专利名称：蒲黄中香蒲新苷的提取分离方法
技术领域：
本发明是关于植物药有效成分的提取分离方法，具体说是关于中药蒲黄中的有效成分的提取分离方法。
背景技术：
蒲黄是一种常用中药，对于蒲黄的研究已有许多文献报道，其中对蒲黄化学成分的研究，也有一些文献记载。但这些文献记载的研究内容，并非以探讨蒲黄中主要有效成分香蒲新苷的提取分离方法为主要目的。由于香蒲新苷是蒲黄的主要有效成分之一，常将香蒲新苷作为蒲黄药材和含蒲黄药物的质量控制指标，为此，实际工作中需要提取分离纯度高的香蒲新苷作为对照品。特别是在含蒲黄的药物开发研究当中，如何简化蒲黄有效成分香蒲新苷的提取工艺，提高提取分离纯度，是制剂工艺研究过程的关键环节之一。目前一些提取分离方法的提取工艺路线复杂，香蒲新苷收率较低，不适合于工业化大规模生产，且因为难以进一步提高香蒲新苷的纯度，使其用作质量控制用对照品受到一定限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取分离蒲黄中有效成分的新工艺，即提取分离蒲黄有效成分香蒲新苷的新工艺。
本发明的工艺方法步骤如下 A取蒲黄药材醇提得稠膏，即总提取物； B总提取物硅胶拌样后，另取硅胶活化、干柱层析，以5～10∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂为洗脱剂或展开剂，分段提取得8～12份，各份用甲醇、乙醇或丙酮洗脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；合并其中第5份和第6份得到香蒲新苷粗品； C以硅胶为吸附剂，香蒲新苷粗品用甲醇溶解后，干法上样，以乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，梯度为100∶0-60∶40，分段提取得8～12份，减压浓缩，把其中第8-10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品； D取香蒲新苷精品，加入甲醇或乙醇至溶解，浸泡、湿法装柱，色谱柱的径高比为3∶20-27，吸附剂为葡聚糖凝胶LH-20，用量为被分离样品量的18-30倍，用甲醇或乙醇进行洗脱，分段收集洗脱液，共收集12～15份；把其中第8～10份分别浓缩，加入浓缩液20～25倍量的乙酸乙酯，静置沉淀，过滤，沉淀用乙酸乙酯洗涤后，干燥，即得到香蒲新苷纯品。
上述方法中步骤A的方法为取蒲黄药材25重量份，加入浓度为60～90％的乙醇150～250体积份，浸泡24～48小时后，加热回流提取0.5～1.5小时，静置1～2小时，吸取上清液；药渣用同样的方法先后提取2～4次，提取药液合并，药渣弃去；将上清液和提取液合并，水浴加热，水浴温度60～90℃，减压浓缩至浓缩液无醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即总提取物2.5～3.0重量份。
上述方法中步骤A的优选方法为取蒲黄药材25重量份，加入浓度为70％的乙醇200体积份，浸泡24小时后，加热回流提取1小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次，提取药液合并，药渣弃去；将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.8重量份。
上述方法中步骤B的方法为取稠膏50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅胶，干燥，得到拌样硅胶。另取1500～2000重量份的100～200目的硅胶，100～105℃活化1.5～2小时后，干法装柱；将拌样硅胶加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000～3000体积份为洗脱剂或展开剂，进行干柱层析，放干溶剂，进行等分切割或按色带切割，共得到8～12份；各份用1500～2000体积份的甲醇、乙醇或丙酮洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。收集其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.5-8重量份； 上述方法中步骤B的优选方法为取稠膏50重量份，拌入150重量份，160～200目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶；另取160～200目硅胶1500重量份，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2500体积份为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，等分切割，共得到10份。各份用温度为80℃的70％的热乙醇1500体积份洗脱；洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.9重量份。
上述方法中步骤C的方法为吸附剂为100～150重量份的200～300目的硅胶，香蒲新苷粗品7.5～8.0重量份用甲醇100～200体积份溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂(乙酸乙酯、甲醇、乙醇均为分析纯)进行梯度洗脱；洗脱梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为100～300体积份，洗脱流速为每分钟2～6体积份，分份收集，每份100～150体积份，减压浓缩至10～20体积份；把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品2.5-3.0重量份； 上述方法中步骤C的优选方法为吸附剂为100重量份的200～300目的硅胶H，香蒲新苷粗品7.9重量份用甲醇100体积份溶解后，加到4倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂进行梯度洗脱；最佳洗脱梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为200体积份，洗脱流速为每分钟4体积份，洗脱剂总用量为2600体积份，分份收集，每份100体积份，减压浓缩至10体积份；把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品2.80重量份； 上述方法中步骤D的方法为香蒲新苷精品2.50～3.00重量份，加30～60体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小时后，湿法装柱葡聚糖凝胶LH-20 50～80重量份，色谱柱径高比为1∶20-26，用甲醇或乙醇60～150体积份进行洗脱，收集洗脱液，每份5～10体积份，共收集12～15份。把其中第6～9份分别浓缩至2～3体积份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，静置0.5～2小时，沉淀，过滤，沉淀用15-30体积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品1.80～2.80重量份。
上述方法中步骤D的优选方法为香蒲新苷精品2.80重量份，加50体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小时后，湿法装柱葡聚糖凝胶LH-20 50重量份，色谱柱径高比为1∶20，用甲醇或乙醇150体积份进行洗脱，收集洗脱液，每份5体积份，共收集15份。把其中第6～9份分别浓缩至2体积份后，加入20倍量乙酸乙酯，静置0.5～2小时，沉淀，过滤，沉淀用20体积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.70重量份。
采用本方法提取蒲黄有效成分香蒲新苷，提取工艺路线简单，提取分离纯度提高，香蒲新苷收率提高，适合于工业化大规模生产。下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1香蒲新苷的纯度检查 用高效液相色谱法检查纯度。仪器美国惠普公司HP1050高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(HP1050 DAD)，HP1050/WIN-3D化学工作站，Waters公司25μL可调进样器。色谱柱Bondclone 10 C18柱，3.9mm×300mm(美国Phenomenex公司)。流动相乙腈-水(15～20∶85～80)；流速1.0～1.2mL/min；柱温室温；检测波长254nm；衰减8；进样量20μg，保留时间(RT)香蒲新苷为6～7min，色谱图记录时间20min。归一化法测定纯度，香蒲新苷纯品的纯度为98.74％，大于98.00％，可作为对照品使用。实验例2香蒲新苷的结构测定 熔点用Boetius THMK05型显微熔点测定仪测定；紫外(UV)光谱用日本岛津U-2000型紫外分光光度计测定；红外光谱(IR)用Nicolet FTIR-5DX型红外光谱仪测定，KBr压片；核磁共振氢谱和碳谱(1HNMR和13CNMR)用JEOLGX-400型和VIRIAN GEMINI300型核磁共振仪测定，TMS为内标；质谱(MS)用VGZABSPEC型和VG-MM7070型质谱仪测定。
取上述精制方法所得的香蒲新苷纯品为淡黄色无定形粉末(甲醇-乙酸乙酯)，熔点150～152℃，易溶于水、甲醇，溶于乙醇，微溶于丙酮、乙酸乙酯。紫外灯下呈黄棕色荧光，三氯化铝显色后呈黄绿色荧光。盐酸镁粉反应阳性，Molish反应阳性，示为黄酮苷类化合物。UVλmax(nm)254，354(MeOH)，示3位为取代的黄酮醇；269，329，407(MeONa)，带I红移53nm，示4’位为游离羟基；273，322，357(NaOAc)，带II红移19nm，示7位为游离羟基；254，354(NaOAc+H3BO3)，示无邻二羟基；269，301，369sh，405(AlCl3)，带I红移51nm；268，361sh，402(AlCl3/HCl)，峰位与AlCl3光谱比较基本不变，示5位为游离羟基。IRυmax(KBr，cm-1)3407.9(OH)，2936.8，1659.4(C＝O)，1613.8，1517.7(苯环)，1462.1，1358.8，1289.4，1205.2，1131.5，1061.3，984.1，918.1，812.1。FAB-MS(m/z)794(M++Na+H)，771(M-+H)，625(M+-鼠李糖基+H)，478(M+-鼠李糖基-鼠李糖基+H)，317(M+-鼠李糖基-鼠李糖基-葡萄糖基+H)。说明两个鼠李糖基是末端的，即三糖部分是分支的。1HNMR(CD3OD，TMS)δ0.91和1.06出现的两个双峰，示有两个鼠李糖。δ4.53和5.18的信号，示两个鼠李糖基端基氢，若仔细观察，每一信号实为双峰，其偶合常数很小，推断两个糖均为α-构型；δ5.73处出现的双峰信号，示为3位葡萄糖基的相应的端基质子，偶合常数为7.3Hz，推断为β-构型。由此表明，该化合物的3位连有两个鼠李糖基和一个葡萄糖基。13CNMR(CD3OD，TMS)δ68.9归于葡萄糖基6位次甲基碳的信号，较对应的葡萄糖甲苷向低场位移，这是6位羟基苷化后而引起的位移效应，表明一个鼠李糖的端基与葡萄糖的6位相连。δ80.9为葡萄糖基2位碳的信号，与对应葡萄糖甲苷相比，此C-2信号向低场位移，而C-3信号向高场位移，这表明另一鼠李糖基与葡萄糖2位相连。该化合物用0.1mol/L盐酸水解，水解液纸层析检出L-鼠李糖和D-葡萄糖。综合以上数据及实验结果，确定为异鼠李素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-α-L-鼠李糖(1→6)-β-D-葡萄糖苷，即香蒲新苷(typhaneoside)，分子式为C34H42O2。其UV、1HNMR、13CNMR数据见表1、2、3。
表1 香蒲新苷的UV光谱数据(nm)测定溶剂香蒲新苷MeOHMeONaNaOAcNaOAc+H3BO3AlCl3AlCl3/HCl254，354269，329，407273，322，357254，354269，301，369sh，405268，361，402 表2香蒲新苷的1HNMR数据(in CD3OD)氢原子香蒲新苷682’5’6’-OCH31”11””6-CH36”” -CH3δ6.18，d，J＝1.8Hzδ6.38，d，J＝2.1Hzδ7.93，d，J＝2.1Hzδ6.91，d，J＝8.5Hzδ7.57，dd，J＝8.2Hz，2.0Hzoverlaidδ5.73，d，J＝7.3Hzδ4.53，d，J＝2.0Hzδ5.18，d，J＝2.0Hzδ0.91，d，J＝6.1Hzδ1.06，d，J＝6.4Hz 表3香蒲新苷的13CNMR数据(in CD3OD)碳原子香蒲新苷(δ)23456789101’2’3’4’5’6’OCH31”2”3”4”5”6”123456l””2””3””4””5””6””159.3135.1180.2164.0100.5166.595.5159.2106.7124.1116.9151.4149.1115.3124.557.7101.380.979.674.578.068.9103.573.172.974.770.718.6103.273.172.974.770.517.3 实验例3硅胶干柱色谱分离香蒲新苷粗品试验 取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇200L，浸泡24h后，加热回流提取1小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次，提取药液合并，药渣弃去。将上述上清液和提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏50g，拌入150g粗硅胶(青岛海洋化工厂生产，160～200目)，自然干燥，得到拌样硅胶。另取粗硅胶(青岛海洋化工厂生产，160～200目)1.5kg，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱(直径12cm，高60cm)。将拌样硅胶加入柱中，以乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶1)混合溶剂为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，等分切割，共得到10份。各份用温度为80℃的70％的热乙醇1500mL洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检查。
薄层色谱条件吸附剂硅胶GF254预制薄层板；展开剂乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。
其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并，得到香蒲新苷粗品7.9g；香蒲新苷粗品为棕黄色粉末。
实验例4减压柱色谱分离香蒲新苷精品试验 香蒲新苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量100g)。取上述实验例所得香蒲新苷粗品7.9g用180毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为150mL，洗脱流速为每分钟3mL，洗脱剂总用量为1950mL，分份收集，每份100mL，减压浓缩至小体积(约10mL)后，用薄层色谱检查，薄层色谱条件吸附剂硅胶GF254预制薄层板；展开剂乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。其中第8-10份香蒲新苷含量较高，把第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品黄色粉末2.83g。实验例5葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱色谱分离香蒲新苷纯品试验 上述香蒲新苷精品黄色粉末2.83g以40毫升甲醇溶解，上样(SephadexLH-20凝胶50g，甲醇浸泡24h后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用120毫升甲醇进行洗脱，待色带到达柱底部时，开始收集洗脱液，每份5mL，共收集15份。用薄层色谱检查，薄层色谱条件吸附剂硅胶GF254预制薄层板；展开剂乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(8∶3∶1∶1)混合溶剂。其中第6-9份香蒲新苷含量较高，把其中第8～10份分别浓缩至小体积(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，静置1小时，沉淀，过滤，沉淀用20毫升乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.61克，为淡黄色粉末。
实施例1香蒲新苷纯品的制备 取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇175L，浸泡30小时后，加热回流提取1小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度70℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.5kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。另取180目硅胶1600g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以10∶1∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000毫升为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，色带切割，共得到10份。各份用甲醇1750ml洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并，得到香蒲新苷粗品8g。
香蒲新苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用200目的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量110g)。香蒲新苷粗品8g用100ml甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为200mL，洗脱流速为每分钟4mL，洗脱剂总用量为2600mL，每份100mL，减压浓缩至小体积(约18mL)后，把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品黄色粉末3.00g。
香蒲新苷的纯化上述香蒲新苷精品黄色粉末3.00g以60mL甲醇溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶80g，乙醇浸泡30小时后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用甲醇150毫升进行洗脱，待色带到柱底部时，开始收集洗脱液，每份10mL，共收集10份。把其中第6～9份分别浓缩至小体积(2.8mL)后，加入25倍量乙酸乙酯，静置1.5小时，沉淀，过滤，沉淀用30毫升乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.8克，为淡黄色粉末。
实施例2香蒲新苷纯品的制备 取蒲黄药材25kg，加入浓度为80％的乙醇200L，浸泡40小时后，加热回流提取1.5小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取4次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.7kg。
取上述稠膏53g，拌入180g，120目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。另取180目硅胶1600g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以乙7∶3∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2200毫升为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，色带切割，共得到10份。各份用甲醇1900ml洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并，得到香蒲新苷粗品7.8g。
香蒲新苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用250目的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量130g)。香蒲新苷粗品7.8g用150毫升甲醇溶解后，加到5倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为220mL，洗脱流速为每分钟5mL，洗脱剂总用量为2860mL，每份120mL，减压浓缩至小体积(约16mL)后，把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品黄色粉末2.60g。
香蒲新苷的纯化上述香蒲新苷精品黄色粉末2.60g以40毫升乙醇溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶70g，甲醇浸泡26小时后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用甲醇100毫升进行洗脱，待色带到柱底部时，开始收集洗脱液，每份8mL，共收集12份。把其中第6～9份分别浓缩至小体积(2.4mL)后，加入24倍量乙酸乙酯，静置1.5小时，沉淀，过滤，沉淀用30毫升乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.5克，为淡黄色粉末。
实施例3香蒲新苷纯品的制备 取蒲黄药材25kg，加入浓度为90％的乙醇225L，浸泡45小时后，加热回流提取0.5小时，静置1小时，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取2次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.8kg。
取上述稠膏55g，拌入170g，160目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。另取160目硅胶1700g，100～105℃活化2小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以乙9∶1∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂1800毫升为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，等分切割，共得到10份。各份用丙酮1700ml洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并，得到香蒲新苷粗品7.5g。
香蒲新苷精品的制备采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用300目的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量140g)。香蒲新苷粗品7.5g用120毫升甲醇溶解后，加到4倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为200mL，洗脱流速为每分钟4mL，洗脱剂总用量为2600mL，每份140mL，减压浓缩至小体积(约12mL)后，把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品黄色粉末2.50g。
香蒲新苷的纯化上述香蒲新苷精品黄色粉末2.50g以30毫升乙醇溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶60g，乙醇浸泡28小时后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用乙醇120毫升进行洗脱，待色带到柱底部时，开始收集洗脱液，每份7mL，共收集14份。把其中第6～9份分别浓缩至小体积(3mL)后，加入22倍量乙酸乙酯，静置1小时，沉淀，过滤，沉淀用20毫升乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.3克，为淡黄色粉末。
实施例4香蒲新苷纯品的制备 取蒲黄药材25kg，加入浓度为70％的乙醇200L，浸泡24h后，加热回流提取1小时，静置，吸取上清液。药渣用同样的方法先后提取3次，提取药液合并，药渣弃去。将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏2.8kg。
取上述稠膏58g，拌入160g，180目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶。另取120目硅胶1900g，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以乙8∶2∶1酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000毫升为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，等分切割，共得到10份。各份用温度为80℃的70％的热乙醇1600ml洗脱。洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份香蒲新苷含量较高，合并，得到香蒲新苷粗品7.9g。香蒲新苷粗品为棕黄色粉末。
香蒲新苷的精制采用减压柱层析方法。吸附剂为薄层层析用250目的硅胶H(青岛海洋化工厂生产，用量150g)。香蒲新苷粗品7.9g用150毫升甲醇溶解后，加到3倍量的粗硅胶(160～200目)中，拌匀，挥干溶剂，干法上样(色谱柱直径12cm，高4cm)。洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂，进行梯度洗脱(梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60)，每个梯度洗脱剂用量为150mL，洗脱流速为每分钟4mL，洗脱剂总用量为1950mL，每份150mL，减压浓缩至小体积(约10mL)后，把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷黄色粉末2.80g。
香蒲新苷的纯化上述香蒲新苷精品黄色粉末2.80g以50毫升甲醇溶解，上样(Sephadex LH-20凝胶50g，甲醇浸泡24小时后，湿法装柱。色谱柱直径3cm，高60cm)，用乙醇120毫升进行洗脱，待色带到柱底部时，开始收集洗脱液，每份5mL，共收集15份。把其中第6～9份分别浓缩至小体积(2mL)后，加入20倍量乙酸乙酯，静置1.5小时，沉淀，过滤，沉淀用20mL乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.70克，为淡黄色粉末。
权利要求
1、一种香蒲新苷纯品的提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤
A取蒲黄药材醇提得稠膏，即总提取物；
B总提取物硅胶拌样后，另取硅胶活化、干柱层析，以5～10∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂为洗脱剂或展开剂，分段提取得8～12份，各份用甲醇、乙醇或丙酮洗脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；合并其中第5份和第6份得到香蒲新苷粗品；
C以硅胶为吸附剂，香蒲新苷粗品用甲醇溶解后，干法上样，以乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，梯度为100∶0-60∶40，分段提取得8～12份，减压浓缩，把其中第8-10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品；
D取香蒲新苷精品，加入甲醇或乙醇至溶解，浸泡、湿法装柱，色谱柱的径高比为3∶20-27，吸附剂为葡聚糖凝胶LH-20，用量为被分离样品量的18-30倍，用甲醇或乙醇进行洗脱，分段收集洗脱液，共收集12～15份；把其中第8～10份分别浓缩，加入浓缩液20～25倍量的乙酸乙酯，静置沉淀，过滤，沉淀用乙酸乙酯洗涤后，干燥，即得到香蒲新苷纯品。
2、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于该方法中A步骤为
取蒲黄药材25重量份，加入浓度为60～90％的乙醇150～250体积份，浸泡24～48小时后，加热回流提取0.5～1.5小时，静置1～2小时，吸取上清液；药渣用同样的方法先后提取2～4次，提取药液合并，药渣弃去；将上清液和提取液合并，水浴加热，水浴温度60～90℃，减压浓缩至浓缩液无醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即总提取物2.5～3.0重量份。
3、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于该方法中B步骤为
取稠膏50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅胶，干燥，得到拌样硅胶；另取1500～2000重量份的100～200目的硅胶，100～105℃活化1.5～2小时后，干法装柱；将拌样硅胶加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000～3000体积份为洗脱剂或展开剂，进行干柱层析，放干溶剂，进行等分切割或按色带切割，共得到8～12份；各份用1500～2000体积份的甲醇、乙醇或丙酮洗脱；洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；收集其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.5-8重量份。
4、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于该方法中C步骤为
吸附剂为100～150重量份的200～300目的硅胶，香蒲新苷粗品7.5～8.0重量份用甲醇100～200体积份溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂(乙酸乙酯、甲醇、乙醇均为分析纯)进行梯度洗脱；洗脱梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为100～300体积份，洗脱流速为每分钟2～6体积份，分份收集，每份100～150体积份，减压浓缩至10～20体积份；把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品2.5-3.0重量份。
5、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于该方法中D步骤为
香蒲新苷精品2.50～3.00重量份，加30～60体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小时后，湿法装柱葡聚糖凝胶LH-20 50～80重量份，色谱柱径高比为1∶20-26，用甲醇或乙醇60～150体积份进行洗脱，收集洗脱液，每份5～10体积份，共收集12～15份；把其中第6～9份分别浓缩至2～3体积份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，静置0.5～2小时，沉淀，过滤，沉淀用15-30体积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品1.80～2.80重量份。
6、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤
A、取蒲黄药材25重量份，加入浓度为60～90％的乙醇150～250体积份，浸泡24～48小时后，加热回流提取0.5～1.5小时，静置1～2小时，吸取上清液；药渣用同样的方法先后提取2～4次，提取药液合并，药渣弃去；将上清液和提取液合并，水浴加热，水浴温度60～90℃，减压浓缩至浓缩液无醇味，得稠膏2.5～3.0重量份，即总提取物2.5～3.0重量份；
B、取稠膏50～60重量份，拌入150～180重量份的100～200目的硅胶，干燥，得到拌样硅胶；另取1500～2000重量份的100～200目的硅胶，100～105℃活化1.5～2小时后，干法装柱；将拌样硅胶加入柱中，以7～9∶1～3∶1的乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2000～3000体积份为洗脱剂或展开剂，进行干柱层析，放干溶剂，进行等分切割或按色带切割，共得到8～12份；各份用1500～2000体积份的甲醇、乙醇或丙酮洗脱；洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；收集其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.5-8重量份；
C、吸附剂为100～150重量份的200～300目的硅胶，香蒲新苷粗品7.5～8.0重量份用甲醇100～200体积份溶解后，加到3～5倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-甲醇或乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂进行梯度洗脱；洗脱梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为100～300体积份，洗脱流速为每分钟2～6体积份，洗脱剂总用量为1500～3000体积份；分份收集，每份100～150体积份，减压浓缩至10～20体积份；把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品2.5-3.0重量份；
D、香蒲新苷精品2.50～3.00重量份，加30～60体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡20-30小时后，湿法装柱葡聚糖凝胶LH-20 50～80重量份，色谱柱径高比为1∶20-26，用甲醇或乙醇60～150体积份进行洗脱，收集洗脱液，每份5～10体积份，共收集12～15份；把其中第6～9份分别浓缩至2～3体积份后，加入20～25倍量乙酸乙酯，静置0.5～2小时，沉淀，过滤，沉淀用15-30体积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品1.80～2.80重量份。
7、如权利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于该方法中A步骤为取蒲黄药材25重量份，加入浓度为70％的乙醇200体积份，浸泡24小时后，加热回流提取1小时，静置1小时，吸取上清液；药渣用同样的方法先后提取3次，提取药液合并，药渣弃去；将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.8重量份。
8、如权利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于该方法中B步骤为
取稠膏50重量份，拌入150重量份，160～200目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶；另取160～200目硅胶1500重量份，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2500体积份为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，等分切割，共得到10份；各份用温度为80℃的70％的热乙醇1500体积份洗脱；洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.9重量份。
9、如权利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于该方法的C步骤为吸附剂为100重量份的200～300目的硅胶H，香蒲新苷粗品7.9重量份用甲醇100体积份溶解后，加到4倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂进行梯度洗脱；洗脱梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为200体积份，洗脱流速为每分钟4体积份，洗脱剂总用量为2600体积份，分份收集，每份100体积份，减压浓缩至10体积份；把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品2.80重量份。
10、如权利要求1、2、3、4、5或6所述的提取方法，其特征在于该方法中D步骤为香蒲新苷精品2.80重量份，加50体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小时后，湿法装柱葡聚糖凝胶LH-20 50重量份，色谱柱径高比为1∶20，用甲醇或乙醇150体积份进行洗脱，收集洗脱液，每份5体积份，共收集15份；把其中第6～9份分别浓缩至2体积份后，加入20倍量乙酸乙酯，静置0.5～2小时，沉淀，过滤，沉淀用20体积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.70重量份。
11、如权利要求6所述的提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤
A、取蒲黄药材25重量份，加入浓度为70％的乙醇200体积份，浸泡24小时后，加热回流提取1小时，静置1小时，吸取上清液；药渣用同样的方法先后提取3次，提取药液合并，药渣弃去；将上清液与提取液合并，水浴加热，水浴温度80℃，减压浓缩至浓缩液至无醇味，得稠膏即蒲黄总提取物2.8重量份；
B、取稠膏50重量份，拌入150重量份，160～200目粗硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶；另取160～200目硅胶1500重量份，100～105℃活化1.5小时后，干法装柱，径高比为1∶5；将拌样硅胶加入柱中，以8∶2∶1乙酸乙酯-甲醇-水混合溶剂2500体积份为展开剂，下行法展开，进行干柱层析，待展开剂前沿到达色谱柱底部时，放干溶剂，等分切割，共得到10份；各份用温度为80℃的70％的热乙醇1500体积份洗脱；洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物；其中第5份和第6份合并，得到香蒲新苷粗品7.9重量份；
C、吸附剂为100重量份的200～300目的硅胶H，香蒲新苷粗品7.9重量份用甲醇100体积份溶解后，加到4倍量的160～200目硅胶中，拌匀，挥干溶剂，干法上样；洗脱剂依次采用不同比例的乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂进行梯度洗脱；最佳洗脱梯度为100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50、45∶55、40∶60；每个梯度洗脱剂用量为200体积份，洗脱流速为每分钟4体积份，洗脱剂总用量为2600体积份；分份收集，每份100体积份，减压浓缩至10体积份；把其中第8～10份浓缩液合并，减压抽干得到香蒲新苷精品2.80重量份；
D、香蒲新苷精品2.80重量份，加50体积份甲醇或乙醇至溶解，浸泡24小时后，湿法装柱葡聚糖凝胶LH-20 50重量份，色谱柱径高比为1∶20，用甲醇或乙醇150体积份进行洗脱，收集洗脱液，每份5体积份，共收集15份；把其中第6～9份分别浓缩至2体积份后，加入20倍量乙酸乙酯，静置0.5～2小时，沉淀，过滤，沉淀用20体积份乙酸乙酯洗涤后，自然干燥，即得到香蒲新苷纯品2.70重量份。
全文摘要
本发明公开了提取分离蒲黄有效成分香蒲新苷的新工艺。本发明的工艺方法步骤如下A取蒲黄药材醇提得稠膏，得总提取物；B总提取物硅胶拌样后，另取硅胶活化、干柱层析，洗脱或展开，分段提取、洗脱，减压回收后；合并第5份和第6份得到香蒲新苷粗品；C香蒲新苷粗品溶解，干法上样，梯度洗脱，分段提取，把其中第8－10份浓缩液合并，减压抽干得香蒲新苷精品；D香蒲新苷精品，加入醇溶解，浸泡、湿法装柱，洗脱，分段收集，把其中第8～10份浓缩，沉淀，过滤，洗涤、干燥，得香蒲新苷纯品。
文档编号C07H17/07GK1651446SQ20041010178
公开日2005年8月10日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者刘斌, 石任兵, 邓巧虹, 王伟, 陆蕴如 申请人:北京中医药大学