专利名称：TGF－β基因表达抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及转化生长因子TGF-β基因表达抑制剂、用于与TGF-β相关的疾病的治疗药物和新的吡咯-咪唑聚酰胺。更具体地说，本发明涉及含有具有特定结构的吡咯-咪唑聚酰胺的TGF-β基因表达抑制剂。
背景技术：
原发性高血压诱发严重的并发症，诸如脑卒中、缺血性心脏病、肾硬化等，并且这些并发症基本上与因血管平滑肌细胞(VSMC)过度生长的血管病有关且是高血压疗法的目标。此外，在治疗心绞痛和心肌梗死的经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)后，在约40％的病例中出现再狭窄，但没有治疗它的有效药物，并且是心血管领域中的巨大难题。在组织病理学上，已知在动脉增生性疾病，诸如高血压性血管疾病、血管成形术后的新内膜形成和动脉粥样硬化中涉及TGF-β。认为这类疾病中的细胞生长会受到各种机制抑制。不同机制之一为抑制转化生长因子(TGF)表达。
TGF是首先作为莫洛尼(Molony)肉瘤病毒(MSV)转化的小鼠3T3细胞的因子发现的，而莫洛尼(Molony)肉瘤病毒(MSV)可以将正常细胞转化成恶性细胞并且主要分类为TGF-α和TGF-β。TGF-β是蛋白质的C-末端上的112个氨基酸的部分，其中所述蛋白质的分子量约为40,000且由作为前体的390-412个氨基酸组成并且进一步通过二硫键形成二聚体(25kDa)以便具有活性。
构成控制细胞生长和发育的蛋白质家族的TGF-β(非专利对比文件1)在不同组织中产生，诸如血管、血小板、肝、肾、心肌、肺、胰腺、皮肤、胎盘、骨髓，并且对细胞增殖、胞外基质形成和免疫性具有控制活性。
TGF-β抑制大部分细胞增殖，但对间质细胞，诸如成纤维细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)等具有双相增殖活性。即，在正常条件下，TGF-β抑制这些细胞增殖，而在诸如炎症、机械应激等情况下刺激增殖。这些事实揭示出TGF-β通过促进VSMC生长和胞外基质形成涉及血管成形术后的新内膜形成。在动脉硬化损害形成中也涉及TGF-β。基于这类信息，认为目的在于控制TGF-β作用的对血管疾病的局部治疗可以有效减轻上述动脉增生性疾病。
此外，认为经皮的肾血管成形术后的肾动脉再狭窄中涉及TGF-β。这些事实揭示出本发明的特异性TGF-β基因表达抑制剂可以有效地作为上述各种增生性血管和狭窄性疾病的治疗药物。
此外，肝中的星形胶质细胞在肝中原纤维形成过程中的胞外基质产生中起重要作用(非专利对比文件2)。星形胶质细胞由TGF-β1活化，并且活化的星形胶质细胞诱导TGF-β1从受损害的肝中的炎症细胞中分泌。同时，TGF-β1受体的表达在活化的星形胶质细胞中受到促进，并且胞外基质蛋白通过自身内分泌机制在TGF-β1周围增加(非专利对比文件3)。这些事实揭示出有理由推定本发明的TGF-β1基因表达特异性抑制剂可以有效地作为上述各种肝病的治疗药物。
此外，TGF-β的表达在肾病，诸如IgA肾病、局灶性肾小球硬化、新月形肾炎、局灶性硬化性狼疮性肾炎、弥漫性增生性狼疮性肾炎、糖尿病性肾病变、高血压性肾硬化等的模型动物肾活组织检查中的胞外基质中和肾小球肾炎和糖尿病性肾病变患者的肾活检组织中同时增加(非专利对比文件4和非专利对比文件5)。同时，Border等报导了对Thy-1肾炎大鼠给予抗-TGF-β抑制胞外基质在肾小球中的蓄积(非专利对比文件5)。这些事实提示有理由推定本发明的TGF-β1基因表达特异性抑制剂可以有效地作为上述各种肾病的治疗药物。
此外，在心肌梗死动物模型中的疤痕形成阶段上的梗死形成病灶中，TGF-β的表达连续升高并且涉及心肌纤维性颤动(非专利对比文件6)。这些事实提示有理由推定本发明的TGF-β1基因表达特异性抑制剂可以有效地作为心肌梗死后心肌纤维性颤动的治疗药物。
此外，对肺纤维化模型动物给予抗-TGF-β抗体和TGF-β的可溶性受体改善了肺纤维化(非专利对比文件7)。这些事实提示有理由推定本发明的TGF-β1基因表达特异性抑制剂可以有效地作为肺纤维化的治疗药物。
此外，有许多有关TGF-β1在人慢性胰腺炎中高度表达的报导，并且对复发性急性胰腺炎模型动物给予重组TGF-β诱导胰腺炎症损害处的原纤维形成或纤连蛋白mRNA的高度表达。相反，已经证实当准备了胰腺炎模型时，给予针对TGF-β1的中和抗体抑制了胞外基质产生以及I和III型胶原蛋白和纤连蛋白的mRNA表达(非专利对比文件8)。这些事实提示有理由推定本发明的TGF-β1基因表达特异性抑制剂可以有效地作为慢性胰腺炎中原纤维形成的治疗药物。
此外，已经提出硬皮病可能由TGF-β导致，并且Mori等报导了TGF-β诱导皮肤原纤维形成模型小鼠的皮肤原纤维形成(非专利对比文件9)。这些事实提示有理由推定本发明的TGF-β1基因表达特异性抑制剂可以有效地作为各种皮肤原纤维形成疾病的治疗药物。
此外，已经报导了TGF-β mRNA的表达在骨髓纤维化患者的巨核细胞中得到促进(非专利对比文件10)，并且TGF-β在血小板中的浓度取得了高值(非专利对比文件11)且TGF-β在患者血浆中的浓度明显较高(非专利对比文件12)。根据Rameshwar等所述，骨髓纤维化患者的单核细胞通过粘着活化了诱导IL-1产生的NF-k且IL-1通过促进TGF-β产生导致骨髓纤维化(非专利对比文件13)。这些事实提示有理由推定本发明的TGF-β1基因表达特异性抑制剂可以有效地作为骨髓纤维化的治疗药物。
此外，已经报导了在具有额部毛发脱失的雄激素性脱发患者的细胞培养系统中，雄激素从真皮乳头细胞中诱导TGF-β1且这种TGF-β1抑制表皮细胞生长(非专利对比文件14)。这些事实提示有理由推定本发明的TGF-β1基因表达特异性抑制剂可以有效地作为具有额部毛发脱失的雄激素性脱发的治疗药物。
已经将使反求遗传学中的基因功能失活的方法用于分析特异性基因功能，该方法还具有用于病毒感染、癌症和异常基因表达导致的其它疾病的治疗应用的潜力。即，已知可以通过同源重组在DNA水平上或者可以通过反义寡脱氧核苷酸和核酶在RNA水平上实现基因功能失活。然而，使用反义寡核苷酸和核酶的方法存在靶序列受限、反义寡核苷酸和核酶转入组织和细胞无效和它们易于被核糖核酸酶降解的问题。
另一方面，已经报导了不同于(脱氧)核苷酸试剂，诸如反义试剂和核酶，吡咯-咪唑聚酰胺类(下文也称作Py-Im聚酰胺)可以特异性识别DNA序列并在胞外控制特异性基因的表达。
吡咯-咪唑聚酰胺类是一组合成小分子，它们由为芳族环的N-甲基吡咯单元(下文也称作Py)和N-甲基咪唑单元(下文也称作Im)组成(非专利对比文件15-17)。连续偶联并折叠的Py和Im在γ-氨基丁酸酯的存在下可以呈现U-形构象。在本发明涉及的吡咯-咪唑聚酰胺类中，N-甲基吡咯单元(Py)、N-甲基咪唑单元(Im)和γ-氨基丁酸酯单元(也称作γ-连接基)彼此通过酰胺键(-C(＝O)-NH-)结合，并且吡咯-咪唑聚酰胺类的一般结构和生产方法为公知的(专利对比文件1-3)。
合成的聚酰胺类可以结合具有高度亲和性和特异性的双螺旋DNA小沟中的特异性碱基对。碱基对的特异性识别取决于Py与Im的1对1配对的形成。即，在DNA小沟中的U-形构象中，Py/Im对靶向C-G碱基对，Im/Py靶向G-C碱基对，且Py/Py靶向A-T碱基对和T-A碱基对(非专利对比文件16-17)。按照近来的研究，显而易见的是，作为用3-羟基吡咯(Hp)取代Py/Py对的吡咯环的结果，A-T缩合可以通过Hp/Py优选与T/A对结合而得到克服(非专利对比文件18)。
一般来说，认为启动转录是基因控制中的重要点。为了启动转录，需要几种转录因子结合基因启动子区中的特异性识别序列。小沟中的聚酰胺可以通过阻断转录因子结合干扰基因控制，条件是该转录因子在基因表达中起重要作用。这种推定已经在体外和体内实验中被证实为正确的。结合在锌指识别位点(TFIIIA结合位点)内的8元环Py-Im聚酰胺抑制5S RNA基因的转录(非专利对比文件19)。结合与人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)启动子中的转录因子序列相邻的碱基对序列的聚酰胺类阻断人细胞中的HIV-1复制。这些序列包括TATA框、淋巴细胞强化因子LEF-1序列和ETS-1序列(非专利对比文件20)。与它们相反，聚酰胺还可以通过阻断阻抑因子或取代原始转录因子活化基因的表达(非专利对比文件21-23)。人巨细胞病毒(CMV)的UL122介导的早期蛋白2(IE86)阻断将RNA聚合酶II提供给启动子并抑制相应基因的转录(非专利对比文件21)。合成的聚酰胺类可以通过IE86阻断抑制并减缓相应基因的表达(非专利对比文件22)。通过Mapp设计的聚酰胺作为人工转录因子起作用并介导基因的转录反应(非专利对比文件23)。
专利对比文件1日本专利JP3045706专利对比文件2JP-A-2001-136974专利对比文件3WO 03/000683 A1非专利对比文件1Piek等，《FASEB杂志》(FASEB J.)13，2105-2124(1999)非专利对比文件2Bataller R等《胃肠病学》(Gastroenterology)118，1149，2000非专利对比文件3Watanabe，H.等Gendai Iryo 35(No.2)，2003非专利对比文件4Yamamoto T.等《国际肾脏》(KidneyInt)49461，1996非专利对比文件5Border WA等《国际肾脏》(KidneyInt)511388，1997非专利对比文件6Ono等《循环》(Circulation)98149，1998非专利对比文件7Giri SN al《胸腔》(Thorax)1993非专利对比文件8Makino，N等Gendai Iryo Vol.35，No.2，2003非专利对比文件9Mori等《细胞生理学杂志》(J CellPhysiol)；181153，1999非专利对比文件10Reilly J等《临床血液病学》(ClinHaematol)11751-767，1998非专利对比文件11Martyre MC等《英国血液病学杂志》(Br J Haematol)7780-86，1991非专利对比文件12Rameshwar P等《美国血液病学杂志》(Am J Haematol)59133-142，1998非专利对比文件13Rameshwar等《免疫学杂志》(JImmunol)1652271-2277，2000非专利对比文件14Shigeki等《FASEB杂志》(FASEBJ.)161967-1969，2002非专利对比文件15Trauger等《自然》(Nature)，1996；382559-61非专利对比文件16White等《化学与生物学》(Chem Biol.)1997；4569-78非专利对比文件17Dervan《生物有机药物化学》(BioorgMed Chem.)2001；92215-35非专利对比文件18White等《自然》(Nature)1998；391468-71非专利对比文件19Gottesfeld等《自然》(Nature)1997；387202-5非专利对比文件20Dickinson等《美国国家科学院院报》(Proc Natl Acad Sci USA.)1998；9512890-5非专利对比文件21Lee等《美国国家科学院院报》(ProcNatl Acad Sci USA.)1996；932570-5非专利对比文件22Dickinson等《生物化学》(Biochemistry.)1999；3810801-7非专利对比文件23Mapp等《美国国家科学院院报》(Proc Natl Acad Sci USA.)2000；973930-5
发明内容
本发明要解决的问题使用反义寡脱氧核苷酸和核酶的上述方法存在靶序列受限、反义寡核苷酸和核酶转入组织和细胞无效和它们易于被核糖核酸酶降解的问题。迄今为止，尚没有有关使用结合hTGF-β基因碱基序列的TGF-β基因表达抑制剂或与TGF-β相关的疾病的治疗药物的报导。
解决问题的方式本发明者努力尝试研发通过特异性结合人TGF-β启动子特定区抑制人TGF-β基因表达的吡咯-咪唑聚酰胺类并研究其药理作用。为了获得可以抑制人转化生长因子-β1(hTGF-β1)基因表达并且还可以用作治疗药物的化合物，本发明者已经研究了靶向hTGF-β1启动子的不同片段的聚酰胺类，并且发现结合与脂肪-特异性元件2(FSE2)序列相邻的hTGF-β1启动子从-557到-536的碱基对序列的化合物显著抑制hTGF-β1启动子的活性并且减量调节培养的人血管平滑肌细胞(VSMC)中hTGF-β1基因的表达，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)TGF-β基因表达抑制剂，包含吡咯-咪唑聚酰胺，该吡咯-咪唑聚酰胺含有N-甲基吡咯单元(下文也称作Py)、N-甲基咪唑单元(下文也称作Im)和γ-氨基丁酸酯单元，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺可以在双螺旋区(下文称作靶区)的小沟中的γ-氨基丁酸酯单元处折叠成U-形构象，其中所述的双螺旋区包含下列人转化生长因子β1(下文也称作hTGF-β1)启动子中从-557到-536的碱基序列(SEQ ID NO1)的部分或全部及其互补链TAAAGGAGAGCAATTCTTACAG其中Py/Im对相应于C-G碱基对，Im/Py对相应于G-C碱基对，并且Py/Py对相应于A-T碱基对和T-A碱基对。
(2)(1)所述的TGF-β基因表达抑制剂，进一步包含β-丙氨酸单元。
(3)(1)或(2)所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的靶区为双螺旋区，它包含如下hTGF-β1启动子中从-548到-537的碱基序列(SEQ ID NO2)的部分或全部及其互补链GCAATTCTTACA。
(4)(3)所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的靶区为双螺旋区，它包含如下hTGF-β1启动子中从-544到-538的碱基序列(SEQ IDNO3)的部分或全部及其互补链TTCTTAC。
(5)(1)所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺由如下通式表示[通式1] (6)(5)所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺的末端羧基形成酰胺。
(7)(6)所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的酰胺为与N，N-二甲氨基丙胺形成的酰胺。
(8)(5)-(7)中任意一项所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺与FITC(异硫氰酸荧光素)形成共轭物。
(9)由如下通式表示的吡咯-咪唑聚酰胺 本发明的效果按照本发明，可以获得没有如化疗剂产生的副作用的TGF-β基因表达抑制剂，因为基因表达可以受到特异性抑制，并且没有作为被核糖核酸酶降解的缺陷，因为它是一种化合物。
附图1表示用于本发明的合成Py-Im聚酰胺的结构。
附图2A表示合成Py-Im聚酰胺(化合物4b)的结构。
附图2B表示合成Py-Im聚酰胺(化合物4b)的TIC图和电喷雾离子化质谱。
附图3表示聚酰胺-寡核苷酸复合物通过合成Py-Im聚酰胺与相应双链寡核苷酸结合的形成。通过T4多核苷酸，使用[γ-32P]-ATP标记相应于hTGF-β1启动子从-548到-537碱基对序列的双链DNA(附图1)并在37℃下和结合缓冲液中与错配聚酰胺(泳道0)或与增加量的聚酰胺(泳道1、2和3分别为1nM、2nM和4nM)一起培育15分钟。将由此获得的复合物在20％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并通过放射自显影术观察。
附图4表示FITC标记的聚酰胺在10-9M浓度下培育2小时后保留在培养的hVSMC细胞核中。FITC标记的聚酰胺可以在培养的hVSMC细胞核中保留48小时以上。将FITC标记的聚酰胺以10-9M的浓度直接加入到培养基中并在荧光显微镜下观察。
附图5表示聚酰胺在体外转录反应中抑制荧光素酶基因的转录。在30℃下将1微克质粒在转录缓冲液中与8U的海拉细胞核提取物、3类各400mM的未标记的核苷酸三磷酸(UTP、CTP、GTP)和25μMα-32P-ATP一起培育60分钟。通过添加175μl的海拉提取物终止溶液终止反应且然后进行苯酚-氯仿-异戊醇提取和乙醇沉淀。将样品重新悬浮于98％甲醛负荷染料中并在90℃下加热10分钟，此后上6％的7M脲-聚丙烯酰胺凝胶。干燥该凝胶并通过放射自显影术观察；附图6表示聚酰胺抑制质粒实验中荧光素酶基因的表达(pGL/TGF)。TPA促进hTGF-β1启动子活性，聚酰胺(pol)降低hTGF-β1启动子活性，而错配的聚酰胺(Mis)不会降低该活性。使用脂质转染物试剂在灭菌培养基中将受到hTGF-β1启动子控制的1微克荧光素酶基因转染6小时。在转染24小时后，将细胞在有(或没有)聚酰胺或错配聚酰胺存在下的含有0.5％ CS的培养基中培育24小时，并且使用双重荧光素酶/报道基因测定系统检测荧光素酶活性。将100μL荧光素酶底物与20μL细胞提取物混合。混合后，将该反应混合物放入发光计(Turner Designs-Bioblock，Illkirch，France)，并且测定室温下发射10秒的光。将PMA用作阳性对照。与对照组比较*P＜0.05。
附图7表示聚酰胺抑制hTGFβ1 mRNA在hVSMC细胞中的表达。将10-9M聚酰胺加入到培养的hVSMC的培养基中并培育24小时。将用50ng/mL TPA处理用作阳性对照。从细胞中提取总RNA并通过逆转录产生单链cDNA且如材料和方法部分中所述用hTGFβ1和18S rRNA的引物扩增。(A)在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离5微升PCR产物。(B)TPA刺激hTGFβ1 mRNA的表达。hTGFβ1 mRNA与18S rRNA之比在聚酰胺处理的组(pol)中显著下降，而错配的聚酰胺(mis)对hTGFβ1的表达没有任何作用。
附图8表示聚酰胺对培养的hVSMC中hTGFβ1蛋白的作用。将10-9M聚酰胺加入到培养的hVSMC的培养基中并培育24小时。(A)通过蛋白质印迹分析研究hTGFβ1蛋白的表达。(B)聚酰胺(pol)显著抑制培养的hVSMC中的hTGFβ1蛋白，而错配的聚酰胺(mis)没有这种作用。序列表自由正文SEQ ID NO4有义引物SEQ ID NO5反义引物SEQ ID NO6有义引物SEQ ID NO7反义引物本发明的最佳实施方式在本发明涉及的吡咯-咪唑聚酰胺中，N-甲基吡咯单元(下文也称作Py)、N-甲基咪唑单元(下文也称作Im)和γ-氨基丁酸酯单元(也称作γ连接基)彼此通过酰胺键(-C(＝O)-NH-)结合，并且吡咯-咪唑聚酰胺的一般结构和制备方法为公知的(专利对比文件1-3)。
例如，易于通过自动化合成仪，使用固相上的Fmoc(9-芴基甲氧羰基)(固相Fmoc法)合成吡咯-咪唑聚酰胺类(专利对比文件3)。由于可使用固相Fmoc法以从在末端上带有羧酸残基的固相载体上切下吡咯-咪唑聚酰胺类，所以可以通过在分子末端引入不同官能团生产吡咯-咪唑聚酰胺类的衍生物。如果必要，可以引入具有DNA烷基化活性的化合物，例如duocarmycin、吡咯并苯二氮杂、博来霉素、烯二炔类化合物、氮芥、其衍生物等。由于固相Fmoc法因使用商购蛋白质(肽)合成仪而自动化，所以可以合成与带有吡咯-咪唑聚酰胺类的天然或非天然蛋白质的共轭物。此外，由于在Fmoc法中的反应条件比在t-BOC法中温和，所以能够引入非蛋白质的有机化合物(包括带有在酸性条件下不稳定的官能团的化合物)。例如，可以通过自动方式合成吡咯-咪唑聚酰胺类与DNA或RNA的共轭物(或其衍生物)。
可以按照上述公知的Fmoc法等合成带有末端羧基的吡咯-咪唑聚酰胺类。具体实例包括在末端上带有β-丙氨酸残基(β-氨基丙酸酯残基)和γ-氨基丁酸酯残基的吡咯-咪唑聚酰胺类。例如，可以通过固相Fmoc法，使用带有固相载体的肽合成仪合成在末端上带有β-丙氨酸残基和γ-氨基丁酸酯残基的吡咯-咪唑聚酰胺类，所述的固相载体可以固定氨基吡咯甲酸、氨基咪唑甲酸、β-丙氨酸或γ-氨基丁酸酯，它们中每一种的氨基被Fmoc保护。
氨基吡咯甲酸的具体实例包括例如4-氨基-2-吡咯甲酸、4-氨基-1-甲基-2-吡咯甲酸、4-氨基-1-乙基-2-吡咯甲酸、4-氨基-1-丙基-2-吡咯甲酸、4-氨基-1-丁基-2-吡咯甲酸等。氨基咪唑甲酸的具体实例包括例如4-氨基-2-咪唑甲酸、4-氨基-1-甲基-2-咪唑甲酸、4-氨基-1-乙基-2-咪唑甲酸、4-氨基-1-丙基-2-咪唑甲酸、4-氨基-1-丁基-2-咪唑甲酸等。
例如，可以通过固相Fmoc法合成吡咯-咪唑聚酰胺和FITC(异硫氰酸荧光素)的共轭物。由于已知FITC为荧光标记试剂，所以可以将获得的共轭物用于证实吡咯-咪唑聚酰胺识别特异性DNA。
本发明的TGF-β基因表达抑制剂包含含有N-甲基吡咯单元(Py)、N-甲基咪唑单元(Im)和γ-氨基丁酸酯单元的吡咯-咪唑聚酰胺，该吡咯-咪唑聚酰胺可以在上述双螺旋区(下文称作靶区)的小沟中的γ-氨基丁酸酯单元处折叠成U-形构象，其中所述的双螺旋区包含hTGF-β1启动子中从-557到-536的序列(SEQ ID NO1)的部分或全部及其互补链，其中Py/Im对相应于C-G碱基对，Im/Py对相应于G-C碱基对，并且Py/Py对相应于A-T碱基对和T-A碱基对。
一般来说，DNA螺旋骨架形成2种沟。宽和深沟称作大沟，而窄和浅沟称作小沟。上述吡咯-咪唑聚酰胺可以通过非共轭键与由特异性碱基对形成的具有高度亲和性和特异性的小沟结合。吡咯-咪唑聚酰胺的Py/Im对、Im/Py对和Py/Py对分别结合小沟的相应C-G碱基对、G-C碱基对和A-T和T-A碱基对。并且吡咯-咪唑聚酰胺的分子在γ-氨基丁酸酯单元的位置上折叠成U-形构象。
当小沟中的碱基对与吡咯-咪唑聚酰胺的Py和Im对不相应时，吡咯-咪唑聚酰胺与小沟的结合不足。在本说明书中，与如上所述的小沟碱基对不相应的吡咯-咪唑聚酰胺称作错配物或错配的聚酰胺。
根据体外研究，Py-Im聚酰胺类为一般或组织特异性转录因子的有效抑制剂或激活剂(非专利对比文件19-23)。果蝇属有时获得了功能表型或在有特定聚酰胺存在下失去它而没有特定的毒性。这就是聚酰胺对基因表达特异性控制的结果(Janssen等《分子细胞》(MolCell.)2000；61013-24；Janssen等《分子细胞》(Mol Cell.)2000；6999-1011)。本发明者合成了靶向hTGF-β1启动子的特异性片段的Py-Im聚酰胺类。正如附图4中确切表示的，FITC标记的Py-Im聚酰胺类自发通过细胞膜，并且在将Py-Im聚酰胺加入到hVSMC培养物的培养基中时，它以高浓度在细胞核中蓄积。这些聚酰胺类在细胞核中稳定地保留48小时或48小时以上，而没有特定的丢失。与上述反义寡核苷酸和核酶相比(Hu WY，Fukuda N，Nakayama M，Kishioka H，Kanmatsuse K.“靶向大鼠血小板衍生生长因子A-链mRNA的DNA-RNA嵌合型锤头核酶抑制血管平滑肌细胞增殖”(Inhibition of vascularsmooth muscle cell proliferation by DNA-DNA chimeric hammerheadribozyme targeting to rat platelet-derived growth factorA-chain mRNA.)-《高血压杂志》(J Hypertens.)2001；19203-12；Teng J，Fukuda N，Hu WY，Nakayama M，Kishioka H，Kanmatsuse K.“与转化生长因子-βmRNA的DNA-RNA嵌合型锤头核酶抑制来自自发性高血压型大鼠的血管平滑肌细胞过度生长”(DNA-RNA chimerichammerhead ribozyme to transforming growth factor-betal mRNAinhibits the exaggerated growth of vascular smooth muscle cellsfrom spontaneously hypertensive rats.)-《心血管研究》(Cardiovasc Res.)2000；48138-47)，聚酰胺类在培养的hVSMC中表现出优良的渗透性(在低浓度下，不需要转染培养基)和较高的稳定性。聚酰胺类的高渗透性和稳定性可以对真核细胞核提供理想的药物递送以用于基因疗法。
迄今为止，Py-Im聚酰胺类的研发基于启动子序列中的转录因子-DNA复合物的结构特征。靶向含有启动子的TATA框中的序列的最有效方式在于靶向与TATA框相邻的碱基对序列的设计。在编码大部分蛋白质的基因中，TATA框位于转录起始位点上游的25-35碱基对。转录相关因子D(TAFIID)包括TATA框结合蛋白(TBP)，该蛋白特异性结合TATA框并形成获得了核心启动子中的其它转录相关因子的前起始复合物(PIC)。PIC通过与激活剂或抑制剂发生相互作用启动基因转录并控制基因表达。由于TBP还结合双螺旋DNA的小沟(Lee等《细胞》(Cell.)1991，12月20日；67(6)1241-50；Starr等《细胞》(Cell.)1991；671231-40；Courey等《细胞》(Cell.)1988；55887-98.)，合成的聚酰胺竞争性地占据了TATA结合蛋白的结合位点并干扰基因的转录。已知在基于不同启动子设计的聚酰胺类中，靶向TATA框的任意一种始终是成功的(非专利对比文件20、21)。
存在既不带有TATA框，也不带有启动区(Inr)的启动子类型(Javahery等《分子细胞生物学》(Mol Cell Biol.)1994；14116-27；Lo等《基因》(Gene.)1996，12月5日；182(1-2)13-22；Romeo等《基因》(Gene.)1997；189289-95.)。看起来存在高度特异性地高度表达的基因启动子可能带有TATA框，而管家基因的启动子缺乏它的趋向。对以低水平表达的基因或那些在生长期过程中需要严格减量调节的基因而言可能需要没有TATA框的启动子，而对这些启动子的机理仍然有待研究。hTGF-β1的启动子属于这类启动子且含有许多转录起始位点不同上游区中的正序列和负序列(Kim等《生物化学杂志》(J Biol Chem.)1989；264402-8.)。几种SP-1和两种AP-1序列与转录起始位点相邻存在。由于各种病毒和细胞启动子被SP-1蛋白活化，所以看起来仅一种SP-1序列对受到SP-1刺激的启动子而言是足够的(Kadonaga等《细胞》(Cell.)1987；511079-90；Courey等《细胞》(Cell.)1988；55887-98.)。AP-1序列对由Jun同型二聚体或Fos/Jun杂二聚体复合物组成的AP-1转录因子起反应。几种物质，诸如TPA、v-src基因产物和hTGF-β1自身通过AP-1序列刺激hTGF-β1表达(Kim等《生物化学杂志》(J Biol Chem.)1989；2647041-5；Kim等《生物化学杂志》(J Biol Chem.)1989；26419373-8.Kim等《分子细胞生物学》(Mol Cell Biol.)1990；101492-7；Birchenall-Roberts等《分子细胞生物学》(Mol Cell Biol.)1990；104978-83.)。
推定SP-1和/或AP-1的序列介导hTGF-β1基因表达活化。设计重要的聚酰胺类以便靶向与AP-1和SP-1的不同序列相邻的碱基对，从而阻断反应性转录因子的结合。然而，没有数据足以证实这些聚酰胺类是抑制，还是活化hTGF-β1启动子。这些结果可能是因设计的聚酰胺类在DNA等的小沟中占据的位点不合适所致。本发明者已经将靶序列扩展至hTGF-β1启动子的上游。聚酰胺类之一靶向hTGF-β1启动子从-544到-538的碱基对序列，并且证实它在体外抑制启动子活性(附图5-7)并抑制hVSMC培养物中的hTGF-β1 mRNA和蛋白(附图7、8)。hTGF-β1启动子从-544到-538的碱基对序列与脂肪-特异性元件2(FSE2)序列相邻定位(附图1)。FSE2表示对前脂肪细胞中脂肪细胞P2(aP2)基因表达的抑制活性，并且前脂肪细胞含有多于脂肪细胞的FES2序列结合蛋白(Kadonaga等《细胞》(Cell.)1987；511079-90；Courey等《细胞》(Cell.)1988；55887-98.)。已经从含有TATA框的核心启动子中发现了抑制转录的转录阻抑物，但在不含TATA的启动子中未发现(Aso等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)1994；13435-45；Mack等《自然》(Nature.)1993；363281-3；Merino等《自然》(Nature.)1993；365227-32.)。认为这些转录阻抑物干扰TBP-TATA相互作用且然后抑制基因转录。与阻抑物相关的这些数据的组合提示了如下推定脂肪细胞中FSE-2序列的抑制功能由TATA框介导。由于hTGF-β1启动子不含TATA框，认为FSE2序列在hTGF-β1中的功能与aP2基因的功能不同。由于哺乳动物的几乎所有基因的表达非常倾向依赖于与启动子和增强子序列结合的大量蛋白质的作用的组合，解释本发明结果的最简单的模型在于本发明的吡咯-咪唑聚酰胺阻断FSE2序列区中转录因子和DNA的相互作用并且表现出对hTGF-β1启动子活性的抑制作用。
除启动子区中非转录因子的调节作用外，存在其它因子也可能影响基因表达的可能性。这些因子包括染色质包装、聚腺苷酸化、剪接、mRNA稳定性、翻译启动等(Berger等《分子细胞》(Mol Cell.)2001；5263-8；McKeown《细胞生物学年鉴》(Annu Rev Cell Biol.)1992；8133-55；Decker等《生物化学科学趋势》(Trends Biochem Sci.)1994；19336-40；Kozak《细胞生物学年鉴》(Annu Rev CellBiol.)1992；8197-225.)。看起来存在合成的聚酰胺因核小体定位而可以接近靶位点并且通过靶向特异性序列对染色质凝聚/解凝结构起作用的可能性(Gottesfeld等《分子生物学杂志》(J Mol Biol.)2002；321249-63；Gottesfeld等《分子生物学杂志》(J Mol Biol.)2001；309615-29.)。已经证实吡咯-咪唑聚酰胺开放了能够使GAF结合成为可能的异染色质褐色卫星，且作为结果，导致黑腹果蝇中的表型改变。由于吡咯-咪唑聚酰胺类易于合成且设计成用于靶向关注的序列，所以它们用于研究基因组功能，并且最终用于基因疗法，诸如抑制和活化hTGF-β1基因。
可以在远离转录起始区的上游设计本发明的Py-Im聚酰胺且它们表现出对hTGF-β1基因表达的抑制作用。
具体实施例方式
I.材料和方法(1)相应于hTGF-β1启动子的Py-Im聚酰胺的设计附图1表示生产用于本实验的化合物及其错配化合物(下文还简称为错配物)的方案。设计Py-Im聚酰胺以使其结合与脂肪-特异性元件2(FSE2)相邻的hTGF-β1启动子从-544到-538的碱基对。
(2)使用Fmoc法的Py-Im聚酰胺类的机器辅助的自动化合成使用恒流肽合成仪Pioneer(Trademark)(Applied Biosystems，Inc.)进行0.1mmol等级的吡咯-咪唑聚酰胺类的机器辅助的自动化合成(200mg的Fmoc-β-丙氨酸-CLEAR酸性树脂，0.50meq/g，PeptideInstitute，Inc.)。自动化固相合成包括下列步骤用DMF洗涤；用20％哌啶/DMF除去Fmoc基团；用甲醇洗涤；在有HATU和DIEA(各4当量)存在下与单体偶联60分钟；用甲醇洗涤；如果必要，用无水乙酸/吡啶保护；和最终用DMF洗涤。一般获得中等产率的Py-Im聚酰胺类(10-30％)。
FITC偶联使溶于DMF的四(4)倍过量的荧光素(0.40mmol)和DIEA(不含HATU)过柱并闪蒸60分钟。
一般操作在用Fmoc-β-丙氨酸-Wang树脂除去Fmoc基团后，用甲醇连续洗涤该树脂。使用Fmoc氨基酸进行偶联步骤且然后用甲醇进行洗涤。将这些步骤重复多次，直到引入所有序列。在完成偶联步骤后，保护N末端上的氨基酸或如果必要使其与FITC偶联，用DMF进行洗涤并移除反应容器。
作为羧酸的降解通过在降解步骤后用冷乙醚沉淀分离合成的聚酰胺类(91％ TFA-3％/TIS-3％ DMS-3％水混合物，5ml/树脂0.1mmol)。
作为胺的降解通过在降解步骤后用冷乙醚沉淀分离合成的聚酰胺类(N，N-二甲氨基丙胺5ml/树脂0.1mmol，50℃，过夜)。
纯化使用分析型RP-HPLC进行最终纯化，流速为10ml/分钟，在缓冲液A(0.1％ AcOH/水)中的B(乙腈)的线性梯度，在350nm处使用UV检测。
在如下的化合物4a和4b中，I、P、β、γ、Dp和Ac分别表示N-甲基咪唑残基、N-甲基吡咯残基、β-丙氨酸残基、γ-氨基丁酸酯残基、N，N-二甲氨基丙胺和酰基。
a)FITC-β-IPP-β-IPP-γ-PPP-β-PP-βDp(化合物4a)梯度缓冲液B 15％-45％(30分钟)，流速10ml/分钟。产率7mg(3％)。
b)Ac-IPP-β-IPP-γ-PPP-β-PP-βCOOH(化合物4b)梯度缓冲液B 25％-35％(30分钟，60℃)，流速10ml/分钟。产率29mg(17％)。
附图2A及其TIC(总离子色谱图)图中显示了Py-Im聚酰胺(化合物4b)的结构且附图2B中显示了电喷射离子化质谱。作为错配物，使用具有Ac-PPP-β-IPP-γ-PPP-β-COOH结构的聚酰胺，它为上述化合物4b，其中与酰基相邻的I被P取代。
(3)hVSMC细胞培养hVSMC获自Clonetics(Walkersville，MD)。在含有10％牛血清(Gibco Life Technologies，Gaithersburg，MD)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养hVSMC。通过用在不含Ca2+和不含Mg2+的磷酸缓冲盐水(PBS)中的0.05％胰蛋白酶(Gibco)进行胰蛋白酶处理使细胞传代并且在75-cm2组织培养瓶中培养。将培养基每隔4或5天更换一次，并且在5-10代过程中对细胞进行实验。
(4)在培养的hVSMC中FITC-标记的聚酰胺类的培育以105/cm2的密度将传代的hVSMC在24-孔瓶中培养24小时。以10-9M的浓度将FITC-标记的聚酰胺类直接加入到培养基中并且在荧光显微镜下每隔1小时观察一次。
(5)凝胶移动检测合成寡核苷酸，退火并生产相应于hTGF-β1启动子从-548到-537的碱基对的12种双链寡核苷酸(附图1A)。使用[γ-32P]-ATP，应用T4多核苷酸激酶标记双链DNAs，并且在37℃下和在结合缓冲液(40mMTris，pH 7.9，250mM NaCl，25mM EDTA，25mM DTT，100mM KCl)中与聚酰胺类或错配的聚酰胺类一起培育15分钟。通过20％聚丙烯酰胺凝胶对由此获得的复合物进行电泳并通过放射自显影术观察。
(6)在hTGF-β1启动子控制下的荧光素酶基因表达系统的构建分离含有来源于质粒phTBG 101(非专利对比文件10)的hTGF-β1启动子的2.2kb片段并插入荧光素酶报道基因编码区上游处的pGL3碱性质粒(Promega，Madison，WI)。通过光谱分析与限制酶分析并测序鉴定构建质粒的精确结构。
(7)体外转录反应使用海拉细胞的细胞核提取物和体外转录系统(Promega，Madison，WI)进行体外转录反应。25微升的反应混合物由100ng DNA模板、8U海拉细胞核提取物、各400μM的3种未标记的核苷酸三磷酸(UTP、CTP、GTP)、25μM γ-32P-ATP(5ci/mmol，NEM Life ScienceProducts)、含有20mM羟乙基哌啶基(piperadinyl)乙磺酸(HEPES)、100mM KCl、4.0mM MgCl2、20％甘油、0.2mM EDTA和0.6mM苯甲基磺酰氟的转录缓冲液(pH 7.9)组成。用SphI(New Engl and BioLabs，Beverly，MA)切割转录用模板DNA。在30℃下将转录反应混合物培育60分钟后，通过添加175μM海拉提取物终止溶液(0.3M Tris-HCl，pH7.0，0.3M乙酸钠，0.5％ SDS，2.0mM EDTA，3μg/ml tRNA)终止反应且然后用苯酚-氯仿-异戊醇进行提取并且用乙醇进行沉淀。将样品重新悬浮于98％甲醛上样染料中并在90℃下加热10分钟后在7M脲6％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。干燥凝胶并通过放射自显影术观察带。
(8)瞬时转染和荧光素酶检测在有10％ CS存在下在24孔平板中以10-5/cm2的密度培养hVSMC细胞。24小时后，按照制造商指定的方法，在灭菌培养基中1μg DNA存在下使用脂质转染物试剂(GibcoBRL)转染hTGF-β1启动子驱动的报道基因。将细胞与DNA脂质体复合物一起培育6小时且然后将培养基更换成1ml新鲜的完全培养基。在转染24小时后，在有或没有聚酰胺或错配聚酰胺存在下的含有0.5％ CS的培养基中将细胞培育24小时。在处理结束时，除去培养基并刮取细胞且悬浮于150μl被动裂解缓冲液中。在简短离心后，使用双重-荧光素酶报道基因测定系统(Promega，Madison，WI)测定细胞提取物中的荧光素酶活性。将100微升荧光素酶底物加入到20μl提取物中。混合后，将该反应混合物放入发光计(Turner Designs-Bioblock，Illkirch，France)，并且测定室温下发射10秒的光。
(9)用于生长因子mRNA的RNA提取和逆转录反应以及聚合酶链反应(RT-PCR)试验用PBS洗涤培养的细胞，溶于800μL RNAzolB(BiotexLaboratories，Inc.，Houston，TX)，与80μL氯仿混合并离心。将无色的上部水相与等体积的异丙醇混合以沉淀RNA。用500μL的75％乙醇洗涤RNA沉淀两次，并且在干燥后溶于10μL TE缓冲液。在65℃下变性15分钟后，在室温下用在0.5ml DNA酶缓冲液(20mM Tris-HClpH 8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl2)中的0.5U DNA酶(Gibco)将RNA样品处理45分钟。通过添加0.5ml 0.5M EDTA并在98℃下加热10分钟使DNA酶变性。
使用在10mM Tris-HCl(pH 8.3)，5mM MgCl2，50mM KCl，1mM脱氧NTPs和2.5μM随机六聚物中的2.5U/20μL鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶(Takara Biochemicals，Osaka，Japan)对等量的RNA等分试样(1μg/20μL)逆转录成单链cDNAs。通过与10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、4mM MgCl2、0.025U/μL Taq DNA聚合酶(TakaraBiochemicals，Osaka，Japan)和各0.2μM上游有义引物和下游反义引物混合将2微升稀释的cDNA产物制成25μl。将有义引物(5′-ATCAGAGCTCCGAGAAGCGGTACC-3′)(SEQ ID NO4)和反义引物(5′-GTCCACTTGCAGTGTTATCCTG-3′)(SEQ ID NO5)用于hTGF-β1 mRNA的PCR扩增。就人18S核糖体RNA而言，将有义引物(5′-TCAAGAACGAAAGTCGGACG-3′)(SEQ ID NO6)和反义引物(5′-GGACATCTAAGGGCATCACA-3′)(SEQ ID NO7)用作内部对照。使用自动热调节器(Perkin Elmer，Foster，CA)进行PCR。PCR条件为起始变性，在94℃下2分钟；在94℃下变性1分钟、在58℃下退火1分钟和在72℃下延伸1分钟的30个循环；在72℃下1分钟的最终延伸。作为内部对照，在每次反应中均包括使用用于18S rRNA的引物的PCR。为了证实通过PCR无法扩增基因组DNA，不使用逆转录酶且使用引物组进行对照RT-PCR实验。在任意反应中，均没有扩增产物。为了对mRNA的半定量分析，监测PCR的动力学特性。在各种样品中比较在凝胶上可检测到PCR产物的循环次数。扩增连续稀释10-倍(100、10和1ng)的cDNA样品。通过增加cDNA的量，PCR产物在早期循环时可检测到。相应于各靶mRNA的PCR产物的量在20-35个循环时均呈线性增加。在1.5％琼脂糖凝胶上通过电泳分离5微摩尔(μM)PCR产物。通过使用NIH软件的计算机分析测定带的强度。
(10)细胞制备和蛋白质印迹分析将试验VSMC和对照VSMC在6-孔平板中培育24小时，用PBS洗涤两次并在300μL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/mL抑肽酶，1％ Triton X-100)中培育30分钟。将细胞刮入1.5mL试管并离心且收集上清液。通过Bradford蛋白质试验，使用BIO-RAD蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad Lab，Hercules，CA)测定上清液中的蛋白质含量。上清液含有20μg总蛋白质，使其在100℃下和加样缓冲液中变性3分钟，在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并转移至硝化纤维素膜上。将该膜在室温下与对hTGF-β1具有特异性的小鼠单克隆抗体(1∶500)(R&D systems，Minneapolis，MN)一起培育且然后在室温下与按1∶2000的抗-小鼠HRP缀合次级抗体一起培育1小时。在充分洗涤后，将膜与电化学发光底物(Amersham Life Service，Buckinghamshire，UK)一起培育并暴露在X-光片中。
(11)统计分析将结果表示为平均值±SEM。通过斯氏t检验评价平均值中差异的显著性。将P＜0.05视为显著性。
II.结果(1)合成聚酰胺与双链寡核苷酸的结合首先检查合成的Py-Im聚酰胺类(化合物4a和4b)是否可以结合相应的碱基对。聚酰胺类中的任一种能够结合相应的12个碱基对的双链寡核苷酸(附图3，泳道2-4)，而错配聚酰胺无法结合这些寡核苷酸(附图3，泳道1)。
(2)合成聚酰胺通过细胞膜的渗透性和引入细胞核为了证实将合成化合物引入细胞核并使其在稳定条件下保留在活细胞中，用FITC标记Py-Im聚酰胺类。当以10-9M的浓度在培养基中将FITC标记的聚酰胺类培育2小时时，在以高密度培养的hVSMC的细胞核中检测到了这种FITC(附图4)。FITC标记的聚酰胺在细胞核中的这种高度蓄积是因基因组中的非特异性结合所致，并且这种化合物在细胞质中的浓度极低。
(3)合成聚酰胺类对hTGF-β1启动子活性的抑制体外转录系统在有海拉细胞核提取物和hTGF-β1启动子存在下转录DNA密码。由于合成的聚酰胺类(pol)结合hTGF-β1启动子从-544到-538的碱基对，所以它们减少转录。另一方面，错配聚酰胺(Mis)不会表现出对转录分子形成的任何显著作用(附图5)。
在质粒转染实验中，hTGF-β1启动子驱动编码荧光素酶的报道基因且该基因在培养的hVSMC中得到表达。12-O-十四酰基-佛波醇-13-乙酰转移酶(TPA)刺激荧光素酶蛋白的表达。与10-9M聚酰胺一起培育显著减量调节了荧光素酶的表达，而错配的聚酰胺对荧光素酶基因的表达没有影响(附图6)。
(4)合成聚酰胺类对hVSMC中hTGF-β1 mRNA的抑制为了观察体内聚酰胺对hTGF-β1基因表达的作用，将培养的hVSMC与10-9M聚酰胺一起培育24小时。使用RT-PCR法分析hTGF-β1 mRNA。将TPA用作阳性对照。50ng/mL的TPA显著刺激hTGF-β1 mRNA的表达。本发明的聚酰胺(pol)抑制TPA诱导的hTGF-β1 mRNA的表达，而错配的聚酰胺(Mis)没有这种作用(附图7)。
(5)合成聚酰胺对hVSMC中hTGF-β1蛋白表达的作用本发明者检查了合成的聚酰胺(pol)对hVSMC中hTGF-β1表达的作用。10-9M合成的聚酰胺抑制培育24小时后hTGF-β1蛋白的表达，而错配的聚酰胺(Mis)没有这种作用(附图8)。
工业实用性本发明的TGF-β基因表达抑制剂用作与TGF-β产生相关的疾病的治疗药物。
序列表中的自由正文SEQ ID NO4有义引物SEQ ID NO5反义引物SEQ ID NO6有义引物SEQ ID NO7反义引物序列表序列表<110>NIHON UNIVERSITY<120>TGF-β活性控制剂<130>W1799<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人类<400>1taaaggagag caattcttac ag 22<210>2<211>12<212>DNA<213>人类<400>2gcaattctta ca 12<210>3<211>7<212>DNA<213>人类<400>3ttcttac7<210>4<211>24<212>DNA<213>人工
<220>
<223>有义引物<400>4atcagagctc cgagaagcgg tacc 24<210>5<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>反义引物<400>5gtccacttgc agtgttatcc tg 22<210>6<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>有义引物<400>6tcaagaacga aagtcggacg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>反义引物<400>7ggacatctaa gggcatcaca 20<210>8
<211>37<212>DNA<213>人类<400>8cagtaaagga gagcaattct tacaggtgtc tgcctcc 37<210>9<211>37<212>DNA<213>人类<400>9ggaggcagac acctgtaaga attgctctcc tttactg 3权利要求
1.TGF-β基因表达抑制剂，包含吡咯-咪唑聚酰胺，该吡咯-咪唑聚酰胺含有N-甲基吡咯单元(下文也称作Py)、N-甲基咪唑单元(下文也称作Im)和γ-氨基丁酸酯单元，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺可以在双螺旋区(下文称作靶区)的小沟中的γ-氨基丁酸酯单元处折叠成U-形构象，其中所述的双螺旋区包含下列人转化生长因子β1(下文也称作hTGF-β1)启动子中从-557到-536的碱基序列(SEQ ID NO1)的部分或全部及其互补链TAAAGGAGAGCAATTCTTACAG其中Py/Im对相应于C-G碱基对，Im/Py对相应于G-C碱基对，并且Py/Py对相应于A-T碱基对和T-A碱基对。
2.权利要求1所述的TGF-β基因表达抑制剂，进一步包含β-丙氨酸单元。
3.权利要求1或2所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的靶区为双螺旋区，它包含如下hTGF-β1启动子中从-548到-537的碱基序列(SEQ ID NO2)的部分或全部及其互补链GCAATTCTTACA。
4.权利要求3所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的靶区为双螺旋区，它包含如下hTGF-β1启动子中从-544到-538的碱基序列(SEQ ID NO3)的部分或全部及其互补链TTCTTAC。
5.权利要求1所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺由如下通式表示[通式1]
6.权利要求5所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺的末端羧基形成酰胺。
7.权利要求6所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的酰胺为与N，N-二甲氨基丙胺形成的酰胺。
8.权利要求5-7中任意一项所述的TGF-β基因表达抑制剂，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺与FITC(异硫氰酸荧光素)形成共轭物。
9.由如下通式表示的吡咯-咪唑聚酰胺[通式2]
全文摘要
TGF－β基因表达抑制剂，含有吡咯－咪唑聚酰胺，它带有N－甲基吡咯单元(下文也称作Py)、N－甲基咪唑单元(下文也称作Im)和γ－氨基丁酸酯单元，该吡咯－咪唑聚酰胺可以在双螺旋区(下文称作靶区)的小沟中的γ－氨基丁酸酯单元处折叠成U－形构象，其中所述的双螺旋区含有作为全部或部分的相应于人转化生长因子β1(下文也称作hTGF－β1)启动子碱基序列中－557到－536上的序列的互补链TAAAGGAGAGCAATTCT－TACAG，其中Py/Im对相应于C－G碱基对，Im/Py对相应于G－C碱基对，并且Py/Py对分别相应于A－T碱基对和T－A碱基对。
文档编号C07K5/027GK1845733SQ200480025429
公开日2006年10月11日 申请日期2004年9月3日 优先权日2003年9月4日
发明者福田升, 岸冈博文, 杉山弘 申请人:学校法人日本大学, 基因生物系统株式会社