac2O/CH2Cl2乙酰化多肽的氨基端15min；9)用CH2Cl23min×3次后，室温晾干；10)采用IRORI Sorting解码Microkan并分配到对应的15毫升裂解管中；11)每一个Microkan用1mL在室温下裂解液裂解2h；12)再用1mL裂解液浸泡洗涤Microkan 5min；13)合并裂解液和洗涤液；14)惰性气体流吹干浓缩至残留少量裂解液；15)加入事先用冰水浴充分冷却的甲基叔丁基醚/石油醚(v/v3/1)，放入冰水浴中冷却20min；16)离心沉淀多肽化合物(3000rpm以上)，10min后小心倾去上清液；
17)再加入冷却的甲基叔丁基醚/石油醚，充分洗涤、离心，倾去上清夜，共两次；18)将多肽残余物置于室温下，直至完全干燥；19)将多肽化合物用10％HOAc/H2O或30％CH3CN/H2O或60％CH3CN/H2O溶解后，经HPLC-MS检测纯度和正确的分子量。
实施例2ELISPOT方法筛选SARS-CoV特异性的T-细胞抗原决定簇根据人类IFN-γELISPOT试剂盒(5个装)(R&D Systems)检测说明书，将包被抗体用1ml PBS溶解，稀释50倍后均匀加入96孔PVDF(Millipore)板，100μl/孔，过夜。第二天，甩弃孔内液体，PBS洗板4次，扣干后待用。无菌采取SARS康复病人及正常人外周血，淋巴细胞分离液密度梯度离心分离其PBMC，用完全RPMI-1640培养基调整细胞至所需浓度，均匀加入96孔PVDF板中，3×105细胞/孔。加入不同浓度的SARS多肽(或SARS多肽混合物)，终体积为100μl/孔。以正常人PBMC为阴性对照，以PMA为阳性对照。PVDF板置于37℃、5％CO2完全湿度的培养箱中培养24h。甩弃孔内细胞和液体，PBST洗板4次。扣干后加入生物素标记的检测抗体(R&D Systems)后继续孵育过夜。甩弃孔内细胞和液体，PBST洗板4次。扣干后用ELISPOT Blue Color Module(R&D system)显色，Bio-Reader 4000(Bio-Sys Inc.Germany)进行检测，计算SFC(Spot-forming cells)的数量，即IFN-γ分泌细胞的数量。
根据SARS-CoV多肽在SARS-CoV基因组的位置构建多肽池(Pooled peptide)，即将错位合成的多肽1-10混合在一起，作为多肽池1，将多肽11-20混合在一起，作为多肽池2，多肽21-30混合在一起，作为多肽池3，依此类推。第一轮筛选时先针对这些多肽池筛选出阳性后，再将阳性多肽池中10个多肽分为单个逐一筛选阳性多肽。最后再用纯化的多肽进行验证。代表性结果参见图2。
实施例3胞壁酰二肽衍生物MDP-C的协同作用胞壁酰二肽衍生物MDP-C的学名为Nα-(1-α-苄基-N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰)-Nε-(3-硝基-反式苯乙烯基羰基)-L-赖氨酰胺(专利申请号200310101618.9)，具有非特异性免疫增强作用。本实验中在实施例2的每一项实验的多肽中都加入0.1μM～10μM的MDP-C，观察其对多肽化合物刺激SARS康复病人PBMC产生IFN-γ的协同效果，实验步骤同实施例2。结果参见图3。
采用四份SARS康复患者的外周血单核细胞重复实验，具有统计学意义的化合物被最终确认为特异性T-细胞抗原决定簇。结果见图4。
其中，A-G代表康复SARS病人的外周血单核细胞(PBMC)，(n＝4，代表周姓康复者、辛姓康复者、石姓康复者和苏姓康复者)。H-K代表健康者外周血单核细胞(n＝4)。
A和H为无刺激物对照。BT1，T2，T3，T4各25微克；C代表MDP-C(10.0μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；DMDP-C(3.0μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；EMDP-C(1.0μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；FMDP-C(0.3μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；GMDP-C(0.1μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)；IMDP-C(10.0μM)；JT1，T2，T3，T4(各25微克)；KMDP-C(10.0μM)+T1，T2，T3，T4(各25微克)。
aP＜0.01，bP＜0.001vs A；cP＜0.05，dP＜0.01，eP＜0.001vs B；fP＜0.05，gP＜0.01vs J；hP＜0.05，iP＜0.01，jP＜0.001vs J；kP＜0.05，lP＜0.01vs K。
实施例4SARS康复病人的HLA分型检测八位SARS康复病人的HLA基因分型是根据帕弗瑞公司临床系统(PEL-FREEZ Clinical Systems)ABDR-SSP UniTray试剂盒的说明书的标准程序进行的。即，先用RNA提取试剂盒(PEL-FREEZ)分别从SARS康复病人外周血中提取mRNA，然后对每份RNA进行逆转录，再根据AB-DR匹配的可能所有基因亚型设计的多种引物在相同外界条件(Tm值除外)下、在同一块512孔板上进行PCR，进行35个循环。相同外界条件下凝胶电泳，紫外光下成像。用PEL-FREEZ自主开发的软件计算出相应的HLA基因亚型。
序列表<110>中国医学科学院药物研究所<120>冠状病毒特异性T-细胞抗原决定簇<130>IDC040059<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>corona virus<400>1Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>corona virus<400>2Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser1 5 10<210>3<211>9<212>PRT<213>corona virus<400>3Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile1 5
<210>4<211>10<212>PRT<213>coronavirus<400>4Ile Ile Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>coronavirus<400>5Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>coronavirus<400>6Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp1 5 10<210>7<211>10<212>PRT<213>coronavirus<400>7Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg1 5 10
<210>8<211>10<212>PRT<213>coronavirus<400>8Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala1 5 10
权利要求
1.一组与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒的T-细胞抗原决定簇，其选自至少一种下列多肽序列，或其任一组合，包括T-1KKISNCVADY(S343-352)(SEQ ID NO1)T-2VADYSVLYNS(S349-358)(SEQ ID NO2)T-3DQLTPAWRI(S613-621)(SEQ ID NO3)T-4IIRGHLRMAG(M143-152)(SEQ ID NO4)T-5IPIGAGICAS(S650-659)(SEQ ID NO5)T-6MAGHSLGRCD(M150-159)(SEQ ID NO6)T-7TALALLLLDR(N218-227)(SEQ ID NO7)T-8TVTKKSAAEA(N246-255)(SEQ ID NO8)
2.权利要求1所述冠状病毒(SARS-CoV)T-细胞抗原决定簇的用途，其作为一种新的免疫治疗药物、疫苗或者治疗性疫苗抗原，用于开发和研制预防和/或治疗重症急性呼吸道综合征的药物和疫苗的用途。
全文摘要
本发明涉及一组与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒的B－细胞抗原决定簇。本发明还涉及上述冠状病毒(SARS－CoV)T－细胞抗原决定簇作为一种新的免疫治疗药物、疫苗或者治疗性疫苗抗原，用于开发和研制预防和/或治疗重症急性呼吸道综合征的药物和疫苗的用途。
文档编号C07K7/08GK1746181SQ20041007456
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月8日 优先权日2004年9月8日
发明者刘刚, 程桂芳, 李莉, 杨红振 申请人:中国医学科学院药物研究所