专利名称：一种人mdr1基因表达调节剂筛选系统及其筛选基因表达调节剂的方法
技术领域：
本发明公开一种人MDR1基因表达调节剂筛选系统，还提供了利用该系统筛选人MDR1基因表达调节剂的方法，以期筛选到高效、低毒的化疗增敏剂和耐药性逆转剂，属于生物制药技术领域。
背景技术：
肿瘤细胞在化疗过程中会对一大类结构与功能并无相关性的许多药物产生耐药性，这一现象称为“多药耐药”(multidrug resistance，MDR)，肿瘤细胞多药耐药性的获得与细胞表面各种ATP结合盒(ATP-Binding cassette，ABC)式载体蛋白的表达密切相关，在人类染色体中，有大约50种ABC载体基因，其中以MDR1基因所编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp or P170)在肿瘤细胞中介导的耐药性最为广泛(Michihiko Kuwano，et al.Cancer Sci.2003，94(1)9-14；UlrikeStein，et al.J.Biol.Chem.，2001，276(30)28562-28569.)。目前认为有两个机制参与了恶性肿瘤中MDR1基因的上调。一个是MDR1基因的启动子可通过环境因素被激活，另一个主要机制是MDR1启动子上CpG位点的甲基化和去甲基化(Kusaba H，et al，Somat Cell Mol Genet 1997；23259-74.；Kusaba H，et al，Eur J Biochem 1999；262924-32.)。
P-gp对保护机体免受外源性毒素的侵害，排泄其代谢产物，转化内源性有害物质等有重要生理意义。然而，在肿瘤细胞中由于P-gp的过度表达，使得细胞毒性药物被泵出细胞外，细胞内的药物浓度下降，从而产生耐药性，而且MDR程度与MDR1的过度表达呈正相关。
如何消除肿瘤细胞的耐药性，以增强化疗效果已成为目前肿瘤治疗研究的难点和重点之一。抑制ATP依赖性的药物泵，从而增加细胞内的化疗药物浓度以克服肿瘤细胞的耐药，这一思路的可行性已经得到了实验的证实(Sikic BI，et al.Jclineal reversal of multi drug resistance Anticancer Drug Resistance.1994；p p149～165；Wallstab A，et al.Brit J Gancer，1999；79(7/8)1053～1063.)。目前已发现的逆转肿瘤多药耐药的P-gp蛋白功能抑制性药物主要有钙通道阻断剂、反义RNA、核酶等。但都有其致命的弱点，已发现的阻断P-gp泵的药物，由于毒副作用大，较难在临床上应用(Sharma V et al.Chem Rev.1999，992545～2560.)。要在体内将反义核糖核酸和核酶只转染给肿瘤细胞而不进入其它组织，技术上有相当难度。因此全面了解人肿瘤细胞中MDR1基因与肿瘤耐药性的关系，进行必要的体外逆转实验，筛选出高效、低毒、低剂量的化疗增敏剂和耐药性逆转剂是目前肿瘤治疗中亟待解决的问题。
多药耐药基因的表达是受其启动子控制的，在启动子上有很多基元(motif)供转录因子识别。某些转录因子与相应的基元结合后，将抑制下游基因的表达；而某些转录因子与相应的基元结合后，将激活下游基因的表达。不同的药物可能会通过不同的途径，直接或间接地影响不同的转录因子，使其与启动子上的相应基元结合后，表现出对下游基因表达的激活或抑制。
发明内容
本发明公开一种人MDR1基因表达调节剂筛选系统，是以MDR1基因启动子为靶点建立MDR1基因表达调节剂的筛选模型。
本发明还提供利用上述系统筛选人MDR1基因表达调节剂的使用方法，用于筛选出在肿瘤治疗中具有高效、低毒、低剂量的化疗增敏剂和耐药性逆转剂。
本发明的筛选系统，它是由一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞组成。
筛选系统中所述的外源核苷酸是一个重组载体。
所述的重组载体包含原始载体和人MDR1基因启动子，其中所述原始载体为一种质粒，它含有一个报告基因且不含启动子；所述人MDR1基因启动子连接到报告基因的上游，且人MDR1基因启动子的活性和报告基因的表达具有相关性。
所述的重组载体，其中所述原始载体为pGL3质粒或pEGFP1质粒。
所述的重组载体，其中所述报告基因为荧光素酶基因或荧光蛋白基因。
具体解决方案如下将人MDR1基因启动子重组入含有报告基因的载体中，用MDR1基因启动子来驱动报告基因的表达，用此重组载体转化或转染相应的宿主细胞，建立瞬时或稳定转染的细胞株，此细胞株可作为筛选模型用于筛选人MDR1基因表达抑制剂和激动剂。在此细胞株的培养体系中加入待筛选的样品，通过该样品对报告基因表达量的影响来判定其对MDR1基因表达的调节作用。
包括以下步骤(1)通过生物信息学原理分析确定MDR1启动子区域，并根据此区域设计引物，上游端引物为5’-GGGGTACCCCAGTCTCTACG-3’(序列ID为2)，下游端引物5’-CAAGCTTGTCCGACCTGAAGAG-3’(序列ID为3)。以人基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，从而钓取MDR1启动子区域。
(2)通过缺失突变构建不同长度的启动子片段，以找到启动子的核心部位，利用此部位构建筛选模型将会提高筛选的敏感度。
(3)将启动子核心部位连接入含有报告基因的原始载体中，构建重组载体。
(4)用重组载体转染宿主细胞，构建瞬时转染体系或用G418进行压力筛选，构建稳定表达体系。
(5)将瞬时或稳定转染了含有MDR启动子的重组质粒的宿主细胞接种到96孔板中，每孔中加入不同的待筛选样品，并分别于不同时间检测报告基因的表达量，从而找到MDR1启动子的最佳抑制剂和激动剂。若用重组载体转染的宿主细胞接触待测样品后，细胞内报告基因的表达减弱了，则该待测样品可能是一种人MDR1基因的表达抑制剂；相反，若宿主细胞接触待测样品后，细胞内报告基因的表达增强了，则该受试对象可能是一种人MDR1基因的表达激动剂。通过该方法可对不同的对象进行平行筛选。因此，该方法可应用于高通量筛选中。
本发明中的“载体”可以是质粒、噬菌体、粘粒(cosmid，装配型质粒)、病毒颗粒或噬菌体等，包括但不限于PGL3、PGL2、pd2ECFP-1、PECFP1、pDsRed1-1、pd2EGFP-1、pFGFP-1、pd2EYFP-1、pEYFP-1、pHcRed1-1、pd2EGFP-Basic、pGFP-1等，优选pGL3质粒或pEGFP1质粒，此原始载体必须含有一个报告基因，且报告基因的上游没有启动子，但有一个多克隆位点，可供克隆启动子之用。
本发明中的“报告基因”可以是任何一种可被检测的蛋白质或酶的基因，即一种其表达产物非常容易被鉴定的基因，包括但不限于红色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、LacZ基因或荧光素酶基因等。
为了便于建立稳定的转染体系，还可对上述载体进行改建，使之含有Neo基因。
本发明中的“宿主细胞”可以是人、鼠和其他哺乳动物细胞，包括但不限于HEK293细胞和HEK293T细胞(人胚胎肾细胞系)、MCF-7细胞(人乳腺癌细胞系)、HT22细胞(小鼠海马神经细胞系)等。
本发明中的“待筛选的样品”可以是蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它分子。
本发明中的“抑制剂”是指当与人MDR1基因启动子作用时，一种可导致该基因表达下调的分子。抑制剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可作用于人MDR1基因启动子的分子。
本发明中的“激动剂”是指当与人MDR1基因启动子作用时，一种可导致该基因表达上调的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可作用于人MDR1基因启动子的分子。
本发明提供了一种含有外源多核苷酸的重组载体，它包含原始载体和人MDR1基因启动子，其中所述原始载体含有一个报告基因且不含启动子，所述人MDR1基因启动子连接到报告基因的上游，且人MDR1基因启动子的活性和报告基因的表达具有相关性。
较佳地，本发明的重组载体所含的原始载体为质粒，优选pGL3质粒或pEGFP1质粒；所述报告基因为荧光素酶基因或荧光蛋白基因；更佳地，本发明的重组载体还可以包含Neo基因。利用上述筛选系统进行筛选人MDR1基因表达调节剂的方法，其特征在于，先将权利要求6所述的宿主细胞与待测样品接触，再检测宿主细胞内报告基因表达强度的变化，所述报告基因的表达和人MDR1基因启动子的活性具有相关性。
本发明还提供一种筛选人MDR1基因表达调节剂的方法，它包括先将本发明的任一宿主细胞与待测样品接触，再检测该宿主细胞内报告基因表达强度的变化。所述报告基因的表达和人MDR1基因启动子的活性具有相关性。
上述的方法，其特征在于，若所述宿主细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度降低，则该待测样品可抑制人MDR1基因的表达。
上述的方法，其特征在于，若所述宿主细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度升高，则该待测样品可促进人MDR1基因的表达特别是，若该宿主细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度降低，则该待测样品可抑制所述人MDR1基因的表达；若该宿主细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度提高，则该待测样品可促进所述人MDR1基因的表达。
本发明的优越性在于所构建的筛选模型中所选的启动子(-1997至-1)与目前文献中(Shengkan Jin et al.Ecteinascidin 743，a transcription-targetedchemotherapeutic that inhibits MDR1 activation.PNAS，2000，97(12)6775-6779；Shengkan Jin and Kathleen W.Scotto.Transcriptional Regulationof the MDR1 Gene by Histone Acetyltransferase and Deacetylase Is Mediatedby NF-Y.Molecular and Cellular Biology，1998，18(7)4377-4384)所提到的最长MDR1启动子(-1202至+118)相比，在5’端长出795bp，在此区段含有许多转录因子结合基元(motif)，其中有代表性的是Smads结合位点(CAGA/TCTG)5个；HSF结合位点(AGAAA/AGAAC)8个；CdxA的结合位点ATTTATA/TATAAAT6个；SRY的结合位点(AAACAAA)2个；AP1的结合位点(GTCAA/TGAC)3个；SP1的结合位点(CTCC/GGCG/GGTG/GGAG/CGCC/CACC)13个。因此以本发明所用启动子为靶点更能全面反映MDR1基因的表达调节情况。
另外，通过对不同药物作用下MDR1-p-pGL3转染细胞荧光素酶活性的检测，证明本发明所构建的筛选模型具有较好的稳定性、特异性及敏感性。不加任何刺激时，转染MDR1-p-pGL3质粒的细胞内荧光素酶的活性为转染pGL3质粒的细胞内荧光素酶活性的22倍，说明本发明的模型具有很高的敏感性；用曲古抑素A(trichostatinA，TSA)及钙调蛋白抑制剂PAO(pherylarsin oxide，PAO)刺激可显著抑制MDR1启动子活性，而增食欲素(orexin，OX)则可明显刺激MDR1启动子活性，说明本发明的模型具有一定的特异性；而且本实验具有较好的可重复性，说明此模型比较稳定。
本研究的筛选系统具有筛选方法简单，适用性广等特点，既适合于手工筛选，又适合于高通量筛选。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中加以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的其他特点、目的和优势将会更为明显。
图12Kb MDR1启动子区的核苷酸序列图2含人MDR1启动子的重组质粒构建示意3不同药物对MDR1-p-pGL3转染细胞荧光素酶活性影响。
具体实施例方式实施例1人基因组DNA的提取1.取人外周血3ml加抗凝剂，混匀2.3000rpm 4℃离心20’。
3.吸掉上层血浆，注意不要吸掉中间白细胞层。
4.加5倍体积无菌双蒸水，混匀，室温放置5-10分钟。
5.4000rpm 4℃离心20分钟，弃上清。注意不要吸出白细胞。
6.加5ml生理盐水，使白细胞恢复等渗环境。
7.4000rpm 4℃离心15分钟，弃上清。
8.重复6、7步两次，共洗3次9.获取白细胞层。
10.在白细胞中加入5ml消化缓冲液(TES液)(15mM Tris-cl，15mM EDTA，15mM Nacl，0.5％SDS)11.加蛋白酶K至终浓度为0.1mg/ml，充分混匀，50℃水浴3-5小时(4.5h)。
12.冷却，加等体积Tris酚，轻轻振摇5分钟，4℃4000rpm离心20分钟。
13.小心吸取上清，移至另一离心管中，加等体积酚抽提一次，4000rpm 4℃离心20分钟。
14.小心吸取上清，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，4000rpm 4℃离心20分钟。
15.重复14步一次。
小心吸取上清，加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，沉淀DNA。
实施例2MDR1启动子区的钓取1.引物的设计根据文献报道从GenBank中查找MDR1启动子区的碱基序列，根据此序列设计PCR扩增用引物，其引物序列如下上游端引物为5’-GGGGTACCCCAGTCTCTACG-3’；下游端引物为5’-CAAGCTTGTCCGACCTGAAGAG-3’。5’端带有Kpn I酶切位点，3’端带有HindIII酶切位点。
2.PCR扩增以人类基因组DNA为模板，用以上合成的引物进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃，5min；94℃，1min，62℃，45sec，72℃，1min，30个循环；72℃，10min.
3.PCR产物的电泳及回收将上述PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在PCR产物中2Kb条带的前方用刀片切一小口，插入DE81滤纸，继续电泳4分钟，取出滤纸，用STE溶液洗3次，每次100μl，然后用1.2M NaCl TE进行洗脱，洗脱体积为300μl，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇，-20℃，1小时。12000rpm，离心5分钟，弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤，12000rpm，离心5分钟，弃上清，沉淀干燥后溶于10μl无菌蒸馏水中，取1μl测定浓度后备用。
4.PCR产物的TA克隆将上述回收产物与TA克隆载体连接，方法按Promega TA克隆试剂盒说明进行，4℃过夜后，将连接产物中加入20μl水，1μl 18mg/ml的糖原，1.5μl 5M NaCl，70μl无水乙醇，-20℃，1小时，12000rpm，离心5分钟，弃上清，加入100μl 70％乙醇洗涤，12000rpm，离心5分钟，弃上清，沉淀干燥后溶于10μl无菌蒸馏水中，取1μl连接产物电转化感受态的JM109细菌，将细菌涂在事先涂有IPTG和X-gal的选择培养基上，37℃孵箱培养过夜。
5.重组质粒的筛选挑取白色菌落，接种至2ml的LB培养基中，37℃振摇培养过夜，次日提取质粒，用KpnI和HindIII酶切鉴定，将酶切鉴定阳性的质粒进行测序。
实施例3MDR1-p-pGL3及MDR1-p-pEGFP1重组质粒的构建将上述TA克隆细菌进行大量扩增后提取质粒，用Kpn I和HindIII酶切，回收2Kb片段；同时将pGL3用Kpn I和HindIII酶切，回收酶切后的质粒，将回收后的片段和pGL3质粒用TAKARA的连接酶I进行连接，在构建MDR1-p-pEGFP1重组质粒时，将阳性TA克隆质粒和pEGFP1载体分别用EcoR I酶切并回收片段进行连接，连接方法按TAKARA Ligation Kit说明书进行，16℃连接4小时后，将连接产物按上述方法处理后电转化DH5α，将细菌涂至具有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃孵箱培养过夜。挑取菌落接种到2ml的LB培养基中，37℃振摇培养过夜，次日提取质粒，用Kpn I和HindIII或EcoR I酶切鉴定，将酶切鉴定阳性的质粒进行测序，其序列如图1所示。
实施例4细胞瞬时转染及荧光检测1.HEK293-T细胞的转染将HEK293-T细胞用10％FCS的DMEM培养基传代培养，将生长良好的细胞以5×105个/ml的密度接种24孔板，每孔0.5ml，37℃，5％CO2孵箱培养过夜，次日，用无血清DMEM培养基稀释质粒DNA，以每孔200μl DMEM、0.6μg MDR1-p-pGL3(MDR1-p-pEGFP1重组质粒或空质粒)、0.2μg CMV-β-gal的比例稀释，然后加入2.4μlTransfast转化试剂，涡旋混匀，室温静置15-20分钟，将细胞用PBS洗一次后，将质粒及转化试剂混合物加入细胞孔，37℃培养1小时后，每孔加入1ml完全培养基，继续培养12小时后加入刺激物，继续培养24小时后裂解细胞，测荧光素酶活性。
2.荧光素酶活性的测定将24孔板中的细胞收集至EP管中，5000rpm，离心5min，弃上清，每管加入1ml PBS，充分振荡使细胞悬浮，5000rpm，离心5min，弃上清，在每个EP管中加入100μl Extraction Buffer(1％Triton X-100，15mM MgSO4，4mM EGTA，1mM DTT，25mM glycylglycine)，涡旋振荡1分钟，冰上放置20min，待用。在测定管中加入5μl Assay cocktail(30mM ATP，0.1M KH2PO4(pH7.4)，0.1MMg2SO4)，再加入45μl细胞裂解液，最后每管加入100μl荧光素液(0.1M KH2PO4，50μg/ml的荧光素)，立即用化学发光仪(Lumat 9507)测定荧光素酶活性。
3.β-半乳糖苷酶活性的测定在96孔酶标板中加入37.5μl β-gal缓冲液(0.5M Na2HPO4，1M NaH2PO4，3M KCl，1M MgCl2，0.34％2-melcaptalethanol)，12.5μl ONPG，20μl细胞裂解液，振荡混匀，37℃避光反应直至液体变黄，用酶标仪测定OD420值。用此数值来标准化荧光素酶活性，以修正由于转染效率的差异而引起的误差。
实施例5重组质粒的改建用BglII及Sal I将pKO质粒中的Neo基因表达元件切下，连接入用BamHI及Sal I酶切后的重组质粒，使重组质粒中含有Neo基因，便于稳定转染体系的建立。
实施例6哺乳动物细胞稳定转染及荧光检测将HEK293-T细胞接种到直径60mm的培养板中，次日，将3μg改建后的重组质粒，用TransFast转化试剂转染293-T细胞，培养24小时后全换液，继续培养24小时后加入G418，最终浓度为400μg/ml，每2～3天观察并更换筛选培养基1次。2周左右克隆形成后，挑选细胞克隆30个，分别入6孔板。用含G418(200μg/ml)的培养基维持培养1周，将克隆有限稀释后加入96孔板，使每个孔中只有3个细胞，继续培养直至克隆长至满孔，取出部分细胞检测荧光素酶活性，将荧光素酶活性较高的孔继续G418(200μg/ml)维持扩大培养，用于样品库的筛选。
筛选方法实施例1用荧光素酶报告基因模型对待测样品进行筛选1.HEK293-T细胞的转染将HEK293-T细胞用10％FCS的DMEM培养基传代培养，将生长良好的细胞以5×105个/ml的密度接种24孔板，每孔0.5ml，37℃，5％CO2孵箱培养过夜，次日，用无血清DMEM培养基稀释质粒DNA，以每孔200μ1DMEM、0.6μg MDR1-p-pGL3(MDR1-p-pEGFP1重组质粒或空质粒)、0.2μg CMV-β-gal的比例稀释，然后加入2.4μl Transfast转化试剂，涡旋混匀，室温静置15-20分钟，将细胞用PBS洗一次后，将质粒及转化试剂混合物加入细胞孔，37℃培养1小时后，每孔加入1ml完全培养基，培养12小时后加入刺激物，继续培养24小时后裂解细胞，测荧光素酶活性。
2.荧光素酶活性的测定将24孔板中的细胞收集至EP管中，5000rpm，离心5min，弃上清，每管加入1ml PBS，充分振荡使细胞悬浮，5000rpm，离心5min，弃上清，在每个EP管中加入100μl Extraction Buffer(1％Triton X-100，15mM MgSO4，4mM EGTA，1mM DTT，25mM glycylglycine)，涡旋振荡1分钟，冰上放置20min，待用。在测定管中加入5μl Assay cocktail(30mM ATP，0.1M KH2PO4(pH7.4)，0.1MMg2SO4)，再加入45μl细胞裂解液，最后每管加入100μl荧光素液(0.1M KH2PO4，50μg/ml的荧光素)，立即用化学发光仪(Lumat 9507)测定荧光素酶活性。
3.β-半乳糖苷酶活性的测定在96孔酶标板中加入37.5μl β-gal缓冲液(0.5M Na2HPO4，1M NaH2PO4，3M KCl，1M MgCl2，0.34％2-melcaptalethanol)，12.5μl ONPG，20μl细胞裂解液，振荡混匀，37℃避光反应直至液体变黄，用酶标仪测定OD420值。
4.待测样品对MDR1启动子活性影响的判定首先用每孔细胞裂解液的荧光素酶活性值除以β-半乳糖苷酶活性值，从而对荧光素酶活性值进行标准化，以避免由于转化效率不同而带来的误差。然后用标准化后的重组质粒转染孔的荧光素酶活性值除以空质粒转染孔的荧光素酶活性值，求出二者比值，用此比值来判断待测样品对MDR1启动子活性的影响，从而避免质粒中MDR1启动子以外的其它无关序列对报告基因表达的影响。本实验的结果如图3所示用曲古抑素A(trichostatin A，TSA)10nM/ml刺激时，与对照相比可明显抑制MDR1启动子活性；用乙酰豆蔻佛波酯100nM/ml刺激时，与对照相比对MDR1启动子活性无明显影响；用增食欲素(orexin，OX)1nM/ml刺激时，与对照相比可明显刺激MDR1启动子活性；用钙调蛋白抑制剂PAO(pherylarsin oxide，PAO)1μM/ml刺激时，与对照相比可显著抑制MDR1启动子活性。
实施例2用GFP报告蛋白基因筛选模型对待测样品进行筛选将HEK293-T细胞用10％FCS的DMEM培养基传代培养，将生长良好的细胞以5×105个/ml的密度接种24孔板，每孔0.5ml，37℃，5％CO2孵箱培养过夜，次日，用无血清DMEM培养基稀释质粒DNA，以每孔200μl DMEM、0.8μg MDR1-p-pEGFP1或空载体pEGFP1的比例稀释，然后加入2.4μl Transfast转化试剂，涡旋混匀，室温静置15-20分钟，将细胞用PBS洗一次后，将质粒及转化试剂混合物加入细胞孔，12孔加重组质粒，12孔加空质粒，37℃培养1小时后，每孔加入1ml完全培养基，培养12小时后加入待测样品，继续培养24小时，用博麦洁公司的Fluostar检测荧光强度，然后用重组质粒转染孔的荧光强度值除以相应的空质粒转染孔的荧光强度值，并以此值来判断待测样品对MDR1启动子活性的影响，从而避免质粒中MDR1启动子以外的其它无关序列对报告基因表达的影响。
序列表<110>东北师范大学<120>人MDR1基因表达调节剂筛选系统<130>1<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2003<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>promoter<222>(1)..(2003)<223>
<400>1cccagtctct acgaaaaata caaaaaatta gccgggcgtg gtggcgggag cctgtagtcc 60cagctacctg ggaggctgag gcaggagaat ggtgtgaacc cgggaggcgg agcttgcagt120gagccgagat cctgccactg cactccagcc tgggcgacaa agcaagactc cgtctcaaaa180aagaaaaaag aaagaaaaac aaaagaaaac ttcattgtat tgtaaggcca agaacaaaat240atatcaagat aaggaaaatt tgtagtcaag aatagaaaaa aattatggct ttgaagtatg300agttatttaa agaaagtgga aacatcctca gactatgcag taaaaaacaa agtgattttc360ttcttctaaa cttatgcaat aaactgatag gtaatatgtg aaagtcatag aatgtagact420agaggataca acaaacctat ttcctctatg ttcataagaa gtaagaaaag ctctgatgtg480agttagcatt gctttacaat tttgaattgt gcagattgca cgtacttttc ctcagtttga540agtaaatagt ggacaggaaa aaatattaaa tgttggcagt aaatatggaa ggaaattaca600actaatgtaa tatgctaaaa catgctatgt ttattttact aatttgaatt aaaatgtaag660aatttaaaat gccctggaaa aacacgggca ttgatctgac gtctgaagtt ttaaaatatt720acacactttg aaatagcatt tgtaccttga aatacctgtc tctatatatt ttttaaaact780
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<221>primer<222>(1)..(20)<223>
<400>2ggggtaccccagtctctacg20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>primer<222>(1)..(22)<223>
<400>3caagcttgtccgacctgaagag2权利要求
1.一种人MDR1基因表达调节剂筛选系统，它是由一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞组成。
2.权利要求1中所述的筛选系统，其外源核苷酸是一个重组载体。
3.权利要求2中所述的重组载体包含原始载体和人MDR1基因启动子，其中所述原始载体为一种质粒，它含有一个报告基因且不含启动子；所述人MDR1基因启动子连接到报告基因的上游，且人MDR1基因启动子的活性和报告基因的表达具有相关性。
4.权利要求2中所述的重组载体，其中所述原始载体为pGL3质粒或pEGFP1质粒。
5.权利要求2中所述的重组载体，其中所述报告基因为荧光素酶基因或荧光蛋白基因。
6.权利要求1中的筛选系统在筛选人MDR1基因表达调节剂中的用途。
7.一种筛选人MDR1基因表达调节剂的方法，其特征在于，先将权利要求1所述的宿主细胞与待测样品接触，再检测宿主细胞内报告基因表达强度的变化，所述报告基因的表达和人MDR1基因启动子的活性具有相关性。
8.权利要求7中所述的方法，其特征在于，若所述宿主细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度降低，则该待测样品可抑制人MDR1基因的表达。
9.权利要求7中所述的方法，其特征在于，若所述宿主细胞接触待测样品后，其胞内报告基因的表达强度升高，则该待测样品可促进人MDR1基因的表达。
全文摘要
本发明公开一种人MDR1基因表达调节剂筛选系统，还提供了利用该系统筛选人MDR1基因表达调节剂的方法，以期筛选到高效、低毒的化疗增敏剂和耐药性逆转剂，该筛选系统包含一种含有外源多核苷酸的重组载体以及由该重组载体转化或转染的宿主细胞，该重组载体包含原始载体和人MDR1基因启动子，其中所述原始载体含有一个报告基因且不含启动子，所述人MDR1基因启动子连接到报告基因的上游，且人MDR1基因启动子的活性和报告基因的表达具有相关性。本发明还公开了构建该筛选系统的方法及其用途。本发明的筛选系统可用于筛选人MDR1基因表达调节剂。
文档编号C07K14/435GK1778919SQ20051001717
公开日2006年5月31日 申请日期2005年9月30日 优先权日2005年9月30日
发明者鲍永利, 李玉新, 孟祥颖, 乌垠, 纪雪, 易静雯 申请人:东北师范大学遗传与细胞研究所