专利名称：结合型马雌激素天然混合物的获取方法
技术领域：
本发明涉及结合型牝马雌激素的天然混合物的获取方法，该混合物中酚类尿容物和非结合型亲脂化合物被贫化，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物，尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物，以及类似的非结合型化合物。
雌激素在医学中用于激素替代疗法。尤其是将雌激素混合物用于治疗和预防妇女在自然绝经或人为绝经后出现的更年期症状。已经证明，结合型雌激素的天然混合物(例如存在于妊娠牝马尿液中的，以下被称为结合型牝马雌激素的天然混合物)对此特别有效且具有良好的耐受性。
溶解在妊娠牝马尿液(＝pregnant mares urine，以下简称为“PMU”)中的固体的含量自然会在较大的范围内变动，一般为每升40-90克干物质。PMU的固体含量中，除尿素和其它常见的尿容物之外，酚类成份含量约为干物质的2-5重量％。这些酚类成份中有甲酚和以HPMF著称的二氢-3，4-双[(3-羟基苯基)甲基]-2(3H)-呋喃酮。它们以游离或结合的形式存在。PMU中含有雌激素的天然混合物，其很大程度上以结合的形式例如以硫酸半酯-钠盐(以下简称为“硫酸盐”)存在。结合型雌激素的含量(以雌激素硫酸盐计算)为干物质的0.1-0.5重量％。此外在PMU的固体含量中还可以存在其它亲脂化合物，其含量可以在较大的范围内变化并且不可预见。这些亲脂化合物主要来源于作为饲料被妊娠牝马摄入的植物，主要包括各种类黄酮-、异类黄酮-、去甲类异戊二烯-衍生物和类似物质，例如7-羟基-4′-甲氧异黄酮、染料木黄酮、黄豆苷元、鸡豆黄素A、马尿酚(Equol)和香豆雌酚。这些原本植物来源的亲脂化合物可以在尿液中以结合或游离(非结合型)的形式存在。属于在PMU的固体含量中出现的亲脂成份，此外还有非结合型甾族化合物衍生物，在此尤其是雄烷-和孕烷甾族化合物，也称非结合型雌激素衍生物。
含有结合型雌激素天然混合物的提取液，通常是采用固相提取法获得的，或者通过基于使用与水不相混合或仅仅少量混合的有机溶剂的各种液-液-萃取步骤的方法而获得。通常适宜的是，为使所获取的结合型雌激素天然混合物能够作为活性成份用于制药，必须使之满足特定的制药学规格，例如必须符合USP(美国药典)或欧洲药典制定的规格。如此，必须使结合型雌激素相对于干物质的含量保持在特定的临界值内。
美国专利No.2,551,205和No.2,429,398描述了一种用于由PMU制备一种水溶性雌激素制剂的方法，其中首先经过在活性炭或其它适宜的吸附性材料上的吸附，用一种可与水相混合的有机溶剂例如吡啶进行洗脱，随即去除溶剂而获取一种水性浓缩物，其含有原始使用的PMU中的水溶性雌激素成份的绝大部分。在美国专利No.2,429,398中，将浓缩物用苯和/或乙醚萃取进一步提纯，而在美国专利No.2,551,205中描述的是，将浓缩物酸化至pH-值为2-6，优选为4-5，然后迅速用选自脂族、芳香族或脂环族的烃(例如己烷、苯、甲苯、环己烷)或氯代烃(例如氯仿、二氯乙烯、三氯乙烯、四氯化碳、氯苯)的与水几乎不相混合的有机溶剂进行萃取，以使不希望有的物质如脂肪、油、游离型酚类成份和非结合型甾族化合物通过转移至有机相而被去除。最后通过中和作用使水相稳定。美国专利No.2,551,205推荐，将获取的萃取液通过随后的萃取步骤和沉淀作用进一步提纯。总之，在实施美国专利No.2,551,205描述的方法后，所获取的产率仅仅约为所应用的浓缩物的雌激素成份的80％。
美国专利No.2,565,115中描述了用丙酮由PMU提取结合型雌激素的方法。但是没有陈述所获取的雌激素级份的纯度。
美国专利No.2,696,265所描述的方法是，首先将雌激素用脂族醇或酮，例如己醇、环己醇或环己酮进行萃取。雌激素进入有机相，随即被进一步提纯，此外还将含有雌激素的水相用盐酸调节至pH-值为4，并用二氯乙烯萃取。
美国专利No.2,834,712公开了高纯度低毒性雌激素混合物的制备方法，其原理是采用多个独立的具有不同溶剂和不同pH-值设置的萃取步骤。其中需要应用大量溶剂如己烷和苯。例如在某一步骤中将已经提纯的浓缩物溶于水，用盐酸调节至pH-值约为5.0，用苯并随后用乙醚萃取，以去除酚类成份。
国际专利申请书WO01/27134描述了一种由PMU萃取结合型雌激素的相对简单的方法在添加盐例如氯化钠后，将PMU用至少同等体积份的有机溶剂例如乙酸乙酯进行萃取，就此结合型雌激素进入有机相。将有机相分离并干燥，以获取提取液。WO01/27134没有陈述所获取的结合型雌激素提取液的纯度。
然而以上所描述的和由现有技术已知的液-液-萃取方法过程中会出现许多问题，如产生大量泡沫、产生沉淀、形成乳浊液和差的相分离。一般需要诸多萃取步骤，而导致损耗并只能部分获取雌激素含量。而且这些萃取步骤还需要大量的部分有损健康的溶剂。此外在以上列举的专利文本中，既没有陈述在所获取的产物中非结合型亲脂成份(例如非结合型类黄酮-、异类黄酮-、去甲类异戊二烯-衍生物和类似的非结合型化合物或者非结合型甾族化合物尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物)的含量，也没有陈述这些成份的去除过程。所述由现有技术已知的方法，不是在产率方面或者在所获取的提取液的纯度方面(相对于干物质测量所获取的激素的总量)均不能提供满意的结果，就是需要诸多不同方法步骤和应用大量有机的和甚至部分根据毒理学观点是不适宜的溶剂。
此外，由现有技术已知各种不同的固相提取方法，可用于获取酚类尿容物被高度贫化的结合型牝马雌激素的天然混合物。
国际专利申请书WO98/08526如此描述了一种方法，其通过在一种半极性，尤其是在非离子型半极性的聚合物吸附树脂上进行的固相提取，可以获取酚类尿容物被贫化的、高度脱除甲酚和HPMF的、几乎完全含有PMU中的天然雌激素成份的混合物。国际专利申请书WO98/08526描述了一种类似的方法，在固相提取时采用硅胶作为吸附材料。还有中国专利申请书CN 1308083描述了一种应用含氰基的极性吸附性树脂的类似方法。另外US专利申请US 2002/0156303描述了一种方法，其中PMU在通过聚苯乙稀吸附树脂提纯之前，首先用一种碱性溶剂(Solvenz)处理并经过滤预先纯化。如此所获取的提取液适合于作为起始材料，用于制备所含活性成份来源于PMU的结合型雌激素天然混合物的药物。
根据WO 98/08526或WO 98/08525的方法由PMU获取的结合型雌激素混合物通常可以达到所规定的制药学规格的要求，例如在相对于干物质的结合型雌激素含量方面所应遵守的临界值。特别是可以借助于其中所公开的方法获取酚类尿容物被贫化的、高度脱除甲酚和HPMF的产物。但是事实表明，在所获取的干物质中，除含有所需要的结合型雌激素成份外，还可能含有非结合型亲脂化合物。这些非结合型亲脂化合物例如包括各种非结合型类黄酮-、异类黄酮-、去甲类异戊二烯-衍生物及类似的非结合型化合物，例如7-羟基-4′-甲氧异黄酮、染料木黄酮、黄豆苷元、鸡豆黄素A、马尿酚和香豆雌酚，并且还包括非结合型甾族化合物，尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物，以及非结合型雌激素，在此所列举的并非囊括了全部可能性。由PMU所获取的结合型雌激素混合物中这些非结合型亲脂化合物的存在无法标准化，而游离型和结合型亲脂化合物的含量和组成例如根据妊娠牝马所摄食饲料的不同而变化。
虽然结合型牝马雌激素天然混合物的组成不会因为额外存在非结合型亲脂化合物而有所改变，但是结合型牝马雌激素相对于干物质的含量却会因此而降低。通过针对性地去除非结合型亲脂成份，可以在所获取的提取液中达到较高的活性物质(即结合型牝马雌激素)的浓度。此外，非结合型亲脂化合物的分离保障了各个提取液批次的均一组成，因为如此非结合型亲脂成份被去除了，所述非结合型亲脂成份在PMU中的含量和组成与妊娠牝马摄食饲料种类的季节变化而相关地变化，并且由此获得的提取液相对于干物质都具有近似的结合型牝马雌激素含量。此外，非结合型亲脂化合物的分离还有利于达到均一的生理学活性谱。例如从结合型牝马雌激素的天然混合物中去除可能存在的非结合型亲脂化合物可以是有意义的，因为它们或许本身具有内在的生理作用。
为了去除不需要的非结合型亲脂化合物的一种可能是将例如借助已知的上述固相提取法获取的结合型牝马雌激素的天然混合物分开地用适宜的有机溶剂进行液-液-萃取，其针对性地将不需要的非结合型亲脂化合物萃取而不会导致结合型牝马雌激素的损失。这样的一种方法在正在进行中的国际专利申请PCT/EP 03/50703中有一般性的描述。
本发明的目的在于，开发一种技术和经济上优化的方法用于获取结合型牝马雌激素的天然混合物，其中所述混合物无论在酚类尿容物还是在非结合型亲脂性化合物方面均是被高度贫化的。所述非结合型亲脂性化合物特别是指非结合型类黄酮-、非结合型异类黄酮-、非结合型去甲类异戊二烯-衍生物。特别是本发明的一项任务在于开发一种方法，其相对于已知的用于获取结合型牝马雌激素的天然混合物的方法无需额外的操作步骤。本发明的任务在于开发一种在固相提取过程中实现无论是酚类尿容物还是非结合型亲脂化合物的贫化。进一步开发一种只需要少数方法步骤即能够提供结合型牝马雌激素的提取液的方法，并且该提取液相对于干物质具有较高含量的结合型雌激素。进一步应该使本发明的方法以简便的方式还能够从妊娠牝马的尿液中获取一种结合型雌激素的天然混合物，即便所述尿液含有的非结合型亲脂化合物量是变换着的且可能是升高了的。本发明的任务在于开发一种优化的用于固相提取的方法，以使得所获取的结合型牝马雌激素的天然混合物具有优良的活性物质含量并满足所要求的药物规格，特别是鉴于相对于干物质的结合型雌激素的含量应该遵守所要求的临界值。
目前发现一种方法，其以令人惊奇的简便方式可以从PMU中获取酚类尿容物被贫化的、高度脱除甲酚和HPMF的结合型牝马雌激素混合物，所述获取的结合型牝马雌激素混合物同时在非结合型亲脂性化合物(特别是指非结合型类黄酮-、非结合型异类黄酮-、非结合型去甲类异戊二烯-衍生物)方面也是被高度贫化的，即便所述PMU含有的非结合型亲脂化合物量是变换着的且可能是升高了的。
根据本发明的方法的基本步骤基于在WO 98/08526中所描述的用于从PMU中获取酚类尿容物贫化的结合型雌激素的天然混合物的方法。另外根据本发明的方法还基于在国际专利申请WO 03/048183中所描述的方法，该方法也可以使用可能含有升高了的游离型雌激素份额的陈化PMU而获取达到所要求的药物规格的结合型雌激素的天然混合物。
据此本发明涉及一种用于从妊娠牝马的尿液中获取结合型雌激素的天然混合物的方法，该方法包括a)一种尿液，其任选地为脱除了粘液物质和固体物质的尿液、经浓缩的所述尿液的浓缩物或所述尿液经膜过滤而获得的经浓缩的尿滞留物，与一种用于吸附尿液中含有的结合型雌激素的混合物的足够量的聚合物吸附树脂接触，并将被结合型雌激素的混合物加载的聚合物吸附树脂从剩余的尿液中分离，并且b)被结合型雌激素的混合物加载的聚合物吸附树脂用一种pH-值调节到至少为12.0，特别是12.5～14.0的洗涤用水洗涤，并且c)任选地进行中间洗涤步骤，其中用水洗涤被结合型雌激素的混合物加载的聚合物吸附树脂，并且d)将经洗涤的吸附树脂与一种用于解离所吸附的结合型雌激素的混合物的足够量的洗脱液接触，并且e)从吸附树脂上分离含有结合型雌激素的天然混合物的洗出液并视需要地浓缩，其中根据本发明的方法相对于现有技术的方法，其特征在于，所获取的结合型牝马雌激素的天然混合物在酚类尿容物和包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物(尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物)的非结合型亲脂化合物以及类似的非结合型化合物方面被贫化，且在方法步骤(d)中作为洗脱液使用一种单相或两相-混合物，其含有(i)水，任选地其pH-值被调节至碱性范围内，和(ii)至少一种适用于洗脱选自上述列举的非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂，和任选地
(iii)至少一种与水可混溶的有机溶剂，其选自与水可混溶的醚类、低级链烷醇类和低级脂族酮类，以及前述溶剂的混合物，并且如果在方法步骤e)所获取的、任选地经浓缩的洗出液为一种两相混合物，将所获取的由两相构成的洗出液中的水相分离，并且获取含有结合型雌激素的天然混合物的水相并将其任选地浓缩。
各批次的准备，即本身已知的方法步骤a)，b)，d)和e)以及在方法步骤e)中获取的含有结合型雌激素天然混合物的洗脱液的应用，已经在国际专利申请WO 98/08526中作为方法步骤a)，b)和c)有一般性描述，并且源于这些公开的专利申请由此对于本领域技术人员而言是熟悉的。本发明的本身已知的方法步骤c)在国际专利申请WO 03/048183中作为“中间洗涤”有一般性描述，并且源于这些公开的专利申请由此对于本领域技术人员而言是熟悉的。所述WO 98/08526以及WO 03/048183的内容用于本发明的公开也作为本申请的内容。对于一般性方法的进一步的细节和可使用的材料在本申请的实施例部分中做有总结。
例如可以根据WO 98/08526使用半极性，特别是非离子型半极性吸附树脂。此外，依照本发明的方法令人惊奇地还可能与本发明的方法一起使用其它吸附树脂而不会影响产品质量或应遵守的药物规格。如此在本发明的范围内聚合物吸附树脂适用于作为本发明的方法的吸附材料。在本发明的范围内可使用的聚合物吸附树脂在说明书的实施例部分将进一步地阐述。
根据本发明利用所述方法获取结合型牝马雌激素的天然混合物，其无论是在酚类尿容物如甲酚和HPMF还是在包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物(尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物)的非结合型亲脂化合物以及类似的非结合型化合物方面均是被贫化的。
在进行本身已知的方法步骤(a)至(c)之后，为此在方法步骤(d)中将经洗涤的加载有结合型雌激素的混合物的吸附树脂用足够量的用于洗脱结合型雌激素的混合物的洗脱液处理。根据本发明为此在方法步骤(d)中作为洗脱液使用的一种单相或两相-混合物，其含有(i)水，任选地其pH-值被调节至碱性范围内，和(ii)至少一种适用于洗脱非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物，尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物，以及类似的非结合型化合物，和任选地(iii)至少一种与水可混溶的有机溶剂，其选自与水可混溶的醚类、低级链烷醇类和低级脂族酮类，以及前述溶剂的混合物，在本发明的一个优选实施方案中，在方法步骤(d)中作为洗脱液使用的一种单相或两相-混合物，其含有(i)水，任选地其pH-值被调节至碱性范围内，和(ii)至少一种适用于洗脱非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物，尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物，以及类似的非结合型化合物，和(iii)至少一种与水可混溶的有机溶剂，其选自与水可混溶的醚类、低级链烷醇类和低级脂族酮类，以及前述溶剂的混合物，在方法步骤(d)作为洗脱液应用的单相或两相-混合物含有水(i)，任选地其pH-值被调节至碱性范围内。
如果在方法步骤(d)中应用的洗脱液为单相-混合物，这种含水的洗脱液的pH-值在中性直至达pH 13的碱性范围内，在pH 7和10之间可以是有利的。在含水的洗脱液中作为溶剂成份选自在所使用的pH-范围下稳定的有机溶剂。含水的、单相洗脱液的所希望的pH-值是通过添加相应量的水溶性惰性碱性物质而调节的，优选无机碱，例如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，特别是氢氧化钠。
如果在方法步骤(d)中应用的洗脱液为两相-混合物，这种洗脱液的水相的pH-值在两相的充分混合后在中性直至达pH 13的碱性范围内，在pH 7和10之间可以是有利的。如果这种两相洗脱液的水相含有一种有机溶剂成份，作为有机溶剂成份则选自在所使用的pH-范围内稳定的有机溶剂。两相洗脱液的水相所希望的pH-值是通过添加相应量的水溶性惰性碱性物质而调节的，优选无机碱，例如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，特别是氢氧化钠。
除了任选地调成碱性的水(i)，在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物还含有至少一种有机溶剂(ii)用于洗脱非结合型亲脂化合物，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物，尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物，以及类似的非结合型化合物。此外这种适宜的有机溶剂(ii)应该与水不可混溶或几乎不可混溶，在此几乎不可混溶意指在水相中存在至多6体积％溶解的有机溶剂。在本发明的范围内适用于洗脱非结合型亲脂性化合物的有机溶剂(ii)，例如可以是下列具有1-10个呈直链的、支化的或环状排列的碳原子的有机溶剂C4-C10醇类(例如丁醇、己醇、环己醇和戊醇)、C1-C10酯化酸例如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙基甲基丙二酸酯、二甲基膦酸酯)、C3-C10醛类和C4-C10酮类(例如丁酮、戊酮、己烷-2，4-二酮、己二醛、庚醛、丁烷-1，2，4-三甲醛、甲基苯基酮及类似化合物)、或者所有的C3-C10烷氧基-化合物、C3-C10醚类(乙醚、甲基叔丁基醚)、C3-C6腈类和C1-C3卤代烷烃(二氯甲烷)，以及前述溶剂的混合物。尤其是在本发明的范围内可以使用乙酸-C1-C4-烷基酯、丁醇、环己醇、己醇、乙醚、二氯甲烷、甲基叔丁基醚和所述溶剂的混合物作为适合用于洗脱非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)。在此可选范围内，乙酸-C1-C4-烷基酯，尤其是乙酸乙酯和/或乙酸异丙酯优选为所使用的适合用于洗脱非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的本发明的有机溶剂(ii)。
此外，根据本发明在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物还任选地含有至少一种与水可混溶的有机溶剂(iii)，其选自与水可混溶的醚类、低级链烷醇类和低级脂族酮类，以及前述溶剂的混合物。作为洗脱液的醚成份适宜的是与水可混溶的环状醚如四氢呋喃或二噁烷，但也可以是与水可混溶的开链的醚类如乙二醇二甲醚(＝Monoglyme)、二甘醇二甲醚(＝Diglyme)或乙氧基乙氧基乙醇(＝Carbitol)。作为低级链烷醇类适宜的是与水可混溶的具有1～4，优选1～3个碳原子的烷基醇，特别是乙醇或异丙醇。作为低级脂族酮类适宜的是与水可混溶的具有3～5个碳原子的酮类，特别是丙酮。此外，已表明特别有益的洗脱液是其中与水可混溶的有机溶剂(iii)为丙酮、乙醇或丙酮和乙醇的混合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，除了任选地调成碱性的水(i)外，在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物还含有作为适用于洗脱非结合型亲脂化合物并与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)的乙酸-C1-C4-烷基酯，优选乙酸乙酯和/或乙酸-异丙酯，和作为与水可混溶的有机溶剂(iii)的丙酮和/或乙醇。
在本发明的另一个优选的实施方案中，除了任选地调成碱性的水(i)外，在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物还含有作为适用于洗脱非结合型亲脂化合物并与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)的乙酸乙酯，和作为与水可混溶的有机溶剂(iii)的丙酮。
在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物中水(i)和与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)的体积比可以在5∶1至1∶5的范围内，特别是2∶1至1∶2的体积比被认为是适宜的。
此外，在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物中水(i)和与水可混溶的有机溶剂(iii)的体积比可以在4∶1至1∶5的范围内，优选2∶1至1∶3的体积比被认为是适宜的。
特别是，在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物中水(i)同与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)的总体积和与水可混溶的有机溶剂(iii)的体积比可以在5∶1至1∶5的范围内，优选在2∶1至1∶2的范围内。
在本发明的一项特别优选的实施方案中，在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物由(i)水，(ii)乙酸-C1-C4-烷基酯，优选乙酸乙酯和/或乙酸-异丙酯作为与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂，和(iii)丙酮和/或乙醇作为与水可混溶的有机溶剂一起组成，并且体积比在1∶1∶1至1∶1∶2的范围内。特别是在方法步骤(d)中作为洗脱液应用一种单相-混合物，其由(i)水，(ii)乙酸乙酯作为与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂，和(iii)丙酮作为与水可混溶的有机溶剂以体积比为1∶1∶1.4组成。
如果在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的是一种两相-混合物，建议直接在加载于柱之前将两相充分混合。
所使用的洗脱液的体积可以约为3至10(特别是约4至6柱体积)每柱体积的聚合物吸附树脂。适宜的是将洗脱液通过一个含有加载了雌激素混合物的吸附树脂的反应器以这样的洗脱速度进行，即接触时间足以用于充分洗脱结合型雌激素的混合物。在以体积比为10∶10∶14的水、乙酸乙酯和丙酮的单相混合物的应用下洗脱速度例如为3至10(优选5至7)体积份洗脱液每体积份吸附树脂每小时是适宜的。适宜的是，洗脱在温度范围约为20℃至80℃之间，优选在约30℃和约50℃之间进行。理想的是，通过略微升高的压力(例如在直到0.2巴的过压)下操作，调节洗脱速度并且洗出液以多个级份收集。
各个洗出液级份的结合型雌激素、酚类尿容物如甲酚和HPMF、和非结合型亲脂化合物的含量可以用本身已知的方式通过高效液相色谱(＝high performance liquid chromatography，简称为“HPLC”)或通过气相色谱(简称为“GC”)确定。
洗脱过程中在方法步骤e)中首先获得浅色至无色，几乎无雌激素的前洗脱级份(Vorlauffraktion)，其体积约相应于1倍柱体积。结合型雌激素的主要体积，例如80～99％的存在于初始PMU中的结合型雌激素，在随后的深黄-褐色的主要洗脱级份中，其体积一般为2至4倍柱体积。在后来的后洗脱级份中一般只含有痕量的结合型雌激素。如果所获得的后洗脱级份还含有相对于干物质超过10重量％的结合型雌激素和相对于干物质低于0.6重量％的甲酚和HPMF，则可以将其与富含雌激素的主要洗出液合并用于进一步的加工。
在方法步骤(e)中所获得的洗出液可以是单相或两相混合物。即使是应用单相混合物作为洗脱液也可通过柱对在洗脱前就存在于吸附树脂柱的水的排放和由此产生的水相和有机相体积比的变化而致使洗出液由两相组成。理想的是可以将在方法步骤(e)中所获得的单相或两相洗出液以本身已知的方式进一步浓缩。特别是，如果在方法步骤(e)中所获得的洗出液是单相的，该洗出液被浓缩以便优选去除与水可混溶的有机溶剂(iii)直至所述浓缩的洗出液成为两相-混合物。
如果在方法步骤(e)中获得的、视需要经浓缩的洗出液为两相混合物，根据本发明在方法步骤(f)中将获得的由两相组成的洗出液中的水相分离，而获得一种含有结合型雌激素的天然混合物的水相。为此静置所获得的两相洗出液以便达到相的分离。所述相分离可以分别根据所获得的体积需要10分钟至24小时的时间，优选静置所述相5至10小时。当水相和有机相彼此分开后，将水相分离并用于进一步的应用，有机相被放弃。
在分离有机相和水相之后，在步骤(f)中获取含有结合型雌激素天然混合物的水相。该水相含有在PMU中出现的结合型雌激素天然混合物，只含有少量份额的来源于PMU中存在的酚类尿容物，如甲酚和HPMF，以及极少量份额的来源于PMU中存在的非结合型亲脂成份。视需要可以将该水相按照本身已知的方式进一步浓缩，以获取高度去除有机溶剂的、适合于进一步处理过程的浓缩液。因此可以例如将仍存在的有机溶剂残余物从所获取的水相中蒸馏除去。通过蒸馏还可以将水性萃取相的干物质含量调节至具体的数值，优选干物质含量调节至5-15％之间的范围内，尤其优选干物质含量为9％。随即为了稳定所获取的结合型牝马雌激素的天然混合物，还可以将水性萃取液的pH-值调节至碱性范围内，优选在8-13之间的范围内，更优选在9-12之间的数值范围内。用通常适合于调节pH-值的碱调节pH-值，例如1N NaOH或Na2CO3。
根据本发明在方法步骤(f)中所获取的、任选地还经进一步处理或浓缩的水相可以作为起始材料，用于制备含结合型牝马雌激素天然混合物的药物。视需要可以通过合适的干燥工序，例如喷雾干燥法或流化床干燥法制备不含洗脱剂的固体混合物。如果结合型雌激素天然混合物用于制备固态药物，适宜的是，于浓缩和干燥之前，就已经在含有结合型雌激素的水相中混合加入固态载体物质，以这种方式获取含有结合型雌激素和载体物质的固体混合物。例如可以将含有结合型雌激素的水相在流化床中喷涂于一种固态载体物质上，例如纤维素。无论是含有雌激素混合物的水相，还是由此制备的浓缩液或经干燥的固体产物，均可以按照本身已知的方式加工成固态的或液态的盖伦式制剂，如片剂、糖衣剂型、胶囊或乳剂。可以按照本身已知的方式，在应用常规的固态或液态载体物质如淀粉、纤维素、乳糖或滑石粉或液体石蜡和/或在应用常规的制药学佐剂，例如片剂崩解剂、增溶剂或防腐剂的条件下，制备这些盖伦式制剂。如此可以将含有结合型雌激素的产物与制药学载体物质和佐剂按照本身已知的方式混合，然后将该混合物转化成适宜的剂型。
根据本发明所描述的固相-提取法，从尿液中获取结合型牝马雌激素的天然混合物，所述尿液任选地为脱除了粘液物质和固体物质的尿液、经浓缩的所述尿液的浓缩物或所述尿液的经膜过滤而获得的经浓缩的尿滞留物，其中所述混合物以简单的方法高度贫化所述混合物中无论是酚类尿容物(如特别是甲酚和HPMF)还是多种非结合型亲脂性化合物。去除的非结合型亲脂化合物尤其是指非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯和非结合型甾族化合物，在此尤其是指非结合型雄烷-和非结合型孕烷-衍生物。
与已知的固相-提取法相比较，根据本发明的固相-提取法提供一种无论是酚类尿容物还是非结合型亲脂性化合物均被高度贫化的结合型牝马雌激素的天然混合物，其中根据本发明的方法不存在额外的操作步骤，因为即使是非结合型亲脂化合物的贫化也已经在所述固相提取法中完成了。
在从WO 98/08526已知的方法中非结合型亲脂化合物的一部分，例如异黄酮马醇，在方法步骤b)中洗出，而其它非结合型亲脂化合物，例如7-羟基-4′-甲氧异黄酮，随同进入洗出液并视需要必须通过随后的液-液-萃取分离。对于非结合型，即游离型甾族激素也是相类似的情况，其同样在洗出液中以一定的份额检测得到。因此极为令人惊奇的是，对于定量地洗脱，在聚合物吸附树脂上吸附的结合型雌激素可以使用由水、一种与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂以及视需要一种与水可混溶的有机溶剂如低级醚类、链烷醇类或酮构成的单相或甚至于两相混合物，并使所获得的、视需要经浓缩的洗出液分为两相，其中经定量洗脱的结合型雌激素几乎只在水相中被再度发现，而不需要的、非结合型亲脂化合物在有机相中存在并可以简便地去除。
本发明的方法进一步提供一种结合型牝马雌激素的提取液，其相对于干物质具有比较高含量的结合型雌激素。如此采用本发明的方法，即便当尿液含有变换的和可能提高含量的非结合型亲脂化合物，也能以简便的方式从妊娠牝马的尿液中获取结合型雌激素的天然混合物，而不需要在所述固相提取法之后进行进一步的提纯步骤。
通过本发明的方法作为活性物质-提取液所获得的、非结合型亲脂成份和酚类尿容物被贫化的结合型牝马雌激素的天然混合物，相对于通过已知的固相提取法所获取的活性物质-提取液，表现出显著优化的药物规格，正如根据本发明所确立的。
必须称为极其令人惊奇的是，已知的固相提取法在根据本发明的变化下，即便是提供结合型雌激素的天然混合物的妊娠牝马尿液中含有不同和变换含量的非结合型亲脂成份，也可以导致所获取的活性物质提取液如此的质量改善。特别令人惊奇的是，与所使用的PMU相关而无论是在含量还是在组成上可能大幅度变换的非结合型亲脂化合物的份额，通过本发明的方法可以如此确保地减少，在方法步骤f)中作为水相可以获得符合药物规格的高要求的天然结合型牝马雌激素的混合物，所述药物规格的要求例如是根椐USP或欧洲药典所提出的要求。
正如以上详细描述的，根据本发明的方法相对于现有技术具有一系列优点和改善。所以本发明还能够使用非结合型亲脂成份含量变换的PMU，例如其可以具有较高含量的游离型类黄酮、游离型异类黄酮、游离型去甲类异戊二烯或游离型甾族化合物衍生物，在此尤其是游离型雄烷-或游离型孕烷-甾族化合物，而不致影响应该遵守的制药学规格。其中根据本发明的方法建立于已知固相提取法之上，却令人吃惊地不再需要其它提取步骤。由此根据本发明的方法可以保障各个提取液批次的均一组成，因为总是能够去除在PMU中的含量和组成取决于妊娠牝马所摄食的饲料种类而会有所变化的非结合型亲脂成份，并且由此使所获取的提取液相对于干物质都具有近似的结合型牝马雌激素含量。此外通过使用根据本发明的方法以一次性操作步骤不仅针对性地去除酚类尿容物还特别针对性地去除非结合型亲脂成份，而使在所获取的提取液中具有较高浓度的活性物质，即结合型牝马雌激素。根据本发明方法还具有经济优点，因为明显减少了在不能遵守制药学规格的情形下放弃贵重活性物质的风险，例如相对于干物质结合型雌激素含量不够的情况。此外通过应用根据本发明的所述方法能够基本准确而且重复地调节所获取的提取液中活性物质的含量。该活性物质成份突出地适合于制备含有天然结合型牝马雌激素混合物作为活性物质的药物。
以下实施例应能进一步描述本发明，而并非将其范围仅限于此。
实施例以下实施例将描述由PMU获取活性物质提取液的一般工作规则，所述提取液含有PMU中所含有的结合型雌激素天然混合物，并且其中不仅酚类尿容物(例如甲酚或HPMF)而且非结合型亲脂化合物(例如非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物、尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物和类似的非结合型化合物)均被高度贫化。其显示根据本发明如何由非结合型亲脂化合物份额变换或提高的PMU获取活性物质含量高的优质提取液。
尿液对于本发明的方法，可以作为尿液的正如根据WO 98/08526所述为如下的PMU，即使用一种通过浓缩从PMU中获取的浓缩物或一种通过过滤或类似的方法已经预先纯化过的从PMU中获取的浓缩物。所收集的尿液(PMU)首先以本身已知的方式脱除粘液物质和固体物质。适宜的是使固体物质和粘液物质沉积，然后依照本身已知的分离方法，例如滗析，分隔和/或过滤而分离。所以PMU可以例如通过一种本身已知的分离装置，例如分离器、过滤装置或沉淀器导出。作为分离装置可以例如使用一种沙床，或可以使用商购可得的分离器，例如喷嘴分离器(Düsenseparatoren)或腔室分离器(Kammerseparatoren)。需要时还可以使用微过滤仪器或超过滤仪器，在其应用中同时可以致使经过滤的PMU高度脱除霉菌和病毒。
任选地可以在尿液或尿浓缩物中加入防腐剂、杀微生物剂、杀菌剂和/或抗蠕虫剂。
作为预先纯化过的尿浓缩物还可以使用通过本身已知的膜过滤方法从PMU中获得的浓缩的PMU滞留物。滞留物中的固体含量及其组成可以分别根据所使用的PMU和用于膜过滤所使用的膜，例如其孔径，以及过滤条件而变化。例如可以在使用纳米过滤膜的情形下几乎达到在PMU滞留物中雌激素含量的浓度无损失，且同时去除达50重量％的低分子量的PMU内容物。对于本发明的方法可以使用浓缩比例达到约1∶10，例如比例约为1∶7的PMU滞留物，由此其体积可以浓缩至原PMU体积的约1/10，例如约1/7。
吸附树脂在方法步骤a)中可使用的聚合物吸附树脂根据WO 98/08526是半极性的，特别是非离子型半极性的聚合物吸附树脂。在根据本发明的方法中作为吸附材料可使用的聚合物吸附树脂优选多孔的有机非离子型聚合物，其与非极性疏水性聚合物吸附树脂相反具有中等的极性(＝例如树脂的活性表面的偶极矩在1.0至3.0，特别是在1.5至2.0德拜的范围内)并具有略微亲水性的结构，例如聚碳酸酯树脂。适宜的是使用大孔半极性树脂，所述大孔半极性树脂优选具有巨网结构，平均孔径在50至150埃，优选在70至100埃的范围内，并且具有比表面积在300至900m2/g，优选400至500m2/g的范围内。表明特别适宜的是大孔交联的脂族聚碳酸酯树脂，特别是交联的聚丙烯酸酯树脂如Rohm和Haas公司的Amberlite XAD-7(HP型)，为非离子型半极性吸附树脂。
除了所述优选的吸附材料还可以使用其它吸附树脂。在此适合作为吸附树脂的不仅是非极性、半极性还有极性吸附树脂。能够泵入吸附材料的尿液量在此首先依据吸附树脂各自的吸附能力而确定。可使用的吸附树脂的实例是商购可得的类型，例如具有苯乙烯二乙烯基苯的基本结构单元的聚合物Amberlite吸附材料(例如XAD-1180型，XAD-2型，XAD-16型)，具有丙烯酸酯基本结构单元的聚合物Amberlite吸附材料(例如XAD-7)或那些具有含高极性基本结构的氮和氧的聚合物Amberlite吸附材料(例如XAD-12)。其它吸附树脂为Dowex-树脂(苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物)，例如Dowex112、Dowex Optipore、DowexOptipore V 493；Lewatit(交联的聚苯乙烯)，例如Lewatit OC 1064、Lewatit OC 1066或Lewatit OC 1163，聚胺阴离子交换树脂，例如Dowex-树脂。有利的吸附树脂特别是XAD-7(HP型)、XAD-16(HP型)、XAD 118和Dowex Optipore，优选的是Dowex Optipore V 493以及Lewatit OC 1064、OC 1066和OC 1163。
方法步骤a)结合型雌激素在聚合物吸附树脂上的吸附可以依据W0 98/08526，也如在根据本发明的方法中通过使视需要经预加工的PMU或其滞留物与吸附树脂进行接触，方法是将尿液导入含有吸附树脂的反应器并在其中保持与吸附树脂接触足够用于吸附雌激素成份的时间。在聚合物吸附树脂上成功地吸附结合型雌激素后可以将加载有结合型雌激素的混合物的吸附树脂与剩余的尿液以本身已知的方式分离。适宜的是可以将尿液通过含有吸附树脂的柱以这样的流通速度进行，即接触时间足以用于吸附雌激素成份。适宜的是例如流通速度相当于3至10(优选5至7)体积份PMU每1体积份吸附树脂每小时的通过量。适宜的是尿液通过反应器的流通速度可以在略微的过压或减压下加工而控制。聚合物吸附树脂的应用量可以分别根据所使用的吸附树脂的类型和在尿液中的固体含量而变化。在使用PMU的情形下可以例如一体积份吸附树脂，例如交联的脂族聚碳酸酯-吸附树脂，用直至80，优选为30至50的体积份的经预处理的PMU加载，而不会在流出的尿液中检测到显著量的雌激素。在使用PMU-浓缩物或PMU-滞留物的情形下，当然吸附树脂的加载能力随其浓缩的程度而减少。由此可以例如1体积份交联的脂族聚碳酸酯-吸附树脂用与20至80，优选30至50体积份的PMU相应量的尿液加载。
方法步骤b)被结合型雌激素的混合物加载的聚合物吸附树脂将在方法步骤b)中用调节至pH-范围至少为12.0，特别是12.5至14，优选约12.5至13.5的洗涤水洗涤。作为洗涤水可以使用在尿液中溶解的惰性碱性物质的水溶液，其足够使pH-值达到至少12.5。作为对于聚合物吸附树脂惰性的水溶性碱性物质适宜的是，优选水溶性无机碱如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，特别是氢氧化钠。适宜的是所述洗涤水只约含有使之达到理想的pH-值(优选约pH 13)所需要的碱性物质的量。如此选择洗涤水的量，使之足够高度去除酚类尿容物而不会就此伴随着洗掉值得一提的量的结合型雌激素。表明适宜的是例如使用2至10，特别是4至6柱体积的洗涤液每柱体积的吸附树脂。在此将洗涤水适宜地以3至10，优选5至7，体积份洗涤水每1体积份吸附树脂每小时的流通速度通过含有吸附树脂的反应器。
方法步骤c)-中间洗涤步骤在方法步骤b)之后的中间洗涤步骤中用水洗涤在方法步骤a)中加载有结合型雌激素的混合物的聚合物吸附树脂。洗涤水的量如此选择，即在最后的方法步骤e)中所获得的洗出液具有结合型雌激素的混合物，其满足对于游离型雌激素最高含量的要求并由此作为活性物质成份可以用于制药。表明适宜的是每柱体积的吸附树脂例如应用1至8(优选1至4)柱体积的洗涤水。在此将洗涤水适宜地以3至10，优选5至7体积份洗涤水每1体积份吸附树脂每小时的流通速度通过一种含有吸附树脂的反应器。
在一个根据本发明的方法的有利的实施方案中，所述中间洗涤步骤在低于室温下，特别是在0℃和10℃之间的温度下进行，因为发现通过附加的中间洗涤步骤可能随条件激素或活性物质的损失可以明显减少。室温是通常被认为的环境温度，例如描述的是在20℃和30℃之间的温度。极其适宜的是所述方法在实际的0℃或近似0℃的温度下进行。在实践中，因此建议在稍高于0℃的温度下操作并通过相应的措施用以维持所述的温度范围。为此可以用常规的措施用于降低温度，例如使用经冷却的反应器、经冷却的材料和/或经冷却的原料如PMU。温度为0℃或接近0℃从实际的角度出发可以理解为0℃约至5℃，特别是0℃约至3℃。
为了在中间洗涤步骤维持尽可能少的可能的激素损失，根据所述变体方案在中间洗涤步骤中和/或也在方法步骤b)中使用的调成碱性的洗涤水预冷却至低于室温，特别是在0℃和10℃之间的温度。进一步适宜的或优选的温度范围是如前述列举的从0℃约至5℃，特别是从0℃约至3℃的温度。优选在0℃或接近0℃的温度下操作，即优选在中间洗涤步骤中和/或也在方法步骤b)中所使用的调成碱性的洗涤水预冷却至稍高于0℃的温度。通过经冷却的调成碱性的洗涤水在方法步骤b)中的应用预冷却或维持吸附树脂的已经完成的冷却，例如为了避免在加入经冷却的用于中间洗涤步骤的洗涤水时发生所不希望的再度升温。因此优选中间洗涤步骤和所述前序的方法步骤b)两者在同一温度范围内进行，例如在低于室温，特别是在0℃和10℃之间或优选在如上所给出的温度范围内的温度。
在本发明的前述的低于室温的温度下进行的变体方案中，值得希望的是可以将所有使用的装置如用于承载聚合物吸附树脂的反应器或已经装有聚合物吸附树脂的反应器和/或所使用的PMU预冷却至低于室温，特别是在0℃和10℃之间的温度或在上述列举的优选维持的温度范围之内进行使用。
本发明的方法步骤d)，e)和f)随后根据本发明的方法步骤d)的描述，所述经洗涤的加载有结合型雌激素的混合物的吸附树脂采用足够用于洗脱结合型雌激素的混合物的量的洗脱液处理，在方法步骤e)中获得一种含有PMU的结合型雌激素的天然混合物的洗出液，并视需要地浓缩。如果所获得的、视需要经浓缩的洗出液为一种两相混合物，则在方法步骤f)中分离洗出液的水相，以便获取一种含有PMU的结合型雌激素的天然混合物的水相，其视需要可以进一步地浓缩。
吸附树脂柱的再生为了柱的再生首先分别使用1至4，特别是2至3柱体积的调节至pH 13的含有50％乙醇的乙醇/水-混合物每柱体积吸附树脂，然后用相应体积的10％柠檬酸钠水溶液和最终用相应体积的蒸馏水洗涤。整个再生过程在40℃至45℃的温度下进行。该柱可多次，例如多至40次加载和重复再生。
实施例1相应于WO 98/08526和WO 03/048183的方法的对比实施例实施例2a，2b和3(根据本发明的方法)实施例2a在室温下用50体积％的乙酸乙酯洗脱实施例2b在45℃下用50体积％的乙酸乙酯洗脱实施例3在40℃下用单相的含乙酸乙酯的洗脱液混合物洗脱a)在半极性聚丙烯酸酯-吸附树脂上吸附PMU的雌激素成份(用于所有实施例)330毫米柱高的具有直径为40毫米的柱用200毫升的在水中溶胀的半极性聚丙烯酸酯-吸附树脂(＝Rohm和Haas公司的Amberlite XAD-7(HP型)，粒度为0.3至1.2毫米，偶极矩为1.8德拜，平均孔径为80埃，比表面积约450m2/g，干燥的)装填。7升(＝35柱体积，下文简称为BV)经超过滤装置过滤的PMU于室温下在实施例1中采用流通速度为平均16.7毫升/分钟(＝5BV/h)，在实施例2a中采用40毫升/分钟(＝12BV/h)和在实施例2b和3中采用24.4毫升/分钟(＝7.3BV/h)通过柱，其中PMU的结合型雌激素含量(以雌激素硫酸盐、马烯雌酮硫酸盐和17-α-二氢-马烯雌酮的总和计算)以及甲酚含量借助HPLC确定(数值请参见表I)。PMU的雌激素成份将完全被吸附在如此被加载的半极性吸附树脂柱上。所述流出的尿液借助HPLC检测其结合型雌激素含量并表明实际上无雌激素。丢弃所述流出的尿液。
b)经加载的吸附树脂柱的洗涤(用于所有实施例)采用1.0升(＝5BV)的pH-值为13的氢氧化钠水溶液洗涤经加载的吸附树脂柱。为此将碱性洗涤水采用平均为16.7毫升/分钟的流通速度(＝5BV/h)通过柱。所流出的洗涤液体借助HPLC检测其中结合型雌激素和甲酚的含量。该检测显示，在洗涤期间低于全部加载于柱上的雌激素的5％被洗出。
c)中间洗涤步骤(用于所有实施例)采用600毫升水(＝3BV)洗涤经加载的吸附树脂柱。在此将中性洗涤水以平均为16.7毫升/分钟的流通速度(＝5BV/h)通过柱。所流出的洗涤液体借助HPLC检测其中结合型雌激素和甲酚的含量。该检测显示，在洗涤期间只有占全部加载于柱上的雌激素的极少部份(至多只有约若干百分数)被洗出。
d)和e)从经洗涤的吸附树脂柱上解离结合型雌激素实施例1-对比实施例1.1升(＝5.5BV)的洗脱液(乙醇/水30∶70)采用平均为8.2毫升/分钟(＝2.4BV/h)的流速通过预热至45℃的柱。将所流出的洗出液以6个级份E1至E5收集。所述级份各为200毫升(＝1柱体积)或100毫升(＝0.5柱体积对于E6)并借助HPLC检测其中的结合型雌激素和甲酚的含量(数值请参见表I)。
前四个级份含有占柱所吸附的结合型雌激素总量的约80至98％。后续的级份只含有少量的结合型雌激素。含有结合型雌激素主要量的级份是适用于盖伦氏进一步加工的提取液。
实施例2在室温下用50体积％的乙酸乙酯洗脱(实施例2a)在45℃下用50体积％的乙酸乙酯洗脱(实施例2b)将900毫升(＝4.5柱体积)的两相洗脱液(比例为50∶50的乙酸乙酯-水混合物)采用16.7毫升/分钟(＝5.0BV/h)的平均流速通过处于上述的洗脱温度的柱。所述流出的洗出液以9个级份E1至E9收集。所述级份分别为100毫升(＝0.5BV)，从第四个级份开始获得的洗出液是两相-混合物，其为了用于分析各个提取液，分隔为水相和有机相(E4至E9，分别以LM表示溶剂和W表示水相)。所有级份将借助HPLC检测其结合型雌激素和甲酚的含量(数值请参见表I)。对于某些级份还将借助GC确定非结合型亲脂化合物含量，例如7-羟基-4′-甲氧异黄酮(数值请参见表II)。
前三个极份只含有痕量的雌激素。随后的级份4至8的水相含有占柱所吸附的结合型雌激素总量的约80至98％。后续的级份只含有极少量的雌激素。含有结合型雌激素主要量的级份是适用于盖伦氏进一步加工的提取液。
为了控制根据本发明的采用乙酸乙酯-水-混合物洗脱的彻底性，随即在提取后连接一个采用单相乙醇-水-混合物(30∶70)进行的已知的萃取。
通过随后的乙醇洗脱，在实施例2a中仍然洗脱出显著量(相当于约6.8％的总加载量)的结合型雌激素。通过将洗脱温度提高至45℃可以使仍在柱上留存的只有通过乙醇才能洗脱的结合型雌激素的量降低至低于1％。
实施例3在40℃下采用单相含有乙酸乙酯的洗脱液混合物洗脱1.0升(＝5BV)单相洗脱液(体积比为1∶1∶1.4的乙酸乙酯-水-丙酮混合物)采用16.7毫升/分钟(＝5.0BV/h)的平均流速通过处于温度为40℃的柱。所述流出的洗出液以13个不同量的级份收集。第一个级份为100毫升(＝0.5BV)，随后的10个级份分别为50毫升(＝0.25BV)，而最后的两个级份分别为200毫升。从柱中排出洗涤水后令人惊奇地已经在洗出液中分为两个相(从级份4开始)。所有级份均借助HPLC检测其结合型雌激素和甲酚的含量(数值请参见表II)。
第一个级份只含有痕量的雌激素。在随后的级份2至7中含有占柱所吸附的结合型雌激素总量的约80至98％。最后的级份只含有极少量的雌激素。含有结合型雌激素主要量的级份是适用于盖伦氏进一步加工的提取液。
所述洗出液E7至E13直至约24小时后才分为两相。将所述洗出液E1至E7合并如下加工所述洗出液E1至E7用500毫升分液漏斗合并获得约350毫升的溶液。没有即刻出现相分离，但在静置一个周末后可见约10毫升的小量的有机相位于分液漏斗的上端。所述相借助HPLC检测其结合型雌激素和甲酚的含量。在相分离后将水相在旋转蒸发器中于70℃浓缩至TS为8-10％(在此为8.16％TS，数值请参见表I)吸附树脂柱的再生(用于所有实施例)为了再生首先采用400毫升调节至pH 13的含有50％乙醇的乙醇/水-混合物洗涤柱，然后采用400毫升10％的柠檬酸钠的水溶液和最终采用400毫升蒸馏水洗涤。整个再生过程在40℃至45℃的温度范围内进行。柱可以多次，例如多至40-次加载和重复再生。
对于在洗脱中所获得的含有主要量的结合型雌激素的级份在下表中分别表示出以重量％计的TS含量和通过HPLC确定的结合型雌激素以及甲酚的含量(CE以雌激素硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和17-α-二氢-马烯雌酮的总和计算)。此外将提取的产率以数值形式列出。
表I根据含有结合型雌激素主要量的级份的组成对比各方法
*)通过计算得出的含量的确定值例如在实施例1的实验过程中，即在乙醇洗脱的情形下，一部分异类黄酮，例如马醇，用碱性洗涤洗出，一部分异类黄酮，例如7-羟基-4′-甲氧异黄酮，也进入了洗出液，并且只能通过后续的萃取而分离。对于其它非结合型亲脂化合物也是类似的，例如游离型甾族激素。相反，根据本发明的洗脱方法能够使柱中仍存在的异类黄酮和游离的甾族化合物以主要的份额进入任选地浓缩的洗脱液的与水不可混溶的溶剂相中，而约达98％的结合型雌激素位于需要进一步加工的洗出液的水相中。所述水相不合非结合型甾族激素并且高度贫化了异类黄酮和类似的非结合型亲脂化合物。这一分布可依据实施例2a的第4洗出液的水相和有机相的GC-分析表明于下表中。
表II结合型雌激素，实施例2a的第4洗脱液的水相和有机相中的游离的甾族激素和7-羟基-4′-甲氧异黄酮(作为异类黄酮的实例)的分布，GC-分析计算值(该水相在测试前约浓缩1.8倍)
权利要求
1.用于从妊娠牝马的尿液中获取结合型雌激素的天然混合物的方法，该方法包括a)一种尿液，其为未脱除或脱除了粘液物质和固体物质的尿液、经浓缩的所述尿液的浓缩物或所述尿液经膜过滤而获得的经浓缩的尿滞留物，与一种用于吸附尿液中含有的结合型雌激素的混合物的足够量的聚合物吸附树脂接触，并将被结合型雌激素的混合物加载的聚合物吸附树脂从剩余的尿液中分离，并且b)被结合型雌激素的混合物加载的聚合物吸附树脂用一种pH-值调节到至少为12.0的洗涤用水洗涤，并且c)任选地进行中间洗涤步骤，其中用水洗涤被结合型雌激素的混合物加载的聚合物吸附树脂，并且d)将经洗涤的吸附树脂与一种用于解离所吸附的结合型雌激素的混合物的足够量的洗脱液接触，并且e)从吸附树脂上分离含有结合型雌激素的天然混合物的洗出液并视需要地浓缩，其特征在于，所获取的结合型牝马雌激素的天然混合物在酚类尿容物和非结合型亲脂化合物方面被贫化，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物，尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物，以及类似的非结合型化合物，且在方法步骤(d)中作为洗脱液使用一种单相或两相-混合物，其含有(i)水，任选地其pH-值被调节至碱性范围内，和(ii)至少一种适用于洗脱选自上述列举的非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂，和任选地(iii)至少一种与水可混溶的有机溶剂，其选自与水可混溶的醚类、低级链烷醇类和低级脂族酮类，以及前述溶剂的混合物，并且如果在方法步骤e)中所获取的、任选地经浓缩的洗出液为一种两相混合物，则在方法步骤f)中将所获取的由两相构成的洗出液中的水相分离，并且获取含有结合型雌激素的天然混合物的水相并将其任选地浓缩。
2.根据权利要求1的方法，其中在方法步骤(d)中作为洗脱液使用的一种单相或两相-混合物，其含有(i)水，任选地其pH-值被调节至碱性范围内，和(ii)至少一种适用于洗脱非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物，尤其是雄烷-和孕烷-甾族化合物，以及类似的非结合型化合物，和(iii)至少一种与水可混溶的有机溶剂，其选自与水可混溶的醚类、低级链烷醇类和低级脂族酮类，以及前述溶剂的混合物。
3.根据前述权利要求之一的方法，其中适用于洗脱非结合型亲脂化合物的与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)选自呈直链的、支化的或环状C4-C10醇、C1-C10酯化酸、C3-C10醛类、C4-C10酮类、C3-C10醚类、C3-C6腈类和C1-C3卤代烷烃，以及前述溶剂的混合物。
4.根据权利要求3的方法，其中适用于洗脱非结合型亲脂化合物的与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)选自乙酸-C1-C4-烷基酯、丁醇、环己醇、己醇、乙醚、二氯甲烷、甲基叔丁基醚和前述溶剂的混合物。
5.根据权利要求4的方法，其中适用于洗脱非结合型亲脂化合物的与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)选自乙酸-C1-C4-烷基酯，优选为乙酸乙酯和/或乙酸-异丙酯。
6.根据前述权利要求之一的方法，其中所述与水可混溶的有机溶剂(iii)选自丙酮、乙醇和四氢呋喃以及前述溶剂的混合物。
7.根据权利要求6的方法，其中所述与水可混溶的有机溶剂(iii)是丙酮和/或乙醇。
8.根据权利要求7的方法，其中所述与水可混溶的有机溶剂(iii)是丙酮。
9.根据权利要求1-4之一的方法，其中适用于洗脱非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)是乙酸-C1-C4-烷基酯，优选为乙酸乙酯和/或乙酸-异丙酯，而与水可混溶的有机溶剂(iii)是丙酮和/或乙醇。
10.根据权利要求9的方法，其中适用于洗脱非结合型亲脂化合物的、与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)是乙酸乙酯，而所述与水可混溶的有机溶剂(iii)是丙酮。
11.根据前述权利要求之一的方法，其中在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物的水(i)和与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)的体积比在5∶1至1∶5的范围内，优选在2∶1至1∶2的范围内。
12.根据前述权利要求之一的方法，其中在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物的水(i)和与水可混溶的有机溶剂(iii)的体积比在4∶1至1∶5的范围内，优选在2∶1至1∶3的范围内。
13.根据前述权利要求之一的方法，其中在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物的水(i)和与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)一起相对于与水可混溶的有机溶剂(iii)的体积比在5∶1至1∶5的范围内，优选在2∶1至1∶2的范围内。
14.根据权利要求9的方法，其中在方法步骤(d)中作为洗脱液应用的单相或两相-混合物的水(i)相对于作为与水不可混溶或几乎不可混溶的有机溶剂(ii)应用的乙酸-C1-C4-烷基酯，优选乙酸乙酯和/或乙酸-异丙酯，和相对于作为与水可混溶的有机溶剂(iii)应用的丙酮和/或乙醇的体积比在1∶1∶1至1∶1∶2，优选在约1∶1∶1.4的范围内。
15.根据前述权利要求之一的方法，其中作为聚合物吸附树脂使用半极性的吸附树脂，优选使用非离子型半极性吸附树脂。
16.根据前述权利要求之一的方法，其中结合型雌激素的天然混合物从经洗涤的吸附树脂上的洗脱，是在方法步骤d)中于20℃和80℃之间的温度范围内，优选在30℃和50℃之间的温度下进行的。
全文摘要
本发明涉及用于获取含有结合型牝马雌激素的天然混合物的提取液的方法，其中通过固相提取法从妊娠牝马的尿液中获取结合型雌激素的混合物，该混合物中酚类尿容物和非结合型亲脂化合物被贫化，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型甾族化合物，尤其是雄烷－和孕烷－甾族化合物，以及类似的非结合型化合物。
文档编号C07J1/00GK1805971SQ200480016602
公开日2006年7月19日 申请日期2004年7月13日 优先权日2003年7月17日
发明者H-H·拉斯彻, K·维尔布兰德, S·班沙巴驰 申请人:索尔瓦药物有限公司