具有多种功能的细胞因子的制作方法

专利名称：具有多种功能的细胞因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及新颖的细胞因子的多核苷酸及多肽、含有所述多核苷酸的载体或宿主细胞、生产所述多肽的方法、或所述多肽或多核苷酸的应用。
背景技术：
细胞因子为小分子的分泌性多肽类因子，包括白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等。细胞因子通过特异性结合细胞表面受体发挥效应，调节机体的免疫功能，参与免疫细胞的增殖、分化和行使功能。细胞因子除存在于免疫系统外，在机体的各个系统也广泛存在，发挥极为重要的生理调节作用。目前有十余种细胞因子基因工程药物已经被批准上市，治疗肿瘤、感染、造血功能障碍等疾病，另有数十种细胞因子药物在临床实验中，细胞因子抑制剂的新药及临床研究也在近年来获得快速的发展。因而，发现新的细胞因子，进行功能和应用研究是国际的热点领域，具有重要的理论意义和实用价值。
趋化因子(chemokine，又称趋化素)，是一类结构相似、分子量8-12kD、具有细胞趋化作用的小分子多肽，它们在机体的免疫防御、免疫调节、炎症反应、造血调节、血管生成等方面具有重要作用。趋化素样因子(chemokine-like factor，CKLF)是由本发明人最先克隆成功并命名的细胞因子。功能研究发现，CKLF1具有广谱的趋化活性和增殖刺激活性(参见国际申请PCT/CN00/00026)，而CKLF2是CKLF的全基因产物，编码152个氨基酸。在上述CKLF的基础上，本发明人又陆续得到了一些新的细胞因子。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种多核苷酸。
本发明的另一目的是提供一种含有本发明的多核苷酸的载体。
本发明的另一目的是提供一种含有本发明的载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种生产本发明的多肽的方法。
本发明的另一目的是提供一种本发明的多核苷酸片段。
本发明的另一目的是提供一种多肽。
本发明的另一目的是提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的多核苷酸或其药物可接受的盐、载体、宿主细胞、或多肽或其药物可接受的盐，以及一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的另一目的是提供本发明的多核苷酸或多肽在制备预防和/或治疗免疫缺陷、造血功能障碍或艾滋病的药剂中的应用。
本发明的另一目的是提供检测待测样品中本发明的多核苷酸的表达水平是否变化的方法。
本发明的另一目的是提供一种单克隆或多克隆抗体，其与本发明的多肽或其具有抗原性的片段特异性结合。
本发明提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含(1)编码如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸，或编码如SEQ ID NO2所示的198-248位氨基酸序列的多核苷酸；或(2)与(1)具有至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的多肽与(1)编码的多肽具有相同的功能。
如SEQ ID NO2所述的氨基酸序列为趋化素样因子超家族(chemokine-like factor superfamily)的一个成员，本文定义为CKLFSF2，定位于16q22.1。CKLFSF2的氨基酸序列如SEQID NO2所示，全长248个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基94-111，116-135，142-116，179-198。SignalP分析表明该蛋白没有明显的信号肽。CKLFSF2在蛋白一级序列上与CKLFSF其它成员的同源性不高，但与多数CKLFSF成员相似，具有潜在的四次跨膜结构和MARVEL结构域，以及小窝蛋白结合结构域(caveolin-binding domain)和AR结合基序(AR-binding motif)，提示它们在功能上具有相关性。
本发明人利用DNAstar软件对CKLFSF2亲水性和抗原性进行了分析，表明在CKLFSF2两端具有较强的抗原性，因此本发明以羧基端51个氨基酸(CKLFSF2 C51，SEQ ID NO2所示的198-248位氨基酸序列)为例研究了CKLFSF2的片段及其功能。
本发明的多核苷酸序列可以只编码SEQ ID NO2所示的多肽或其片段，也可以在上述多肽或其片段的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。
本发明的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。本发明所述的反义链可以为如SEQ ID NO1所示的序列的互补序列。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内本发明CKLFSF2的表达。本发明的CKLFSF2的核苷酸序列可以来自任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，优选人类。
本发明还包括与编码CKLFSF2或其片段的多核苷酸具有至少有70％、80％、85％，较好90％，最好95％同源性的多核苷酸序列。特别涉及在严格条件下与CKLFSF2的多核苷酸杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”意指发生杂交的前提是序列间至少具备95％的同源性。这样的序列可以是天然存在或人工产生的，可以包括CKLFSF2多核苷酸序列的等位基因变异体、也可以包括CKLFSF2多核苷酸序列中碱基的缺失、插入及置换。这样的序列编码的多肽可以在功能上与本发明的CKLFSF2相同、相似、或不同，但最好是编码与CKLFSF2生物学活性基本相同的多肽。因此，本发明优选与编码SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO2所示的多肽具有相同的功能。
本发明多核苷酸更优选包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的多核苷酸序列或其互补片段，其中如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列来源于人睾丸cDNA文库，全长1065个核苷酸，包含编码CKLFSF2蛋白的序列，(例如编码序列(CDS)核苷酸153-899)和5′非编码区(核苷酸1-152)及3′非编码区(核苷酸900-1065)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码CKLFSF2蛋白序列，例如SEQ ID NO1所示的编码序列核苷酸153-899。本发明如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列在Genbank中的登录号为AF479260。
如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的多核苷酸序列的片段也在本发明的范围之内，所述片段如SEQ ID NO1的752-904位所示的多核苷酸或其互补序列。所述片段编码的多肽具有与SEQ ID NO1所示的序列编码的多肽相同的功能。
本发明还提供一种含有编码本发明CKLFSF2多肽的多核苷酸或其片段的基因工程载体。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体等。其中普通载体主要用于各种基因组文库和cDNA文库的建立，它们通常含有两个或两个以上的标记基因，其中一个基因用于选择转化体(transformant)，另一基因则是用于检查载体中是否有外源DNA插入。表达载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产一些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于cDNA文库的建立。这类载体除具有普通型载体的特征外，表达载体中应含有适当的启动子、核糖体结合位点、终止子等。为了便于表达产物在细胞中定位，在多肽编码序列上游可加入适当的前导序列。合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明的多核苷酸以及合适的转录及翻译调控元件之载体的方法。具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。GST原核表达系统也可用于本发明。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯1126-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的一个实施方案中(参见实施例3)，以抗原性较强的CKLFSF2羧基端51个氨基酸(CKLFSF2C51)为例，构建本发明的测序载体和表达载体。其中，将CKLFSF2 C51核苷酸序列克隆至pGEM-T easy质粒中(Promega)进行纯化测序；采用EcoRI处理的pGEX-4T-3载体(Amersham-Pharmacia Biotech公司)，构建本发明携带CKLFSF2 C51的表达载体pGEX-4T-3-CKLFSF2 C51。在实施例5中，将CKLFSF2cDNA完整开放读码框架，酶切产物连接到EcoRI、Cip处理的pcDNA3.1B载体(Ivitrogen公司)中，得到pcDNA3.1B-CKLFSF2。另外，在实施例10中，还将CCR4和CCR5的完整开放阅读框的cDNA片段克隆到pcDI载体中，使之在HEK 293细胞(ATCC CRL-1573)中有效表达。
本发明同时提供一种适于表达本发明多肽的宿主，该宿主包括但不限于原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman(Cell 23175，1981))及其它的能表达相容载体的细胞系。本领域技术人员周知将含有本发明的多核苷酸的构建体导入上述宿主细胞的方法，包括但不限于氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.；Ausubel，F.M.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)，McGraw Hill，N.Y.191-196；Engelhard，E.K.等人，PNAS，913224-3227；Logan，J.等人，PNAS，813655-3659)。在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞以及所表达的目的多肽的性质选择相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。在本发明的实施例中使用的宿主细胞例如大肠杆菌JM 105，大肠杆菌BL21，HEK293细胞(ATCC CRL-1573)和293T细胞(ATCC CRL-11268)等。
本发明还提供一种生产多肽的方法，其包括以下步骤(1)在适于表达的条件下，培养含有编码本发明多肽的多核菅酸或其片段的宿主细胞；(2)从所述细胞培养物中获得多核苷酸编码的多肽。
具体地说，在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的CKLFSF2的多肽或其片段或融合多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。
本发明CKLFSF2多核苷酸序列的片段还可以为本发明多核苷酸的至少10，例如至少20个，至少30，至少50个连续核苷酸序列的片段。这些片段可以用作引物或者杂交探针，用于检测编码本发明的多核苷酸序列。此外，本发明的多核苷酸的片段，也可以是如SEQ IDNO1所述的多核苷酸或其互补序列的一部分，例如反义寡核苷酸可用于抑制细胞内本发明CKLFSF2的表达。至于这些片段是否编码多肽或编码的多肽是否具有本发明的多肽的功能，对于检测、杂交和/或抑制表达这些用途来说并不是特别重要。
另一方面，本发明提供一种多肽，该多肽包含(1)如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO2的198-248位氨基酸所示的多肽；(2)与(1)具有至少80％同源性的多肽，该多肽的功能与(1)的功能相同。
其中CKLFSF2的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，全长248个氨基酸。prosite计算机软件分析，其具有4个跨膜区，分别位于氨基酸残基94-111，116-135，142-116，179-198。本发明SEQ ID NO2所示序列的片段也在本发明的范围内，如SEQ ID NO2的198-248位氨基酸所示序列。该序列与本发明SEQ ID NO2所示全长序列的功能相同，但是因为其比全长序列短，所以操作起来更方便。本发明多肽还包括与如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO2的198-248位氨基酸所示序列的同源性(序列匹配)超过80％，优选超过85％，更为优选超过90％，更进一步优选超过95％，特别优选超过98％，更进一步特别优选超过99％的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO2所示的序列具有相同或不同的功能，优选具有相同的功能。
本发明CKLFSF2多肽或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本发明CKLFSF2多肽可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生多肽产物(具体参见实施例)。也可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid PhasePeptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成，或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的多肽。
本领域普通技术人员已知，本发明所述的多肽或其片段可以同其它的多肽或其片段形成融合多肽。其它多肽或其片段一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。本发明的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列可以用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)测定。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。
本发明提供一种药物组合物，其含有本发明治疗有效量的多核苷酸、载体、宿主细胞或多肽或其药物可接受的盐；和必要时药学上可接受的载体或赋形剂。
在所述药物组合物中，可以含有本发明治疗有效量的CKLFSF2多核苷酸或其功能片段(与其具有相同功能的片段)、含有其的载体、含有其的宿主细胞或多肽，也可以以所述多核苷酸或多肽的药物可接受的盐形式使用。“药物可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激、变态反应等的盐。本发明的药物可接受的盐是本领域药剂学常规组分。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将多肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。药学上可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。
本发明还公开了本发明的多核苷酸或多肽(包括其功能片段)在制备预防和/或治疗免疫缺陷、艾滋病或造血功能障碍的药物中的应用。
发明人利用pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清及重组人CKLFSF2 C51蛋白进行功能研究，小鼠脾细胞的趋化实验结果表明CKLFSF2具有较强的趋化活性；显微镜下可见重组CKLFSF2 C51促进小鼠腹腔巨噬细胞的粘附，流式细胞术检测发现，CKLFSF2能够上调小鼠腹腔巨噬细胞表面粘附分子CD11b的表达，提示CKLFSF2在免疫应答中发挥作用；所以可以将CKLFSF2多肽或多核苷酸或它们的功能片段用于治疗免疫缺陷。
在此基础上，在钙流实验中，发现CKLFSF2能够使转染有CCR5的HEK293细胞(HEK293/CCR5)发生Ca2+释放，pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清能够封闭CCR5配体CCL5/RANTES的作用，证实CCR5是CKLFSF2功能性受体之一；CCR5是HIV-1感染单核巨噬细胞所必需的共受体，所以，CKLFSF2与CCR5结合会抑制HIV-1与CCR5结合，进而抑制HIV-1感染。因此，本发明的多肽或多核苷酸或其功能片段还可用于治疗艾滋病。
MTT法及骨髓甩片染色发现，CKLFSF2具有促进小鼠骨髓细胞增殖的功能。在体外实验中，MTT结果表明CKLFSF2促进小鼠骨髓细胞的增殖。骨髓细胞甩片在显微镜下可见CKLFSF2真核细胞转染上清和CKLFSF2 C51原核蛋白处理的小鼠骨髓细胞出现明显较大的细胞，而对照组pCDNA3.1B转染上清和PBS则未见异常。由此，本发明的多肽或多核苷酸或其功能片段能够用于治疗造血功能障碍，其中包括原发性或继发性造血功能障碍等病症。
本发明的CKLFSF2是小分子蛋白质，可由生殖系统和造血系统细胞、白细胞等多种细胞产生；虽然CKLFSF2没有典型的信号肽序列，但它存在分泌或可溶形式；CKLFSF2具有趋化作用、免疫增强和造血促进等多种功能；CCR5是其功能性受体之一。因此，CKLFSF2具备了细胞因子的结构和功能特点。
发明还提供一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的多核苷酸或多肽的表达水平是否变化的方法，该方法包括(1)检测待测样品中所述多核苷酸或多肽的表达水平；(2)将待测样品中所述多核苷酸或多肽的表达水平与正常样品的多核苷酸或多肽的表达水平进行比较；(3)确定待测样品中多核苷酸或多肽的表达水平是否变化。
所述正常样品可以从已知未患病的正常人的细胞获得，该细胞应与待测样品细胞的组织来源一致；正常样品的多核苷酸的表达水平可以是从所述正常人的细胞获得的具有统计学意义的多核苷酸的表达水平。其中所述检测待测样品中多核苷酸水平的方法可以为上述任何检测方法，优选利用RT-PCR检测所述多核苷酸在核酸水平的表达水平；或利用特异性单克隆或多克隆抗体检测所述多核苷酸在蛋白质水平的表达水平，例如免疫组织化学检测。所述待测样品可以从来自受试者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。优选为待测者的睾丸组织样品或精液样品。
在本发明的具体实施例中，利用抗CKLFSF2多克隆抗体，在包含6种组织的组织芯片、正常睾丸组织以及睾丸肿瘤组织芯片中检测了CKLFSF2的表达情况，免疫组织化学的结果提示在乳腺、肺、胃、结肠和直肠的正常组织和肿瘤组织未见阳性表达，仅于正常食道上皮的角化细胞中有较强阳性表达；在正常睾丸组织中CKLFSF2能够分泌到生精小管中；而在睾丸肿瘤中，精原细胞瘤的CKLFSF2表达丰度明显高于正常组织，主要存在于细胞浆、细胞膜和核膜，睾丸B淋巴瘤和大B淋巴瘤中表达丰度较低。这与我们表达谱分析的结果一致，并在蛋白质水平上说明CKLFSF2的表达谱较窄，具有天然的分泌形式；与正常睾丸组织中CKLFSF2的表达情况相比，在不同的睾丸肿瘤组织中，CKLFSF2的表达水平和细胞定位均有明显改变，提示CKLFSF2不仅参与正常的生精过程，而且在男性生殖系统肿瘤的发生和发展中具有重要作用。
本发明还提供对本发明CKLFSF2多肽或其片段具有特异性的多克隆和单克隆抗体。这里所述的“特异性”是指抗体能结合于本发明的CKLFSF2基因产物或片段。优选那些能与本发明的CKLFSF2的基因产物结合但不识别并不与其它非相关抗原分子结合的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制本发明CKLFSF2基因产物的抗体，也包括那些并不影响本发明CKLFSF2多肽功能的抗体。上述抗体不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法来制备。例如，纯化的本发明CKLFSF2多肽基因产物或其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。在本发明的一个实施方案中(参见实施例5)，以抗原性较强的CKLFSF2羧基端51个氨基酸(SEQ ID NO2的氨基酸序列198-248(简称CKLFSF2 C51))为例，制备多克隆抗体，经ELISA法检测抗体效价，Western blot鉴定抗体特异性，证实得到效价高、特异性好的抗体，可将该抗体进一步用于CKLFSF2的表达谱分析和功能研究。本发明的抗体还可以是单克隆抗体，其可利用杂交瘤技术制备(见Kohler等人，Nature 256495；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T cell Hybridaomad，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用本发明的CKLFSF2基因产物或其片段或功能区，通过常规免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与本发明CKLFSF2多肽的基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的多肽或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。


图1A和图1B显示通过实验分析CKLFSF2 mRNA在组织中的分布。其中，1阴性对照；2结肠；3脑；4骨髓；5卵巢癌；6结肠癌；7乳腺癌；8胎儿胸腺；9胎儿脾脏；10胎儿肌肉；11胎儿肝脏；12胎儿肾脏；13胎儿心脏；14胸腺；15扁桃体；16睾丸；17脾脏；18骨骼肌；19胎盘；20卵巢；21淋巴结；22肝脏；23白血球；24肾脏；25心脏。
图2显示CKLFSF2 mRNA在静息和活化的血细胞中的分布，其中，1单核细胞(B-，T-细胞，和单核细胞)；2静息的CD4+细胞(T-辅助细胞/诱导)；3活化CD4+细胞；4静息的CD8+细胞(T-抑制细胞/细胞毒性)；5活化CD8+细胞；6静息的单核细胞；7活化单核细胞；8静息的CD19+细胞(B-细胞)；9活化CD19+细胞；-阴性对照；+阳性对照。
图3为原核表达质粒pGEX-4T-3-CKLFSF2C51的构建示意图。
图4显示SDS-PAGE分析CKLFSF2的表达及纯化结果。其中，1未诱导的E.coli BL21/CKLFSF2 C51；2诱导的E.coli BL21/CKLFSF2 C51；3用谷胱甘肽-琼脂糖4B纯化后的CKLFSF2 C51；4纯化的GST对照。
图5显示用抗GST的单克隆抗体鉴定GST-CKLFSF2 C51融合蛋白结果，其中，1未诱导的E coli.BL21/CKLFSF2 C51；2诱导的E coli.BL21/CKLFSF2 C51。
图6显示Western blot鉴定抗CKLFSF2抗体特异性结果，其中，A用抗-CKLFSF2抗体检测；B用抗-Myc抗体检测，作为阳性对照；1对照pcDNA3.1转染上清；2pcDNA3.1-CKLFSF 2转染上清；3pcDNA3.1-CKLFSF 2/Myc-His6转染上清。
图7显示组织芯片检测CKLFSF2在多种组织中的表达，其中，A正常食道组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；B食道癌组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；C正常乳房组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；D乳腺癌组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；E正常肺组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；F肺癌组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；G正常胃组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；H胃癌组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；I正常结肠组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；J结肠癌组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；K正常直肠组织(上图为10倍率，下图为40倍率)；L直肠癌组织(上图为10倍率，下图为40倍率)。
图8显示免疫组化检测CKLFSF2在正常睾丸组织中的表达，其中，使用二抗对照(A10倍率；B40倍率)、使用正常兔IgG对照(C10倍率；D40倍率)及使用CKLFSF2特异性多克隆抗体(E10倍率；F40倍率)。
图9显示睾丸肿瘤组织芯片检测CKLFSF2的表达结果，40倍率，使用CKLFSF2特异性多克隆抗体，A精原细胞瘤(血浆)；B精原细胞瘤(隔膜和血浆)；CB细胞淋巴瘤(+)；DB细胞淋巴瘤(-)；E大B细胞淋巴瘤(+)；F大B细胞淋巴瘤(-)；G中度萎缩睾丸组织；H正常睾丸组织。
图10显示pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清对小鼠脾细胞的趋化作用，其中，(A，C，E，G10倍率；B，D，F，H40倍率)A，BCKLFSF2转染上清；C，D稀释5倍的CKLFSF2转染上清；E，F稀释25倍的CKLFSF2；G，HpCDNA3.1B转染上清。
图11为显示CKLFSF2 C51对小鼠脾细胞的趋化作用的柱状示意图。
图12显示CKLFSF2 C51对小鼠腹腔巨噬细胞粘附的影响，其中，ACKLFSF2 C51处理过的小鼠腹腔巨噬细胞；BGST处理过的小鼠腹腔巨噬细胞，作为对照；C凝血酶处理过的小鼠腹腔巨噬细胞，作为对照。
图13显示流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞CD11b的表达，其中，APBS；BpCDNA3.1B转染上清；CCKLFSF2转染上清；DPBS；EPBS(包含凝血酶)；FCKLFSF2 C51。
图14A与图14B为MTT法检测CKLFSF2对小鼠骨髓细胞的促增殖作用结果分析图，其中，图14ACKLFSF2和pCDNA3.1B转染上清；图14BCKLFSF2 C51和PBS(对照)。
图15显示CKLFSF2对小鼠骨髓细胞的促增殖作用，其中，ApCDNA3.1B转染上清；BCKLFSF2转染上清；CPBS对照；D100ng/L CKLFSF2C51。
图16显示pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清诱导细胞Ca2+释放及对CCL5/RANTES诱导Ca2+释放的封闭作用，是利用激光扫描共焦显微镜检测细胞内Ca2+流的变化。其中，APCDNA3.1B转染上清和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/CCR5；BCKLFSF2转染上清和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/CCR5；CPCDNA3.1B转染上清和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/PCDI；DCKLFSF2转染上清和100nMCCL5/RANTES诱导HEK293/PCDI。
图17显示CKLFSF2 C51诱导细胞Ca2+释放，是利用激光扫描共焦显微镜检测细胞内Ca2+流的变化。其中，APBS和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/CCR5；BCKLFSF2 C51和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/CCR5；CPBS和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/PCDI；DCKLFSF2 C51和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/PCDI。
图18显示pCDNA3.1B转染上清和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/CCR5细胞Ca2+释放。
图19显示pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清诱导HEK293/CCR5细胞Ca2+释放及对CCL5/RANTES诱导Ca2+释放的封闭作用。
图20显示CCL5/RANTES诱导HEK293/CCR5 Ca2+释放及对CKLFSF2诱导Ca2+释放的封闭作用，是利用激光扫描共焦显微镜检测细胞内Ca2+流的变化，其中，A先用100nMCCL5/RANTES处理然后用100nM CCL5/RANTES处理HEK293/CCR5；B先用100nMCCL5/RANTES处理然后用CKLFSF2 C51处理HEK293/CCR5。
图21显示CCL5/RANTES对pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清诱导HEK293/CCR5细胞Ca2+释放的封闭作用。
图22显示pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清和CCL17/TARC诱导HEK293/CCR4细胞Ca2+释放，是利用激光扫描共焦显微镜检测细胞内Ca2+流的变化，其中，APCDNA3.1B真核细胞转染上清和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/CCR4；BCKLFSF2真核细胞转染上清和100nM CCL5/RANTES诱导HEK293/CCR4。
具体实施例方式
实施例1CKLFSF2全长cDNA序列的拼接与扩增1、CKLSF2全长cDNA的EST拼接利用CKLF2蛋白质序列(Genbank登录号AF135380)对蛋白质数据库(NCBI的blastp)和人的表达序列标签(Expression Sequence Tag，简称EST)进行数据检索和同源性比较，发现多组EST序列(见表1)，通过EST Assembly machine(网址为http//www.tigem.it)进行EST拼接，形成重叠群(contig)再次进行BLAST拼接，找到完整的读码框架。得到人趋化素样因子超家族成员2(CKLFSF2)全长cDNA序列(参见SEQ ID NO1)。
CKLFSF2全长cDNA序列拼接的EST序列BG826826，AA778552，BG212551，AI201364，AW663435，AI2230252.PCR扩增根据EST拼接得到的CKLFSF2的全长cDNA序列，设计特异的引物，序列为P1 5’-TCGGTGGTCCTGGCAGTTAG-3’(-143～-124)(SEQ ID NO3)P2 5’-CAAGCAAAGGTGGTAATGAAAATG-3’(845～868)(SEQ ID NO4)以Multiple Tissue cDNA Panels试剂盒(BD Biosciences Clontech公司)提供的人睾丸组织单链cDNA文库作模板，进行PCR扩增，扩增条件如下94℃，2分钟；94℃，15秒，59℃，15秒，72℃，30秒，35个循环；72℃，7分钟。
实施例2CKLFSF2mRNA在多种组织和细胞系中的检测上述信息学分析为CKLFSF2表达状况提供了参考，下面用实验进行分析和验证。
1.细胞总RNA的提取总RNA的提取利用GIBCO-BRL公司的TRIZOLTM试剂。取生长良好的多种细胞系，在60mm的培养皿中加入1ml TRIZOLTM(Gibico公司)试剂，反复吹打破碎细胞，转移到1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中，室温静置5分钟后加入0.2ml氯仿，猛烈振荡15秒后，12000rpm于4℃离心15分钟，收集上清，用0.7倍体积异丙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，室温干燥后，总RNA复悬于DEPC处理的H2O中，分光光度计(Beckman 640)定量后用于逆转录。
2.逆转录合成单链cDNA利用CLONTECH公司SMART(TM)RACE试剂盒提供的Powerscript逆转录酶和转换引物(switching primer)进行逆转录，合成单链cDNA。5μg总RNA，oligo(dT)(10μM)1μl，SMARToligo(10μM)1μl，加H2O至5μl反应体积，混匀，70℃ 2分钟，快速冰浴冷却2分钟，短暂离心后，加入2μl 5×第一链合成缓冲液(First Strand synthesis Buffer)，1μl 10mM dNTP Mix，1μlH2O，1μl Powerscript逆转录酶，轻轻混匀后，置于42℃空气浴孵箱中，反应90分钟，冰浴，终止第一链cDNA合成反应。合成后cDNA第一链冷冻于-80℃保存或直接进行PCR反应。
3.PCR扩增以Multiple Tissue cDNA Panels试剂盒(BD Biosciences Clontech公司)提供的多种组织cDNA、Human Blood Fractions cDNA Panels试剂盒(BD Biosciences Clontech公司)提供的多种血细胞cDNA和上述逆转录得到的多种细胞系的cDNA为模板，设计引物，序列如下P3 5’-AGTCATGGCACCTAAGGCGG-3’(-4～16)(SEQ ID NO5)P4 5’-CCTCCAAGTCATTTCTTTCCC-3’(735～755)(SEQ ID NO6)进行第一次PCR扩增，扩增条件如下94℃，2分钟；94℃，15秒，59℃，15秒，72℃，30秒，30个循环；72℃，7分钟。
将血细胞和细胞系PCR扩增产物10倍稀释，取1μl作为模板，其它条件同上进行第二次PCR扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
4.CKLFSF2mRNA在组织中的分布采用已经为多种看家基因预先标准化的多种组织cDNA文库(Multiple Tissue cDNAPanels)，来检测CKLFSF2 mRNA在组织中的分布情况。结果参见图1A和图1B，从图中可以看出，按照表达丰度高低依次为睾丸、骨髓和白细胞，此外，在胎盘、卵巢、胎肝和脑也有少量表达，其它组织未检测到CKLFSF2的表达。
与生物信息学分析结果相一致，可见CKLFSF2主要表达于生殖、免疫和造血系统，本发明将以此为基础，进一步来研究CKLFSF2的功能。
5.CKLFSF2 mRNA在静息、活化白细胞中的表达CKLFSF2在外周血白细胞中高表达，因此采用Human Blood Fractions cDNA文库(BDBiosciences Clontech公司)进行扩增，请参见图2，为CKLFSF2 mRNA在静息和活化的血细胞中的分布结果，从图中可以看出，在外周血单个核细胞、T淋巴细胞和单核细胞中都检测到CKLFSF2 mRNA的表达，而在B淋巴细胞则未见其表达；静息的CD8+T淋巴细胞和静息的单核细胞中多出一约600bp的片段，而在相应的活化细胞中则无此条带，推测其可能是CKLFSF2的一种变异体，但尚需测序验证。
6.CKLFSF2 mRNA在细胞系中的分布提取8种细胞(包括正常细胞系、肿瘤细胞系及人外周血白细胞)的总RNA，经RT-PCR检测CKLFSF2的表达。由于CKLFSF2的表达量低，在各种细胞中第一次扩增30轮均未见明显条带；在第二次扩增后，在Jurkat(人白血病细胞系)、PMA刺激的Jurkat、HeLa S3(人宫颈癌细胞系)、A204(人横纹肌肉瘤细胞系)和人外周血白细胞中可见CKLFSF2的表达。
CKLFSF2细胞系分布与生物信息提示和组织表达谱结果相似，阳性表达的细胞系可以用于以后的基因功能和调控研究。
实施例3CKLFSF2 C端51氨基酸多肽的原核细胞表达质粒的构建和鉴定为了进一步了解CKLFSF2的功能，首先对其氨基酸序列进行生物信息学分析，并根据提示的信息，选择抗原性较强的CKLFSF2羧基端51个氨基酸，用于原核蛋白的表达，CKLFSF2 C51可以用于功能研究和抗体制备。由于CKLFSF2 C51与本发明具有相同的功能，所以其可以代替本发明的全长多肽，制备本发明的药物组合物或用于预防和/或治疗免疫缺陷、艾滋病或造血功能障碍。
1.生物信息学分析ProtScale软件分析亲疏水性，可以看出CKLFSF2疏水性强；疏水性强的蛋白较难用原核细胞表达完整蛋白，所以进一步根据氨基酸序列进行抗原性预测，以选择抗原性强的部分表达蛋白片段；DNAStar软件分析可见羧基端(198-248氨基酸)抗原性较强，因此，本发明进行了CKLFSF2C51原核蛋白的制备。
2.pGEM-Teasy-CKLFSF2 C51的构建和测序1)CKLFSF2 C51片段的扩增按照CKLFSF2 cDNA序列设计了扩增其C端198-248氨基酸(简称CKLFSF2 C51)的上、下游引物，并将引物序列加入EcoRI酶切位点及保护碱基。阴影部分为设计的EcoRI酶切位点和保护碱基。P5 5′ CCTTCAAAGAAACCACTTCAGAGGC-3′(SEQ ID NO7)，P6 5′ TATTTCTTTCCCTTTGCTGGCC-3′(SEQ ID NO8)。
以pcDNA3.1B-CKLFSF2为模板，进行PCR扩增，扩增条件如下94℃，5分钟；94℃，15秒，59℃，15秒，72℃，30秒，25个循环；72℃，7分钟。
2)PCR产物的纯化PCR产物经TAE配制的琼脂糖电泳分离后，切下PCR条带，加3倍体积的NaI(6M)，45-55℃融胶，加GLASSMILK悬浮液5-10μl，在旋转仪上孵育10min，短暂离心沉淀Glassmilk/DNA复合物，用DNA洗涤溶液洗3次，加H2O于45-55℃洗脱。
3)PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体1μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液，1μl pGEM-TEasy载体(promega)(50ng)，PCR产物25ng，1μl T4 DNA连接酶(3 Weiss units/μl)，加H2O至10μl，4℃连接过夜。连接产物转化XL-1Blue菌，筛选克隆可采用蓝白斑颜色反应。
4)质粒的提取和纯化用于测序和转染真核细胞的质粒用Qiagen质粒纯化试剂盒提取。以Qiagen-tip20为例，操作如下挑单菌落于3ml含50-100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，培养12-16小时，离心，重悬于含100μg/ml RNase A的0.3ml缓冲液P1中，加0.3ml缓冲液P2，颠倒4-6次，室温放置5分钟，加4℃预冷的0.3ml缓冲液P3，颠倒4-6次，冰浴5分钟。高速离心，上清加入经1ml缓冲液QBT平衡好的Qiagen-tip20柱中，用1ml缓冲液QC洗柱，重复4次，加0.8ml缓冲液QF洗脱质粒，加0.7倍体积的异丙醇，室温高速离心30分钟。弃上清，用70％乙醇洗二遍。空气干燥5分钟，溶于H2O中。根据所选柱体积的不同，相应扩大缓冲液的体积。
5)测序使用ABI PRISM 3100 Sequencer遗传分析仪进行DNA序列测定。测序反应按公司提供的测序试剂盒中的的方法。
3.pGEX-4T-3-CKLFSF2 C51原核表达质粒的构建和鉴定将测序正确的pGEM-Teasy-CKLFSF2 C51质粒，用EcoRI酶切，释放出CKLFSF2 C51片段，连接到EcoRI处理的pGEX-4T-3载体(Amersham-Pharmacia Biotech公司)上，并且保证ORF不发生移码，正确表达CKLFSF2 C51融合蛋白。质粒构建流程图如图3所示。
连接产物转化大肠杆菌JM105，CKLFSF2 C51 cDNA存在两种插入的可能性，即正向和反向两种插入可能。用GST上游引物和CKLFSF2下游引物进行PCR鉴定，琼脂糖电泳分析得到正向连接的重组质粒。鉴定正确后，提取质粒以备表达原核蛋白，质粒命名为pGEX-4T-3-CKLFSF2 C51。此原核表达质粒可以表达GST-CKLFSF2 C51融合蛋白，用于免疫动物、制备抗体，以及功能研究。
4.CKLFSF2 C51原核蛋白的表达和免疫学鉴定为了得到重组人CKLFSF2 C51蛋白，本实施例用pGEX-4T-3-CKLFSF2 C51表达质粒转化大肠杆菌BL21，用终浓度为10μmmol/L的IPTG进行了诱导表达。结果参见图4，显示SDS-PAGE分析小批量诱导表达产物结果，在预计位置出现一条明显的蛋白带，相对分子质量约为31kD，大小与预期值基本一致。
用抗GST的单克隆抗体检测融合蛋白的表达，由图5中可见，此原核表达的融合蛋白可与GST抗体特异性结合，为GST融合蛋白。
实施例4重组GST-CKLFSF2 C51融合蛋白的表达和纯化1.重组GST-CKLFSF2 C51融合蛋白的诱导表达转化pGEX-4T-3-CKLFSF2 C51质粒至表达菌株E coli.BL21，用引物P5和P6对克隆进行PCR鉴定。挑选阳性克隆，37℃进行培养扩增，至OD6001.5，加入终浓度为100μmol/L的IPTG 30℃诱导1小时。
2.重组GST-CKLFSF2 C51融合蛋白的纯化以6000r/min离心收集诱导菌，每1L诱导菌重悬于50-100ml PBS(10mmol/L PB pH7.4，0.14mol/L NaCl)，含5mmol/L的DTT。在冰浴条件下超声破菌，收集超声后的液体，混匀，20000r/min(Beckman JA25.50)4℃离心20分钟，收取上清，保存在4℃。用Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析柱料(已溶涨)在4℃进行蛋白的纯化。用冷PBS进行预平衡，上柱流速为5ml/min，上柱后用冷PBS洗至OD280到基线水平。然后用50mM Tris HCl，PH8.0(含10mM的还原型谷胱甘肽)进行洗脱。对洗脱蛋白进行Bradford法蛋白定量。将1L大肠杆菌的表达产物用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析的方法纯化后可以得到5mg融合蛋白，该法纯化后的GST-CKLFSF2 C51蛋白纯度可达95％以上，见图4。此纯度的蛋白可以用于抗体制备。部分样品进行SDS-PAGE分析。
3.重组GST-CKLFSF2 C51融合蛋白的凝血酶切割估计柱料所吸附的蛋白量(每ml柱料大致可吸附20mg蛋白)，将所需要的凝血酶(10U/mg蛋白)稀释至适当体积的PBS中，在柱子上进行凝血酶切，酶切时间一般为1-2小时。收集酶切后的蛋白产物，用适当大小截留分子量的超滤装置浓缩蛋白浓度至2-3mg/ml，再用Sephacryl S-200凝胶过滤柱分离目的蛋白，纯化蛋白用BCA(Pierce公司产品)方法进行定量。
4.GST-CKLFSF2 C51融合蛋白的免疫学鉴定电泳采用常规方法，将含重组质粒的表达工程菌诱导表达，裂解菌体，上清液进行15％SDS-PAGE电泳；转膜电泳后将蛋白电转移至经过甲醇活化的Bio Trace PVDF膜(Amersham-Pharmaciabiotech公司)上，使用1×CAPS电转液，90V，120分钟；封闭电转移后，膜用5％脱脂奶粉(TBST配制)室温封闭1小时；加入一抗加入小鼠抗人GST单克隆抗体，于4℃过夜反应；加入二抗用TBST(TBS+0.05％ Tween-20)充分洗涤4-6次，每次10分钟；然后加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG(1∶5000，Promega)，室温作用1小时；发光TBST充分洗涤4-6次，每次10分钟；用TBS洗涤一次后，使用ECL发光试剂盒，发光后X-film曝光，显影定影后分析蛋白条带。
5.重组人CKLFSF2 C51蛋白测序鉴定1L诱导菌纯化后的蛋白经10U凝血酶切割去GST，切下的CKLFSF2 C51蛋白片段在中国医学科学院基础医学研究所进行N端测序，结果测得N端13个氨基酸为GSPNSLQRNHFRG，与预期序列一致。
重组CKLFSF2 C51片段用于进行功能研究。
实施例5抗GST-CKLFSF2 C51融合蛋白抗体的制备和鉴定一、抗GST-CKLFSF2 C51融合蛋白抗体的制备1.免疫方案第一次免疫剪去兔子两后脚掌的部分兔毛，碘酒和酒精消毒。用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)完全乳化的500ug GST-CKLFSF2C51(1∶1)1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
第二次免疫间隔2-3周后，于背部两旁皮下4-6点注入弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原1ml。间隔7-10天后，从耳缘静脉采血0.5ml，分离血清，ELISA方法检测血清效价。
加强免疫每隔2-3周加强免疫，方法同上。5次免疫至效价达到要求后立即放血。
2.放血、分离血清和抗体的纯化心脏放血法兔子仰面，四肢缚于动物固定架上。剪去左胸部兔毛，消毒皮肤。左拇指摸到心脏搏动最强的部位，用50ml注射器，倾斜45°，对准心脏搏动最强处刺入，抽血至兔子死亡。
分离血清将血液放入三角烧瓶，室温静置1小时，再置4℃冰箱3-4小时。待血液凝固血块收缩后，吸出血清，2000rpm离心20分钟，取上清，再10000rpm离心20分钟，取上清，加入防腐剂(终浓度0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠)，分装后置-20℃冰箱中保存备用。
抗体的纯化部分血清经GST吸收后，HiTrapTM Protein G亲和层析，按说明操作并保存于0.01M PBS中。
二、ELISA方法检测血清效价1.方法包被将CKLFSF2 C51用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml，按照100μl/孔的量包被NUNC 96孔酶标板，4℃过夜包被；封闭用PBS-T(10mmol/L PB，140mmol/L NaCl，0.1％Tween20，pH7.4)洗涤3次，然后按照200μl/孔的量加入封闭液(3％BSA+PBS)；加入一抗用PBS-T洗涤3次，每孔加入100μl倍比的免疫血清(0.1％BSA+PBS稀释)，正常兔血清作为阴性对照，每个样品设3个复孔，37℃孵育2小时；加入二抗用PBS-T洗涤3次，每孔均加入100μl用含0.1％BSA的PBS稀释的抗羊单克隆抗体(Anti-Goat-monoantibody)-HRP(1∶4000 Sigma公司)，37℃孵育；显色与终止显色用PBS-T洗涤3次，加入50μl OPD显色液，室温避光显色10-15分钟，用25μl 2mol/L的硫酸终止反应；读数在490nm波长下用EL-311SX ELISA Reader读数。
2.结果用纯化后的融合蛋白免疫家兔，获得抗血清，以常规间接ELISA法测定抗体的效价。该抗血清的效价为1∶10000。
三、Western blot鉴定抗体的特异性为了进一步确定所制备的多克隆抗体的特异性，以转染pcDNA3.1B-CKLFSF2和pcDNA3.1B-CKLFSF2/Myc-His6的293T细胞裂解液为抗原进行Westernblot检测。
1.方法1)构建真核细胞表达质粒pCDNA3.1B-CKLFSF2根据CKLFSF2 cDNA编码区核酸序列，设计用于扩增CKLFSF2完整开放读码框架(open reading frame，ORF)的引物上游引物为P1’5’-AAGGACACCGAGTCAGTCATG-3’(SEQ ID NO9)和下游引物为P2’5’-TCATTTCTTTCCCTTTGCTGGCC-3’(SEQ ID NO10)，以人睾丸cDNA文库为模板，以P1和P2进行PCR扩增。琼脂糖电泳回收PCR产物，连接到pGEM-Teasy载体中；连接产物转化大肠杆菌DH5α；挑取阳性克隆，测序，正确质粒经EcoRI酶切，释放出CKLFSF2片段，酶切产物连接到EcoRI、Cip处理的pcDNA3.1B载体(Invitrogen)中，筛选正向插入克隆，得到pcDNA3.1B-CKLFSF2。
2)质粒转染真核细胞采用磷酸钙转染方法试剂配置2×HBS溶液HEPES 50mM；NaCl 280mM；NaHPO43mM；pH7.0-7.1，25℃；操作步骤以35mm平皿为例简述如下种植细胞转染前18-24h以4×105/2ml培养基种植细胞，使转染时的细胞密度约50-70％；转染前配置如下溶液A液2.5M CaCl210μlDNA 5μg加H2O至 100μlB液2×HBS 100μl转染将B液逐滴滴加到A液中，边滴加边混合，使之形成DNA-Ca-PO4复合物。立即将复合物滴加到293T细胞培养基中，轻轻晃动平皿，使之混匀；培养细胞放入CO2孵箱，细胞于37℃，5％CO2培养5小时，换新鲜培养基培养48小时后分别收获上清和细胞用于下一步实验。
3)总细胞裂解液制备收集细胞磷酸钙转染5小时后换新鲜培养基，继续培养48小时，收集细胞；裂解细胞以下操作均在冰上或4℃进行，所有液体预先致冷。培养细胞收获后，用PBS洗2次，加细胞裂解液(1×107/ml裂解液)(1％Triton X-100，加入到PBS中，用前加蛋白酶抑制剂)；轻柔充分悬浮细胞，于4℃放置在垂直转台上不断摇动充分裂解30分钟；然后离心12,000×g，4℃，10分钟；
收获细胞裂解液将离心上清转移至新管中，即为总细胞裂解液。
4)Western blot转染空载体的细胞裂解液作阴性对照，抗Myc抗体与CKLFSF2/Myc-His6融合蛋白的反应条带作阳性对照，以细胞裂解液为抗原，Westernblot方法鉴定CKLFSF2抗体。
2.结果结果请参见图6所示，以转染pcDNA3.1B-CKLFSF2和pcDNA3.1B-CKLFSF2/Myc-His6的293T细胞裂解液为抗原进行Western blot检测，可以形成反应条带，而转染pcDNA3.1B载体的293T细胞裂解液则不与CKLFSF2多克隆抗体反应，抗Myc抗体与CKLFSF2/Myc-His6融合蛋白的反应条带作为阳性对照，CKLFSF2多克隆抗体与CKLFSF2/Myc-His6融合蛋白的反应条带与阳性对照在同一位置。提示所制备的抗体可以与真核细胞表达的CKLFSF2蛋白和CKLFSF2/Myc-His6融合蛋白发生特异性反应。
实施例6组织芯片及睾丸组织免疫组织化学检测一、方法实施例5证实抗CKLFSF2抗体效价高、特异性好，可以用于检测和功能研究。于是，本实施例用此抗体对包含6种组织的组织芯片、正常睾丸组织和睾丸肿瘤组织芯片进行了CKLFSF2表达情况检测。具体方法如下脱蜡将组织芯片、正常睾丸组织或睾丸肿瘤组织石蜡切片置于二甲苯中浸泡20分钟脱蜡(重复一次)；脱二甲苯再分别于100％乙醇中浸泡5秒(两次)、90％乙醇(两次)脱二甲苯；除过氧化物酶用PBS洗后，组织切片用3％的H2O2室温下孵育5-10min，以消除内生性过氧化物酶的活性；抗原修复再用0.01M的PBS浸泡5min后，进行抗原修复，将切片放入装有500ml的抗原修复液的烧杯中，微波炉加热15min(保持温度在92℃-98℃)，室温下冷却20-30min；封闭PBS平衡后，用10％的正常羊血清室温封闭20分钟；加入一抗弃去羊血清，勿洗，加1∶100抗CKLFSF2 C51抗体IgG，37℃1小时。以正常兔IgG替代一抗作阴性对照；加入二抗用0.01M的PBS(PH 7.4)清洗3次，每次5分钟。二抗用羊抗兔抗体(1∶200稀释)，37℃1小时；显色和封片用0.01M的PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟，加DAB显色，再用苏木精复染后，封片，于显微镜下观察并记录结果。
二、结果1、包含6种组织的组织芯片本实施例采用实施例5的抗体，于组织芯片上检测了6种组织中CKLFSF2的表达和分布；每种组织均包括正常组织(n＝2)和肿瘤组织(n＝8)。结果如图7所示，在乳腺、肺、胃、结肠和直肠的正常组织和肿瘤组织未见阳性表达，仅于正常食道上皮的角化细胞中有较强阳性表达，在蛋白质水平上说明了CKLFSF2的表达谱较窄。
2、正常睾丸组织实施例2中的生物信息学及组织表达谱分析均提示CKLFSF2在睾丸组织中高表达，因此，本实施例检测了CKLFSF2在正常睾丸组织中的表达情况，结果请参见图8，在正常组织中主要以分泌形式存在于生精小管中，精原细胞仅有少量表达。
3、睾丸肿瘤组织芯片另外，本实施例还用实施例5中的抗体于睾丸肿瘤组织芯片中检测CKLFSF2的表达情况。此芯片包括肿瘤组织(n＝60)，其中有精原细胞瘤(n＝42)、B细胞淋巴瘤(n＝15)和大B细胞淋巴瘤(n＝3)，还有2例中度萎缩组织和1例正常组织。
请参见图9所示，与其它组织相比较，睾丸组织可见较强的阳性表达，与表达谱分析的结果相吻合。睾丸的肿瘤组织与正常组织的表达部位和存在形式不同，在正常组织和中度萎缩的组织主要以分泌形式存在于生精小管中，精原细胞仅有少量表达；而精原细胞瘤表达丰度较高，主要存在于胞浆和胞膜。
不同的肿瘤类型表达情况亦存在差异。CKLFSF2在精原细胞瘤的胞浆有阳性表达，其中阳性程度为+～++总共41例，占精原细胞瘤总数的97.6％；大部分精原细胞瘤胞膜也有表达，其中阳性程度为+～++总共32例，占76.2％。在B细胞淋巴瘤中有5例阳性表达于胞浆中，阳性程度为+，占33.3％，胞膜上则无阳性表达。在大B细胞淋巴瘤的表达情况与B细胞淋巴瘤类似，1例阳性表达于胞浆中，阳性程度为+，占33.3％，胞膜上无阳性表达，结果参见表1。
表1CKLFSF2在睾丸肿瘤组织中的表达

实施例7趋化实验一、方法将pCDNA3.1B和pCDNA3.1B-CKLFSF2质粒分别转染293T细胞，收集细胞培养上清，分别用原浓度、5倍稀释和25倍稀释的上清对小鼠脾细胞进行趋化实验。趋化作用用趋化指数来表示，所谓的趋化指数是指实验组迁移的细胞数与对照组非特异迁移的细胞数的比值，一般来说，趋化指数大于2有意义。
具体实验采用48孔Boyden小室法将倍比稀释的转染上清37℃预温，震荡去除溶解的空气，把底层板放水平台面上，NP标记位于右下方，将样品加入小孔中，最适的液体量是液体注入小孔后，能形成一个稍微隆起的凸液面，当覆盖滤膜时，可以避免气泡形成；在滤膜的一角切去1mm左右的小角，分别用镊子夹住滤膜两端，水平下降，中间部位最先接触小室，平放在加完样的底层板上，缺角对着NP标记。稍微调整滤膜的位置；依次铺上硅胶垫，装上上层板，硅胶垫的缺角及上层板的NP标记位于右下方，拧紧整个装置；将用于作趋化实验分析的各种细胞浓度调整至1×106/ml，加适量细胞悬液，加入的液体量能使小孔形成一稍隆起的凸液面；加完样的趋化小室放在37℃，5％CO2的孵箱中。嗜中性粒细胞孵育30分钟，淋巴细胞和腹腔巨噬细胞均孵育2小时；拧下螺帽，将整个小室倒置，托着上层板的四角(现位于下面)慢慢水平下放在纸巾上，卸下下层板；迁移细胞现位于滤膜朝下的一面，称为细胞面，用镊子夹起滤膜的一角，然后用大塑料夹夹住这一端距边缘1mm的宽度，拎起滤膜，迅速用小镊子夹住另一边缘，在盛有PBS的平皿中沾湿非细胞面；在清洗片上洗去非细胞面上的细胞，让清洗片首先接触靠近大夹子处的滤膜，在与垂直方向成30°角方向轻轻上拉。重复两次该过程；小心将滤膜浸入甲醇中，2分钟，固定细胞；将固定后的细胞用Giemsa染色；随机选5个视野记数，取平均值，将转染CKLFSF2的上清组趋化的细胞数与转染pcDNA3.1-Myc-His B(-)载体组上清组趋化的细胞数相比，即得到趋化指数。
二、结果结果如图10所示，未稀释的pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清趋化指数为4.6，5倍稀释的上清趋化指数达到8.7，25倍稀释的上清趋化指数是1.2。可以看出，pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清对小鼠的脾脏中的细胞具有明显趋化活性。
同时，本实施例检测到了原核蛋白CKLFSF2 C51对小鼠的脾细胞也具有明显趋化活性，结果请参见图11。
实施例8CKLFSF2对小鼠腹腔巨噬细胞的作用一、方法1、小鼠腹腔巨噬细胞获取与粘附状况的观察将小鼠脱颈椎处死，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3-5秒。然后，置小鼠于解剖台上，针头固定四肢，暴露腹腔，于腹腔靠上部位用注射器注入5ml预温的PBS，不拔出针头，轻轻把针头挑起，反复揉搓腹腔约1-2分钟。然后用注射器回抽腹腔液，或用镊子轻轻夹起腹膜(针头进针处)拔出针头，用尖吸管吸取腹腔液置一洁净试管内。将腹腔液吹打均匀，(尽量避免产生气泡)，放于24孔板内。37℃，孵育30min。取出，用RPMI1640冲洗3次。加入真核细胞转染上清或原核细胞表达的CKLFSF2 C51，显微镜下观察巨噬细胞的粘附状况。
2、流式细胞术检测CD11b的表达盐酸利多卡因消化细胞，于37℃培养箱中消化3-5分钟，PBS洗涤2次，加入FITC标记的抗CD11b抗体(BD Biosciences Clontech公司)，于4℃避光放置30分钟，PBS洗涤2次，进行流式细胞术检测CD11b的表达。
二、结果1、请参见图12所示，CKLFSF2 C51原核蛋白处理的小鼠腹腔巨噬细胞在无血清条件下仍旧具有良好的贴壁能力，而对照组细胞则由于撤血清而变圆，丧失贴壁能力。
2、用荧光标记的抗小鼠CD11b单克隆抗体检测腹腔巨噬细胞CD11b的表达，结果请参见图13，可以发现CKLFSF2真核细胞转染上清和CKLFSF2 C51原核蛋白处理的小鼠腹腔巨噬细胞CD11b的表达明显增强。
实施例9CKLFSF2对小鼠骨髓细胞的作用一、方法收集骨髓细胞颈椎脱臼处死小鼠，无菌操作取小鼠双股骨髓细胞，调细胞至5×106/ml，取90μl加入96孔细胞培养板中，再加入预先按一定浓度稀释的转染上清或原核细胞表达的蛋白10μl。设5个复孔，置37℃，5％CO2培养箱培养72小时。
MTT法检测终止前5小时h，掺入MTT(5mg/ml)10μl/孔，终止培养时，离心弃上清，每孔加100μl DMSO，37℃，5％CO2培养箱过夜，于全自动酶标仪波长560nm处测定其OD值，以OD值代表骨髓细胞活性。
骨髓细胞甩片取1孔的细胞甩片，离心2000rpm，2min；Gimsa染色。显微镜下观察。
二、结果请参见图14A和图14B所示，CKLFSF2在骨髓中高表达，提示其在造血过程中发挥重要作用，在体外实验中，MTT结果表明CKLFSF2促进小鼠骨髓细胞的增殖。
同时请参见图15，骨髓细胞甩片在显微镜下可见CKLFSF2真核细胞转染上清和CKLFSF2 C51原核蛋白处理的小鼠骨髓细胞出现明显较大的细胞，而对照组pCDNA3.1B转染上清和PBS则未见异常。
实施例10钙流实验鉴定CKLFSF2的功能性受体一、方法已有文献表明CCR5属于共享性趋化因子受体(一种受体能结合同家族中多个成员)，它的已知配体包括MIP-1α、MIP-1β、CCL5/RANTES、MCP-2等。现已明确CCR5是嗜巨噬细胞(M)HIV-1病毒感染人体细胞的共受体，因此，CCR5是抗病毒治疗的理想靶位。
趋化因子受体CCR4是CKLF1的功能性配体之一，而CKLFSF2和CKLF在染色体上紧密连锁，为了进一步探讨CKLFSF2是通过何种趋化因子受体来行使功能的，本实施例采用pCDI、pCDI-CCR4和pCDI-CCR5分别瞬时转染HEK293细胞，表达CCR4和CCR5，应用钙流实验进行分析。
应用流式细胞术，用荧光标记的抗CCR4和抗CCR5单克隆抗体分别检测CCR4和CCR5在HEK293细胞的表达，结果显示转染效率高，可以用于钙流实验。
CCL17/TARC是CCR4的配体，CCL5/RANTES是CCR5的配体，二者在适当浓度下可分别诱导表达CCR4、CCR5细胞发生Ca2+释放，作为阳性对照并进行封闭研究。用荧光强度来监测细胞内Ca2+的变化情况。
具体方法如下1、pCDI-CCR4和pCDI-CCR5真核细胞表达质粒的构建方法如下根据数据库中释放的人趋化因子受体CCR4和CCR5的cDNA序列(CCR4，NM_005508.2；CCR5，NM_000579)，设计引物，从K562细胞的cDNA文库中克隆扩增包含其完整开放阅读框的cDNA片段，并克隆到pcDI载体中，使之在HEK293细胞有效表达。
2、电穿孔转染趋化因子受体HEK293细胞常规传代培养，胰酶消化细胞，调整细胞密度，电穿孔转染pCDI、pCDI-CCR4和pCDI-CCR5，转染方法如前。接种于35mm petridish/10mm microwell皿的中心孔中，密度为1×105/ml，37℃孵育过夜。
3、流式细胞术检测趋化因子受体的表达进行流式细胞术分析，检测CCR4和CCR5的表达情况。流式细胞仪为FACScan，功率1200w，2W氩离子激发器，激发光谱488nm，光电倍增管的信号对数放大后，输入CellQuest(Becton Dickison)计算机软件进行分析，每个样品分析1×104个细胞，以单参数直方图(histogram)定量显示FITC阳性细胞数。
4、激光扫描共焦显微镜检测细胞内的钙流待检细胞用Hank’s平衡盐(PH7.4)溶液洗二次，负载Fluo-3/AM避光，37℃，60分钟。用Hank’s平衡盐溶液洗细胞二次后，在激光扫描共焦显微镜(例如Leica公司的TCS NT)上加样，进行检测，并于特定的时刻加入待检测的试剂，观察荧光强弱的变化。
二、结果实验结果请参见图16-图22(显示部分结果)。
分别在第10-15秒、135-140秒之间各加一次样品。首先，在第10-15秒中加入pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清，可以使HEK293/CCR5细胞在瞬间内荧光强度明显增强，表明细胞内Ca2+显著升高，发生了Ca2+释放；然后，在135s-140s之间加入100nmol/LCCL5/RANTES，细胞荧光强度增强不明显，即CCL5/RANTES诱导的HEK293/CCR5细胞Ca2+释放大部分被抑制。
而先加入100nmol/L重组CKLFSF2 C51蛋白，也能够使HEK293/CCR5细胞荧光强度明显增强，即诱导细胞Ca2+释放；但加入100nmol/L CCL5/RANTES后，仍旧能够再次增强细胞荧光强度，即CKLFSF2 C51不能抑制CCL5/RANTES诱导的Ca2+释放。
而pCDNA3.1B-CKLFSF2真核细胞转染上清和重组CKLFSF2 C51蛋白，均未能够诱导HEK293/pCDI和HEK293/CCR4细胞发生明显Ca2+释放，亦不能封闭CCL17/TARC诱导的HEK293/CCR4细胞Ca2+释放作用。
反之，先加入CCL5/RANTES也能够大部分抑制CKLFSF2诱导的HEK293/CCR5细胞Ca2+释放。这提示CCR5是CKLFSF2的功能性受体之一，而CCR4不是CKLFSF2的功能性受体。
上述说明，CKLFSF2多肽或其功能片段作为CCR5的配体之一，其通过与CCR5结合，在抗HIV-1感染中发挥重要作用。
序列表<110>北京大学<120>具有多种功能的细胞因子<130>D0411014F<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1073<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(161)..(907)<223>
<400>1ggcgcgggag ttggcattcg gtggtcctgg cagttagctg agcacgccct ctgagccgct60cggtggacac caggcactct agtaggcctg gcctacccag aaacagcagg agagagaaga 120aacaggccag ctgtgagaag ccaaggacac cgagtcagtc atg gca cct aag gcg 175Met Ala Pro Lys Ala1 5gca aag ggg gcc aag cca gag cca gca cca gct cca cct cca ccc ggg 223Ala Lys Gly Ala Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly10 15 20gcc aaa ccc gag gaa gac aag aag gac ggt aag gag cca tcg gac aaa 271Ala Lys Pro Glu Glu Asp Lys Lys Asp Gly Lys Glu Pro Ser Asp Lys25 30 35cct caa aag gcg gtg cag gac cat aag gag cca tcg gac aaa cct caa 319Pro Gln Lys Ala Val Gln Asp His Lys Glu Pro Ser Asp Lys Pro Gln40 45 50aag gcg gtg cag ccc aag cac gaa gtg ggc acg agg agg ggg tgt cgc 367Lys Ala Val Gln Pro Lys His Glu Val Gly Thr Arg Arg Gly Cys Arg55 60 65cgc tac cgg tgg gaa tta aaa gac agc aat aaa gag ttc tgg ctc ttg 415Arg Tyr Arg Trp Glu Leu Lys Asp Ser Asn Lys Glu Phe Trp Leu Leu70 75 80 85ggg cac gct gag atc aag att cgg agt ttg ggc tgc cta ata gct gca 463
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<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Pro Lys Ala Ala Lys Gly Ala Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala1 5 10 15Pro Pro Pro Pro Gly Ala Lys Pro Glu Glu Asp Lys Lys Asp Gly Lys20 25 30Glu Pro Ser Asp Lys Pro Gln Lys Ala Val Gln Asp His Lys Glu Pro35 40 45Ser Asp Lys Pro Gln Lys Ala Val Gln Pro Lys His Glu Val Gly Thr50 55 60Arg Arg Gly Cys Arg Arg Tyr Arg Trp Glu Leu Lys Asp Ser Asn Lys65 70 75 80Glu Phe Trp Leu Leu Gly His Ala Glu Ile Lys Ile Arg Ser Leu Gly85 90 95Cys Leu Ile Ala Ala Met Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Val His Pro100 105 110Ile Leu Arg Leu Ile Ile Thr Met Glu Ile Ser Phe Phe Ser Phe Phe115 120 125Ile Leu Leu Tyr Ser Phe Ala Ile His Arg Tyr Ile Pro Phe Ile Leu130 135 140Trp Pro Ile Ser Asp Leu Phe Ash Asp Leu Ile Ala Cys Ala Phe Leu145 150 155 160Val Gly Ala Val Val Phe Ala Val Arg Ser Arg Arg Ser Met Asn Leu165 170 175His Tyr Leu Leu Ala Val Iie Leu Ile Gly Ala Ala Gly Val Phe Ala180 185 190Phe Ile Asp Val Cys Leu Gln Arg Asn His Phe Arg Gly Lys Lys Ala195 200 205Lys Lys His Met Leu Val Pro Pro Pro Gly Lys Glu Lys Gly Pro Gln210 215 220Gln Gly Lys Gly Pro Glu Pro Ala Lys Pro Pro Glu Pro Gly Lys Pro225 230 235 240Pro Gly Pro Ala Lys Gly Lys Lys245
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3tcggtggtcc tggcagttag 20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4caagcaaagg tggtaatgaa aatg 24<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5agtcatggca cctaaggcgg 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6cctccaagtc atttctttcc c21<210>7<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>9aaggacaccg agtcagtcat g21<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10tcatttcttt ccctttgctg gcc 2权利要求
1.一种多核苷酸，该多核苷酸包含(1)编码如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸，或编码如SEQ ID NO2所示的198-248位氨基酸序列的多核苷酸；或(2)与(1)具有至少80％同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的多肽与(1)编码的多肽具有相同的功能。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，该多核苷酸包含如SEQ ID NO1所示的多核苷酸或其互补序列，或如SEQ ID NO1的752-904位所示的多核苷酸。
3.一种基因工程载体，该基因工程载体含有权利要求1或2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，该宿主细胞经权利要求3所述的基因工程载体转化、转染或转导得到。
5.一种生产多肽的方法，该方法包括以下步骤(1)在适于表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞；(2)从所述宿主细胞培养物中获得权利要求3所述的基因工程载体携带的多核苷酸编码的多肽。
6.一种多肽，该多肽包含(1)如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO2的198-248位氨基酸所示的多肽；(2)与(1)具有至少80％同源性的多肽，该多肽的功能与(1)的功能相同。
7.一种权利要求1或2所述的多核苷酸的片段，该片段为所述的多核苷酸的至少10个连续核苷酸序列，用作检测所述多核苷酸的引物或探针，或抑制所述多核苷酸的表达。
8.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1或2所述的多核苷酸或其药物可接受的盐、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞、或权利要求6所述的多肽或其药物可接受的盐，以及一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。
9.如权利要求1或2所述的多核苷酸或如权利要求6所述的多肽在制备预防和/或治疗免疫缺陷、艾滋病或造血功能障碍的药物中的应用。
10.一种体外检测来自待测者的样品中权利要求1或2所述的多核苷酸或如权利要求6所述的多肽的表达水平是否变化的方法，该方法包括(1)检测待测样品中所述多核苷酸或多肽的表达水平；(2)将待测样品中所述多核苷酸或多肽的表达水平与正常样品的多核苷酸或多肽的表达水平进行比较；(3)确定待测样品中多核苷酸或多肽的表达水平是否变化。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述的待测样品为待测者的睾丸组织样品或精液样品。
12.一种单克隆或多克隆抗体，该抗体与权利要求6所述的多肽特异性结合。
13.如权利要求12所述的单克隆或多克隆抗体，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO2的198-248位氨基酸所示。
全文摘要
本发明涉及一种编码如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其片段的多核苷酸，含有所述多核苷酸的基因工程载体和宿主细胞。同时，本发明涉及一种如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其片段的多肽及多肽的生产方法。本发明还涉及含有所述多核苷酸或其药物可接受的盐，或所述多肽或其药物可接受的盐的药物组合物。本发明还涉及本发明的多核苷酸或多肽在制备预防和/或治疗免疫缺陷、艾滋病或造血功能障碍的药物中的应用。本发明还涉及体外检测来自待测者的样品中本发明所述的多核苷酸或多肽的表达水平是否变化的方法。本发明还涉及与本发明的多肽或其活性片段特异性结合的单克隆或多克隆抗体。
文档编号C07K14/715GK1772897SQ20041009098
公开日2006年5月17日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者韩文玲, 马大龙, 石爽, 王应, 邱晓彦, 刘雅楠, 李婷, 钟英成, 钟吉, 张颖妹, 宋泉声 申请人:北京大学