专利名称：与人乳腺癌转移相关基因的分离和分离方法
技术领域：
本发明涉及一种与人乳腺癌转移相关基因的分离及其分离方法。
背景技术：
恶性肿瘤最显著的生物学特性之一就是肿瘤的转移，肿瘤细胞在人体内的转移是90％以上肿瘤患者的致死原因，而由原发性肿瘤致死是较为罕见的。然而，由于目前肿瘤转移的确切机制尚不十分清楚，关于肿瘤转移一直是肿瘤学研究的热点。
肿瘤的转移是一个多步骤、多因素、序贯的复杂过程，它受许多特殊基因的调控，它们或被激活，或被抑制，相互协同或拮抗，最终影响肿瘤细胞的生物学特性。因此，对乳腺癌转移过程中基因组的改变进行全面的了解，筛选出与转移相关的基因，在研究肿瘤转移抗体疫苗、筛选控制肿瘤转移药物等方面都有着十分重要的意义。
目前，在有关乳腺癌转移的研究中，主要是以手术切除的正常乳腺组织、乳腺癌组织或乳腺癌原发灶和转移灶组织标本为实验样本。作为实验样本，要求组织新鲜，无坏死、无包膜等，但手术切除的组织只有很少一部分能达到这样的标准；另外由于临床手术切除的组织细胞成分复杂，不同转移能力细胞混杂，直接影响着对肿瘤转移相关基因的研究。因此，建立一种高通量、高精确度的肿瘤转移相关基因的分离方法十分必要。
发明内容
本发明提供了一种高精确度、高通量、高稳定性和重复性好的与人乳腺癌转移相关基因的分离方法。该方法克服了以往分离或研究方法中的上述缺点和不足，建立了具有高转移倾向的转移亚克隆LM-MCF-7细胞系，并与其亲本人乳腺癌细胞系MCF-7形成配对细胞系作为实验样本，不仅可随时无限量培养，使实验样本简单易得，为实验提供了极大的方便，且由于实验样本的细胞成分均一，保证了分离结果的精确性和准确性。
本发明方法还通过基因表达谱芯片技术，比较两种具有不同转移能力细胞系基因表达谱的差异，分离出了与人乳腺癌转移相关的基因，这些肿瘤转移相关基因的表达和功能的确认，可从分子水平深入揭示乳腺癌的转移和发展，从而可以进一步寻找到理想的乳腺癌转移的药物治疗的靶点或基因治疗方法。本发明的技术的公开，不仅在乳腺癌的药物或基因治疗方面，而且在用于制备肿瘤转移芯片、制备抗肿瘤转移基因疫苗及建立抗肿瘤转移药物筛选技术平台等方面，也将有着重要的实际应用价值。
本发明与人乳腺癌转移相关基因的分离方法，包括
1)SCID(Severe combined immunodeficiency，SCID)鼠从人乳腺癌细胞系MCF-7中筛选和建立具有高转移倾向的转移亚克隆LM-MCF-7细胞系；2)细胞培养将LM-MCF-7和MCF-7细胞用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸链霉素和100u/ml青霉素)培养液，在37℃、5％CO2条件下CO2培养箱中培养；3)总RNA提取一步法提取MCF-7和LM-MCF-7细胞的总RNA，用异丙醇沉淀，并过柱纯化；4)cDNA反转录及荧光标记取一定量总RNA，以T7-Oligo(dT)15为引物，合成双链cDNA，纯化；之后将双链cDNA进行体外转录合成cRNA、纯化；取cRNA，用Superscript II反转录酶(200u/μl)，9个碱基的随机序列寡核苷酸引物反转录为cDNA并纯化；取cDNA，用9个碱基的随机序列寡核苷酸引物和KLENOW酶进行荧光标记，之后纯化并抽干；标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120μM，dCTP为60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP为40μM。dNTP为10mM。
5)制备人寡聚核苷酸标准基因芯片将Qiagen公司人类基因的Oligo库中的寡聚DNA点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上；点制在芯片上的样品还包括人的12个看家基因作为阳性对照，12条人工合成的与人基因没有同源性的70个碱基的寡聚DNA作为阴性对照，以及拟南芥的3个基因作为外标；整个点阵分成48个亚阵；每个亚阵有22行，22列；点间距为185μm，点的直径约为140μm；6)杂交与洗涤将标记的DNA溶于35μl杂交液中，放入标准基因芯片于42℃杂交过夜。杂交结束后，将芯片在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液体中洗5分钟，再在0.2×SSC中室温洗5分钟，最后甩干用于扫描；杂交液的组分为3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺；7)筛选确定用ScanArray Express双通道激光扫描仪扫描基因芯片，用GenePix Pro 4.0软件分析芯片上每个点Cy3和Cy5荧光信号的强度和比值，并用Lowess方法归一化；以差异为两倍(即比值大于2.0，小于0.5)的标准来确定差异表达基因。
采用本发明方法分离出的与人乳腺癌转移相关的基因，如表1所示。
表1与人乳腺癌转移相关的基因
附图简要说明
图1.总RNA甲醛变性凝胶电泳检测结果。
其中A为MCF-7细胞的总RNA，B为LM-MCF-7细胞的总RNA.
图2.基因表达谱芯片杂交图，红点和绿点分别代表LM-MCF-7细胞中高表达和低表达的基因，黄色点表示该基因表达的差异不显著。
图3.基因表达谱芯片散点图，其中X轴和Y轴分别以两种样品的荧光信号强度值为坐标，图中每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号。红色标记和绿色标记的数据点分别表示Y/X的比值≥2和≤0.5，是属于表达有差异的基因，黑色标记表示Y/X的比值在0.5和2之间，表达基本无差异。
图4.Real-time PCR 1.5％琼脂糖凝胶电泳图。
泳道1，LM-GAPDH；泳道2，M-GAPDH；泳道3，LM-ADAMTS1；泳道4，M-ADAMTS1；泳道5，LM-ACTB；泳道6，M-ACTB；M，DL2000具体实施方式
下面提供一种本发明的实施方式，用于说明本发明方法。
实施例1)用SCID(Severe combined immunodeficiency，SCID)鼠从人乳腺癌细胞系MCF-7中筛选和建立具有高转移倾向的转移亚克隆LM-MCF-7细胞系。
2)细胞培养LM-MCF-7和MCF-7细胞应用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸链霉素和100u/ml青霉素)培养液，在37℃、5％CO2条件下CO2培养箱中培养。
3)总RNA提取用Trizol(Invitrogen，USA)采用一步法提取MCF-7和LM-MCF-7细胞的总RNA，异丙醇沉淀，并用RNeasy mini spin column kit(Qiagen，USA)过柱纯化。然后用紫外分光光度计定量，甲醛变性凝胶电泳检测，结果表明总RNA完整性好。结果见附图1。
4)cDNA反转录并荧光标记取10μg总RNA，以T7-Oligo(dT)15为引物，用cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成双链cDNA，并用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化。用T7RiboMAX Expres LargeScale RNA Production System(Promega)将双链cDNA进行体外转录合成cRNA；并用RNeasyMini Kit(Qiagen)纯化。取2μg cRNA，用SuperscriptII反转录酶(200u/μl，Invitrogen)，9个碱基的随机序列寡核苷酸引物反转录为cDNA并纯化。取1μg cDNA反转录产物，用9个碱基的随机序列寡核苷酸引物和KLENOW酶进行荧光标记，之后纯化并抽干。
标记进行两次。第一次用呈红色的Cy5荧光素标记LM-MCF-7细胞cDNA探针，用呈绿色的Cy3荧光素标记MCF-7细胞cDNA探针。第二次用呈绿色的Cy3荧光素标记LM-MCF-7细胞cDNA探针，用呈红色的Cy5荧光素标记MCF-7细胞cDNA探针；标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120μM，dCTP使用浓度为60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，USA)使用浓度为40μM，dNTP为10mM。
5)制备标准基因芯片标准芯片选用由北京博奥生物芯片有限公司制备的人寡聚核苷酸芯片(CAP-B0006，北京博奥生物芯片公司生产)6)杂交与洗涤将第一次和第二次标记的DNA分别溶于35μl杂交液中，分别放入标准基因芯片于42℃杂交过夜。杂交结束后，将两个芯片分别在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液体中洗5分钟，再在0.2×SSC中室温洗5分钟；最后甩干后用于扫描。
杂交液的组分为3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺；7)筛选确定用ScanArray Express双通道激光扫描仪扫描基因芯片，用GenePix Pro 4.0软件分析芯片上每个点Cy3和Cy5荧光信号的强度和比值，并用Lowess方法归一化；以差异为两倍(即比值大于2.0，小于0.5)的标准来确定差异表达基因。结果见附图2和附图3。
验证以如下的Real-time PCR方法，对随机选取的差异表达的基因(见表2)进行SYBR GreenI Real-time PCR验证，验证结果证明了本发明方法结果的准确性和可靠性。
ADAMTS1为随机选取的基因，选自应用本发明方法获得的在LM-MCF-7和MCF-7中差异表达的基因，用Real-time PCR方法检测ADAMTS1在LM-MCF-7和MCF-7中表达的差异水平。
选择看家基因ACTB和GAPDH作为校准基，用Roche Light Cycler PCR仪检测其在LM-MCF-7和MCF-7中表达差异(Ct值差)分别为0.2和0.3。一般认为两个基因在相应样本中表达的Ct值差小于0.5为二者表达基本相同。上述两个标本Ct值差为0.1，符合小于0.5的标准，故两个基因在相应样品中的表达基本相同，可任选ACTB作为校准基因。
a)验证方法采用Trizol(Invitrogen，USA)一步法提取MCF-7和LM-MCF-7细胞的总RNA，用异丙醇沉淀，并用RNeasy mini spin column kit(Qiagen，USA)过柱纯化。用RNA free DNase I处理实验体系，在37℃下反应30分钟，然后用苯酚/氯仿处理，添加1/10体积的3M醋酸钠，用2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀RNA，以70％乙醇清洗，干燥后溶于适量DEPC水中。取2.5μg总RNA反转录形成1st-cDNA。使用Light Cycler PCR仪(Roche，PTC-225)，Lightcycler-faststart DNA master SYBR green I(Roche)进行real time-PCR扩增。扩增条件为镁离子浓度3mM，引物浓度0.25μM，95℃变性10min；95℃10秒，60℃ 5秒，72℃ 15秒，重复45个循环；75℃至95℃绘制溶解曲线。电泳检测PCR扩增情况，得到一条整齐、亮度高的电泳条带(结果见图4)，证明扩增片段大小与本发明方法结果一致，基因扩增效率和特异性均好；并采用比较阈值法对Real-time PCR结果进行定量分析，所得结果见表3。
表2 Real-time PCR引物
表3 Real-time PCR结果
注比值＝LM-MCF-7(LM)/MCF-7(M)；Ct(threshold cycle)＝荧光达到荧光阈值的循环数；ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct看家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct看家基因)对照组Real-time PCR结果显示，差异基因在LM-MCF-7细胞中有高表达，差异表达的比值与本发明结果中的差异比值很接近，表明Real-time PCR结果很好的吻合了本发明实验的结果，证实了本发明分离方法结果的准确性和可靠性。
权利要求
1.一种与人乳腺癌转移相关基因的分离方法，其特征在于包括1)用SCID(Severe combined immunodeficiency，SCID)鼠从人乳腺癌细胞系MCF-7中筛选和建立具有高转移倾向的转移亚克隆LM-MCF-7细胞系；2)细胞培养将LM-MCF-7和MCF-7细胞用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸链霉素和100u/ml青霉素)培养液，在37℃、5％CO2条件下CO2培养箱中培养；3)总RNA提取一步法提取MCF-7和LM-MCF-7细胞的总RNA，用异丙醇沉淀，并过柱纯化；4)cDNA反转录及荧光标记取一定量总RNA，以T7-Oligo(dT)15为引物，合成双链cDNA，纯化；之后将双链cDNA进行体外转录合成cRNA、纯化；取cRNA，用Superscript II反转录酶(200u/μl)，9个碱基的随机序列寡核苷酸引物反转录为cDNA并纯化；取cDNA，用9个碱基的随机序列寡核苷酸引物和KLENOW酶进行荧光标记，之后纯化并抽干；标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120μM，dCTP为60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP为40μM，dNTP为10mM；5)制备人寡聚核苷酸标准基因芯片将Qiagen公司人类基因的Oligo库中的寡聚DNA点制在一张75×25mm、经过化学修饰的载玻片上；点制在芯片上的样品还包括人的12个看家基因作为阳性对照，12条人工合成的与人基因没有同源性的70个碱基的寡聚DNA作为阴性对照，以及拟南芥的3个基因作为外标；整个点阵分成48个亚阵；每个亚阵有22行，22列；点间距为185μm，点的直径约为140μm；6)杂交与洗涤将标记的DNA溶于35μl杂交液中，放入标准基因芯片于42℃杂交过夜；杂交结束后，将芯片在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液体中洗5分钟，再在0.2×SSC中室温洗5分钟，最后甩干用于扫描；杂交液的组分为3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺；7)筛选确定用ScanArray Express双通道激光扫描仪扫描基因芯片，用GenePix Pro 4.0软件分析芯片上每个点Cy3和Cy5荧光信号的强度和比值，并用Lowess方法归一化；以差异为两倍(即比值大于2.0，小于0.5)的标准来确定差异表达基因。
全文摘要
本发明公开了一种高精确度、高通量筛选筛选乳腺癌转移相关基因的分离方法。本发明方法通过建立具有高转移倾向的转移亚克隆LM－MCF－7细胞系与其亲本人乳腺癌细胞系MCF－7形成配对细胞系作为实验样本，不仅可随时无限量培养获得，且由于实验样本的细胞成分均一，保证了分离结果的精确性和准确性。本发明方法还通过基因表达谱芯片技术分离出了与人乳腺癌转移相关基因，这些相关基因的表达和功能的确认，在乳腺癌药物或基因治疗方面以及在用于制备肿瘤转移芯片、制备抗肿瘤转移基因疫苗及建立抗肿瘤转移药物筛选技术平台方面，都将有着重要的实际应用价值。
文档编号C07H21/00GK1810979SQ200510013150
公开日2006年8月2日 申请日期2005年1月28日 优先权日2005年1月28日
发明者叶丽虹, 张晓东, 尤嘉琮, 王长晔 申请人:南开大学